專利名稱：一種高溫酸性木聚糖酶xyn10j88及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種高溫酸性木聚糖酶XYN10J88 及其基因、包含該基因的重組載體和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
半纖維素是由D-木糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖或D-乳糖以直鏈或支鏈聚合而 成的多糖，分子主鏈可由一種或幾種糖基組成，鏈短且存在側(cè)鏈，并且具有多樣的側(cè)鏈取代 基，如乙?；肴樘?、阿拉伯糖或葡萄糖醛酸殘基。與纖維素主鏈相比，半纖維素的結(jié)構(gòu) 與組成十分復(fù)雜。木聚糖主要存在于蕨類、裸子植物和被子植物中，甘露聚糖主要存在于 針葉樹中，阿拉伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖主要存在于落葉松中，木葡聚糖則主要存在于雙子 葉植物中。半纖維素酶是分解半纖維素的一類酶的總稱，包括木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉 伯聚糖酶、阿拉伯半乳糖酶和木葡聚糖酶等。自然界中，木聚糖是許多生物材料半纖維素 的主要組成成分，是半纖維素中最豐富的一種，其主鏈由吡喃木糖以0_1，4糖苷鍵連接而 成，聚合度150-200，側(cè)鏈上具有阿拉伯糖、葡萄糖醛酸、乙醚、香豆酸、肉桂酸等(Collins et al.FEMS MicrobiologyReviews. 2005，29 :3_23.)。對(duì)木聚糖酶的研究已有半個(gè)世紀(jì)， 主要研究集中在適合于飼料工業(yè)、食品工業(yè)、制漿造紙工業(yè)、能源工業(yè)等方面的木聚糖酶， 已經(jīng)從不同來源的微生物中分離到大量的不同類型不同功能的木聚糖酶。并分離出多種木 聚糖酶基因，已工業(yè)化生產(chǎn)多種木聚糖酶產(chǎn)品。其中，大多數(shù)木聚糖酶的最適作用PH值在 6. 0 7. 0。酸性木聚糖酶已經(jīng)引起研究人員的廣泛關(guān)注，酸性木聚糖酶在飼料行業(yè)中的應(yīng) 用，可以有效破壞木聚糖分子中的共價(jià)交聯(lián)，顯著降低阿拉伯木聚糖分子大小，從而降低食 糜的粘度，改善飼料性能，降低因粘度增加而引起的抗?fàn)I養(yǎng)作用(劉強(qiáng)和馮學(xué)琴，動(dòng)物營養(yǎng) 學(xué)報(bào).1999，11 6-11.)在啤酒釀造行業(yè)具有潛在的應(yīng)用前景，在啤酒釀造過程中，不被降 解的阿拉伯木聚糖造成啤酒過濾困難、堵塞過濾膜，增加了啤酒的生產(chǎn)成本和品質(zhì)，采用酸 性木聚糖酶與葡聚糖酶協(xié)同作用，可以解決以上問題。因此，酸性木聚糖酶的產(chǎn)生、純化、性 質(zhì)、酸性特征的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及其在飼料加工、釀酒工業(yè)、果汁加工、以及能源等領(lǐng)域的應(yīng)用正 在不斷深入。由于不同工業(yè)對(duì)木聚糖酶性質(zhì)需求不同，因此，獲得新型具有優(yōu)良特性木聚糖酶 的研究仍具有重大意義?？寺『头蛛x具有高溫酸性的木聚糖酶可以更好的應(yīng)用于飼料、釀 酒，食品工業(yè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能高效應(yīng)用的高溫酸性木聚糖酶木聚糖酶。本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述高溫酸性木聚糖酶的基因。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述高溫酸性木聚糖酶的基因工程方法。
本發(fā)明的另一目的提供上述高溫酸性木聚糖酶的應(yīng)用。本發(fā)明從瓶霉(Phialophorasp. J88CGMCC 3873)(保藏日期2010 年 5 月 25 號(hào)， 保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3 號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所100101)，其保藏號(hào)為CGMCC No. 3873。)中分離得到一種新 的高溫酸性木聚糖酶XYN10J88。本發(fā)明提供了一種高溫酸性木聚糖酶XYN10J88，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所不。