專利名稱：桿狀病毒載體的制作方法
桿狀病毒載體本發(fā)明涉及用于將基因插入到桿狀病毒序列的基因座中的轉(zhuǎn)移載體。本發(fā)明還涉及使用轉(zhuǎn)移載體和衍生的桿粒和桿狀病毒的方法。已經(jīng)將桿狀病毒表達系統(tǒng)用于在真核細胞中表達數(shù)以千計的蛋白質(zhì)用于結(jié)構(gòu)和生物化學(xué)研究(14)。除了表達單個重組蛋白的能力之外，桿狀病毒系統(tǒng)也已用于共同表達形成復(fù)合物的多種蛋白(15-22)。這一點是重要的，因為基因組范圍內(nèi)的相互作用的篩選揭示了活細胞的多種關(guān)鍵功能是由多亞基蛋白復(fù)合物完成的(23)。已經(jīng)使用了兩種主要的策略利用桿狀病毒系統(tǒng)實現(xiàn)蛋白質(zhì)的共表達。使用各自表達一種重組蛋白的兩種或者多種病毒共感染細胞是目前為止最常見的方法(19，24，25)。然而，這些研究中蛋白質(zhì)復(fù)合物的產(chǎn)率通常變化很大并且由兩種不同的桿狀病毒共感染相同的細胞不滿足泊松分布(poisson distribution) (26)。因此，盡管共感染方法在技術(shù)上簡單，但在實踐中其僅限于相對簡單的復(fù)合物的回收，用于不需要大量純化蛋白的應(yīng)用。對于例如結(jié)構(gòu)研究和需要多種蛋白質(zhì)的大規(guī)模的疫苗試驗的應(yīng)用而言，以及對于由多個亞基形成的更加復(fù)雜的復(fù)合物而言，使用了共表達來自插入到多角體蛋白或者PlO 位置的多個類似表達框中的的蛋白質(zhì)的可選方法(15-18，22，27)。該方法的優(yōu)點在于在培養(yǎng)物中的每一個被重組病毒感染的細胞都以可再生的方式表達形成蛋白質(zhì)復(fù)合物所需要的蛋白質(zhì)。將共感染和單獨桿狀病毒方法進行比較時，單獨桿狀病毒方法證明具有顯著更高的重組復(fù)合物產(chǎn)率(28)。然而，使用單獨的重組病毒表達多種蛋白質(zhì)并不是沒有缺點。 盡管棒狀的桿狀病毒看起來似乎對于其基因組中的插入相當有耐受力，但基因是通過同源重組轉(zhuǎn)移到病毒，同時轉(zhuǎn)移載體的尺寸必須容易在大腸桿菌中操作。因此，對于能插入到轉(zhuǎn)移載體中的基因的數(shù)目有限制。在實踐中，這意味著不大可能表達來自單個座位上的多于4 種的蛋白質(zhì)。除此之外，桿狀病毒含有表達蛋白質(zhì)的序列，該蛋白質(zhì)促進同源重組(29-32)。 因此，含有大量重復(fù)序列的病毒容易發(fā)生重排和重組(21，33，34)。通過在桿粒的chiA/cath印sin基因座插入IoxP位點，修改了單獨桿狀病毒共表達的方法，所述的桿粒已經(jīng)在多角體蛋白基因座上含有Tn7的靶點(20)。這使得通過在大腸桿菌中的重組在這些基因座的每一個中插入多個表達框。正如假定這個系統(tǒng)依賴于經(jīng)過修飾以表達不同基因的表達框的重復(fù)復(fù)制所預(yù)料的那樣，有證據(jù)顯示插入到該系統(tǒng)中在某種程度上在遺傳上不穩(wěn)定(21)。最近的桿狀病毒研究受益于ET重組系統(tǒng)的使用，該重組系統(tǒng)使得能夠選擇性地敲除病毒的基因(35-49)。然而，還未檢驗這種技術(shù)改造和促進在PlO和多角體蛋白之外的基因座上表達蛋白的潛力。本發(fā)明涉及從單個的桿狀病毒基因組中有效地表達多種重組蛋白質(zhì)(即桿狀病毒蛋白質(zhì))的方法。該方法使得能夠使用ET重組系統(tǒng)在病毒基因組內(nèi)的不同基因座上有效地插入單個的蛋白質(zhì)表達框。除此之外，該方法使得能表達具有多個亞基的復(fù)合物。已經(jīng)完善地建立了使用桿狀病毒作為表達系統(tǒng)來表達單個的蛋白質(zhì)。該表達系統(tǒng)的基本方法學(xué)自從其首次產(chǎn)生以來變化很小。到133kb時桿狀病毒的dsDNA太大無法直接操作。