專利名稱：一種l-2-氨基丁酸的生產(chǎn)方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體地說，是關于一種L-2-氨基丁酸的生產(chǎn)方法。
背景技術：
L-2-氨基丁酸，英文名為 L(+)-2-Aminobutyric acid，分子式為 C4H9N02，CASNo. 為1492-24-6，是一種非天然的手性α-氨基酸，是新型抗癲癇藥一左乙拉西坦的主要生產(chǎn)原料。左乙拉西坦是比利時UCB(優(yōu)時比)公司開發(fā)研制的一種新型抗癲痢藥，于2000 年4月獲得FDA批準，在美國和歐盟上市，主要用于治療局限性及繼發(fā)性全身性癲癇。目前在全球超過66個國家和地區(qū)上市，全球有超過100萬人的治療記錄，是目前美國癲癇治療中應用最多的新型抗癲癇藥物。2007年3月10日正式在中國上市。隨著左乙拉西坦的推廣，L-2-氨基丁酸需求量也在以每年15%的速度遞增。據(jù)IMS Health (艾美仕市場調(diào)研咨詢公司)銷售數(shù)據(jù)顯示，截至2007年9月份，其片劑全年銷售額約為13. 58億美元，是一個重量級的藥物。2009年該藥物的專利保護到期，市場需求量大幅增加，作為關鍵中間體的 L-2-氨基丁酸的市場需求也隨之增加。L-2-氨基丁酸也是合成抑菌抗結核藥乙胺丁醇的關鍵手性前體，其作為合成手性藥物的手性元，已成為多種手性藥物的重要手性中間體。在對于酶法生產(chǎn)L-2-氨基丁酸的研究中，轉氨酶法是目前報道較多的方法。早期， Rozzell等采用各種酮酸和谷氨酸為底物，在氨基酸轉氨酶(aromaticaminotransferase) 的作用下生成L-2-氨基丁酸，但是由于轉氨是一種動態(tài)平衡，轉化反應的收率只有50%。 他們繼而對這一工藝進行了改進，引入乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase)，提高了收率[Rozzell, J. , Production of L-amino acids bytransamination. 1985, US Patent 4518692]。i^theringham等在Rozzell等人研究的基礎上，以L-蘇氨酸為原料，建立了三酶體系制備L-2-氨基丁酸的方法，其中，三酶體系為蘇氨酸脫氨酶、芳香氨基酸轉氨酶、 乙酰乳酸合成酶。如圖1所示，通過蘇氨酸脫氨酶的作用生產(chǎn)丁酮酸，丁酮酸在芳香氨基酸轉氨酶的作用下，以天冬氨酸為氨基供體轉化為L-2-氨基丁酸，天冬氨酸轉化為2-氧代丁二酸，2-氧代丁二酸自發(fā)脫羧形成丙酮酸，丙酮酸在乙酰乳酸合成酶的作用下形成了乙酰乳酸，乙酰乳酸自發(fā)脫羧后形成3-羥基-2- 丁酮。以該法生產(chǎn)L-2-氨基丁酸，轉化率只有M%，濃度只有20多g/L，而且轉化時產(chǎn)生一定量的副產(chǎn)物NH3、L-丙氨酸和3-羥基-2- 丁酮，且由于L-2-氨基丁酸與副產(chǎn)物L-丙氨酸性質(zhì)相似，影響L-2-氨基丁酸進一步純化[Fotheringham, I. , et al. , Engineering of a novel biochemicalpathway for the biosynthesis of L-2-aminobutyric acid in Escherichia coli K12. Bioorganic & medicinal chemistry,1999. 7(10) :p. 2209-2213.]。氨基酸氧化酶法以化學合成的混旋2-氨基丁酸為底物，使用D-氨基酸氧化酶在金屬催化劑的作用下制備L-2-氨基丁酸，分離收率可達95%以上Potheringham， I.，et al.，Preparative deracemization of unnatural amino acids. Biochemical SocietyTransactions, 2006. 34 :p. 287-290.],由于化學合成混旋2-氨基丁酸的成本較高，特別是金屬催化劑的成本高，所以該路線并不適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
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脫氫酶法以丁酮酸為底物，在亮氨酸脫氫酶或者纈氨酸脫氫酶作用下生成 L-2-氨基丁酸[Kulaa, Μ. , Enzymatic reduction of a-keto acids leading to L-aminoacids, D~or L-hydroxy acids. Journal of Biotechnology,1997. 53 :p. 29-39 ； Hyun, C. , et al. , Valine dehydrogenase from Streptomyces albus :gene cloning, heterologousexpression and identification of active site by site-directed mutagenesis. FEMSmicrobiology letters，2000. 182 (1) :p.四_34·]。氨基酸脫氫酶以NADH作為輔酶，所以在轉化體系需耦合輔酶的再生體系。Degussa使用酶膜反應器使得輔酶可以循環(huán)使用[Liese，Α.，K. Seelbach, and C. Wandrey, Industrial biotransformations. 2006 :Vch Verlagsgesellschaft Mbh. ]，{0 , I^S61 ^zfe, ^^g 采用價格昂貴且不穩(wěn)定的丁酮酸為底物，所以工業(yè)生產(chǎn)的成本較高。