SEQ ID NO. 1 MRGLKASLFAYLGTASIVSADGLNVRAQAAGKKYFGTAISTTVLNDATADAIAKNYQDFGQYTCENEMKFDATEPSRNSFSYGSADMIVAQAQADGQIMRCHNLVWHNQVPSWVTDGNFDNATLISIMKNHIANVVGHYKGKCYAWDVGNEALNEDGSYMTSGSVWGSTIGPAYIPIAFAAAAEADPAAKLyYNDYNCEKAGAKSTGAQNLIKMVKSYGAPIHGIQGHFTTGQVGGSSALVS匪QAFTALGVEVAYTELDMATPSSDPDLTQQATDYATVVTSCKQVPDCVGITIWEFSDRYTWLTNSAPLPWDVNFQKKPAYTSILDAWGGSATGSATSTPTTMATSTTTAGPAPSGGGGGCTAAHWAQCGGTGYTGCTTCASPYTCQVSNPYYSQCL其中，該酶基因編碼399個(gè)氨基酸，N端20個(gè)氨基酸為其預(yù)測(cè)的信號(hào)肽序列 "mrglkaslfaylgtasivsa" (SEQ ID NO. 3)。因此，成熟的高溫酸性木聚糖酶XYN10J88的理論分子量為40. OkDa,其氨基酸序 列如SEQ ID NO. 2所示DGLNVRAQAAGKKYFGTAISTTVLNDATADAIAKNYQDFGQYTCENEMKFDATEPSRNSFSYGSADMIVAQAQADGQIMRCHNLVWHNQVPSWVTDGNFDNATLISIMKNHIANVVGHYKGKCYAWDVGNEALNEDGSYMTSGSVWGSTIGPAYIPIAFAAAAEADPAAKLyYNDYNCEKAGAKSTGAQNLIKMVKSYGAPIHGIQGHFTTGQVGGSSALVS 匪 QAFTALGVEVAYTELDMATPSSDPDLTQQATDYATWTSCKQVPDCVGITIWEFSDRYTWLTNSAPLPWDVNFQKKPAYTSILDAWGGSATGSATSTPTTMATSTTTAGPAPSGGGGGCTAAHWAQCGGTGYTGCTTCASPYTCQVSNPYYSQCL本發(fā)明的木聚糖酶XYN10J88具有好的熱穩(wěn)定性，同時(shí)在常溫下、酸性和中性的范 圍內(nèi)均具有高活性、抗蛋白酶降解等特性。本發(fā)明篩選到Phialophora sp. J88CGMCC 3873 所產(chǎn)生的木聚糖酶，其最適PH值為4. 0，在pH4. 0 7. 0的范圍內(nèi)維持50%以上的酶活性； 最適溫度為70°C，在40°C仍具有50%左右的酶活力；用胃蛋白酶和胰蛋白酶處理120分 鐘，酶活性維持在50%以上。本發(fā)明提供了編碼上述高溫酸性木聚糖酶XynlOJ88。具體地，該基因的基因組序 列如SEQ ID NO. 4所示atgcgtggtctcaaagccagcttgttcgcctaccttggcacggcgagcatcgtctcggccgatggcctc aatgttcgcgcgcaggccgcgggaaagaagtactttggcaccgccatcagcaccaccgtcctcaacgacgcgactgcggacgcga tagccaagaactaccaggacttcggacagtacacctgtgagaacgagatgaagttcgacgccaccgagccatccaggaatagc
4ttcagctatggcagcgccgacatgatcgtagcgcaggcgcaagccgacggccagatcatgaggtgccacaaccttgtctggcat aaccaggtgccctcgtgggttaccgacggcaacttcgacaacgcgaccctgatcagcatcatgaagaaccacatcgccaacgt ggtcgggcactacaagggcaagtgctatgcgtgggatgtgggaaacgaggccctgaacgaggacggctcgtacatgacgtctgg ttccgtgtgggggtcgaccatcgggccggcctacatccccatagccttcgcggcggcagcggaggcagacccggcggccaagc tgtactacaacgactacaactgtgagaaggcgggggcaaaatccacgggcgcgcagaacctgatcaagatggtcaagtcgta cggagccccgatccatggcatccaggggcatttcacgaccggccaggtcgggggctcttccgcgctggtgagcaacatgcag gccttcactgccctgggcgtcgaggtggcctataccgagctcgacatggcgacgccgtcatccgacccggatctcacccaacag