因此將編碼外來蛋白質(zhì)的基因在大腸桿菌中克隆到含有來自AcMNPV昆蟲病毒的表達框的載體中，隨后將其與病毒DNA —起引入到昆蟲細胞中，在昆蟲細胞中病毒和細胞的蛋白質(zhì)介導(dǎo)同源重組，導(dǎo)致表達外源蛋白質(zhì)的感染性(相對于昆蟲細胞)病毒的產(chǎn)生。在這一主旨下，已經(jīng)產(chǎn)生了一些變化，包括如果發(fā)生重組僅僅復(fù)制的病毒基因組(1，2)，和在大腸桿菌中使用桿粒進行重組從而加快重組病毒的選擇，所述的桿?；谵D(zhuǎn)位子Tn7(3)的使用。通過使用以上簡述的桿狀病毒表達系統(tǒng)，還實現(xiàn)了多蛋白復(fù)合體在昆蟲細胞中的表達。最初使用各自表達單一蛋白質(zhì)的多種病毒共感染易感細胞和在表達之后純化的蛋白質(zhì)復(fù)合物。然而，這充其量也沒有效力并且重復(fù)性不足以用于擴大規(guī)模。作為選擇，生產(chǎn)了將多個表達單元整合但是與單個的病毒基因座重組的載體(4-6)。這些載體的優(yōu)點在于它們在每一個受感染的細胞中生產(chǎn)全部的重組蛋白亞基，并導(dǎo)致顯著更高的重組蛋白復(fù)合物的產(chǎn)率。除此之外，由于僅有一種病毒表達所有的蛋白，感染的結(jié)果更加具有可重復(fù)性。這些載體的缺點是雙重的。首先，該載體含有重復(fù)的序列，并且所述的桿狀病毒表達促進同源組合、表達的蛋白質(zhì)，尤其是來自含有三個或者四個表達單元的蛋白質(zhì)，并且所述的蛋白質(zhì)通過大量的病毒傳代(其在工業(yè)規(guī)模中對于桿狀病毒蛋白質(zhì)表達是必要的)并不總是在遺傳上非常穩(wěn)定。第二，實踐中對于可以在大腸桿菌中容易保持和操作的插入物的大小有限制， 限制了可以從這些載體中表達的蛋白質(zhì)的數(shù)目。為了生產(chǎn)多種蛋白質(zhì)，提出的另一種方法是在桿狀病毒的一個基因座上插入外來蛋白質(zhì)，隨后選擇表達該蛋白的病毒，并使用該病毒基因組在第二個基因座上重組，從而表達其他的蛋白質(zhì)(7)。然而，由于在此方法中涉及的高水平的技術(shù)技能和時間的量(第一個座位16天以及各個隨后的座位各25天)，這種方法基本未曾使用。最近的開發(fā)旨在修飾基于BAC的Τη7轉(zhuǎn)位子，以便在桿狀病毒的第二個基因座中插入LoxP位點，從而使得能在大腸桿菌中的該座位上插入額外的基因(8)。然而， 本方法仍然存在下述問題，即在細菌載體中來自啟動子的復(fù)制的重復(fù)序列意味著對于多個病毒傳代而言，該構(gòu)建物在遺傳上不穩(wěn)定，并且轉(zhuǎn)移載體會迅速地達到在大腸桿菌中操作的最大實際尺寸。本發(fā)明的方法克服了現(xiàn)有方法中固有的至少一些問題，例如遺傳不穩(wěn)定性，以及對多輪重組的需要。根據(jù)第一個方面，本發(fā)明提供了用于將基因插入到桿狀病毒序列的基因座中的轉(zhuǎn)移載體，該轉(zhuǎn)移載體包括表達框，所述表達框包括與基因可操作地連接的真核啟動子；雙向選擇框，該雙向選擇框包括(i)編碼第一個選擇標記的可表達序列；和(ii)編碼第二個選擇標記的可表達序列；和位于表達和雙向選擇框側(cè)翼的序列，其中所述的序列大體上對應(yīng)于桿狀病毒序列中基因座的序列。本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體可以用于將基因有效地插入到桿狀病毒序列的基因座中，并選擇包含該基因的桿狀病毒序列。特別地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與使用單個選擇標記相比，通過使用雙向選擇框，陽性克隆(即含有所插入的基因的桿狀病毒序列)的鑒定獲得了大幅度增加。這與使用單個的選擇標記相比，具有顯著優(yōu)勢。僅有少量的桿狀病毒被轉(zhuǎn)化，所以標記僅僅以很低的水平表達。例如，如果該標記具有抗生素抗性，則只能使用非常低水平的抗生素。這導(dǎo)致了對細菌變體的選擇，該細菌變體對于所使用的抗生素具有抗性。因此，一些在平板上生長的細菌可以不含有修飾。使用兩種陽性選擇方法克服該假陽性的選擇。本發(fā)明的轉(zhuǎn)移載體可以是任意適用的載體，只要其能夠通過同源重組與桿狀病毒序列重組，從而將基因插入到桿狀病毒的序列中。