專利名稱：過度養(yǎng)殖區(qū)水體微生物修復(fù)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于應(yīng)用生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種水環(huán)境過度養(yǎng)殖區(qū)微生物修復(fù)劑。
背景技術(shù)：
微生物作為一種生態(tài)調(diào)節(jié)劑，治理養(yǎng)殖水環(huán)境可以明顯改善水質(zhì)，增加溶氧，降低 氨氮與亞硝酸氮，抑制有害微生物的繁殖，降解有機物，同時具有成本低收效大等優(yōu)點而日 益受到重視。隨著水產(chǎn)集約化養(yǎng)殖的出現(xiàn)，養(yǎng)殖模式主要以投餌為主，且養(yǎng)殖密度大幅度提高， 導(dǎo)致水體中殘餌、糞便、氮、磷等富營養(yǎng)因子增多，促使微生物大量繁殖(包括致病菌)， COD、氨氮含量上升，溶氧下降，有的已超過國家三類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，養(yǎng)殖環(huán)境不斷惡化，使得水 產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)遭受巨大損失，據(jù)估計每生產(chǎn)一噸蝦會使水體中增加0. 2噸的氮元素和0. 05噸的 磷元素，其結(jié)果是導(dǎo)致魚蝦病害和產(chǎn)量下降。因此水質(zhì)好壞對養(yǎng)殖成敗和產(chǎn)量大小有著很 大的影響；水質(zhì)良好，病原菌少，養(yǎng)殖的水生動物生長自然就好，而水質(zhì)條件差，有毒物質(zhì)積 累，病原菌多且致病力強，養(yǎng)殖的水生動物便容易受到侵害。現(xiàn)有技術(shù)中，常使用化學(xué)藥品 來殺菌，但這樣造成病原體產(chǎn)生抗藥性，且藥品的大量殘留，污染水環(huán)境，同時會殺害水中 有益細菌，造成水生生態(tài)的失調(diào)。因此向養(yǎng)殖區(qū)投入微生物制劑是改良水質(zhì)的良好的方法， 當(dāng)向養(yǎng)殖水體中投入一定量的微生物制劑和菌種后，可以抑制有害微生物的生長，增加溶 氧，降低氨氮與亞硝酸氮的含量，抑制有害微生物的繁殖，降解有機物，同時具有成本低收 效大的優(yōu)點，可以建立一種新的微生態(tài)平衡關(guān)系，改良水質(zhì)，使養(yǎng)殖生物健康的生長發(fā)育。有益微生物一般都是在實驗條件下從土壤、水體底泥中分離篩選出來的，單一的 微生物僅對某種有機污染物有特定的降解能力；基因工程菌雖能增強微生物制劑的凈化功 能，但生物安全又是難以逾越的生態(tài)問題。微生物制劑投入養(yǎng)殖水體后，其降解活性受溫度、DO等環(huán)境因子的影響，不適宜的 溫度、濕度、PH值和DO等環(huán)境因子會使微生物制劑的有效性降低或喪失，市場上的一些微 生物制劑不能適應(yīng)過度養(yǎng)殖區(qū)的原位環(huán)境條件，使其中的微生物不能很快的成為水體中的 優(yōu)勢種群，修復(fù)效果很不明顯，且這些外來的微生物對養(yǎng)殖魚類的安全性造成潛在的威脅， 限制了這些微生物在水環(huán)境養(yǎng)殖區(qū)微生物修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是提供一種具有修復(fù)水環(huán)境過度養(yǎng)殖區(qū)且對養(yǎng)殖生物無害的微生態(tài)制劑。本發(fā)明的目的是提供一種微生物制劑，由下列細菌組成芽孢桿菌屬Bacillus、 假單胞菌屬Pseudomonas、短小芽孢桿菌Bacillus pumilus禾口不動桿菌屬Acinetobacter ； 保藏單位為中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號分別為CGMCC No :3737、3739、 3752、3712 ；所述芽孢桿菌屬 Bacillus CGMCCNo :3737、假單胞菌屬 Pseudomonas CGMCC No :3739、短小芽孢桿菌 Bacilluspumilus CGMCC No :3752 和不動桿菌屬 Acinetobacter CGMCC No :3712 的質(zhì)量比為 1. 4 1. 7 1. 0 1. 4 0. 9 1. 1 1. 2 1. 5。