gctaccgactatgccaccgtggtgacgtcgtgcaagcaggtgccggactgcgtgggcatcacgatctgggaattctcggaccg gtatacgtggctcaccaactcggcgccgctgccgtgggacgtcaatttccagaagaaaccggcgtacaccagcatcctggatgc ttgggggggctcggccacaggcagtgcgacaagcacgccgaccaccatggctaccagcaccaccacggcaggtccggctccct cgggcggagggggcggctgcacggcggcccactgggcgcagtgcggcgggactggatacacgggatgcaccacctgtgcg tccccgtatacctgtcaagtctctaatccctactacagtcagtgtctgtaa本發(fā)明通過PCR的方法分離克隆了木聚糖酶基因xynlOJ88，DNA全序列分析結(jié)果 表明，木聚糖酶XYN10J88結(jié)構(gòu)基因xynlOJ88全長1200bp。其中，信號(hào)肽的堿基序列為ATGCGTGGTCTCAAAGCCAGCTTGTTCGCCTACCTTGGCACGGCGAGCATCGTCTCGGCC(SEQ ID NO. 6) 0成熟的木聚糖酶XYN10J88的基因序列如SEQ ID NO. 5所示。SEQ ID NO. 5gatggcctcaatgttcgcgcgcaggccgcgggaaagaagtactttggcaccgccatcagcaccaccgtc ctcaacgacgcgactgcggacgcgatagccaagaactaccaggacttcggacagtacacctgtgagaacgagatgaagttcga cgccaccgagccatccaggaatagcttcagctatggcagcgccgacatgatcgtagcgcaggcgcaagccgacggccagatca tgaggtgccacaaccttgtctggcataaccaggtgccctcgtgggttaccgacggcaacttcgacaacgcgaccctgatcag catcatgaagaaccacatcgccaacgtggtcgggcactacaagggcaagtgctatgcgtgggatgtgggaaacgaggccctgaac
5gaggacggctcgtacatgacgtctggttccgtgtgggggtcgaccatcgggccggcctacatccccatagccttcgcggcgg cagcggaggcagacccggcggccaagctgtactacaacgactacaactgtgagaaggcgggggcaaaatccacgggcgcgcag aacctgatcaagatggtcaagtcgtacggagccccgatccatggcatccaggggcatttcacgaccggccaggtcgggggct cttccgcgctggtgagcaacatgcaggccttcactgccctgggcgtcgaggtggcctataccgagctcgacatggcgacgccgt catccgacccggatctcacccaacaggctaccgactatgccaccgtggtgacgtcgtgcaagcaggtgccggactgcgtgggca tcacgatctgggaattctcggaccggtatacgtggctcaccaactcggcgccgctgccgtgggacgtcaatttccagaagaaac cggcgtacaccagcatcctggatgcttgggggggctcggccacaggcagtgcgacaagcacgccgaccaccatggctaccagca ccaccacggcaggtccggctccctcgggcggagggggcggctgcacggcggcccactgggcgcagtgcggcgggactggat acacgggatgcaccacctgtgcgtccccgtatacctgtcaagtctctaatccctactacagtcagtgtctgtaa成熟蛋白理論分子量為40. OkDa，將木聚糖酶基因xynlOJ88序列及推導(dǎo)出的氨基 酸序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，該基因與來源于Penicillium funiculosum的木聚 糖酶氨基酸序列一致性為49. 5%。說明XYN10J88是一種新的木聚糖酶。本發(fā)明還提供了包含上述高溫酸性木聚糖酶基因xynlOJ88的重組載體，優(yōu)選 為pPIC-xynlOJ88。