專利名稱：在氮限制條件下具有改變的農學特性的植物和涉及編碼lnt6多肽及其同源物的基因的相 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明領域涉及植物育種和遺傳學，具體地講涉及植物中可用的賦予氮利用效率和/或氮限制條件耐受性的重組DNA構建體。
背景技術：
世界范圍內非生物脅迫顯著地限制了作物產量。據(jù)評估這些因素累積地造成平均 70%的農業(yè)產量減少。植物是固著的，必須適應它們周邊的主要環(huán)境條件。這已經導致它們發(fā)展出基因調控、形態(tài)發(fā)生和代謝的高可塑性。適應和防御機制策略涉及激活編碼對適應或防御不同脅迫重要的蛋白。植物氮吸收在它們的生長中起到重要作用(Gallais等人，J. Exp. Bot. 55(396) 295-306 Q004))。植物從環(huán)境中的無機氮合成氨基酸。因此，氮肥已經成為提高栽培植物如玉米和大豆的產量有力工具。為了避免硝酸鹽污染并保持足夠的利潤率，如今農民期望減少氮肥的使用。如果能提高植物的氮同化能力，然后就能期望植物生長和產量的提高。概括地說，具有更好的氮利用效率(NUE)的植物品種是所期望的?？衫眉せ顦擞泚龛b定能影響性狀的基因。已經在模型植物擬南芥屬中使用該方法(Weigel等人，Plant Physiol. 122 1003-1013 (2000))。插入轉錄增強子元件能夠顯著激活和/或提高附近內源基因的表達。這種方法可以用于鑒定特定性狀(例如植物的氮利用效率)的受關注的基因，當所述基因作為轉基因進入生物中時能夠改變該性狀。發(fā)明概述本發(fā)明包括在一個實施方案中，在基因組中包含重組DNA構建體的植物，所述重組DNA構建體包含可操作地連接到至少一種調控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO :18、20、22、24、洸、28、30、31、33、 37、38、40、41、42、43、44、45、46或47進行比較時具有至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出提高的氮脅迫耐受性。 在另一個實施方案中，在基因組中包含重組DNA構建體的植物，所述重組DNA構建體包含可操作地連接到至少一種調控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與SEQ ID NO :18、20、22、對、26、沘、30、31、 33、37、38、40、41、42、43、44、45、46或47進行比較時具有至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出至少一種農學特性的改變。任選地，在氮限制條件下與未包含所述重組DNA構建體的所述對照植物比較時，所述植物表現(xiàn)出所述至少一種農學特性的所述改變。在另一個實施方案中，所述至少一種農學特性選自在綠度、產量、生長速率、生物量、成熟時的鮮重、成熟時的干重、果實產量、種子產量、總植物含氮量、果實含氮量、種子含氮量、營養(yǎng)組織含氮量、總植物游離氨基酸含量、營養(yǎng)組織游離氨基酸含量、果實游離氨基酸含量、種子游離氨基酸含量、總植物蛋白質含量、果實蛋白質含量、種子蛋白質含量、營養(yǎng)組織蛋白質含量、耐旱性、氮攝取、根倒伏、收獲指數(shù)、莖倒伏、植株高度、穗高、穗長、早期幼苗活力、和低溫脅迫下的出苗。在另一個實施方案中，所述至少一種農學特性為產量或生物量并且所述改變?yōu)樘岣?。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括本發(fā)明的任何植物，其中所述植物選自玉米、 大豆、卡諾拉(canola)、稻、小麥、大麥和高粱。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括本發(fā)明的任何植物的種子，其中所述種子在其基因組中包含重組DNA構建體，所述重組DNA構建體包含可操作地連接至少一種調控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與 SEQ ID NO :18、20、22、24、洸、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46、或 47 進行比較時具有至少50%的序列同一性，并且其中所述種子產生的植物在與不包含所述重組 DNA構建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出提高的氮脅迫耐受性或至少一種農學特性的改變，或者兩者皆有。在另一個實施方案中，增加植物氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括(a)將重組 DNA構建體引入到可再生的植物細胞中，該重組DNA構建體包含可操作地連接至少一種調控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與 SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46、或 47進行比較時具有至少50%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細胞再生出轉基因植物，其中該轉基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構建體；和(c) 獲得源自步驟(b)的轉基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含該重組 DNA構建體，并且在與不包含該重組DNA構建體的對照植物比較時表現(xiàn)出提高的氮脅迫耐受性。