本發(fā)明篩選菌株的菌落形態(tài)芽孢桿菌屬Bacillus CGMCC No 3737在營養(yǎng)瓊脂上的菌落形態(tài)菌落不規(guī)則，表 面色暗，不透明，培養(yǎng)后期變成褐色，菌落較大。假單胞菌屬Pseudomonas CGMCC No :3739在營養(yǎng)瓊脂上的菌落形態(tài)菌落呈圓 形，乳白色，不透明，表面光滑，邊緣整齊，菌落較大。短小芽孢桿菌Bacillus pumilus CGMCC No :3752在營養(yǎng)瓊脂上的菌落形態(tài)菌落 不透明，乳白色，表面光滑，邊緣整齊，菌落較小。不動桿菌屬Acinetobacter CGMCC No :3712在營養(yǎng)瓊脂上的菌落形態(tài)菌落無 色，不透明，呈圓形，表面光滑，邊緣整齊，菌落較小。本發(fā)明的有益效果(1)該微生態(tài)制劑用于水產(chǎn)養(yǎng)殖具有顯著效益，可有效降低養(yǎng)殖水質(zhì)中亞硝酸鹽、 氨氮、硫化氫等物質(zhì)的濃度，抑制水體中有害微生物繁殖和生長，凈化水質(zhì)，提高水產(chǎn)品品 質(zhì)和性能。(2)該微生物制劑具有投資小、效益高、使用方便等優(yōu)點，且無毒、無害、無藥物殘 留、不產(chǎn)生耐藥性，長期使用可以減少養(yǎng)殖過程中抗生素的使用量，減少病害發(fā)生。(3)該微生物制劑可迅速降解水體中的殘存飼料、魚類的糞便及其它有機物，特別 是清除池塘長時間的養(yǎng)殖水體底部，如海邊老蝦池底部積累的殘余飼料、排泄廢物、動植物 殘體；同時，還能吸收利用水體中的氨、亞硝酸鹽、硫化氫等有害物質(zhì)，能有效避免固體有機 物和有害物質(zhì)的積累。這些藻類為主的浮游植物所產(chǎn)生的光合作用，又為池塘底棲動物，水 產(chǎn)動物的呼吸，有機物的分解提供氧氣，從而形成池塘良性的生態(tài)循環(huán)，促使有益微生物的 大量繁殖，在池塘內(nèi)形成優(yōu)勢種群，可抑制病原微生物的繁殖，減少疾病發(fā)生。


圖1是本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)的空氣凈化系統(tǒng)圖；圖2是本發(fā)明菌劑的制備方法流程圖；圖3是本發(fā)明菌株的對魚飼料C0D的去除率變化曲線圖。本發(fā)明所使用的菌株為芽孢桿菌屬Bacillus CGMCC No :3737、假單胞菌屬 Pseudomonas CGMCC No :3739、短小芽孢桿菌 Bacillus pumilus CGMCCNo :3752、不動桿菌 屬 Acinetobacter CGMCC No :3712，上述菌株代號分別為 KB2、SL3、WZ3 和 WXW1。
具體實施例方式實施例實施例1-4見下表 將本發(fā)明的這四株細菌按常規(guī)發(fā)酵后的培養(yǎng)基混入粘土、沸石粉吸附物質(zhì)，經(jīng)過 低溫壓縮制成顆粒，吸附物質(zhì)與培養(yǎng)基的質(zhì)量比例為7 3，制成微生物修復(fù)制劑，每克微 生態(tài)修復(fù)制劑含菌量約100億。使用時，先進行活化，活化方法是從過度養(yǎng)殖區(qū)水體中盛一 些水倒入盛放制劑的器皿中，靜置一晚上，然后第二天潑到過度養(yǎng)殖區(qū)水體中。本發(fā)明四種菌種的篩選、培養(yǎng)和發(fā)酵過程1、本發(fā)明菌種的富集和分離取實驗?zāi)鄻又糜谒芰喜蹆?nèi)，加入魚飼料和滅菌淡水，培養(yǎng)一周后再加入魚飼料，循 環(huán)25天，取出泥樣，稀釋，涂布培養(yǎng)于TSB培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)24h，劃線分離得菌株，將上述 菌株采用試管保種法保藏于4°C冰箱中。TSB培養(yǎng)基組分胰蛋白胨17克，植物蛋白胨3克，氯化鈉2. 5克，磷酸氫二鉀2. 5 克，葡萄糖2. 5克，IOOOmL蒸餾水。