氨基?；阜ㄉa(chǎn)L-2-氨基丁酸是國內(nèi)多數(shù)生產(chǎn)廠家采用的非天然手性氨基酸生產(chǎn)工藝。一般以化學法生產(chǎn)消旋氨基酸，然后以市售的L-氨基?；高M行拆分獲得 L-氨基酸，一次拆分的收率最高只有 50% [Bodalo, A.，et al.，Kineticcalculations in the enzymatic resolution of DL-amino acids. Enzyme and MicrobialTechnology, 1999.24(7) :p.381-387 ；ffakayama, Μ. , et al. , Production of d-aminoacids by N-acyl-d-amino acid amidohydrolase and its structure and function. Journalof Molecular Catalysis. B, Enzymatic, 2003. 23 (2-6) :p. 71-85]。國外也開發(fā)了乙酰氨基酸消旋酶 / 氨基酰化酶法生產(chǎn)工藝[Tokuyama, S.，Discovery and application of anew enzyme N-acylamino acid racemase. Journal of Molecular Catalysis. B. Enzymatic, 2001. 12(1-6) :p. 3-14 ；Su, S. and C. Lee, Cloning of the N-acylamino acidracemase gene from Amycolatopsis azurea and biochemical characterization of thegene product. Enzyme and Microbial Technology, 2002. 30(5) :p. 647-655],D/L- ^ 酸的動態(tài)拆分，拆分收率可以達到將近100%，但是乙酰氨基酸消旋酶由于比活低，發(fā)酵成本較高，而且其酶活受到一定濃度乙酸鹽的強烈抑制，所以工業(yè)應用比較困難。1997 年，Galkin 和 Kulakova 等(Galkin, A.，L. Kulakova, et al. (1997). Synthesisof optically active amino acids from alpha-keto acids with Escherichia coIi cellsexpressing heterologous genes. Applied and Environmental Microbiology 63(12) :4651.)構建了共表達L-亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶的基因工程菌種，這一菌種的細胞內(nèi)含有的L-亮氨酸脫氫酶能夠催化丁酮酸和NH3生產(chǎn)L-2-氨基丁酸，同時細胞內(nèi)的甲酸脫氫酶以甲酸銨為底物再生NAD+為NADH，同時放出二氧化碳和NH3。采用這一細胞進行轉化生產(chǎn)L-2-氨基丁酸，濃度達到0. 35M(36. lg/L)，轉化率可達88%。該工藝采用丁酮酸為原料，由于丁酮酸價格較高，市售5g 丁酮酸的價格在百元以上，導致該工藝成本價高， 且丁酮酸性質(zhì)不穩(wěn)定，限制了該工藝的工業(yè)化應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種L-2-氨基丁酸的生產(chǎn)方法。本發(fā)明以L-蘇氨酸為底物，通過包括蘇氨酸脫氨酶、L-氨基酸脫氫酶和輔酶再生系統(tǒng)的酶催化體系的催化高效生產(chǎn)L-2-氨基丁酸。具體的，采用L-蘇氨酸為底物，通過L-蘇氨酸脫氨酶的作用，將L-蘇氨酸轉化為
4丁酮酸和氨；然后丁酮酸和氨在L-氨基酸脫氫酶的作用下被還原為L-2-氨基丁酸；L-氨基酸脫氫酶還原丁酮酸需要NADH作為輔酶，反應后生成NAD+，而NADH價格昂貴，所以需要輔酶再生系統(tǒng)再生NAD+為NADH。本發(fā)明提供的L-2-氨基丁酸的生產(chǎn)方法，所述L-氨基酸脫氨酶選自但不限于， 芽孢桿菌來源的L-亮氨酸脫氫酶、芽孢桿菌來源的L-丙氨酸脫氫酶、古球菌來源的L-丙氨酸脫氫酶、鏈霉菌來源的L-纈氨酸脫氫酶、嗜熱放線菌來源的L-苯丙氨酸脫氫酶、芽孢桿菌來源的L-苯丙氨酸脫氫酶。所述蘇氨酸脫氨酶選自但不限于，大腸桿菌來源的蘇氨酸脫氨酶、鼠傷寒沙門(氏)菌來源的蘇氨酸脫氨酶、擬南芥來源的蘇氨酸脫氨酶。優(yōu)選的，本發(fā)明提供的L-2-氨基丁酸的生產(chǎn)方法，輔酶再生系統(tǒng)為利用細胞內(nèi) NADH和NAD+及細胞自身代謝再生NAD+為NADH的細胞自身代謝輔酶再生系統(tǒng)。具體的，所述細胞自身代謝輔酶再生系統(tǒng)為包括表達L-氨基酸脫氫酶的細胞和碳源的細胞自身代謝輔酶再生系統(tǒng)，相應的，所述酶催化體系為包括表達L-氨基酸脫氫酶的細胞、蘇氨酸脫氨酶和碳源的酶催化體系；或者，所述細胞自身代謝輔酶再生系統(tǒng)為包括共表達L-氨基酸脫氫酶和蘇氨酸脫氨酶的細胞和碳源的細胞自身代謝輔酶再生系統(tǒng)，相應的，所述酶催化體系為包括共表達L-氨基酸脫氫酶和蘇氨酸脫氨酶的細胞和碳源的酶催化體系。所述碳源為葡萄糖、甲醇或者甘油。且所述細胞選自大腸桿菌活細胞、釀酒酵母活細胞、畢赤酵母活細胞，這些細胞內(nèi)本身含有NAD+和NADH，同時細胞代謝過程能夠將NAD+還原為NADH，特別是酵母活細胞，其細胞自身代謝NAD+和NADH含量高，而且代謝旺盛，能高效地將NAD+還原為 NADH。