專利名稱：用于檢測細(xì)胞遷移的瓊脂糖凝膠微流動(dòng)腔裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物芯片領(lǐng)域，尤其涉及用于檢測細(xì)胞遷移的瓊脂糖凝膠微流動(dòng)腔裝置。
背景技術(shù)：
細(xì)胞遷移在眾多生理、病理程中扮演著重要的角色。傳統(tǒng)的細(xì)胞遷移檢測裝置有Boyden小室和Transwell小室，其技術(shù)方案為Boyden小室和Transwell小室為一種小盒 裝置，盒中以一片3 5 μ m孔徑的微孔濾膜將盒分為上、下兩小室，上室加受檢細(xì)胞的懸 液；下室加趨化因子，置37°C溫育數(shù)小時(shí)，上室中的細(xì)胞因受下室內(nèi)趨化因子的誘導(dǎo)，使細(xì) 胞由濾膜微孔進(jìn)入濾膜內(nèi)，最后取濾膜，經(jīng)固定、干燥、著染、脫色等步驟，將處理后的濾膜 置顯微鏡下對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。但是，Boyden小室和Transwell小室存在濃度梯度不穩(wěn)定及 難以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測活細(xì)胞遷移的缺點(diǎn)。Shing-Yi Cheng在A hydrogel-based microfluidic device for thestudies of directed cell migration (J)Iab on chip，2007，7 :763_769 公開了一款瓊脂糖凝膠微流 動(dòng)腔裝置，其技術(shù)方案為用光刻法將三條平行的通道印制在瓊脂糖凝膠表面，微通道末端 為儲(chǔ)液池，將印制了通道的凝膠夾持于兩塊透明平板之間形成一個(gè)“三明治”結(jié)構(gòu)。該裝置 通過在儲(chǔ)液池兩端加入不同濃度的液體產(chǎn)業(yè)濃度梯度來誘導(dǎo)細(xì)胞遷移。但是，此裝置采用 非鍵合方式導(dǎo)致其密封性差，時(shí)常發(fā)生漏液是導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。另外，該裝置也不能通過微注 射泵來調(diào)節(jié)其液體流速。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠產(chǎn)生穩(wěn)定濃度梯度的細(xì)胞遷移檢測裝置，并實(shí)現(xiàn) 實(shí)時(shí)監(jiān)測遷移結(jié)果，為實(shí)現(xiàn)該目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下用于檢測細(xì)胞遷移的瓊脂糖凝膠微流動(dòng)腔裝置，具體由以下結(jié)構(gòu)組成口字型有 機(jī)玻璃框(1)及墊在所述口字型有機(jī)玻璃框下的一塊載玻片(2)，所述口字型有機(jī)玻璃框 (1)內(nèi)灌注有厚度為0. 5 1cm、寬度為2 3cm、長度為4 6cm的瓊脂糖凝膠(3)；三條 處于同一凝膠深度的平行微通道貫穿于所述瓊脂糖凝膠(3)內(nèi)，其中位于兩側(cè)的第一通道和第三通道(5)孔徑為100 500μ m，位于中間的第二通道(6)孔徑為Imm ；所述口字 型有機(jī)玻璃框(1)的兩側(cè)壁鑿有與所述微通道(4) (5) (6)相連通的導(dǎo)入口(7)和導(dǎo)出口 (8)；進(jìn)液管(9)插入所述瓊脂糖凝膠(3)中，通過導(dǎo)入口(7)與第一通道⑷、第三通道(5) 連通；出液管(10)插入所述瓊脂糖凝膠(3)中，通過導(dǎo)出口(8)與第一通道(4)、第三通道連通。進(jìn)一步，所述進(jìn)液管(9)的游離端同雙道微注射泵連接；所述出液管(10)的游離 端同廢液管相連；進(jìn)一步，所述微通道之間的水平距離為2 5mm。本發(fā)明的有益效果為本裝置能快速產(chǎn)生穩(wěn)定的濃度梯度，且密封性好，能通過連接微注射泵來實(shí)現(xiàn)流速控制，并進(jìn)一步通過流速來控制濃度梯度達(dá)到平衡的時(shí)間。本裝置 能夠?qū)罴?xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，為僅通過染色、計(jì)數(shù)來判斷細(xì)胞遷移提供了新思路，并為細(xì)胞 遷移的后續(xù)試驗(yàn)(如血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的后續(xù)試驗(yàn)為血管生成)提供了新平臺(tái)。


