專利名稱：一種提高紅霉素產量的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于鏈霉菌技術領域，具體涉及高產紅霉素菌株的選育、中間載體的構建和利用培育的突變菌株提高紅霉素產量的方法。
背景技術：
自1943年以來，青霉素應用于臨床，現(xiàn)抗生素的種類已達幾千種。在臨床上常用的亦有幾百種。其主要成份都是從微生物的培養(yǎng)液中提取制造的。微生物培養(yǎng)液中產生抗生素濃度的多少很大程度上決定了該抗生素生產成本的高低。因此自從抗生素發(fā)現(xiàn)以來人們就一直不斷地用各種方法篩選高產抗生素的菌種。目前，提高抗生素的產量的方法主要有兩大類，一類是通過物理化學方法對菌種進行誘變，然后在誘變后代中篩選高產菌株；另一類是通過分子生物學的方法，對菌株進行直接的遺傳改變，提高抗生素的產量。通過物理化學方法對菌種進行誘變有一定的肓目性， 篩選工作量大，但不需要對細胞的遺傳背景有很深入的了解。這用來提高抗生素產量的廣泛采取的方法，大部分抗生素工業(yè)生產應用的菌種都是通過這種方法得到的。這些高產菌株是人類社會勞動發(fā)展積累的寶貴財富。目前，隨著細菌基因組研究的不斷深入，對細菌基因功能認識的不斷深刻，人們越來越傾向于用分子生物學的手段對菌株進行改造。用分子生物學的方法可以將功能已知的基因進行改造，增強了針對性，而且工作量大大降代，篩選時間也得到了縮短。然而，人類對微生物基因功能的研究，往往是基于抗生素產量很低的野生模式菌株。以這個菌株為背景得到抗生素合成調控或前體供應相關的信息用于自身菌株是能明顯地提高野生模式菌株的產量。但把相關操作轉移到工業(yè)應用生產的菌株之中，效果很多情況下并不明顯。這是由于工業(yè)生產菌株經(jīng)過一代又一代的隨機誘變篩選后，遺傳背景已經(jīng)和模式菌株有很大的差別，在模式菌株得到的相關調控信息并不一定適用于生產菌株。而正是由于高產菌株遺傳背景的多樣性，在現(xiàn)實中很難找出一個抗生素高產的模式菌，能夠代表所有高產菌株的特性而進行研究。因此這是對經(jīng)隨機誘變篩選產生的高產菌株進行基因工程改造提高產量的一個障礙。在已知的微生物所產生的抗生素中，約2/3由放線菌產生，而其中的80%來源于鏈霉菌。而鏈霉菌抗生素生物合成相關基因在染色體或質粒上往往成簇排列，構成基因簇。 其通常包括抗生素的生物合成基因，耐藥基因，轉運基因和調節(jié)基因。這些抗生素生物合成相關基因在染色體或質粒上成簇排列的特性為我們研究這些基因的結構，調控表達與進行基因克隆提供了方便。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的缺陷，提出一種提高紅霉素產量的方法。它利用紅霉素生物合成的相關基因在染色體上成簇排列的特性，克隆紅霉素生物合成整個基因簇的片段并再導入到親本細胞中，使突變細胞紅霉素合成基因的拷貝數(shù)增加，從而使這些基因在細胞中高于原始菌株所見的水平進行表達進而達到提高紅色糖多孢菌中紅霉素產量的目的。實踐證明，本方法簡便易行，不需要對抗生素合成的調控機理進行深入研究。即克服了物理化學誘變育種的盲目性和工作量的不足，又解決了在現(xiàn)有基因工程方法改造已經(jīng)經(jīng)過多輪誘變育種菌株的不確定性。不但能用于遺傳背景清楚的模式菌，還可以用于遺傳背景雜亂的高產誘變菌，是一種通用的提高抗生素產量的方法。本發(fā)明提供的在紅色糖多孢菌中提高紅霉素產量的方法流程圖如圖1所示，首先，從紅霉素產生菌的基因組文庫篩選出含有完整或部分紅霉素生物合成基因簇的克隆。 第二步，將第一步得到的重組載體通過接合轉移或其它方法轉移到親本菌株中。第三步，采用抗性篩選得到重組載體整合到親本細胞染色體中的突變菌株。第四步，采用Southern雜交或PCR擴增，驗證第三步得到的突變菌株。第五步，測試經(jīng)第四步驗證正確的突變菌株產紅霉素的能力，得到紅霉素高產的突變菌株。


圖1利用在紅色糖多孢菌中增加紅霉素合成基因簇拷貝數(shù)來提高紅霉素產量的流程圖。圖2表示表示一種示例性柯斯載體P0J436的結構，其包含OC31整合酶基因序列、噬菌體附著位點attP序列及構建柯斯黏粒文庫所必需的cos位點序列。圖3表示實施例中黏粒C5所包含紅霉素生物合成基因簇片段的結構示意圖。圖4表示對原始菌株S. erythraea HL3168 E3_attB和重組菌發(fā)酵液進行效價測