將本發(fā)明的木聚糖酶基因插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之 間，使其核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方 案，優(yōu)選為將本發(fā)明的木聚糖酶基因插入到質(zhì)粒PPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切 位點(diǎn)之間，使該核苷酸序列位于AOXl啟動(dòng)子的下游并受其調(diào)控，得到重組酵母表達(dá)質(zhì)粒 pPIC9-xynl0J88o本發(fā)明還提供了包含上述高溫酸性木聚糖酶基因xynlOJ88的重組菌株，優(yōu)選所 述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，優(yōu)選為重組菌株GS115/XynlOJ88。本發(fā)明還提供了一種制備高溫酸性木聚糖酶XYN10J88的方法，包括以下步驟1)用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組木聚糖酶表達(dá)；以及3)回收并純化所表達(dá)的木聚糖酶XYN10J88。其中，優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母細(xì)胞、啤酒酵母細(xì)胞或多型漢遜酵母細(xì)胞，優(yōu) 選將重組酵母表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母細(xì)胞(Pichia ￡1計(jì)01^8)63115，得到重組菌株63115/ xynlOJ88。本發(fā)明還提供了上述高溫酸性木聚糖酶XYN10J88的應(yīng)用。本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種性質(zhì)優(yōu)良的、 適合于在飼料、釀酒、食品工業(yè)中應(yīng)用新的木聚糖酶。本發(fā)明的木聚糖酶最適PH為4. 0，在PH4. 0 7. 0都有較高的酶活性；pH穩(wěn)定性好；具有良好的抗蛋白酶的能力。其耐高溫特 性，可使其在需求高溫環(huán)境的工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用。本木聚糖酶可應(yīng)用于飼料工業(yè)，有效降低粘 度，消除或降低因粘度增加而引起的抗?fàn)I養(yǎng)作用。在釀酒工業(yè)中，可有效降解可溶性何不可 溶性的阿拉伯木聚糖，有效降低麥芽汁的粘度提高過濾效率澄清啤酒。另外，在白酒、清酒 的釀造中有助于提高發(fā)酵效率，提高淀粉利用率，增加酒精的產(chǎn)率。還可以將造紙工業(yè)廢料 及農(nóng)業(yè)廢棄物中的木聚糖可被轉(zhuǎn)化為D-木糖單體，而D-木糖又可被細(xì)菌、酵母及真菌轉(zhuǎn)化 成有價(jià)值的燃料。因此，本木聚糖酶在能源工業(yè)中的應(yīng)用也顯示出其巨大的潛力。


圖1重組木聚糖酶的最適pH。圖2重組木聚糖酶的pH穩(wěn)定性。圖3重組木聚糖酶的最適溫度。圖4重組木聚糖酶的熱穩(wěn)定性。
具體實(shí)施例方式試驗(yàn)材料和試劑1、菌株及載體本發(fā)明從瓶霉(Phialophora sp. J88CGMCC 3873)(保藏日期 2010年5月25號(hào)，保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽區(qū) 北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，100101)，其保藏號(hào)為CGMCC No. 3873。) 中分離得到一種新的高溫酸性木聚糖酶XYN10J88。畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9及菌株GS115 購自于Invitrogen公司。2、酶類及其它生化試劑內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自Invitrogen公司。 燕麥木聚糖購自Sigma公司，其它都為國產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。3、培養(yǎng)基(1)Phialophora sp. J88CGMCC 3873培養(yǎng)基為馬鈴薯汁培養(yǎng)基1000mL馬鈴薯 汁，10g葡萄糖，25g瓊脂，pH2. 5。(2)大腸桿菌培養(yǎng)基LB(1%蛋白胨、0. 5%酵母提取物、NaCl，pH7.0)。(3) BMGY 培養(yǎng)基1 % 酵母提取物，2 % 蛋白胨，1. 