2、篩選菌株將上述保藏在冰箱中的菌株用TSB培養(yǎng)基活化，挑取單菌落接種于魚飼料固體培 養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48小時，取生長較快、形成的菌落較大的菌株，這些細菌生長較快說明能 利用魚餌料作為唯一的碳源和氮源作為其生長所必需的營養(yǎng)。將這些生長較快、形成的菌 落較大的菌株接種于魚飼料液體培養(yǎng)基上，每天采用重鉻酸鉀法測定培養(yǎng)液的COD值，最 終篩選到本發(fā)明的四株對魚飼料分解能力較強的細菌。 3、本發(fā)明菌株分類地位的確定將本發(fā)明四種菌株的16S rRNA序列通過NCBI的BLAST同源性搜索及MEGA 4軟 件系統(tǒng)發(fā)育樹評估，鑒定這四株細菌的分類地位，并保藏在中國普通微生物菌種保藏管理 中心，它們分別是芽孢桿菌屬Bacillus CGMCC No :3737、假單胞菌屬Pseudomonas CGMCC No :3739、短小芽孢桿菌 Bacillus pumilusCGMCC No 3752 和不動桿菌屬 Acinetobacter CGMCC No :3712，在本發(fā)明中編號分別為KB2、SL3、WZ3和WXW1。4、發(fā)酵培養(yǎng)(1)、培養(yǎng)基成分發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分有豆粕、麥麩、淀粉，無機鹽。(2)、培養(yǎng)基滅菌方法采用濕熱滅菌法。(3)、空氣除菌采用空氣過濾除菌的方法，空氣過濾系統(tǒng)如附圖1所示，1為空氣吸氣口、2粗過濾 器、3空氣壓縮機、4 一級空氣冷卻器、5 二級空氣冷卻器、6分水器、7空氣貯罐、8旋風(fēng)分離器、9絲網(wǎng)除沫器、10空氣加熱器、11總空氣過濾器、分過濾器。(4)、種子制備種子制備包括實驗室種子制備及生產(chǎn)車間種子制備實驗室種子制備的培養(yǎng)基為固體培養(yǎng)基，主要成分有豆粕、淀粉及無機鹽，培養(yǎng)溫 度為30攝氏度，培養(yǎng)時間2 8天，不同菌種培養(yǎng)時間有差別，依照不同菌株的常規(guī)實驗方法來確 定。生產(chǎn)車間種子制備亦采用固體培養(yǎng)基，主要成分豆粕、麥麩、淀粉及無機鹽，培養(yǎng)溫度為 30攝食度，2級發(fā)酵。(5)、發(fā)酵培養(yǎng)采用帶機械攪拌的筒柱式反應(yīng)器將本發(fā)明四種菌進行固態(tài)混合發(fā)酵，培養(yǎng)基主要 成分豆粕、麥麩、淀粉和無機鹽；發(fā)酵條件溫度為30攝氏度，pH 7，鹽度5。如附圖2所示為本發(fā)明菌劑的制備方法流程圖，可以清楚的看到整個制備過程。下面對本發(fā)明四種細菌進行生成條件實驗、生態(tài)安全實驗、拮抗性實驗、協(xié)同性及 作用效果檢測實驗。一、有機物降解菌生長條件試驗1、實驗方法牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)成分(基礎(chǔ)成分包括胰蛋白胨10克，牛肉膏3克， IOOOmL蒸餾水，ρΗ7· 4)，用氯化鈉調(diào)節(jié)其鹽度梯度為0、5、10、15、20、25、30、35、40，將有機 質(zhì)降解菌接種到這幾個濃度梯度的細菌培養(yǎng)液中，28°C下培養(yǎng)，每隔4h用分光光度計測定 菌液的0D600值，比較菌株在這幾個鹽度梯度下的生長情況。將本發(fā)明的四種細菌接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基內(nèi)。分別在8°C、12°C、16°C、 20°C、22 °C、24°C、26 °C、28 °C、30°C、32 °C、34°C、36 °C、40°C、44°C 幾個溫度梯度下培養(yǎng)，每隔 4h用分光光度計測定菌液的0D600值，比較菌株在這幾個溫度梯度下的生長情況。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，用煮沸的質(zhì)量濃度為5%的氫氧化納和質(zhì)量濃度為 10%稀鹽酸調(diào)節(jié) pH 值，使其 pH 梯度為 5. 4,5. 6,5. 8,6. 0,6. 2,6. 4,6. 6,6. 8,7. 0,7. 2,7. 4、 7. 6,7. 