定結果。符號說明附圖1中，Southern雜交為DNA雜交；PCR為聚合酶鏈式反應。附圖 3 中，C5 cosmid 為黏粒 C5。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的，下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室指南(New York Co Id Spring HarborLaboratory Press， 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用，但不能限制本方面的內容。實施例1利用增加紅霉素生物合成基因簇內大部分基因的拷貝數(shù)，提高紅色糖多孢菌(S. erythraea HL3168E3-attB)產紅霉素的能力。涉及紅霉素生物合成的基因簇約有561Λ的堿基對，而以柯斯載體為母體構建的基因文庫只能容納不超過501Λ堿基對的基因片段。本實施例中倍增了紅霉素生物合成基因簇561Λ堿基對中的451Λ基因片段。本實施例采用柯斯載體p0J436作為構建基因文庫
4的母體。P0J436除了包含噬菌體包裝蛋白所識別的cos位點外，其質粒骨架上已經(jīng)包含有 OC31整合酶及對應attP序列，并含有屬間接合轉移元件oriT (圖幻。由其構建的黏?？芍苯油ㄟ^OC31介導的位點特異性重組整合進基因組中的attB靶序列中。1.包含有紅霉素生物合成基因簇大部分片段載體C5的構建首先限制性內切酶Sau3AI部份酶切紅色糖多孢菌總DNA，然后把總DNA經(jīng)蔗糖梯度離心，得到的DNA片段略大于401Λ，脫磷。p0J436先用BglII從兩個cos序列中間切開并脫磷，然后再從多克隆位點處用BamHI切開，獲得兩個臂，與制備的401Λ的DNA片段連接過夜。取連接產物與噬菌體包裝蛋白包裝，轉染大腸桿菌E. coli印i300，得到文庫。通過文庫篩選，獲得包含有紅霉素生物合成基因簇內約451Λ片段大小的黏粒C5。 黏粒C5包含有紅霉素聚酮合成酶(1 完整的基因序列及部分負責糖合成和后修飾的相關基因序列，右側以糖基轉移酶基因eryCIII為邊界，左側以甲基化酶基因eryK之外的兩個ORF為邊界。其基因結構圖見圖3，其詳細序列信息見SEQ ID NO :1。2.將重組載體黏粒C5通過接合轉移的方法導入紅色糖多孢菌 S. erythraeaHL3168E3-attB(見中國專利，申請?zhí)?200910194419. 4)中。培養(yǎng)含有黏粒C5 的 E. coli ET12567 (pUZ8002)至 OD600 = 0. 5-0. 6，25mL 培養(yǎng)液中的細菌細胞離心收集，用等體積的LB洗兩次，重懸于2mL LB中，作為大腸桿菌供體細胞。 取適量凍存于_80°C的S. erythraea HL3168E3的20%甘油孢子懸液500 μ L，用等體積的 TES buffer洗兩次，重懸于等體積的TES buffer，50°C熱激IOmin使孢子萌發(fā)。再加等體積的TSB，37°C溫育2Hir。離心重懸于0. 5-lmL LB中作為鏈霉菌受體細胞。將不同濃度的受體細胞100 μ L與等體積的供體細胞混合直接涂布在含有IOmMMgCl2的MS平板上，30°C 培養(yǎng)20hr后，采用無菌水輕輕洗滌平板表面以洗去大部分大腸桿菌，在每一平板的表面覆蓋含萘啶酮酸(終濃度為50ng/yL)和相應抗生素的ImL無菌水。30°C培養(yǎng)5天以上挑取接合子。篩選含有阿普拉抗性的接合子。3.提取含有阿普拉抗性的接合子染色體DNA，采用PCR驗證。PCR驗證引物為引物對1 上游5-GACGCTGTTCCACTCCTACGCC-3(SEQID NO 2)下游5-CAGGGCGAGCAATTCCGAGA-3(SEQID NO 3)引物對 2 上游5-CAGAGCAGGATTCCCGTTGAG-3(SEQID NO 4)下游5，-CGCCCGCCACGTACATCTCA-3(SEQ ID NO 5)分別把經(jīng)引物對1和2擴增的PCR產物連接T載體，進行核酸測序，測序結果與預期相符，證明黏粒C5定向插入至染色體細菌附著位點attB中。