34 % YNB，0. 00004 % Biotin, 1 % 甘油(V/V)。(4)BMMY培養(yǎng)基除以0. 5%甲醇代替甘油，其余成份均與BMGY相同，pH4. 0。說明以下實(shí)施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn) 指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書 進(jìn)行。實(shí)施例1 瓶霉 Phialophora sp. J88CGMCC 3873 產(chǎn)酶特性將來源于云南鈾礦廢水樣品經(jīng)富集培養(yǎng)后(富集培養(yǎng)基(NH4)2S04 5g/L，KH2P04 lg/L, MgS04 7H20 0. 5g/L, FeS04 7H20 0. Olg/L, CaCl2 0. 2g/L,玉米芯粉 0. 5 %，麩皮 0.5%，pH2. 5)，按常規(guī)稀釋后涂布于產(chǎn)酶培養(yǎng)基((NH4) 2S04 5g/L，KH2P04 lg/L, MgS04 7H20 0. 5g/L，F(xiàn)eS04.7H20 0. Olg/L, CaCl2 0. 2g/L，木聚糖 1 %，1. 5%瓊脂糖，pH 2.5)平板上， 30°C培養(yǎng)5 6d，挑取產(chǎn)生透明圈菌落在產(chǎn)酶培養(yǎng)基平板劃線分離，重復(fù)劃線分離過程3輪，使菌株純化。通過此方法篩選到該分泌木聚糖酶的菌株。產(chǎn)透明圈最大的菌株經(jīng)劃線 分離純化后定名為J88，經(jīng)18SrDNA鑒定該菌株為瓶霉，命名為Phialophora sp. J88。實(shí)施例2瓶霉Phialophora sp. J88CGMCC 3873木聚糖酶編碼基因xynlOJ88的克 隆提取瓶霉Phialophora sp. J88CGMCC 3873 基因組 DNA 將液體培養(yǎng)3天的菌絲體用無菌濾紙過濾放入研缽中，加入2mL提取液，研磨 5min，然后將研磨液置于50mL離心管中，65°C水浴鍋裂解20min，每隔IOmin混勻一次，在 4°C下IOOOOrpm離心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體積異 丙醇，于室溫靜置5min后，4°C下IOOOOrpm離心lOmin。棄上清，沉淀用70%的乙醇洗滌兩 次，真空干燥，加入適量TE溶解，置于-20°C備用。根據(jù)第十家族木聚糖酶基因的保守(WDVVNE和I (L)TELDI)序列設(shè)計(jì)合成了簡(jiǎn)并 引物P1，P2Pl 5' -TGGGACGTSGTSAACGAG-3‘；P2 5' -GGATGTCSAGYTCSGTGA-3‘)。以 Phialophora sp. J88CGMCC 3873 總 DNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)參數(shù) 為94°C變性5min ；然后94°C變性30sec，45°C退火30sec，72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)后72°C 保溫lOmin。得到一約348bp片段，將該片段回收后與pEASY_T3載體相連送三博生物技術(shù) 有限公司測(cè)序。根據(jù)測(cè)序得到的核苷酸序列，設(shè)計(jì)上游和下游各三條TAIL-PCR特異性引物設(shè)計(jì) 方向?yàn)樾枰獢U(kuò)增的未知區(qū)域方向，sp2的位置設(shè)計(jì)在spl的內(nèi)側(cè)，sp3位于sp2的內(nèi)側(cè)。每 兩個(gè)引物之間的距離沒有嚴(yán)格規(guī)定，引物長度一般22 30nt，退火溫度在60 65°C。并 將它們分別命名為uspl，卿2，usp3(上游特異性引物)，dspl, dsp2, dsp3(下游特異性引 物)見表1。表1.木聚糖酶XYN10J88TAIL-PCR特異性引物
引物名稱引物序列(5’---3’；)引物長度(bp)usplGTCCACGTCGAATGTAAACTCTTGGCTGAG30usp2CTCGGAATCCATGAGATAGGTGCGCGAG28usp3GATGTGC AAGTTGTAGCATCTGGGCAGATG30dsplCGAAGTACGGAACCGGTTATTGTGATGCTC30dsp2CATGAAGTTTGTCAATGGAACTGTAAGTGAAGTACC36dsp3CAACTCTGGCAAAGGAAACTTGGGCAGC28 通過反向TAIL-PCR得到已知基因序列的側(cè)翼序列，擴(kuò)增得到產(chǎn)物回收后送三博 生物技術(shù)有限公司測(cè)序。拼接后XYN10J88木聚糖酶基因全長1200bp，編碼399個(gè)氨基酸和 一個(gè)終止密碼子。用 SignalP(http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP)進(jìn)行分析表明