圖1為瓊脂糖凝膠微流控裝置制作步驟中的排布微絲示意圖；圖2為瓊脂糖凝膠微流控裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3為無口字型有機(jī)玻璃框存在的瓊脂糖凝膠與通道的結(jié)構(gòu)示意圖；圖4在為流速為50 μ Ι/min時(shí)，三處通道的濃度梯度(灰度值)分析圖；圖5為血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移前、后的照片(20倍顯微鏡下)，圖A為遷移前的照片，圖 B為遷移后的照片，箭頭所指方向代表濃度梯度方向。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu) 選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例1.1主要材料人內(nèi)皮細(xì)胞株EA. hy926，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心； DMEM F12培養(yǎng)基，購自Invitrogen公司(美國)；胎牛血清，購自杭州四季青公司；趨化因 子；瓊脂糖凝膠，購自Advancebiomatrx公司(美國)。1.2細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞貼壁生長于含10%胎牛血清中，在37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1.3微流控裝置的制作排布微絲將內(nèi)徑長6cm、寬3cm、厚Icm的口字型有機(jī)玻璃框(1)的前、后兩側(cè)壁 進(jìn)行激光穿孔，得孔徑為Imm的導(dǎo)入口(7)和導(dǎo)出口⑶各3處，將4根管徑為Imm的鐵氟 龍細(xì)管一一插入兩側(cè)導(dǎo)入口(7)和導(dǎo)出口(8)，其中與導(dǎo)入口(7)相連的為進(jìn)液管(9)，與 導(dǎo)出口(8)相連的為出液管(10)。將1根管徑為Imm的鐵氟龍細(xì)管插入并連接位于中間的 導(dǎo)入口(7)和導(dǎo)出口(8)。兩側(cè)的進(jìn)液管(9)和出液管(10)分別通過直徑為100 μ m的細(xì) 絲(11)連接，詳見圖1。澆注固化在所述口字型有玻璃框(1)的下方墊載玻片(2)，將濃度為3%的瓊 脂糖溶液用微波爐加熱后迅速倒入口字型玻璃框(1)內(nèi)，在凝膠冷卻前保持細(xì)絲的拉直狀 態(tài)。抽絲待瓊脂糖溶液冷卻后得瓊脂糖凝膠(3)，迅速抽出連接于兩側(cè)進(jìn)液管(9)和 出液管(10)的細(xì)絲和位于中間的鐵氟龍細(xì)管，得所述用于檢測細(xì)胞遷移的瓊脂糖凝膠微 流動(dòng)腔裝置，詳見圖2和圖3。上述裝置中，第一通道⑷和第三通道(5)孔徑為100 μ m，分別為藥物趨化因子供 應(yīng)腔和緩沖液供應(yīng)腔。第二通道(6)孔徑為1mm，為細(xì)胞培養(yǎng)通道。1. 4密封性檢測將進(jìn)液管(9)的口字型有機(jī)玻璃框⑴ 外的游離端同雙道微注射泵連接，出液管(10)的有口字型機(jī)玻璃框(1)外的游離端同標(biāo)示有體積刻度的廢液缸相連。微注射泵的注 射器中裝有蒸餾水，通過計(jì)算廢液管中回收液體的體積，來計(jì)算流動(dòng)腔的密封性能，回收率 =(回收體積/輸出體積)X100%，三次回收率的結(jié)果分別為92%，95%和94%，同時(shí)通過 肉眼觀察未發(fā)生漏液現(xiàn)象，僅少量液體因滯留于進(jìn)液管(9)、出液管(10)及瓊脂糖凝膠(3) 內(nèi)。1. 5濃度梯度檢測
將進(jìn)液管(9)的口字型有機(jī)玻璃框(1)外的游離端同雙道微注射泵連接，雙道注 射泵的其中一支注射器中裝有蒸餾水，另一支注射器中裝有按標(biāo)準(zhǔn)方法配制的熒光素溶 液。微注射泵的流速設(shè)定為50 μ Ι/min，將熒光素溶液和蒸餾水接觸瓊脂糖凝膠起設(shè)定為t =O0采用倒置熒光顯微鏡(Olympus 1X51)拍攝通道中的熒光強(qiáng)度圖像，實(shí)驗(yàn)前十分鐘內(nèi) 每十分鐘拍照一次，一小時(shí)后，每5分鐘拍照一次。將拍攝的照片用Photoshop進(jìn)行進(jìn)行灰 度處理，用灰度值代表熒光強(qiáng)度并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。在較短的時(shí)間內(nèi)，位于第一通道(4)和第 三通道(5)之間的瓊脂糖凝膠(3)各處熒光強(qiáng)度達(dá)到平衡穩(wěn)定狀態(tài)，形成穩(wěn)定的濃度梯度， 詳見圖4。1. 6趨化因子濃度梯度誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移將制作好的微流動(dòng)裝置滅菌后，用50ug/mL的纖粘蛋白(Fn)對第二通道(6)進(jìn)行 裱襯。將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行消化，吹散打勻，通過注射泵將密度為4X104個(gè)/ml的 細(xì)胞懸液40 μ 1—分鐘內(nèi)泵入到第二通道(6)內(nèi)，然后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，待大部分細(xì) 胞貼壁后用PBS沖洗未貼壁的細(xì)胞。換入新鮮培養(yǎng)基。同時(shí)，第一通道(4)用微注射泵注 入趨化因子溶液，第三通道(5)用微注射泵注入緩沖液，從而使位于第一通道(4)和第三 通道(5)之間的第二通道(6)保持恒定的濃度梯度。