適用的轉(zhuǎn)移載體對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是熟知的。所述的轉(zhuǎn)移載體的關(guān)鍵特征在下文中進一步地討論。插入到桿狀病毒序列中的基因可以是任意的異源基因(即非桿狀病毒基因)。優(yōu)選的是該異源基因編碼蛋白質(zhì)復(fù)合物的亞基。所述異源基因可以編碼病毒蛋白、受體的組分或者分子伴侶復(fù)合物。尤其優(yōu)選的是，該異源基因編碼病毒蛋白，該病毒蛋白與其他的病毒蛋白一起可以形成病毒樣顆粒(VLP)?；虿迦氲綏U狀病毒序列處的基因座可以是任意適用的基因座，該基因座允許所插入的基因的表達，并且不阻礙桿狀病毒序列復(fù)制的能力。此外，所使用的座位不應(yīng)該影響桿狀病毒感染細胞的能力，即復(fù)制或者從細胞傳播到細胞的能力。該座位包括多角體蛋白和PlO座位。此外，本發(fā)明人鑒定的其他適用的座位包括ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2 禾口 odv_e560所述的桿狀病毒序列可以是能夠在昆蟲細胞及原核細胞如大腸桿菌中復(fù)制的任何適用的桿狀病毒。特別地，可以使用含有BAC復(fù)制子的任何病毒性桿狀病毒基因組。適用的桿狀病毒序列包括AcMNPV桿粒。術(shù)語“表達框”指基因表達所需的元件的組合。因此，表達框包括適合的啟動子， 從而使得所編碼的基因在真核細胞細胞(即昆蟲細胞)中表達，以及位于基因序列側(cè)翼的適合的聚腺苷酸化信號序列。用于在真核細胞中表達基因的表達框?qū)τ诒绢I(lǐng)域的技術(shù)人員而言是熟知的。特別優(yōu)選的啟動子包括桿狀病毒晚期啟動子(例如P35)或者病毒性極晚期啟動子(例如多角體蛋白和PlO啟動子)。適合的聚腺苷酸化信號序列包括色氨酸羥化酶(Tph)聚腺苷酸化序列，或者來自桿狀病毒基因的聚腺苷酸化序列。 所述的表達框可以包含不止一個基因(例如2、3或者4個基因)，這導(dǎo)致不止一個基因的表達。然而，通常優(yōu)選的是所述表達框包括單個的基因。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)所述的雙向選擇框提高了已成功接受基因的克隆的鑒定和分離。所述的雙向選擇框包含2個不同的選擇標記。所述的框還包含在細菌細胞中表達標記所需的任意元件，如一個或多個細菌啟動子。選擇已接受基因的序列的步驟包括選擇包括兩個選擇標記的序列。這一選擇步驟在細菌細胞，如大腸桿菌中進行。所述的選擇標記可以是使得細胞含有要選擇的框的任何標記。例如，所述的標記可以是可視的，例如導(dǎo)致細胞或者菌落出現(xiàn)顏色或者顏色變化的標記?？蛇x地，該標記可以賦予例如對抗生素的抗性。兩個選擇標記可以是同樣類型的標記，例如耐受兩種不同的抗生素，或者不同類型的標記，例如抗生素抗性和可視的標記。第一個選擇標記優(yōu)選地為可視的標記，例如LacZalpha片段，該標記使得表達LacZalpha片段的細胞在IPTG和X_gal的存在下顯示藍色。第二個選擇標記優(yōu)選地是任意的賦予抗生素抗性的標記，例如對氯霉素、四環(huán)素、嘌呤霉素、氨芐西林、青霉素、 阿泊拉霉素、卡那霉素或者腐草霉素產(chǎn)生抗性。特別優(yōu)選的是，第二種標記賦予對腐草霉素的抗性。在優(yōu)選的實施方案中，所述的雙向選擇框的側(cè)翼為LoxP重組序列。在Cre重組酶的存在下，LoxP重組序列的聯(lián)合在一起，導(dǎo)致內(nèi)含子的缺失。因此，當將任意附加的基因插入到桿狀病毒序列中時，可以將所述的雙向選擇框除去，從而使得可以使用同樣的選擇標記。優(yōu)選地，對所述的LoxP位點進行修飾從而確保在位點之間僅發(fā)生單輪重組。適用的經(jīng)修飾的LoxP位點對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是已知的，例如經(jīng)修飾的Lox66和Lox71位