8N端20個(gè)氨基酸為預(yù)測(cè)的信號(hào)肽。預(yù)測(cè)該基因所編碼的成熟蛋白的理論分子量為40. OkDa0實(shí)施例3重組木聚糖酶的制備將表達(dá)載體pPIC9進(jìn)行雙酶切(EcoR I+Not I)，同時(shí)將編碼木聚糖酶的基因 xynlOJ88雙酶切(EcoR I+Not I)，切出編碼成熟木聚糖酶的基因片段與表達(dá)載體pPIC9 連接，獲得含有Phialophora sp. J88CGMCC 3873木聚糖酶基因xynlOJ88的重組質(zhì)粒 pPIC-xynlOJ88并轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，獲得重組畢赤酵母菌株GS115/xynlOJ88。取含有重組質(zhì)粒的GSl 15菌株，接種于300mL BMGY培養(yǎng)液中，30°C 250rpm振蕩培 養(yǎng)48h后，離心收集菌體。然后于150mLBMMY培養(yǎng)基重懸，30°C 250rpm振蕩培養(yǎng)。誘導(dǎo)72h 后，離心收集上清。測(cè)定木聚糖酶的活力。重組木聚糖酶的表達(dá)量為43. 6U/mL。SDS-PAGE 結(jié)果表明，重組木聚糖酶在畢赤酵母中得到了表達(dá)。重組木聚糖的比活為350.6U/mg。實(shí)施例4重組木聚糖酶的活性分析DNS法具體方法如下在pH4. 0，70°C條件下，ImL的反應(yīng)體系包括100 μ L適當(dāng)?shù)?稀釋酶液，900 μ L底物，反應(yīng)lOmin，加入1. 5mL DNS終止反應(yīng)，沸水煮5min。冷卻后540nm 測(cè)定OD值。1個(gè)酶活單位(U)定義為在給定的條件下每分鐘釋放出Iymol還原糖的酶量。實(shí)施例5重組木聚糖酶XYN10J88的性質(zhì)測(cè)定1、重組木聚糖酶XYN10J88的最適pH和pH穩(wěn)定性的測(cè)定方法如下將實(shí)施例4純化的重組木聚糖酶在不同的pH下進(jìn)行酶促反應(yīng)以測(cè)定其最適pH。 底物木聚糖用不同PH的0. lmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中70°C下進(jìn)行木聚糖酶活力 測(cè)定。結(jié)果(圖1)表明，重組酶乂￥附町88的最適？!1為4.0，在？!14.0 7.0有50%以上的 相對(duì)酶活性。木聚糖酶于上述各種不同PH的緩沖液中37°C處理60min，再在pH4. O緩沖液 體系中70°C下測(cè)定酶活性，以研究酶的pH耐性。結(jié)果(圖2)表明木聚糖酶在pH 3.0-9.0 之間均很穩(wěn)定，在此PH范圍內(nèi)處理60min后剩余酶活性在70%以上，這說明此酶在酸性和 中性范圍內(nèi)具有較好的PH穩(wěn)定性。2、木聚糖酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性測(cè)定方法如下木聚糖酶的最適溫度的測(cè)定為在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(PH4.0)緩沖液體 系及不同溫度下進(jìn)行酶促反應(yīng)。耐溫性測(cè)定為木聚糖酶在不同溫度下處理不同時(shí)間，再在 70°C下進(jìn)行酶活性測(cè)定。酶反應(yīng)最適溫度測(cè)定結(jié)果(圖3)表明其最適溫度為70°C。酶的 熱穩(wěn)定性性試驗(yàn)表明(圖4)，XYN10J88有良好的熱穩(wěn)定性，在70°C下溫育lh，能保持90% 以上的酶活。3、木聚糖酶的Km值測(cè)定方法如下用不同濃度的木聚糖為底物，在檸檬酸_磷酸氫二鈉緩沖液(pH4. 0)緩沖液體系 中，70°C下測(cè)定酶活性，計(jì)算出其在70°C下的Km值。經(jīng)測(cè)定，以可溶性小麥阿拉伯木聚糖和 燕麥木聚糖為底物時(shí)的Km值分別為2. 05和2. 31mg/mL,最大反應(yīng)速度Vmax分別為443. 26和 361. 04 μ mol/min · mg。4、不同金屬離子化學(xué)試劑對(duì)XYN10J88酶活的影響測(cè)定如下在酶促反應(yīng)體系中加入不同濃度的不同的金屬離子及化學(xué)試劑，研究其對(duì)酶活性 的影響，各種物質(zhì)終濃度為1和5mmol/L。在70°C、pH4. 0條件下測(cè)定酶活性。結(jié)果表明，大 多數(shù)離子和化學(xué)試劑在濃度為Immol時(shí)重組木聚糖酶的活力沒有明顯變化。但是Ag+、Hg2+ 幾乎可以完全抑制其活力，而SDS也強(qiáng)烈抑制其活力。當(dāng)Cu2+，Cr3+，Zn2+，Pb2+，和β -巰基