優(yōu)選的，本發(fā)明提供的L-2-氨基丁酸的生產(chǎn)方法，輔酶再生系統(tǒng)為非細胞自身代謝輔酶再生系統(tǒng)，所述非細胞自身代謝輔酶再生系統(tǒng)為包括輔酶再生酶、輔酶再生底物、和 NAD+或NADH的非細胞自身代謝輔酶再生系統(tǒng)，相應的，所述酶催化體系為包括蘇氨酸脫氨酶、L-氨基酸脫氫酶、輔酶再生酶、輔酶再生底物、和NAD+或NADH的酶催化體系；或者為包括輔酶再生底物和共表達L-氨基酸脫氫酶和輔酶再生酶的細胞的非細胞自身代謝輔酶再生系統(tǒng)，相應的，所述酶催化體系為包括蘇氨酸脫氨酶、輔酶再生底物和共表達L-氨基酸脫氫酶和輔酶再生酶的細胞的酶催化體系；或者為包括輔酶再生底物和共表達L-氨基酸脫氫酶、蘇氨酸脫氨酶和輔酶再生酶的細胞的非細胞自身代謝輔酶再生系統(tǒng)，相應的，所述酶催化體系為包括了輔酶再生底物和共表達L-氨基酸脫氫酶、蘇氨酸脫氨酶和輔酶再生酶的細胞的酶催化體系。所述包括輔酶再生酶、輔酶再生底物、和NAD+或NADH的非細胞自身代謝輔酶再生系統(tǒng)選自選自包括葡萄糖脫氫酶、葡萄糖、和NAD+或NADH的葡萄糖脫氫酶輔酶再生系統(tǒng)；包括甲酸脫氫酶、甲酸鹽、和NAD+或NADH的甲酸脫氫酶輔酶再生系統(tǒng)和亞磷酸脫氫酶輔酶再生系統(tǒng)；包括亞磷酸鹽、亞磷酸脫氫酶和NAD+或NADH的亞磷酸脫氫酶輔酶再生系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式，酶催化體系包括蘇氨酸脫氨酶、L-氨基酸脫氫酶和非細胞自身代謝輔酶再生系統(tǒng)，其中非細胞自身代謝輔酶再生系統(tǒng)包括催化NAD+為 NADH的輔酶再生酶、輔酶再生底物和微量的NAD+或NADH，如由葡萄糖脫氫酶、葡萄糖和 NAD+組成的葡萄糖脫氫酶輔酶再生系統(tǒng)，或由甲酸脫氫酶、甲酸鹽和NAD+組成甲酸脫氫酶輔酶再生系統(tǒng)。向該酶反應體系中加入L-蘇氨酸，在控制PH和溫度的條件下，該酶反應體系可以高效地將L-蘇氨酸轉化為L-2-氨基丁酸。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式，將L-氨基酸脫氫酶基因和輔酶再生酶基因克隆至表達載體，導入到大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、或者酵母細胞中，實現(xiàn)共表達，共表達 L-氨基酸脫氫酶和輔酶再生酶的活細胞與蘇氨酸脫氨酶和輔酶再生底物組合成酶催化體系。向該酶催化體系中加入L-蘇氨酸，在控制PH和溫度的條件下，該酶催化體系可以高效地將L-蘇氨酸轉化為L-2-氨基丁酸。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式，將蘇氨酸脫氨酶基因、L-氨基酸脫氫酶基因和輔酶再生酶基因克隆至表達載體，導入到大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、或者酵母細胞中，實現(xiàn)共表達，共表達蘇氨酸脫氨酶、L-氨基酸脫氫酶和輔酶再生酶的活細胞與輔酶再生底物組合成一個酶反應體系。向該酶反應體系中加入L-蘇氨酸，在控制PH和溫度的條件下，該酶反應體系可以高效地將L-蘇氨酸轉化為L-2-氨基丁酸。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式，將L-氨基酸脫氫酶基因克隆至表達載體，導入到大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、或者酵母細胞中，優(yōu)選酵母細胞，實現(xiàn)外源表達，表達L-氨基酸脫氫酶的活細胞與蘇氨酸脫氨酶和葡萄糖、甲醇或者甘油等碳源共同組成酶催化體系。 向該酶催化體系中加入L-蘇氨酸，在控制PH和溫度的條件下，該酶催化體系可以高效地將 L-蘇氨酸轉化為L-2-氨基丁酸。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式，將蘇氨酸脫氨酶基因和L-氨基酸脫氫酶基因克隆至表達載體，導入到大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、或者酵母細胞中，優(yōu)選酵母細胞，實現(xiàn)共表達，表達L-氨基酸脫氫酶和蘇氨酸脫氨酶的活細胞與葡萄糖或者甘油等碳源共同組成酶催化體系。向該酶催化體系中加入L-蘇氨酸，在控制PH和溫度的條件下，該酶催化體系可以將L-蘇氨酸轉化為L-2-氨基丁酸。本發(fā)明提供的L-2-氨基丁酸的生產(chǎn)方法，以市售價格為每公斤20元左右的L-蘇氨酸為主要原料，通過由蘇氨酸脫氨酶、L-氨基酸脫氫酶和輔酶再生系統(tǒng)構成的酶催化體系的催化生產(chǎn)L-2-氨基丁酸，工藝成本低，轉化率和產(chǎn)物濃度高，沒有副產(chǎn)物影響，該工藝方法適合工業(yè)應用。