用顯微鏡觀察趨化因子濃度梯度建立 6h后血管內(nèi)皮細(xì)胞較初始狀態(tài)的遷移情況，將第二通道(6)劃分為四等分，統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)后每 個(gè)區(qū)間的細(xì)胞數(shù)目，與初始細(xì)胞數(shù)目相比較，最后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，詳見圖5。遷移后的圖5-B 中，圖片從左到右的順序?qū)澐值乃牡确址謩e標(biāo)示為1、2、3、4區(qū)，其中1區(qū)大約有7%細(xì)胞 數(shù)量減少、2區(qū)大約有3%的細(xì)胞數(shù)量減少，而3區(qū)大約有9%細(xì)胞數(shù)量增加、4區(qū)大約有2% 的細(xì)胞數(shù)量增加。本權(quán)利要求書和說明書中技術(shù)方案中包含“三條處于同一深度的平行直線微通 道貫穿于所述瓊脂糖凝膠(3)內(nèi)”，它可以理解為微通道被包埋于瓊脂糖凝膠而非暴露于瓊 脂糖凝膠的表面，而采用光刻法制作的微流控芯片通常為印制在材料(聚二甲基硅氧烷、 凝膠)的表面。另外，本實(shí)施例中選用血管內(nèi)皮細(xì)胞為對象進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn)，公知常識可知血 管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生遷移現(xiàn)象的時(shí)間長于其他細(xì)胞，在穩(wěn)定的濃度梯度誘導(dǎo)條件下，運(yùn)用本裝 置可以檢測出血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，同樣也能檢測其他遷移時(shí)間較短的細(xì)胞的遷移。另外， 本實(shí)施例中裝置的大小及通道的尺寸根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有材料而設(shè)定的，可以在不花費(fèi)創(chuàng)造 性勞動(dòng)的前提下變換裝置的大小及通道的尺寸而不影響實(shí)驗(yàn)效果。最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參 照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可 以在形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明 的精神和范圍。
權(quán)利要求
用于檢測細(xì)胞遷移的瓊脂糖凝膠微流動(dòng)腔裝置，其特征在于所述瓊脂糖凝膠微流動(dòng)腔裝置包括口字型有機(jī)玻璃框(1)及墊在所述口字型有機(jī)玻璃框下的一塊載玻片(2)，所述口字型有機(jī)玻璃框(1)內(nèi)灌注有厚度為0.5～1cm、寬度為2～3cm、長度為4～6cm的瓊脂糖凝膠(3)；三條處于同一凝膠深度的平行微通道貫穿于所述瓊脂糖凝膠(3)內(nèi)，其中位于兩側(cè)的第一通道(4)和第三通道(5)孔徑為100～500μm，位于中間的第二通道(6)孔徑為1mm；所述口字型有機(jī)玻璃框(1)的兩側(cè)壁鑿有與所述微通道(4)(5)(6)相連通的導(dǎo)入口(7)和導(dǎo)出口(8)；進(jìn)液管(9)插入所述瓊脂糖凝膠(3)中，通過導(dǎo)入口(7)與第一通道(4)、第三通道(5)連通；出液管(10)插入所述瓊脂糖凝膠(3)中，通過導(dǎo)出口(8)與第一通道(4)、第三通道(5)連通。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測細(xì)胞遷移的瓊脂糖凝膠微流動(dòng)腔裝置，其特征在 于所述進(jìn)液管(9)的游離端同雙道微注射泵連接；所述出液管(10)的游離端同廢液管相 連。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測細(xì)胞遷移的瓊脂糖凝膠微流動(dòng)腔裝置，其特征在 于所述微通道之間的水平距離為2 5mm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測細(xì)胞遷移的瓊脂糖凝膠微流動(dòng)腔裝置，包括口字型有機(jī)玻璃框(1)及墊在所述口字型有機(jī)玻璃框下的一塊載玻片(2)，所述口字型有機(jī)玻璃框(1)內(nèi)灌注瓊脂糖凝膠(3)；三條處于同一深度的平行微通道貫穿于瓊脂糖凝膠(3)內(nèi)，口字型有機(jī)玻璃框(1)的兩側(cè)壁鑿有導(dǎo)入口(7)和導(dǎo)出口(8)；進(jìn)液管(9)和出液管(10)通過導(dǎo)入口(7)和導(dǎo)出口(8)插入凝膠中，與兩側(cè)的微通道(4)(5)相連；本裝置制作工藝簡單，密封性好，能在較短的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生穩(wěn)定的濃度梯度，可廣泛運(yùn)用于各類細(xì)胞遷移試驗(yàn)中。
文檔編號C12M1/34GK101858844SQ20101016403
公開日2010年10月13日 申請日期2010年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月6日
發(fā)明者熊新 申請人:重慶醫(yī)科大學(xué)