4.將重組菌株和對照菌株接種到搖瓶發(fā)酵，通過抑菌圈法測定紅霉素發(fā)酵液生物效價。搖瓶發(fā)酵條件如下紅霉素工業(yè)生產菌株HL3168E3和它的重組菌株在斜面培養(yǎng)基[/L :10g玉米淀粉， IOml玉米漿，3g氯化鈉，3g硫酸銨，5g碳酸鈣，pH 7. 0，2g瓊脂粉]，34°C培養(yǎng)7天生長孢子，作為液體發(fā)酵的種子。液體發(fā)酵時，從斜面培養(yǎng)基上取Icm2大小方塊接入50ml發(fā)酵種子培養(yǎng)基[/L :50g 玉米淀粉，18g黃豆餅粉，13ml玉米漿，3g氯化鈉，1. 2g硫酸銨，1. 2g硝酸銨，5ml豆油，6g碳酸鈣，pH 6. 8 7. 0]，在34°C，250rpm培養(yǎng)2天。然后將5ml的種子培養(yǎng)液轉接到50ml發(fā)酵培養(yǎng)基[/L:40g玉米淀粉，30g黃豆餅粉，30g糊精，2g硫酸銨，IOml豆油，6g碳酸鈣，pH 自然]，在34°C，250rpm培養(yǎng)6天。接種24小時后補加0. 5ml的正丙醇。生物效價測定如下取直徑約90mm，高16_17mm的平底雙碟，分別注入加熱融化的培養(yǎng)基20ml，使在碟底內均勻攤布，放置水平臺上使凝固，作為底層，另取培養(yǎng)基適量加熱融化后，放冷至 48-50°C，加入短小芽孢桿菌菌懸液適量，搖勻，在每一雙碟中分別加入5ml，使在底層上均勻攤布，作為上層含菌層。放置水平臺上冷卻后，在每一雙碟中以等距離安置不銹鋼小管 (內徑6. Omm士0. 1_，高1.0士0. 1_，外徑7.8士0. Imm)四個，用瓦蓋覆蓋備用。將樣品分成高低兩個濃度以磷酸緩沖液進行適當稀釋后加入牛津杯。高低濃度的稀釋倍數(shù)為2 1 或4 1，二劑量法標準溶液的高濃度所致的抑菌圈直徑在18-22mm以內，抗生素濃度范圍為5-20單位/ml。37°C培養(yǎng)14-16小時后，測量抑菌圈大小。[稀釋緩沖液磷酸氫二鉀5.59g與磷酸二氫鉀0.41g加水至1000ml，過濾，115°C 滅菌 30min。pH = 7. 8]效價的計算標準品(S)試驗品(T) AT是T的估計效價效價PT生物檢定將T和其S在相同的試驗條件下同時對生物或離體器官等的作用進行比較，通過對比計算出它們的等反應效呈比值(R)，以測得T的效價PTR是S和T的等反應劑呈(dS，dT)的比值，即R = dS/dTM是S和T的對數(shù)等反應劑呈(XS, XT)之差，即M = IgdS-IgdT = XS-XTR = ant i IgMPT是通過檢定測得T的效價含量，稱T的測得效價，是將效價比值(R)用T的估計效價AT校正之后而得，即PT = AT*R或試驗品效價=Q*估計效價Q = Iog-I[(T2+T1-S2-S1)*I/(T2+S2-T1-S1)I為高劑呈與低劑呈之比，I為4 1時IogI = 0. 6021 2 1時IogI = 0. 3010S2 高劑呈標準品的抑菌圈半徑Sl 低劑呈標準品的抑菌圈半徑T2 高劑呈試驗品的抑菌圈半徑Tl 低劑呈試驗品的抑菌圈半徑]分析測定發(fā)酵液中紅霉素的效價如圖4所示，在所述搖瓶條件下，整合了 C5黏粒即增加了紅霉素聚酮合成酶一個拷貝數(shù)的菌株產生比其原始對照菌株多近40%的紅霉素。
SEQ ID NO 1
<110>中國科學院上海有機化學研究所，華東理工大學
<120> 一種提高紅霉素產量的方法
<130>
<160>13
<170>Patent In version 3.3
6<210>1
<211>
<212>DNA
<213> 紅色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea HL 3168 E3) <400>1
