專利名稱：一個調(diào)控果實采后成熟的基因及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用的制作方法
一個調(diào)控果實采后成熟的基因及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用本發(fā)明涉及香蕉檸檬酸合成酶基因(citrate synthase gene, MaCASl)序列的獲 得、表達(dá)分析和體外調(diào)控基因表達(dá)調(diào)節(jié)香蕉果實采后成熟。檸檬酸合成酶(citratesynthase, CS, EC2. 3. 3. 1)催化草酰乙酸(oxaloacetic acid, OA)合成檸檬酸(citrate acid，CA)，是三羧酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán)的關(guān)鍵酶。CS屬于調(diào)控酶，它的活性受ATP、NADH、琥珀酰_CoA、CA、長鏈脂肪酸所抑制，又能 受 AMP 禾口 OA 的促進(jìn)(Caggiano et al. , 1979 ；Mitchell et al. , 1995 ；Tabrettet al.， 2000)。根據(jù)作用位置的不同，CS在植物中大致分為兩類即線粒體中的檸檬 酸合酶(mitochondrial citrate synthase, MCS)和非線粒體中的檸檬酸合酶
(nonmitochondrialcitrate synthase, non-MCS)-包括乙醛酸循環(huán)體中的檸檬酸合酶
(Glyoxysomalcitrate synthase, GCS)，兩者在提純方法、酶動力學(xué)、穩(wěn)定性以及與線粒體 內(nèi)膜的結(jié)合率上均存在差異(Kispal et al.，1991)。Schnarrenberger (2002)對已知序列 的檸檬酸合酶進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，植物中MGCS與酵母、豬、大鼠等真核生物 較為接近，是同一來源的，而乙醛酸循環(huán)體中的檸檬酸合酶則與原核生物的進(jìn)化距離較近， 屬同一來源。隨著CS研究的深入，關(guān)于其在植物生理中作用的報道越來越多。Grzemski (2005) 發(fā)現(xiàn)MCS與植物根瘤固氮有關(guān)，酶活的降低會顯著降低根瘤固氮酶的活性； Landschuetze(1995)發(fā)現(xiàn)MCS與花藥或花粉發(fā)育相關(guān)，且與光合作用相關(guān)，在光合作用的 組織中表達(dá)較高，但在非光合作用的組織中表達(dá)量普遍偏低；在油菜、水稻、胡蘿卜等植物 中GCS與耐鋁、耐鹽、耐磷等脅迫相關(guān)(Larsen et al.，1998 ；Koyamaet al.，2000)；此外， GCS還影響能影響種子的萌發(fā)(Pracharoenwattana et al.，2005)。CS催化的產(chǎn)物CA在許 多果實中存在，影響果實的酸度和口感，所以果實中CS酶活與CA含量的關(guān)系成為果實品質(zhì) 研究者們感興趣的熱點。檸檬酸合酶基因已從南瓜(Cucurbita maxima)、水稻(Oryza sativa)和擬南芥 (Arabidopsis thaliana)等植物中被克隆，但對這些基因的更進(jìn)一步的研究未見報道。我 們(Jin et al. 2008)利用cDNA微陣列和RT-PCR分析研究香蕉采后乙烯生物合成啟動時 (采后10d)基因的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)一個與其他植物同源的檸檬酸合酶基因明顯上調(diào)表達(dá)。 推測該基因可能和香蕉過實采后成熟過程中乙烯生物合成相關(guān)，可能調(diào)控或影響香蕉果實 采后成熟過程。