圖1為轉氨酶法制備L-2-氨基丁酸的反應原理圖。圖2為本發(fā)明的L-2-氨基丁酸的生產(chǎn)方法的反應原理圖。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發(fā)明做進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。如圖2所示，本發(fā)明的L-2-氨基丁酸的生產(chǎn)方法，以L-蘇氨酸為底物，通過由蘇氨酸脫氨酶、L-氨基酸脫氫酶和輔酶再生系統(tǒng)構成的酶催化體系催化生產(chǎn)L-2-氨基丁酸。 具體的，通過L-蘇氨酸脫氨酶的作用，將L-蘇氨酸轉化為丁酮酸和氨；然后丁酮酸和氨在 L-氨基酸脫氫酶的作用下被還原為L-2-氨基丁酸，在L-氨基酸脫氫酶還原丁酮酸的過程中需要NADH作為輔酶，反應后生成酶促因子NAD+。因NADH價格昂貴，所以需要輔酶再生系統(tǒng)再生NAD+為NADH。在本發(fā)明的上下文中，L-氨基酸脫氫酶是指在丁酮酸、氨以及NAD+或NADH存在的條件下，能夠將丁酮酸還原為L-2-氨基丁酸的L-氨基酸脫氫酶。輔酶再生系統(tǒng)是指能夠將輔酶NAD+還原為NADH的輔酶再生系統(tǒng)。實施例1大腸桿菌來源的蘇氨酸脫氨酶、蠟狀芽孢桿菌來源的亮氨酸脫氫酶和枯草芽孢桿菌來源的葡萄糖脫氫酶反應體系催化生產(chǎn)L-2-氨基丁酸配制液體培養(yǎng)基TB(pH7. 0-7.幻，含有12g/L蛋白胨、24g/L進口酵母抽提物、5g/ L甘油、2. 13g/L Iffl2P04、16. 43g/L K2HPO4 · 3H20。培養(yǎng)基TB分裝于IL三角搖瓶，裝液量 200mL，然后在高壓滅菌鍋中于121°C加熱滅菌20min。分別從蠟狀芽孢桿菌來源的亮氨酸脫氫酶表達菌種(參考Kula MR, Stoyan T， Recktenwald A.Cloning， sequencing and overexpression of the leucine dehydrogenasegene from Bacillus cereus. Journal of Biotechnology. 1997,54 77-80所述方法構建)、枯草芽孢桿菌來源的葡萄糖脫氫酶表達菌種(參考Lampel KA, et al. Characterization of the developmentalIy regulated Bacillus subtilis glucosedehydrogenase gene. J Bacteriol. 1986，166 (1) :238-43 所述方法構建)禾口大腸桿菌來源的蘇氨酸脫氨酶表達菌種(參考Abrescia P，et al. Threonine Deaminase Autogenous Regulator of the ilv Genes in Escherichia coil K-12. Molec. gen. Genet. 1979，171 :261-275所述方法構建)的平板上用接種環(huán)挑數(shù)環(huán)菌體接種于TB搖瓶中，接種前在TB培養(yǎng)基中加入100 μ g/mL卡那霉素，于37°C、220rpm搖床培養(yǎng)至OD6tltl = 5-6，加入15g/L乳糖誘導24h左右。離心后收集菌體備用。大腸桿菌來源的蘇氨酸脫氨酶酶活檢測方法為用0. IM Tris-HCl (pH7. 5)重懸蘇氨酸脫氨酶表達菌種的發(fā)酵菌體至終濃度為10g/L。超聲破碎(功率400W，工作5s，間隔8s，30次)，破胞液即為粗酶液。用0. IM Tris-HCl配制0. 4M L-蘇氨酸，調(diào)pH至7. 5， 取ImL加入試管，30°C預熱5min，加入Iml的上述粗酶液，反應lOmin，用10%鹽酸終止反應，HPLC檢測檢測0分鐘和IOmin的L-蘇氨酸含量，根據(jù)減少量或通過檢測丁酮酸的含量計算酶活。蠟狀芽孢桿菌來源的亮氨酸脫氫酶酶活檢測方法為取ImL亮氨酸脫氫酶表達菌種的發(fā)酵液于4°C、12000rpm離心Imin后棄上清，加入等體積0. 2M、pH7. 5的NH3-NH4Cl緩沖液重懸菌體超聲破碎功率400W，工作5s，間隔8s，30次。破胞液于4°C、12000rpm離心:3min，上清液即為粗酶液。亮氨酸脫氫酶反應體系包括50mM 丁酮酸、0. 5mM NADH、0. 2M NH3-NH4Cl緩沖液(pH7. 5)、2. 5%粗酶液。底物和緩沖液在30°C下溫浴10分鐘，加入粗酶液和NADH開始反應，使用分光光度計測定OD34tl的下降值。IU酶活定義為30°C下每分鐘催化消耗IumolNADH所需的酶量?？莶菅挎邨U菌來源的葡萄糖脫氫酶酶活檢測方法為取ImL葡萄糖脫氫酶表達菌種的發(fā)酵液于4°C、12000rpm離心Imin后棄上清，加入等體積0. 2M、pH7. 5的NH3-NH4Cl緩沖液重懸菌體超聲破碎功率400W，工作5s，間隔8s，30次。破胞液于4°C、12000rpm離心:3min，上清液即為粗酶液。葡萄糖脫氫酶反應體系包括IOOmM葡萄糖、ImM NAD+,0. 2M NH3-NH4Cl緩沖液(pH7. 5)、2. 5%粗酶液。底物和緩沖液在30°C下溫浴10分鐘，加入粗酶液和NAD+開始反應，使用分光光度計測定OD34tl的上升值。IU酶活定義為30°C下每分鐘催化產(chǎn)生IumolNADH所需的酶量。將含有1. 5M的L-蘇氨酸，1. 5M葡萄糖的溶液于30°C溫浴，用氨水調(diào)pH至7. 6。依次加入葡萄糖脫氫酶粗酶液O0000U/L)、亮氨酸脫氫酶粗酶液(7000U/L)、NAD+(0. 02g/ L)和蘇氨酸脫氨酶粗酶液(M00U/L)開始反應，用氫氧化鈉控制pH至7. 6，反應M小時， 液相檢測L-2-氨基丁酸的含量為148. 5g/L，L-2-氨基丁酸的光學純度ee為99%，轉化率可達95%以上。液相檢測方法如下在EP管中依次加入PH = 9. 5的硼酸緩沖液300ul，轉化液樣品250ul，衍生劑200ul (取0. 3430g鄰苯二甲醛+5ml無水乙醇+0. 1472gN-乙酰-L半胱氨酸，用0. lmol/L硼砂緩沖液(PH = 9. 5)定溶到25ml，避光備用)，混勻后等待2分鐘，嚴格控制時間和試劑添加量，然后進樣。所需的化合物用0.05mol/L醋酸鈉緩沖液甲醇= 63 35進行洗脫，流速l.Oml/min，采集時間為lOmin。色譜條件為)(DB-C8 (150mm)中性柱，柱溫30°C，檢測波長334nm。