點ο在表達框和雙向選擇框側(cè)翼的序列基本上對應(yīng)于基因座的序列，使得在轉(zhuǎn)移載體和桿狀病毒序列之間能發(fā)生同源重組。每個側(cè)翼序列的長度優(yōu)選地至少20bp，更優(yōu)選地至少30bp，以及甚至更優(yōu)選地至少50bp，并且具有允許與基因座的序列發(fā)生特異性重組的序列。根據(jù)第二個方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)重組桿粒的方法，該方法包括將桿粒和根據(jù)本發(fā)明第一個方面的轉(zhuǎn)移載體結(jié)合在一起從而允許同源重組發(fā)生; 和選擇包含雙向選擇框的重組桿粒。重組桿粒可以使用標準技術(shù)進行選擇，所述的技術(shù)取決于所述雙向選擇框。用于生產(chǎn)重組桿粒的方法可以額外地包括檢測桿?；蛘咂浔磉_產(chǎn)物中基因的存在。根據(jù)具體的基因可以使用合適的篩選方法。除此之外，如果選擇框側(cè)翼是LoxP重組序列，則所述的方法優(yōu)選地包括在LoxP位點之間誘導(dǎo)重組，例如，通過將桿粒暴露于Cre重組酶，從而將雙向選擇框除去。所述的Cre 重組酶優(yōu)選地由可誘導(dǎo)啟動子，例如阿拉伯糖啟動子控制。除去雙向選擇框的優(yōu)點在于，可以將另外的轉(zhuǎn)移載體與該桿粒進行重組，其中所述的另外的轉(zhuǎn)移載體包含相同的雙向選擇框?？梢允褂门c下述第一輪重組中相同的技術(shù)選擇用于進一步重組的桿粒。一般地說，生產(chǎn)重組桿粒的方法在原核細胞中進行，由于基于原核細胞的系統(tǒng)的操作更容易，也更快。優(yōu)選的是，所述的基于原核細胞的系統(tǒng)是有助于同源重組的，該系統(tǒng)包括 λ red 重組系統(tǒng)(lambda red recombination system)，其描述于第 EP-A-U91420 號歐洲專利申請中。優(yōu)選地，生產(chǎn)重組桿粒的方法在大腸桿菌中進行。尤其優(yōu)選的是，使用大腸桿菌細胞系EL350進行該方法，大腸桿菌細胞系EL350具有在溫度調(diào)節(jié)的λ PL啟動子的控制下，表達exo、bet和gam的整合的λ原噬菌體，以及在阿拉伯糖可誘導(dǎo)啟動子的控制下的Cre重組酶。生產(chǎn)重組桿粒的方法可以重復(fù)多次，所以該桿?？梢院卸鄠€異源基因，S卩1、2、 3、4、5、6、7、8個或者更多的異源基因。通過努力將不同的啟動子用于表達各個插入的基因， 并且由于各個基因插入在不同的基因座上，因此有可能減少或者避免在桿粒中有重復(fù)的序列，從而確保桿粒具有好的遺傳穩(wěn)定性。進一步優(yōu)選的是，至少有一個必需基因位于各個插入的異源基因之間。此種排列確保了如果在任意的插入的序列之間發(fā)生同源重組，則必需基因?qū)⑷笔?，從而產(chǎn)生無活性的桿粒。根據(jù)第三個方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的第二個方面的方法得到的重組桿粒。所述的桿粒包括插入的基因，并且也可以包括LoxP序列的剩余部分。這些剩余部分可以用作鑒定桿粒的標記。所述的桿粒優(yōu)選地含有至少6、7、8或9個異源基因。根據(jù)第四個方面，本發(fā)明還提供了生產(chǎn)重組桿狀病毒的方法，該方法包括培養(yǎng)含有重組桿粒的真核細胞，所述的重組桿粒通過根據(jù)本發(fā)明的第二個方面的方法得到，從而生產(chǎn)桿狀病毒。優(yōu)選地，所述的真核細胞是昆蟲細胞，更優(yōu)選地得自昆蟲草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)或者粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)，例如(Sf21、Sf9 或者 TN 5B-1-4)昆蟲細胞。可以使用標準技術(shù)分離桿狀病毒，并可以檢測所插入的異源基因的表達。根據(jù)第五個方面，本發(fā)明還提供了由根據(jù)本發(fā)明第四個方面的方法得到的重組桿狀病毒。