因此，CAS基因的開發(fā)利用，將有助于更加深入了解香蕉果實采后成熟機理， 建立更加安全、廉價、有效的果實采后保鮮新方法。為了深入研究香蕉果實采后成熟機理，建立安全、廉價、有效的果實保鮮新技術(shù)，提高果實的商品價值，分離與果實成熟相關(guān)基因并鑒定它們的功能十分必要，通過對這類 基因功能研究及調(diào)控，將對提高果實采后品質(zhì)，培育耐儲藏新品種具有重要意義。本發(fā)明提供的技術(shù)方案為構(gòu)建香蕉果實采后0天、2天抑制縮減文庫，獲得一個 與CAS基因同源性較高的差異表達(dá)檸檬酸合酶基因同源的cDNA序列，RACE技術(shù)擴增該基因 全長序列(MaCASl)。熒光定量PCR方法研究在正常成熟、乙烯誘導(dǎo)成熟和1-MCP (1-methyl cyclopropene)抑制成熟的條件下，MaCASl在香蕉果實采后不同成熟階段的表達(dá)情況。通 過體外誘導(dǎo)、抑制MaCASl的表達(dá)，研究果實成熟特性。1.香蕉果實采后2天抑制差減文庫構(gòu)建及分析采用熱硼酸法法提取香蕉采后0天和2天果實總RNA，電泳檢測RNA質(zhì)量，質(zhì)量檢 測完畢后C于-76°C備用。按照 Clontech 公司的 PCR-Select cDNA SubstractionKit, Advantage 2 PCR Kit產(chǎn)品使用說明進(jìn)行縮減雜交。抑制縮減雜交產(chǎn)物經(jīng)與pGEM_T Easy Vecter連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5 a，構(gòu)建抑制差減文庫。獲得文庫獨立克隆測序、分析。2.香蕉檸檬酸合酶基因全長序列克隆根據(jù)SSH獲得的基因片段和NCBI的比對結(jié)果可知，該基因片段為657bp，與其他植 物的檸檬酸和酶基因具有較高的同源性。用Primer Premier 5設(shè)計5' -RACE和3' -RACE 引物，以本研究室構(gòu)建的香蕉果實cDNA文庫為模板，PCR擴增5’端和3’端序列。將擴增 序列與已有的657bp序列拼接獲得基因的全長序列。根據(jù)拼接全長序列設(shè)計引物在文庫中 通過PCR擴增、測序驗證。3.熒光定量研究MaCASl與果實采后成熟的關(guān)系采后香蕉果實分設(shè)乙烯處理、1-MCP處理和正常成熟3組，提取3組中不同成熟階 段的果實總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA，熒光定量研究3中不同處理條件下MaCASl表達(dá)與成熟的關(guān) 系。4. MaGADl誘導(dǎo)劑草酰乙酸(0A)和抑制劑檸檬酸(CA)處理果實，研究體外調(diào)控基 因表達(dá)對果實成熟的影響將采后的香蕉果實按照一定濃度用草酰乙酸(0A)和檸檬酸(CA)分別處理，觀察 處理果實成熟變化，乙烯生物合成關(guān)鍵酶基因ACC氧化酶和ACC合成酶基因表達(dá)分析，測定 果實成熟相關(guān)的生理指標(biāo)，分析通過采后體外調(diào)控MaCASl的表達(dá)對果實成熟的影響。[結(jié)果分析]1.成功構(gòu)建香蕉果實采后0天和2天的抑制縮減文庫用差減PCR產(chǎn)物，以T/A克 隆法構(gòu)建質(zhì)粒載體文庫，差減文庫包括312個白色克隆，克隆飽滿清晰。應(yīng)用PCR方法對差 減文庫的312個克隆進(jìn)行篩選，獲得302個重組子，插入片段集中在300bp-500bp之間，符 合抑制縮減文庫的要求。2.成功克隆香蕉檸檬酸合酶基因全長序列對獲得的抑制縮減文庫中302個重組 測序分析，有1個與其他生物檸檬酸合酶基因具有較高同源性。根據(jù)獲得的香蕉檸檬酸合 酶基因片段設(shè)計5’端和3’端PCR引物，克隆5’和3’端序列，與原有序列拼接后利用生物 信息學(xué)軟件分析，具有完整的閱讀框架，為一個完整基因。根據(jù)拼接全長序列重新設(shè)計其5’ 和3 ’弓丨物，從cDNA文庫中獲取序列，測序驗證，它們的堿基序列完全相同，命名為MaCAS 1。 包含一個1542bp的完整開放閱讀框(序列1)，編碼513個氨基酸殘基的多肽(序列2)。與 南瓜乙醛酸循環(huán)體中的檸檬酸合酶CuGCS (登錄號為P49299)具有很高的同源性，一致性達(dá)