8,8. 0,8. 2,8. 4,8. 6,8. 8,9. 0,9. 2,9. 4。將本發(fā)明的四種細菌接種到這幾個濃度梯 度的細菌培養(yǎng)液中，28°C下培養(yǎng)，每隔4h用分光光度計測定菌液的0D600值，以比較本發(fā)明 菌株在這幾個PH梯度下的生長情況。2、實驗結(jié)果如表1所示，本發(fā)明的四株細菌生長的最適宜溫度大多在28V 30°C之間，可生 長溫度范圍在16°C 36°C ；最適宜生長的pH值在7. 4左右，可生長的pH范圍在6. 4 8. 4 之間；最適宜生長的鹽度大多為5 10左右，可生長鹽度范圍在0 20之間。本發(fā)明菌株的生長條件試驗表明本發(fā)明的四株細菌對溫度環(huán)境的適應(yīng)能力較強， 且適宜生長溫度與水環(huán)境養(yǎng)殖區(qū)的最適生長溫度相吻合。二、降解菌生態(tài)安全試驗塑料水槽消毒后，加入20升滅菌淡水，水槽中分別放入5 IOcm的30尾鯉魚、鰱 魚、草魚、鳙魚四種魚，每種魚設(shè)三個平行。將本發(fā)明的微生物修復(fù)劑制成菌懸液接入水槽 內(nèi)，使其在水槽內(nèi)中的終濃度維持在IO6 107CFU/mL，以無菌淡水組作為對照，連續(xù)通氣， 依據(jù)養(yǎng)殖對象投喂相應(yīng)的餌料早晚各一次，記錄養(yǎng)殖對象的的存活情況以及及時清除死亡個體。實驗結(jié)果如表2、3、4和5所示，養(yǎng)殖10天后，將所得數(shù)據(jù)進行差異性檢驗，試驗組 與對照組的成活率無明顯差別，證明本發(fā)明四株菌對試驗品種生長無任何毒副作用。三、本發(fā)明菌株的拮抗性實驗將本發(fā)明四株細菌在TSB培養(yǎng)基上活化，取單菌落于生理鹽水中制成菌懸液，將 一種菌的菌懸液涂布于TSB固體培養(yǎng)基表面，圓形無菌紙片于另一種菌的菌懸液中浸潤， 貼到涂布菌液的TSB培養(yǎng)基表面，48h后觀察有無抑菌圈，檢驗這幾種菌有無拮抗性。TSB培養(yǎng)基配方胰蛋白胨17克，植物蛋白胨3克，氯化鈉2. 5克，磷酸氫二鉀2. 5 克，葡萄糖2. 5克，IOOOmL蒸餾水。實驗結(jié)果顯示，這幾株菌之間均沒有拮抗性。四、本發(fā)明菌株的協(xié)同性及作用效果實驗將本發(fā)明的四株細菌在TSB培養(yǎng)基上活化，取單菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基中，培 養(yǎng)24h后，將每種菌的菌液接種于液體的魚飼料培養(yǎng)基中，總共接種量為0. 5 2. 0 %，每隔 24小時取樣品一次，5000r/min離心，重鉻酸鉀法測定上清液的C0D，連續(xù)測定7天。如圖3 所示，在第 天的時候，SL3、WZ3與WXWl的COD去除率最高，約為60%，如表6所示，菌株 KB2和SL3、WZ3與WXWl的混合菌液的COD去除率最高。每增加一種菌株，混合菌液的COD 去除率依次增加，證明本發(fā)明的四株菌株之間存在協(xié)同作用。結(jié)果分析1、通過檢驗，本發(fā)明幾株菌之間均沒有拮抗性；2、菌株KB2的COD去除率最高，以菌株KB2為基礎(chǔ)，與其他幾株菌株組合，檢驗混 合菌的COD去除率變化，得如表6所示。以實驗組KB2、SL3、WZ3與WXWl的混合菌對培養(yǎng)液 的去除率最高，最高達87.9%，因此微生態(tài)制劑以這四種菌制作而成。綜上所述，通過上述四個實驗得出如下結(jié)論1、由表6可知該微生態(tài)制劑用于水產(chǎn)養(yǎng)殖具有顯著效益，可有效降低養(yǎng)殖水質(zhì)中 亞硝酸鹽、氨氮、硫化氫等濃度，抑制水體中有害微生物繁殖和生長，凈化水質(zhì)，提高水產(chǎn)品 商品性能。2、由表1-6可知該微生物制劑具有投資小、效益高、使用方便等優(yōu)點，且無毒、無 害、無藥物殘留、不產(chǎn)生耐藥性，長期使用可以減少養(yǎng)殖過程中抗生素的使用量，減少病害 發(fā)生，排放的污水對環(huán)境污染也較小。3、本發(fā)明微生物制劑可迅速降解水體中的殘存飼料、魚類的糞便及其它有機物， 特別是清除池塘長時間的養(yǎng)殖水體底部，如海邊老蝦池底部積累的殘余飼料、排泄廢物、動 植物殘體；同時，還能吸收利用水體中的氨、亞硝酸鹽、硫化氫等有害物質(zhì)，能有效避免固體 有機物和有害物質(zhì)的積累。這些藻類為主的浮游植物所產(chǎn)生的光合作用，又為池塘底棲動 物，水產(chǎn)動物的呼吸，有機物的分解提供氧氣，從而形成池塘良性的生態(tài)循環(huán)，促使有益微 生物的大量繁殖，在池塘內(nèi)形成優(yōu)勢種群，可抑制病原微生物的繁殖，減少疾病發(fā)生。附表表1是本發(fā)明菌株的生長條件表；表2是本發(fā)明的菌株芽孢桿菌屬Bacillus CGMCC No 3737對魚類的安全性試驗 表；