實施例2大腸桿菌來源的蘇氨酸脫氨酶、蠟狀芽孢桿菌來源的亮氨酸脫氫酶和博伊丁假絲酵母來源的甲酸脫氫酶反應體系催化生產(chǎn)L-2-氨基丁酸菌種發(fā)酵、粗酶液的制備和液相檢測方法同實施例1，其中，博伊丁假絲酵母來源的甲酸脫氫酶表達菌種參考&ikai Y，et al. Regulation of the formatedehydrogenase gene,FDHl, in the methylotrophic yeast Candida boidinii and growthcharacteristies of an FDHl—disrupted strain on methanol, methylamine, and choline. JBacteriol. 1997，179(14) :4480-5 所述方法構建。大腸桿菌來源的蘇氨酸脫氨酶和蠟狀芽孢桿菌來源的亮氨酸脫氫酶的酶活檢測方法同實施例1。博伊丁假絲酵母來源的甲酸脫氫酶酶活檢測方法為取ImL甲酸脫氫酶表達菌種的發(fā)酵液于4°C、12000rpm離心Imin后棄上清，加入等體積0. 2MNH3_NH4C1 (pH7. 5)緩沖液重懸菌體超聲破碎(功率400W，工作5s，間隔8s，30次)，破胞液于4°C、12000rpm離心 3min，上清液即為粗酶液。甲酸脫氫酶反應體系包括IOOmM甲酸銨、lmMNAD+、0. 2MNH3_NH4C1 緩沖液(PH7. 5)、2. 5%粗酶液。底物和緩沖液在30°C下溫浴10分鐘，加入粗酶液和NAD+ 開始反應，使用分光光度計測定OD34tl的上升值。IU酶活定義為30°C下每分鐘催化產(chǎn)生 IymolNADH所需的酶量。將含有1.5M的L-蘇氨酸，1.5M甲酸銨的溶液于30°C溫浴，用氨水調(diào)pH至 7.6。依次加入甲酸脫氫酶粗酶液(3000U/L)、亮氨酸脫氫酶粗酶液(5000U/L)、酶促因子 NAD+(0. 02g/L)和蘇氨酸脫氨酶粗酶液(M00U/L)開始反應，控制pH至7. 6，反應M小時， 液相檢測L-2-氨基丁酸的含量為147. 3g/L，L-2-氨基丁酸的光學純度ee為99 %，轉化率可達95%以上。實施例3白色鏈霉菌來源的纈氨酸脫氫酶、大腸桿菌來源的蘇氨酸脫氨酶和枯草芽孢桿菌來源的葡萄糖脫氫酶反應體系催化生產(chǎn)L-2-氨基丁酸菌種發(fā)酵、粗酶液的制備和液相檢測方法同實施例1，其中，白色鏈霉菌來源的纈氨酸脫氫酶表達菌種參考 Hyuu CG, Kim SS et al. Valine dehydrogenasefrom Streptomyces albus gene cloning heterologous expression and identification ofactive site by site-directed mutagenesis. FEMS Microbiology Letters. 2000,182 四-34所述方法構建。大腸桿菌來源的蘇氨酸脫氨酶和枯草芽孢桿菌來源的葡萄糖脫氫酶的酶活檢測方法同實施例1。白色鏈霉菌來源來源的纈氨酸脫氫酶酶活檢測方法為取ImL纈氨酸脫氫酶表達菌種的發(fā)酵液于4°C、12000rpm離心Imin后棄上清，加入等體積0. 2MNH3_NH4C1 (pH7. 5)緩沖液重懸菌體超聲破碎(功率400W，工作5s，間隔8s，30次)，破胞液于4°C、12000rpm離心:3min，上清液即為粗酶液。纈氨酸脫氫酶反應體系包括50mM 丁酮酸、0. 5mM NADH、0. 2M NH3-NH4Cl緩沖液(pH7. 5)、2. 5%粗酶液。底物和緩沖液在30°C下溫浴10分鐘，加入粗酶液和NADH開始反應，使用分光光度計測定OD34tl的下降值。IU酶活定義為30°C下每分鐘催化消耗1 μ moINADH所需的酶量。將含有1. OM的L-蘇氨酸，1. OM葡萄糖，0. 05M硫酸銨的溶液于30°C溫浴，用氨水調(diào)pH至7. 6。依次加入葡萄糖脫氫酶粗酶液O0000U/L)、纈氨酸脫氫酶粗酶液(6000U/L)、 酶促因子NAD+(0.02g/L)和蘇氨酸脫氨酶粗酶液(M00U/L)開始反應，用氫氧化鈉控制pH 至7. 6，反應M小時，液相檢測L-2-氨基丁酸的含量為99. 4g/L，L_2_氨基丁酸的光學純度ee為99%，轉化率可達96%以上。實施例4蠟狀芽孢桿菌來源的亮氨酸脫氫酶和枯草芽孢桿菌來源的葡萄糖脫氫酶共表達菌種細胞與大腸桿菌來源的蘇氨酸脫氨酶組成酶反應體系催化生產(chǎn)L-2-氨基丁酸4. 1蠟狀芽孢桿菌來源的亮氨酸脫氫酶和枯草芽孢桿菌來源的葡萄糖脫氫酶共表達菌種構建以實施例1中構建的亮氨酸脫氫酶重組質(zhì)粒為模板合成正義引物和反義引物。引物的核苷酸序列分別記錄于SEQ ID NO 1 (LeuDH-NcoI-F)和SEQ ID NO 2 (LeuDH-BamHI-R)。SEQ ID NO 1 LeuDH-NcoI-FCATGCCATGGGAACATTAGAAATCTTCSEQ ID NO 2 LeuDH-BamHI-RCGGGATCCTTAGCGACGGCTAAT對反應溶液進行PCR擴增，反應溶液中含有上述一對引物，其中，每一個引物為 50pmol，0.2mM dNTP，50ng 載體 DNA，25mM MgCl2, IX KOD ρlusbuffer (TOYOBO), KOD plus 2U (TOYOBO)。PCR的條件如下95°C預變性5min，后按如下參數(shù)循環(huán)30次94°C變性45秒， 55°C退火45秒，68°C延伸90秒，最后一個循環(huán)68°C延伸IOmin。PCR反應結束后，用瓊脂糖凝膠電泳進行分析，檢測到一條大約IOOObp的特異條帶，為所需。用AxyPr印DNA Gel Extraction Kit回收PCR擴增產(chǎn)物，TA克隆到pMD18_T 載體(TAKARA pMD18-T simple vector)上轉化DH5 α，涂布于含Amp的LB平板上，挑選陽性克隆。抽質(zhì)粒鑒定重組體后經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nc0I/BamHI(MBI)雙酶切，與同樣酶切處理得表達載體pET28b (Novagen)用T4DNA連接酶(MBI)連接過夜，轉化大腸桿菌DH5 α，涂布于含Kan的LB平板上。酶切驗證所需后轉化表達宿主大腸桿菌BL21 (DE!3)中進行表達。將該重組質(zhì)粒標記為pET28b-Leudh。以實施例1中構建的葡萄糖重組質(zhì)粒為模板合成正義引物和反義引物。引物的核苷酸序列分別記錄于 SEQ ID NO :3(rbsGDH-SacI-F)和 SEQ ID NO :4 (rbsGDH-XhoI-R)。SEQ ID NO 3 rbsGDH-SacI-F