4到82%。與擬南芥中的CS3、CS2，水稻中的0sGCS、0sI_006349也具有很高的同源性，一致 性分別達(dá)到81%、81%、83%和77%。GenBank查找未見香蕉該基因的報道。3.MaCASl在香蕉果實采后被乙烯誘導(dǎo)表達(dá)，并可調(diào)節(jié)成熟乙烯生物合成， MaGCSl在香蕉果實正常成熟時基因表達(dá)量的變化與內(nèi)源乙烯的釋放相一致，而外源乙烯處 理，MaCASl被誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)量明顯增加且提前。1-MCP處理后MaGCSl的表達(dá)被明顯抑制 (圖1)。以上結(jié)果顯示，MaGCSl與果實采后成熟過程中乙烯生物合成密切相關(guān)，促進(jìn)香蕉 果實采后成熟中的乙烯合成可以顯著促進(jìn)MaGCSl的表達(dá)，抑制香蕉果實成熟中的乙烯合 成可以顯著抑制MaGCSl的表達(dá)。因此，推測該基因與香蕉果實采后成熟相關(guān)，對該基因的 調(diào)控將達(dá)到調(diào)控香蕉采后成熟的目的。4. MaCASl誘導(dǎo)劑和抑制劑顯著促進(jìn)和抑制該基因的表達(dá)，進(jìn)而影響果實的成熟 過程和品質(zhì)研究結(jié)果證明，草酰乙酸(OA)和檸檬酸(CA)分別能誘導(dǎo)和抑制香蕉果實成 熟，通過生理學(xué)分析顯示這種影響改變了果實顏色、硬度、芳香物質(zhì)、淀粉含量等。證實對 MaCASl表達(dá)的調(diào)控可以調(diào)節(jié)果實采后成熟(圖2、圖3)。進(jìn)一步研究顯示，MaCASl調(diào)控果 實成熟是通過調(diào)控MaACOl基因的表達(dá)來實現(xiàn)的，而MaACOl是香蕉果實采后成熟過程中啟 動MaACSl基因表達(dá)和成熟乙烯生物合成的關(guān)鍵酶基因。因此，我們推測香蕉MaCASl是香 蕉果實采后成熟過程中成熟乙烯生物合成的上游調(diào)節(jié)者，它通過調(diào)控MaACOl的表達(dá)控制 果實的成熟過程和品質(zhì)形成(圖4)。


圖1是1-MCP處理和乙烯處理條件下，利用熒光定量PCR分析MaCASl在香蕉采后不同 時期的表達(dá)圖2是OA(上)和CA(下)處理對香蕉果實采后成熟的影響圖3是0A和CA處理后熒光定量PCR分析MaCASl的表達(dá)圖4是0A和CA處理熒光定量PCR分析MaCASl、MaACOl\MaACSl的表達(dá)圖下面結(jié)合實施方式對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明1、材料來源巴西香蕉(M. AAA Group Cavendish)果實，采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶生物技術(shù)研究所實驗基地。2、方法(1)香蕉果實采后2天抑制差減文庫構(gòu)建及分析參照Ching-Yi Wan和 Thea A. ffilkins (1994)的熱硼酸法提取香蕉果實RNA。按照PCR-Select cDNA SubstractionKit，Advantage 2 PCR Kit產(chǎn)品使用說明進(jìn)行0天和2天果實RNA抑制縮減 雜交。抑制縮減雜交產(chǎn)物經(jīng)與pGEM-T Easy Vecter連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH5 a。