表3是本發(fā)明的菌株假單胞菌屬Pseudomonas CGMCC No :3739對魚類的安全性試 驗表；表4是本發(fā)明的菌株短小芽孢桿菌Bacillus pumilus CGMCC No :3752對魚類的
安全性試驗表；表5是本發(fā)明的菌株不動桿菌屬Acinetobacter CGMCC No :3712對魚類的安全性 試驗；表6是本發(fā)明菌株的協(xié)同性及作用效果實驗表。 表 1 表2第10天的存活狀況
分組情況投放魚苗的數(shù)量-與對照組比較差異是否顯著
存活數(shù)(尾)平均存活數(shù)平均存活率(％) 表3
第10天的存活狀況
分組情況投放魚苗的數(shù)量-與對照組比較差異是否顯著
存活數(shù)(尾)平均存活數(shù)平均存活率(％) 表 4 表 5 表 權(quán)利要求
一種過度養(yǎng)殖區(qū)水體微生物修復(fù)劑，其特征是其由下列細菌組成芽孢桿菌屬Bacillus、假單胞菌屬Pseudomonas、短小芽孢桿菌Bacilluspumilus和不動桿菌屬Acinetobacter；保藏單位為中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號分別為CGMCC No3737、3739、3752、3712；所述芽孢桿菌屬Bacillus CGMCC No3737、假單胞菌屬Pseudomonas CGMCC No3739、短小芽孢桿菌Bacillus pumilus CGMCC No3752和不動桿菌屬Acinetobacter CGMCC No3712的質(zhì)量比為1.4～1.7∶1.0～1.4∶0.9～1.1∶1.2～1.5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過度養(yǎng)殖區(qū)水體微生物修復(fù)劑，其特征是所述芽孢桿菌 屬 Bacillus CGMCC No :3737、假單胞菌屬 Pseudomonas CGMCCNo :3739、短小芽孢桿菌 Bacillus pumilus CGMCC No :3752 和不動桿菌屬 Acinetobac ter CGMCC No :3712 的質(zhì)量 比為 1. 5 1. 2 1. 0 1. 3。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種過度養(yǎng)殖區(qū)水體微生物修復(fù)劑，其是由下列細菌組成芽孢桿菌屬Bacillus、假單胞菌屬Pseudomonas、短小芽孢桿菌Bacillus pumilus和不動桿菌屬Acinetobacter；保藏單位為中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號分別為CGMCC No3737、3739、3752、3712；上述細菌的質(zhì)量比為1.4～1.7∶1.0～1.4∶0.9～1.1∶1.2～1.5，本發(fā)明是具有修復(fù)水環(huán)境過度養(yǎng)殖區(qū)且對養(yǎng)殖生物無害的微生態(tài)制劑，能抑制水體中有害微生物繁殖和生長，凈化水質(zhì)，提高水產(chǎn)品品質(zhì)和性能。
文檔編號C12N1/00GK101921710SQ20101026019
公開日2010年12月22日 申請日期2010年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月24日
發(fā)明者李艷華, 王萍, 田在鋒, 祝歡, 肖國華, 胡曉波, 邊蔚, 陳新永, 高曉田 申請人:河北省環(huán)境科學(xué)研究院;河北省水產(chǎn)研究所