根據(jù)第六個方面，本發(fā)明還提供了表達多種異源蛋白質(zhì)的重組桿?；蛘咧亟M桿狀病毒，其中各個蛋白質(zhì)從所述桿?；蛘邨U狀病毒的單獨基因座上表達。進一步優(yōu)選的是，至少一個必需基因位于各個表達異源蛋白質(zhì)的基因座之間。此種排列確保了如果在表達異源基因的基因座之間發(fā)生同源重組，則非必需基因?qū)⑷笔?，從而產(chǎn)生無活性的桿?；驐U狀病毒。優(yōu)選地，桿粒或者桿狀病毒表達至少3種，更優(yōu)選地至少5種，以及最優(yōu)選地至少8種蛋白質(zhì)。所述的蛋白質(zhì)是異源的，即其不由天然存在的桿狀病毒編碼。進一步優(yōu)選的是，所編碼的異源蛋白質(zhì)是蛋白質(zhì)復(fù)合物的亞基，所述的蛋白質(zhì)復(fù)合物如VLP、受體復(fù)合物或者分子伴侶復(fù)合物。進一步優(yōu)選的是，重組桿粒或者桿狀病毒的分離的基因座選自ctx、egt、39k、 orf51、gp37、iap2、odv_e56和plO。參考下表1中的桿狀病毒AcMNPV對該基因座的位置進行具體描述。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠使用此信息，容易地確定在其他桿狀病毒毒株和桿粒中的座位的位置。表 1對照AcMNPV(保藏編號為NC001623)的參考保藏序列對以上提及的基因座定義如下。
權(quán)利要求
1.一種用于將基因插入到桿狀病毒序列的基因座中的轉(zhuǎn)移載體，所述轉(zhuǎn)移載體包括 表達框，所述表達框包括可以與基因可操作地連接的真核啟動子；雙向選擇框，所述雙向選擇框包括(i)編碼第一個選擇標記的可表達序列；和( )編碼第二個選擇標記的可表達序列；和位于表達框和雙向選擇框側(cè)翼的序列，其中所述的序列大體上對應(yīng)于桿狀病毒序列中的基因座的序列。
2.權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)移載體，其中，所述第一個選擇標記是可視的標記。
3.權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)移載體，其中，所述第一個標記是LacZalpha片段。
4.權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)移載體，其中，所述第二個選擇標記賦予對抗生素的抗性。
5.權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)移載體，其中，所述抗生素抗性基因賦予對腐草霉素的抗性。
6.前述任一項權(quán)利要求所述的轉(zhuǎn)移載體，其中，所述雙向選擇框的側(cè)翼為LoxP重組序列。
7.權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)移載體，其中，對所述LoxP序列進行修飾，從而確保僅能發(fā)生單輪重組。
8.前述任一項權(quán)利要求所述的轉(zhuǎn)移載體，其中，位于表達框和雙向選擇框側(cè)翼的序列基本上對應(yīng)于下列任一基因座的序列:ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2、odv_e56和plO。
9.一種用于生產(chǎn)重組桿粒的方法，所述方法包括將桿粒和根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的轉(zhuǎn)移載體放到一起，從而使其發(fā)生同源重組；和選擇包含表達框和雙向選擇框的重組桿粒。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述轉(zhuǎn)移載體是權(quán)利要求6或者權(quán)利要求7中所定義的轉(zhuǎn)移載體，所述方法還包括引起LoxP序列之間重組，從而從桿粒中去除選擇框。
11.一種用于生產(chǎn)重組桿狀病毒的方法，所述方法包括通過權(quán)利要求9或者權(quán)利要求 10的方法生產(chǎn)重組桿粒，并培養(yǎng)含有所述桿粒的真核細胞，從而生產(chǎn)桿狀病毒。