tctgcgttgcagcgactgcggatggatcgagaagaactcacgcaagagccaagctgagtt60CgtCtgCgtgtcctgcggtttcacctgcaacgctgacctgaacgcctcgatcaacgtcgc120ggcaggacatgccggagggacaacaacgacccctggtcgttcacgtgtccgtgaacctca180actcgccctccggtgagttggaatcccccgcctccaggcgagggaggatgtcaaatccag240aagacaccggtggtcttcgacggggagctgacgctgctgcccatggggcagtacctgcac300cgcgccctcggcggcgactacgtcgccctcgccgccacgcacaccggcaccagcgccccc360gagatagagctcgacgacagcagcgacagcggcttcgccgttcgggaggtggatctgccc420gcaccggaggacggaagcatcgaggccgcggccgtcgcggcgcgcatcggaacgggcctc480gtcgacctgcgcgcgcaagctcccggcctggaccggatccgctcccagagcacgtggatg540cggacgccgctgcgcgacgcgttcgacgccgtgctcactgttcccaccgccaccgcggaa600gtctcgacacCCCgtCCggCgcgcgactaagctcaagatcgcgacgcgtgttcgccgacg660tggaaacgacCtgCtgCgCgaggagaacgttgaccaccatcgacgaagttcccggcatgg720ccgacgaaaccgcactcctcgactggctgggcacgatgcgcgagaagcagCCggtgtggC780aggaccggtaCggCgtgtggcacgtcttccgccacgccgacgtccagacggtgttgcgcg840acaccgccacgttctcctccgacccgacccgcgtcatcgagggcgcgagcccgacgccgg900gcatgatccacgagatcgacccgccggagcaccgcgccctgcgcaaggtcgtcagcagcg960ccttcaccccgcgcaccatctccgacctcgaaccccgcatccgcgacgtcacccgctcgc1020tgctggccgatgccggcgagagcttcgacctcgtcgacgtgctcgcgttcCCgCtgCCgg1080tcacgatcgtcgcggagctgCtgggCCtgCcgccgatggaccacgagcagttcggcgact1140ggtcgggtgccctggtcgacatccagatggacgacccgaccgacccggcgctggccgaac1200ggatcgcggatgtgctcaacccgctcaccgcgtacctgaaggcccgctgcgccgagcgcc1260gcgccgatcccggcgacgacctgatctcccgccttgtcctggccgaggtcgacgggcgcg1320cgctcgacgacgaggaggcggccaacttctccaccgcgctgctgctggccggccacatca1380ccacgaccgtcctgctcggcaacatcgtgcgcaccctcgacgagcacccggcccactggg1440acgccgccgccgaggaccccggccggatcccggcgatcgtcgaggaggtcctgcgctacc1500ggccgccgttcccgcagatgcagcgcacgacgaccaaggccaccgaggtcgcgggcgtgc1560ccatcccggccgacgtcatggtcaacacctgggtgctctcggccaaccgcgactccgacg1620cccacgacgaccccgaccggttcgacccgtcgcgcaagtcCggCggCgCCgcgcagctct1680ccttcggccacggcgtgcacttctgcctcggcgcgcccctggcccggctggagaaccgcg1740tggcgctggaggagatcatcgcccggttcgggcggctcaccgtcgaccgcgacgacgagc1800gcctgcgccacttcgaacagatcgtgctcgggacccgtcaCCtgCCggtgctggcgggct1860cctcgccgaggcagtcggcgtagtcgggcagcatccctcgCCgCCtggCggtctccaggt1920ccacggccacCgtgtCgCggtcggagagcacgacctccaggtccgcgggccacggcagac1980ccagcgcggggtcgaacgggtcgatcgcctgctcgtactcggccacgtacggcgtgctga2040ccaggtacgacatcagggtgtcgtcctcaagcgcgaggaaggcgtgcgcggtgcccctgg2100ggaagtagaccgcccggaagtgctcggtgtccatctccaccgcgtcccacttcccgaacg2160tcggcgagccgacccggatgtcgacgatgacgtcgagcgcCCggCCgCgCgcgcagtaga2220cgtacttgcaCtgCCCCggCggggtggtggtgaagtgcagcccgcgcagcacgccccggg2280cggagacgatgtggttcatctgggcgacggggaaccgatggcccaccgcgcccacgaacg2340cctcgtcctgcagcggagacacgaacaggcCCCgCCggtCCtgCttCgggtcgggggtga2400actcgaaaccgcccgccaccgccagctcacgtactcgcaactccggttcaccttccgcgc2460aggaagccgcggtggtcctcccacccgtcggcgatgtctcgttcgagctggttgagccgt2520gcggtcaccgactggtcgaagccgtcgaggaagtactcgtCgCCggggCggggctgcacg2580ccctcgttctccagcacgaagttctccaccacctcgcgcaggctggtcgacggggtgacc2640cggcccgcgatgtagcgggtggcgccctccagctccgggaagcccgcctcgcggtagagg2700tagacgtcgccgagcaggtcgatctgcaccgcgacctgggggtgcgcggtgggacgcatc2760gtctccggccggatgcgcagcagctcggcgtccacaccccgccgcaggctctccagggcg2820tagcccaggtcgatgtgcatgcccggggtcCgCtCggCggcgtagtcgacgaaccgcacc2880aggccctcgcgcagctcgttgcgctcggagtccgacagccggccgtcgtcgcggccgctg2940tagtcctcgcgcaccgtcacgaagtccagcggccgttgcgggctggactcgttgagctcg3000gcgatgaagtcgacgaggtcggtgagccggtcggcccgtcccggcaggatgatgtggttg3060aagccgagccggatcggcgcgtcccgctcggcgcgcatccgcaggaagccctgcaggttc3120ttcttgacgcgttcgaaagcgccgcgcttgCCggtggtCgtctcgtactcgtcgttgttc3180agcccgtagagggacgtgcggatcgcgcccagctcccacaggccgggctggcggttcagc3240gtctgctcggtgagggcgaaggcgttggtgtagacggtgaggtcgaaaccgcgcccggcg3300gcgtgcgacaccagctcgccgagaccggggttggtcagcggctcgagcccgcccgacatg3360tacatcgccttcgggttgtccgtgggcacctcgtcgatgatcgcggccagcgtctcgttg3420cccgccgggaccgatgcggcctcgtagcgggcaccggtcacccgcacgcagaagtggcag3480cggaacatgcacgtcggcccggggtacaggccgacgctgtaggggaaggcaggcttgcgg3540tagaccgccgcgtccagtgcgcctgcggcgtccagcggcttgatcgtgttggaccagtac3600ttgcccgccggaccgtgctccaccgcggtgcccaggtccgggatgcggccgaacaggtcg3660agcaggtgggcgaactccgcgcggtccaggccgagccgcgcacgcgtctgctccagcggc3720gtgaacgggtgcgccccgtagtgcgcggcgaggtcggcgagccgggcggcctgcacgtcg3780gcgtcaccgtcaccggcgccggtgacgcgggagacctccgagctcagcgcccgcacgacc3840gcccgccggtcgacgtccgggcgcgccgcgtcggcgacccccgcttcctgggcggttgcc3900gtacgagttgtgttcatcggggagcgaacctcctggcacttgtggcgcaggtcgtcacga3960accgttgcgcgtcctctggtcccattgcgcgttgatcagctcgccgctggtggcggcgag4020ccggatgatgtcgcacacccgccggatgtcctcgctggacaccgcggggccggtgggcag4080cgcgagcacccggtcggagagctgttcggtgttctccagccgcagcggcggctcggtccg4140gtacggctgcatctggtggcacccgggggagaagtagggttgtgccacaaccttctccgc4200tcgcaggatcgcctgcaactggtcgcggtcgatgccggtggccgcggagtccaccgagat4260gatcacgtactggtagttgttctgctcgccaggatcgaacgcgtgcacggatatgccgcg4320cacgtcgcggagctcgtcggagtagagcgcgtggttgaggcggttgtgcaccctggtctc4380
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權利要求
1.一種用于提高紅霉素產量的方法，該方法包括將紅霉素生物合成相關的部分或者全部基因導入親本菌株的基因組，使突變菌株基因組中有至少兩個拷貝的編碼紅霉素生物合成基因序列；在有助于合成紅霉素的條件下培養(yǎng)親本菌株和突變菌株時，突變菌株紅霉素的產量比親本菌株更高。
2.如權利要求1所述的方法，其特征所述的菌株為紅色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)0
3.如權利要求1所述的方法，其特征是所述的編碼紅霉素生物合成基因特指涉及紅霉素次級代謝生物合成基因簇的相關之基因。
4.如權利要求1所述的提高紅霉素產量的方法，具體步驟如下(a)從紅霉素產生菌的基因組文庫篩選出有完整或部分紅霉素生物合成基因簇的克隆，從而得到有紅霉素生物合成基因簇片段的重組載體；(b)將(a)步驟得到的重組載體通過屬間接合轉移轉移到該紅霉素產生的親本菌株中；(c)抗性篩選得到重組載體整合到親本細胞染色體中的突變菌株；(d)采用Southern雜交或PCR擴增，驗證(c)步驟得到的突變菌株；(e)測定(d)步驟中驗證正確的突變菌株的產紅霉素能力，得到紅霉素高產的突變菌株。
5.如權利要求4所述的方法，其特征是步驟(a)中所述的有紅霉素生物合成基因簇片段的重組載體，此重組載體除采用文庫篩選得到外，還包括通過PCR擴增克隆或噬菌體介導的基因重組的方法得到。
6.一種如權利要求5所述的方法，其特征是步驟(b)中所述的將重組載體轉移到親本菌株的方法，除了采用屬間接合轉移外，還包括用原生質體融合和電穿孔的方法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種在紅色糖多孢菌中提高紅霉素產量的方法。本發(fā)明通過在紅色糖多孢菌染色體中增加一個或多個與紅霉素生物合成相關基因簇的拷貝數(shù)，從而使這些基因在細胞中高于原始菌株所見的水平進行表達進而提高紅霉素的產量。
文檔編號C12N15/63GK102234674SQ20101015446
公開日2011年11月9日 申請日期2010年4月23日 優(yōu)先權日2010年4月23日
發(fā)明者劉 文, 吳杰群, 張嗣良, 張慶林, 鄧瑋 申請人:中國科學院上海有機化學研究所, 華東理工大學