CGAGCTCAATAATTTTGTTTAACTTSEQ ID NO 4 rbsGDH-XhoI-RCCTCGAGTTAACCGCGGCCTG對反應溶液進行PCR擴增，反應溶液中含有上述一對引物，其中，每一個引物為 50pmol，0.2mM dNTP，50ng 載體 DNA，25mM MgCl2, IX KOD ρlusbuffer (TOYOBO), KOD plus 2U (TOYOBO)。PCR的條件如下95°C預變性5min，后按如下參數(shù)循環(huán)30次94°C變性45秒， 55°C退火45秒，68°C延伸90秒，最后一個循環(huán)68°C延伸IOmin。PCR反應結束后，用瓊脂糖凝膠電泳進行分析，檢測到一條大約SOObp的特異條帶，為所需。用AxyPr印DNA Gel Extraction Kit回收PCR擴增產(chǎn)物，TA克隆到pMD18_T 載體上(TAKARA pMD18-T simple vector)轉化DH5 α，涂布于含Amp的LB平板上，挑選陽性克隆。抽質(zhì)粒鑒定重組體后經(jīng)限制性內(nèi)切酶McIAhoI (MBI)雙酶切，與同樣酶切處理的表達載體pET28b-Leudh用T4DNA連接酶(MBI)連接過夜，轉化大腸桿菌DH5 α，涂布于含 Kan的LB平板上。酶切驗證所需后轉化表達宿主大腸桿菌BL21 (DE!3)中進行表達。該重組質(zhì)粒即為亮氨酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶共表達質(zhì)粒。4. 2蠟狀芽孢桿菌來源的亮氨酸脫氫酶和枯草芽孢桿菌來源的葡萄糖脫氫酶共表達菌種細胞與大腸桿菌來源的蘇氨酸脫氨酶組成酶反應體系催化生產(chǎn)L-2-氨基丁酸菌種發(fā)酵、粗酶液的制備、三種酶的酶活檢測方法和液相檢測方法同實施例1，采用4. 1中的方法得到亮氨酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶共表達菌種細胞，經(jīng)測定共表達細胞中亮氨酸脫氫酶的酶活為151U/g濕菌體，甲酸脫氫酶的酶活為1100U/g。將含有0. 5M的L-蘇氨酸，0. 5M葡萄糖的溶液于30°C溫浴，用氨水調(diào)pH至7. 6。 依次加入共表達L-亮氨酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶的細胞40g/L和蘇氨酸脫氨酶粗酶液 (2400U/L)開始反應，用氫氧化鈉控制pH至7. 6，反應M小時，液相檢測L-2-氨基丁酸的含量為48. 3g/L，L-2-氨基丁酸的光學純度ee為99%，轉化率可達93%以上。實施例5蠟狀芽孢桿菌來源的亮氨酸脫氫酶和博伊丁假絲酵母來源的甲酸脫氫酶共表達菌種細胞與大腸桿菌來源的蘇氨酸脫氨酶組成酶反應體系催化生產(chǎn)L-2-氨基丁酸蠟狀芽孢桿菌來源的亮氨酸脫氫酶和博伊丁假絲酵母來源的甲酸脫氫酶共表達菌禾中參考 Groger H，et al. From enzymes to “Designer Bugs，，in reductiveamination a new process for the synthesis of L—tert—Leucine using a wholecell-catalyst. Eng. Life Sci. 2004，4，No. 6所述方法構建。菌種發(fā)酵、粗酶液的制備及酶活檢測方法、液相檢測方法參考實施例1和實施例2，經(jīng)測定共表達細胞中亮氨酸脫氫酶的酶活為148U/g 濕菌體，甲酸脫氫酶的酶活為25U/g。將含有0. 4M的L-蘇氨酸，0. 45M甲酸銨的溶液于30°C溫浴，用氨水調(diào)pH至7. 6。依次加入亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶共表達菌種細胞80g/L和蘇氨酸脫氨酶粗酶液(M00U/ L)開始反應，控制pH至7. 6，反應M小時，液相檢測L-2-氨基丁酸的含量為49. lg/L， L-2-氨基丁酸的光學純度ee為99%，轉化率可達95%以上。實施例6高表達蠟狀芽孢桿菌來源的亮氨酸脫氫酶基因工程畢赤酵母細胞與大腸桿菌來源的蘇氨酸脫氨酶組成酶反應體系催化生產(chǎn)L-2-氨基丁酸6. 1高表達蠟狀芽孢桿菌來源的亮氨酸脫氫酶基因工程畢赤酵母構建
10
以實施例1中構建的亮氨酸脫氫酶重組質(zhì)粒為模板合成正義引物和反義引物。引物的核苷酸序列分別記錄于SEQ ID NO 5 (LeuDH-BamHI-F)和SEQ ID NO 6 (LeuDH-NotI-R)。SEQ ID NO 5 LeuDH-BamHI-FCGCGGATCCACCATGGGAACATTAGAAATCTTCGSEQ ID NO 6 LeuDH-NotI-RGTTAGCCAGCGGCCGCTTAGCGACGGCTAATAATATC對反應溶液進行PCR擴增，反應溶液中含有上述一對引物，其中，每一個引物為 50pmol，0.2mM dNTP，50ng 載體 DNA，25mM MgCl2, IX KOD plus buffer (Τ0Υ0Β0), KOD plus 2U (T0Y0B0)。PCR的條件如下95°C預變性5min，后按如下參數(shù)循環(huán)30次94°C變性45秒，