9乙醇濃度為5mmol時(shí)可以部分抑制XYN10J88酶活力。5、木聚糖酶抗胃蛋白酶及胰蛋白酶能力測(cè)定如下用pH2. 0KC1-HC1緩沖液配制0. lmg/mL胃蛋白酶，pH7. OTris-HCl緩沖液配制 0. lmg/mL胰蛋白酶。取pH2. 0KC1-HC1緩沖液稀釋后的0. 5mL純化的酶液加入0. 5mL胃蛋 白酶，pH7. OTris-HCl緩沖液稀釋后的0. 5mL純化的酶液加入0. 5mL胰蛋白酶混合，蛋白酶 /木聚糖酶(w/w) ^0. 1，37°C保溫60和120min取樣，在pH4.0及70°C條件下測(cè)定酶活性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明木聚糖酶XYN10J88用胃蛋白酶和胰蛋白酶處理120min后，胰蛋白酶處理后 的XYN10J88的酶活比處理前提高了 27%，胃蛋白酶處理后的XYN10J88的木聚糖酶活性比 處理前降低了 49%。6、重組木聚糖酶的底物特異性該酶除可作用于木聚糖外，對(duì)于大麥Avicel、葡聚糖、CMC、Insoluble wheatarabinoxylan也有一定的降解作用(表2)。其對(duì)可溶性的小麥阿拉伯木聚糖的降解 能力相對(duì)于燕麥木聚糖可以達(dá)到169. 2%以上。表2.木聚糖酶XYN10J88底物特異性分析
權(quán)利要求
一種高溫酸性木聚糖酶XYN10J88，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
2.如權(quán)利要求1所述的高溫酸性木聚糖酶XYN10J88，其特征在于，序列SEQIDN0.1在 N端包含信號(hào)肽，所述信號(hào)肽的序列如SEQ IDN0. 3所示。
3.—種高溫酸性木聚糖酶基因xynlOJ88，其特征在于，所述基因編碼權(quán)利要求1所述 的高溫酸性木聚糖酶XYN10J88。
4.如權(quán)利要求3所述的高溫酸性木聚糖酶基因xynlOJ88，其特征在于，其堿基序列如 SEQ ID NO. 4 或 SEQ ID NO. 5 所示。
5.如權(quán)利要求3所述的高溫酸性木聚糖酶基因XynlOJ88，其特征在于，所述高溫酸性 木聚糖酶基因xynlOJ88包括信號(hào)肽基因序列，所述序列如SEQ ID NO. 6所示。
6.包含權(quán)利要求3所述高溫酸性木聚糖酶基因xynlOJ88的重組載體。
7.包含權(quán)利要求3所述高溫酸性木聚糖酶基因xynlOJ88的重組載體pPIC-xynlOJ88。
8.包含權(quán)利要求3所述高溫酸性木聚糖酶基因xynlOJ88的重組菌株。
9.權(quán)利要求1所述高溫酸性木聚糖酶XYN10J88的應(yīng)用。
10.瓶霉(Phialophorasp. J88)，其保藏編號(hào)為 CGMCC No. 3873。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種高溫酸性木聚糖酶XYN10J88及其基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種來源于瓶霉屬Phialophora sp.J88CGMCC No.3873的木聚糖酶XYN10J88，其氨基酸序列如SEQ ID No.1或2所示，且本發(fā)明提供了編碼上述木聚糖酶的編碼基因xyn10J88。本發(fā)明的木聚糖酶的具有以下性質(zhì)最適pH4.0，最適溫度70℃，比活為350.6U/mg；良好的蛋白酶抗性，有效的降解小麥阿拉伯木聚糖以及易于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。做為一種新型的酶制劑，可廣泛用于飼料，釀酒、食品、能源工業(yè)等。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101892208SQ201010194840
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月28日
發(fā)明者姜小偉, 楊海龍, 林格, 郝名慧 申請(qǐng)人:溫州海螺挑戰(zhàn)生物工程有限公司