12.一種通過權(quán)利要求9或者權(quán)利要求10的方法得到的重組桿粒。
13.一種通過權(quán)利要求11的方法得到的重組桿狀病毒。
14.一種表達多種蛋白質(zhì)的重組桿粒，其中，每種蛋白質(zhì)在桿粒的分開的基因座上表達。
15.一種表達多種蛋白質(zhì)的重組桿狀病毒，其中，每種蛋白質(zhì)在桿狀病毒的分開的基因座上表達。
16.權(quán)利要求14所述的重組桿?；蛘邫?quán)利要求15所述的重組桿狀病毒，其中，所述多種蛋白質(zhì)相互作用以形成蛋白質(zhì)復(fù)合物。
17.權(quán)利要求16所述的重組桿?；蛘咧亟M桿狀病毒，其中，所述蛋白質(zhì)復(fù)合物是病毒樣顆?；蛘叻肿影閭H復(fù)合物。
18.權(quán)利要求14所述的重組桿粒或者權(quán)利要求15所述的重組桿狀病毒，其中，所述分開的基因座選自 ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2 和 odv_e56。
19.一種重組桿?；蛘咧亟M桿狀病毒，其中，將編碼重組蛋白質(zhì)的表達框插入到以下的一個或者多個基因座中ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2 和 odv_e56。
20.一種用于將基因插入到桿狀病毒序列的基因座中的轉(zhuǎn)移載體，所述轉(zhuǎn)移載體包括表達框，所述表達框包括與基因可操作地連接的真核啟動子；和位于表達框側(cè)翼的序列，其中，所述的序列基本上對應(yīng)于桿狀病毒序列中的基因座的序列，其中所述的基因座選自ctx、egt、39k、orf51、gp37、iap2和odv_e56。
21.一種用于生產(chǎn)重組桿粒的方法，所述方法包括將桿粒和根據(jù)權(quán)利要求19所述的轉(zhuǎn)移載體放到一起，從而使其發(fā)生同源重組；和選擇包含表達框的重組桿粒。
22.一種用于生產(chǎn)重組桿狀病毒的方法，所述方法包括通過權(quán)利要求21所述的方法生產(chǎn)重組桿粒，和培養(yǎng)含有所述桿粒的真核細胞，從而生成桿狀病毒。
23.一種通過權(quán)利要求21的方法得到的重組桿粒。
24.一種通過權(quán)利要求22的方法得到的重組桿狀病毒。
25.一種細胞，所述細胞含有根據(jù)權(quán)利要求1至8和20中任一項所述的轉(zhuǎn)移載體、根據(jù)權(quán)利要求12、14、16至19和23中任一項所述的桿粒、或者根據(jù)權(quán)利要求13、15至19和M 中任一項所述的桿狀病毒。
26.一種用于生產(chǎn)一種或者多種蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括在適宜的條件下，培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求12、14、16至19和23中任一項所述的重組桿粒，或者根據(jù)權(quán)利要求13、15至19 和M中任一項所述的桿狀病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于將基因插入到桿狀病毒序列的基因座中的轉(zhuǎn)移載體。所述轉(zhuǎn)移載體包括表達框，該表達框包括與基因可操作地連接的真核啟動子，和雙向選擇框。本發(fā)明還涉及使用該轉(zhuǎn)移載體及衍生的桿粒和桿狀病毒的方法。
文檔編號C12N15/866GK102245777SQ200980144325
公開日2011年11月16日 申請日期2009年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月11日
發(fā)明者P·羅伊, R·J·諾德 申請人:倫敦衛(wèi)生及熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院