退火45秒，68°C延伸1分鐘，最后一個循環(huán)68°C延伸lOmin。產(chǎn)物經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并回收純化PCR產(chǎn)物。分別用BamH I及Not I雙酶切亮氨酸脫氫酶LeuDH基因的PCR產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，并與同樣經(jīng)BamH I及Not I雙酶切的pPIC3. 5K載體(Invitrogen)用T4DNA連接酶連接，轉化大腸桿菌DH5 α，轉化菌液涂布在含卡那霉素的LB平板上過夜，挑選陽性克隆子，LB培養(yǎng)過夜抽提重組質(zhì)粒PPIC3. 5K-LeuDH,并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測重組質(zhì)粒，并進一步通過限制性內(nèi)切酶BamH I和Not I雙酶切鑒定，驗證為所需。酵母感受態(tài)細胞GS115的制備。在IOmL試管內(nèi)放2mLYEPD培養(yǎng)基，其組成為酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。接種酵母宿主菌GSl 15單菌落，30°C，200r/min 培養(yǎng)過夜；按接種量轉接后，繼續(xù)培養(yǎng)過夜至OD600 = 1. O。4°C,3000r/min離心5min, 分別用IOOmL及50mL預冷的無菌水洗滌2次，用25mL預冷的IM山梨醇溶液洗滌1次，盡可能去除溶液，用200 μ L預冷的IM山梨醇溶液重懸菌體，獲得酵母感受態(tài)細胞。將獲得的陽性重組質(zhì)粒pPIC3. 5K-LeuDH用McI酶切線性化過夜，約20 μ 1質(zhì)粒 DNA與80 μ 1冷的酵畢赤母GSl 15感受態(tài)細胞混合，轉入預冷的0. 2cm電轉移杯，冰浴5min， 于1500￥、25 4 、200 0條件下電擊，迅速加入1!^冷的說山梨醇溶液，混勻，涂布于1 選擇平板上，30°C培養(yǎng)2 3d，至轉化子(pPIC3. 5K-LeuDH/GS115)長出，挑選轉化單菌落進行陽性克隆鑒定，采用亮氨酸脫氫酶配對引物PCR擴增LeuDH基因，PCR產(chǎn)物電泳檢測。驗證為正確的重組轉化子，進行誘導表達，用于測定生物活性。取發(fā)酵液1ml，12000rpm離心5min 離心，棄上清。加入Iml Tris-HCKpH 8. 0，內(nèi)加0. 2ml蛋白破碎液)懸浮，超聲破碎(時間 3S,間隔時間8S，工作次數(shù)30S，電壓400W)，破碎后12000rpm離心lOmin，上清液既為粗酶液。亮氨酸脫氫酶反應體系包括50mM 丁酮酸、0. 5mMNADH、0. 2M NH3-NH4Cl緩沖液(pH7. 5)、 2. 5%粗酶液。底物和緩沖液在30°C下溫浴10分鐘，加入粗酶液和NADH開始反應，使用分光光度計測定OD34tl的下降值。IU酶活定義為30°C下每分鐘催化消耗1 μ molNADH所需的酶量。經(jīng)檢測，粗酶液中亮氨酸脫氫酶的酶活為3U/mL，該重組克隆驗證為所需。6. 2高表達蠟狀芽孢桿菌來源的亮氨酸脫氫酶基因工程畢赤酵母細胞與大腸桿菌來源的蘇氨酸脫氨酶組成酶反應體系催化生產(chǎn)L-2-氨基丁酸用接種環(huán)從亮氨酸脫氫酶基因工程畢赤酵母平板上挑取一環(huán)菌體接種到 20mLBMGY 培養(yǎng)基(1 %酵母浸出物、2 %蛋白胨、IOOmM 磷酸鉀 PH6. 0,1. 34% YNB,0. 04mg/L 生物素、甘油)中，30°C、200rpm振蕩培養(yǎng)24h至OD6tltl約為1.0，離心收集菌體，用IOOmL含0. 5%甲醇的BMMY培養(yǎng)基(1%酵母浸出物、2%蛋白胨、IOOmM磷酸鉀PH6. 0,1. 34% YNB, 0. 04mg/L生物素、0. 5 %甲醇)重懸培養(yǎng)，誘導LeuDH蛋白的表達，每12h補加0. 5 %的甲醇， 共誘導3-4天，離心后收集細胞，取一部分用于酶活鑒定，亮氨酸脫氫酶的酶活檢測方法同實施例1，其余菌體細胞直接用于轉化反應。蘇氨酸脫氨酶的菌種發(fā)酵、粗酶液的制備和液相檢測方法同實施例1。將含有0. 4M的L-蘇氨酸、5g/L甲醇的0. IM的磷酸緩沖液(PH7. 0) 50ml放入 250ml三角瓶中，然后加入畢赤酵母細胞5g，蘇氨酸脫氨酶(M00U/L)開始反應，溫度控制 300C，轉速200rpm，每1 后補加甲醇5g/L，反應3 后經(jīng)液相檢測L-2-氨基丁酸的光學純度ee為99 %，轉化率可達80 %以上。以上僅以L-亮氨酸脫氫酶、L-纈氨酸脫氫酶為例，詳細描述本發(fā)明的技術方案及技術效果，本領域技術人員可知，對上述L-氨基酸脫氫酶可以作出等同替換，如采用L-丙氨酸脫氫酶、L-苯丙氨酸脫氫酶等，且來源不限于芽孢桿菌、鏈霉菌，如采用古球菌來源、嗜熱放線菌來源等，均可完成本發(fā)明的技術方案，在丁酮酸、氨以及NAD+或NADH存在的條件下，將丁酮酸還原為L-2-氨基丁酸。且本領域技術人員可知，L-蘇氨酸脫氨酶也可采用， 但不限于鼠傷寒沙門(氏)菌來源的L-蘇氨酸脫氨酶、擬南芥來源的L-蘇氨酸脫氨酶。本發(fā)明提供的L-2-氨基丁酸的生產(chǎn)方法，在L-氨基酸脫氫酶的作用下，將在 L-蘇氨酸脫氨酶的作用下由L-蘇氨酸轉化的丁酮酸和氨直接還原為L-2-氨基丁酸，充分利用反應過程中生成的氨，沒有副產(chǎn)物的影響。且與現(xiàn)有的方法相比，本方法的生產(chǎn)成本低，產(chǎn)物濃度顯著提高，且具有高的轉化率，可以大規(guī)模生產(chǎn)，適合工業(yè)應用。雖然已參考優(yōu)選實施例對本發(fā)明進行了描述，應當理解，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請的權利要求書所限定的范圍內(nèi)。
1權利要求
1.一種L-2-氨基丁酸的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述方法以L-蘇氨酸為原料，通過包括蘇氨酸脫氨酶、L-氨基酸脫氫酶和輔酶再生系統(tǒng)的酶催化體系催化生產(chǎn)L-2-氨基丁酸。
2.如權利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述L-氨基酸脫氨酶選自但不限于， 芽孢桿菌來源的L-亮氨酸脫氫酶、芽孢桿菌來源的L-丙氨酸脫氫酶、古球菌來源的L-丙氨酸脫氫酶、鏈霉菌來源的L-纈氨酸脫氫酶、嗜熱放線菌來源的L-苯丙氨酸脫氫酶、芽孢桿菌來源的L-苯丙氨酸脫氫酶。
3.如權利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述蘇氨酸脫氨酶選自但不限于，大腸桿菌來源的蘇氨酸脫氨酶、鼠傷寒沙門(氏)菌來源的蘇氨酸脫氨酶、擬南芥來源的蘇氨酸脫氨酶。
4.如權利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述輔酶再生系統(tǒng)為利用細胞內(nèi)NADH 和NAD+及細胞自身代謝再生NAD+為NADH的細胞自身代謝輔酶再生系統(tǒng)。
5.如權利要求4所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述細胞自身代謝輔酶再生系統(tǒng)為包括表達L-氨基酸脫氫酶的細胞和碳源的細胞自身代謝輔酶再生系統(tǒng)，相應的，所述酶催化體系為包括表達L-氨基酸脫氫酶的細胞、蘇氨酸脫氨酶和碳源的酶催化體系；或所述細胞自身代謝輔酶再生系統(tǒng)為包括共表達L-氨基酸脫氫酶和蘇氨酸脫氨酶的細胞和碳源的細胞自身代謝輔酶再生系統(tǒng)，相應的，所述酶催化體系為包括共表達L-氨基酸脫氫酶和蘇氨酸脫氨酶的細胞和碳源的酶催化體系。
6.如權利要求5所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述細胞選自大腸桿菌活細胞、釀酒酵母活細胞、畢赤酵母活細胞。
7.如權利要求5所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述碳源為葡萄糖、甲醇或甘油。
8.如權利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述輔酶再生系統(tǒng)為非細胞自身代謝輔酶再生系統(tǒng)，所述非細胞自身代謝輔酶再生系統(tǒng)為包括輔酶再生酶、輔酶再生底物、和 NAD+或NADH的非細胞自身代謝輔酶再生系統(tǒng)，相應的，所述酶催化體系為包括蘇氨酸脫氨酶、L-氨基酸脫氫酶、輔酶再生酶、輔酶再生底物、和NAD+或NADH的酶催化體系；或為包括輔酶再生底物和共表達L-氨基酸脫氫酶和輔酶再生酶的細胞的非細胞自身代謝輔酶再生系統(tǒng)，相應的，所述酶催化體系為包括蘇氨酸脫氨酶、輔酶再生底物和共表達L-氨基酸脫氫酶和輔酶再生酶的細胞的酶催化體系；或者為包括輔酶再生底物和共表達L-氨基酸脫氫酶、蘇氨酸脫氨酶和輔酶再生酶的細胞的非細胞自身代謝輔酶再生系統(tǒng)，相應的，所述酶催化體系為包括了輔酶再生底物和共表達L-氨基酸脫氫酶、蘇氨酸脫氨酶和輔酶再生酶的細胞的酶催化體系。
9.如權利要求8所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述包括輔酶再生酶、輔酶再生底物、 和NAD+或NADH的非細胞自身代謝輔酶再生系統(tǒng)選自選自包括葡萄糖脫氫酶、葡萄糖、和 NAD+或NADH的葡萄糖脫氫酶輔酶再生系統(tǒng)；包括甲酸脫氫酶、甲酸鹽、和NAD+或NADH的甲酸脫氫酶輔酶再生系統(tǒng)和亞磷酸脫氫酶輔酶再生系統(tǒng)；包括亞磷酸鹽、亞磷酸脫氫酶和 NAD+或NADH的亞磷酸脫氫酶輔酶再生系統(tǒng)。
10.如權利要求9所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述葡萄糖脫氫酶為芽孢桿菌來源的葡萄糖脫氫酶；所述甲酸脫氫酶為酵母菌來源的甲酸脫氫酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種L-2-氨基丁酸的生產(chǎn)方法，以L-蘇氨酸為原料，通過由蘇氨酸脫氨酶、L-氨基酸脫氫酶和輔酶再生系統(tǒng)構成的酶催化體系催化生產(chǎn)L-2-氨基丁酸。本發(fā)明的L-2-氨基丁酸生產(chǎn)方法，原料廉價，性質(zhì)穩(wěn)定，大幅度降低了L-2-氨基丁酸的生產(chǎn)成本，轉化率和產(chǎn)物濃度高，沒有副產(chǎn)物影響，適于工業(yè)化應用。
文檔編號C12P13/04GK102212567SQ20101013922
公開日2011年10月12日 申請日期2010年4月2日 優(yōu)先權日2010年4月2日
發(fā)明者朱傅赟, 楊晟, 沈正權, 潘震華, 范文超, 陸沈高, 陳濤, 陶榮盛 申請人:中國科學院上海生命科學研究院湖州工業(yè)生物技術中心