采用PCR的 方法對重組子進(jìn)行鑒定，PCR鑒定采用試劑盒提供的引物Nested PCR 引物 1 :5’ -TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3，Nested PCR 引物 2R :5’ -AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3，以待測質(zhì)粒為模板，在Biometra型PCR儀上進(jìn)行PGR反應(yīng)。反應(yīng)條件為94°C變 性5. 0分鐘；94°C 45秒，68°C 1. 0分鐘，72°C 1. 0分鐘，擴增35個循環(huán)；72°C延伸7. 0分鐘。然后取5. 0 yl PCR反應(yīng)液進(jìn)行1. 2%瓊脂糖凝膠電泳，5v/cm恒壓條件下電泳30分鐘后， 于紫外燈下觀察重組子插入片段大小。將插入有目的片段的重組子測序、分析。(2)香蕉檸檬酸合酶基因全長序列克隆根據(jù)SSH獲得的基因片段和NCBI的比 對結(jié)果可知，該基因片段為657bp，與其他植物的檸檬酸和酶基因具有較高的同源性。用 Primer Premier 5 設(shè)計 5' -RACE 和 3' -RACE 引物，5，-RACE 引物GCS-5 :5， -GGTGCTCTGTATGGTCCTCTCCA-3，；3，-RACE 引物GCS-3 :5， -AAGGTCATCCGCAAGTTG-3，以本研究室構(gòu)建的香蕉果實cDNA文庫為模板，利用5’和3’文庫接頭引物PCR擴 增5’端和3’端序列。5’文庫接頭引物ptr5' :5， -CTCCGAGATCTGGACGAGC-3，；3’文庫接頭引物ptr3' :5， -TAATACGACTCACTCACTATAGGG-3’在0. 2mL離心管中依次加入cDNA 文庫庫液1. 0 ii L10 X Buffer (含 2. 5mM Mg2+)2. 5 u LdNTP (dA/G/C/TTP lOmMeach)0. 5 u Lptr5' (lOpM)1. Ou L5，-RACE(lOpM)1. Ou LTaq 聚合酶(55u/ u L)0. 3 u LddH2018. 7u L_總體積25. Ou LcDNA 文庫庫液1. 0 ii L10 X Buffer (含 2. 5mM Mg2+)2. 5 u L
dNTP (dA/G/C/TTP lOmMeach)0. 5 u Lptr3' (lOpM)1. Ou L3，-RACE(lOpM)1. Ou LTaq 聚合酶(5u/ u L)0. 3 u LddH2018. 7u L_總體積25.0iiL將擴增5’和3’端序列與已有的657bp序列拼接獲得基因的全長序列。根據(jù)拼接全長序列，用Primer Premier 5設(shè)計引物，交由上海生物工程有限公司 合成。其中CS L-5是上游引物，CS L-3是下游引物。CS L-5 5' -CGCTTCCCTTCCCCTTGCC-3‘CS L-3 5' -CTATGCTTATTGTTCCACGCACGAGT-3‘
以本研究室構(gòu)建的香蕉果實cDNA文庫為模板，反應(yīng)體系同上進(jìn)行PCR擴增、測序。該基因cDNA 0RF 為 1542bp bp。(3)熒光定量研究MaCASl與果實采后成熟的關(guān)系提取乙烯處理、1-MCP處理和采后正常成熟香蕉不同成熟期的果實總RNA反轉(zhuǎn)錄 cDNA用作熒光定量PCR的模板。用NCBI的保守結(jié)構(gòu)域分析軟件分析MaGADl、Ma-act in 1 2個基因的保守結(jié)構(gòu)， 確保所設(shè)計引物的擴增片段位于非保守區(qū)；然后根據(jù)熒光定量PCR的引物設(shè)計原則，用 primer premier 5 設(shè)計弓|物。MaCASl 上游引物5，-GAGTTCTTTCCTGTTCTGTTTG-3，MaCAS 1 下游引物5，-CTATGCTTATTGTTCCACGC-3，Ma-act in 1 上游引物5 ‘ -CGAGGCTCAATCAAAGA-3 ‘Ma-act in 1 下游引物5 ‘ -ACCAGCAAGGTCCAAAC-3 ‘ 在Stratagene的Mx3000P儀器上進(jìn)行熒光定量PCR。在0. 2mL的PCR反應(yīng) 管中加入 SYBR Premix Ex Taq (2 X) (TAKARA) 12. 5 u L, Rox reference Dye II(50X) (TAKARA) 0. 5 ii L、5 ii M的一對引物各0. 75 u L，cDNA樣品1 y L，然后用水補足至25 y L。每 個樣品既要用于擴增目的基因又要擴增內(nèi)參基因Ma-actinl，各個基因的擴增都做三個重 復(fù)。按照94°C預(yù)變性3min，94°C變性7s，55°C退火15s，72°C延伸20s，共40個循環(huán)的反應(yīng) 程序進(jìn)行擴增(四個基因的反應(yīng)程序是一致的)，并于每個循環(huán)的延伸階段采集熒光信號。 反應(yīng)結(jié)束后做94°C _55°C的融解曲線分析。熒光定量PCR結(jié)果證明，MaCASl表達(dá)受乙烯誘導(dǎo)、1_MCP抑制，在香蕉果實采后成 熟過程中起著調(diào)控乙烯生物合成、果實成熟的作用。(4)MaCASl誘導(dǎo)劑OA和抑制劑CA處理果實對成熟期的影響將采收的果實切割 成單蕉指，用0. 次氯酸鈉進(jìn)行表面消毒lOmin，同時把果實頂部的干花抹掉，放置一個 晚上晾干，隨機選取成熟度較為一致的香蕉果實分成3個處理正常成熟、OA處理、CA處理。 每個處理選取30-40個果實，每3個果實裝進(jìn)一個保鮮盒中。正常成熟的果實置于22°C恒 溫條件下成熟。觀察不同處理對香蕉果實采后成熟時期的影響，結(jié)果顯示OA處理明顯能縮短達(dá) 到每個成熟度的時間，促進(jìn)成熟；CA處理明顯能延長達(dá)到每個成熟度的時間，延緩成熟。
權(quán)利要求
一個分離的香蕉檸檬酸合成酶基因，其特征在于具有序列表中1項下的序列。
2.序列表中1項下的序列限定的蛋白質(zhì)，具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列或?qū)?序列的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的 氨基酸殘基序列相同活性的由序列衍生的蛋白質(zhì)。
3.草酰乙酸(OA)和檸檬酸(CA)處理香蕉采后果實，可誘導(dǎo)和抑制權(quán)利要求1中的序 列所編碼基因表達(dá)。同時，CA對果實采后成熟有抑制作用而OA對果實采后成熟有促進(jìn)作 用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個與香蕉果實采后成熟過程有關(guān)的基因MaCAS1是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的蛋白質(zhì)，具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄?的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的氨基酸殘基序列相同活性的由序列衍生的蛋白質(zhì)。該基因可被草酰乙酸(OA)和檸檬酸(CA)分別誘導(dǎo)和抑制表達(dá)，從而調(diào)控采后香蕉果實成熟度的變化。該基因的應(yīng)用對于建立香蕉采后果實成熟調(diào)控新技術(shù)和培育優(yōu)良品種具有重要的理論及實際意義。
文檔編號C12N9/10GK101851632SQ20101016623
公開日2010年10月6日 申請日期2010年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月20日
發(fā)明者劉菊華, 張建斌, 徐碧玉, 賈彩紅, 遲光紅, 金志強 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯嶒炚?br>