在另一個實施方案中，評價植物氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括(a)將重組 DNA構建體引入到可再生的植物細胞中，該重組DNA構建體包含可操作地連接至少一種調控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與 SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46、或 47進行比較時，具有至少50%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細胞再生出轉基因植物，其中該轉基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構建體；(c)獲取來源于所述轉基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構建體；以及(d)評價該轉子代植物在與不包含該重組DNA構建體的對照植物進行比較時的氮脅迫耐受性。在另一個實施方案中，測定植物至少一種農學特性的改變的方法，所述方法包括 (a)將重組DNA構建體引入到可再生的植物細胞中，該重組DNA構建體包含可操作地連接至少一種調控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、 44、45、46、或47進行比較時具有至少50%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細胞再生出轉基因植物，其中該轉基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構建體；(c)獲取來源于轉基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構建體；以及(d)測定該子代植物在與未包含該重組DNA構建體的對照植物比較時是否表現(xiàn)出至少一種農學特性的改變。任選地，所述測定步驟(d)包括測定所述轉基因植物在氮限制條件下與未包含所述重組DNA構建體的對照植物比較時是否表現(xiàn)出至少一種農學特性的改變。在另一個實施方案中，所述至少一種農學特性選自在綠度、產量、生長速率、生物量、成熟時的鮮重、成熟時的干重、果實產量、種子產量、總植物含氮量、果實含氮量、種子含氮量、營養(yǎng)組織含氮量、總植物游離氨基酸含量、營養(yǎng)組織游離氨基酸含量、果實游離氨基酸含量、種子游離氨基酸含量、總植物蛋白質含量、果實蛋白質含量、種子蛋白質含量、營養(yǎng)組織蛋白質含量、耐旱性、氮攝取、根倒伏、收獲指數(shù)、莖倒伏、植株高度、穗高、穗長、早期幼苗活力、和低溫脅迫下的出苗。在另一個實施方案中，所述至少一種農學特性為產量或生物量并且所述改變?yōu)樘?br> 尚ο在另一個實施方案中，本發(fā)明包括本發(fā)明的任何方法，其中所述植物選自玉米、 大豆、卡諾拉、稻、小麥、大麥和高粱。在另一個實施方案中，本發(fā)明包括分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含 (a)編碼多肽的核苷酸序列，其中SEQ ID N0:20、M、26J8、37或40的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法具有至少或 71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、 81 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 92%,93%,94%,95%, 96%、97%、98%、99%、100%的序列同一性，或(b)所述核苷酸序列的全長互補序列，其中所述全長互補序列和所述核苷酸序列由相同數(shù)目的核苷酸組成并且是100%互補的。所述多肽可包含SEQ ID N0:20、M、26J8、37或40的氨基酸序列，并且所述核苷酸序列可包含 SEQ ID NO :19、23、25、27、36 或 39 的核苷酸序列。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明任何分離的多核苷酸的重組DNA構建體，所述分離的多核苷酸可操作地連接到至少一個調控序列，并且本發(fā)明涉及包含所述重組DNA構建體的細胞、植物和種子。所述細胞可為真核細胞，例如酵母、昆蟲或植物細胞， 或者可為原核細胞，例如細菌。附圖簡述和序列表根據(jù)以下的詳細描述和附圖以及序列表，可更全面地理解本發(fā)明，以下的詳細描述和附圖以及序列表形成本申請的一部分。

圖1示出pHSbarENDs2活化標記構建體的圖譜，該構建體用于制備擬南芥屬種群 (SEQ ID NO 1)ο圖 2 示出載體 pDONR Zeo (SEQ ID NO :2)，GATEWAY 供體載體的圖譜。attPl 位點位于核苷酸570-801 ；attP2位點位于核苷酸27M-2985 (互補鏈)。圖 3 示出載體 pDONR 221 (SEQ ID NO :3)，GATEWAY 供體載體的圖譜。attPl 位點位于核苷酸570-801 ；attP2位點位于核苷酸27M-2985 (互補鏈)。
圖4示出載體pBC-yell0W(SEQ ID NO 4)的圖譜，該載體是用于構建擬南芥屬表達載體的目的載體。attRl位點位于核苷酸11276-11399(互補鏈)；attR2位點位于核苷酸9695-9819 (互補鏈)。圖5示出載體PHP27840 (SEQ ID NO 5)的圖譜，該載體是用于構建大豆表達載體的目的載體。attRl位點位于核苷酸7310-7434 ；attR2位點位于核苷酸8890-9014。圖6示出載體PHP23236(SEQ ID NO 6)的圖譜，它是用于構建Gaspe Flint來源的玉米品系的表達載體的目的載體。attRl位點位于核苷酸2006-2130 ；attR2位點位于核苷酸 2899-3023。圖7示出載體PHP10523 (SEQ ID NO :7)的圖譜，該載體是存在于農桿菌菌株 LBA4404 中的質粒 DNA(Komari 等人，Plant J. 10 165-174(1996) ；NCBI 通用標識符 59797027)。圖8示出載體PHP23235 (SEQ ID NO 8)的圖譜，它是用于構建目的載體PHP23236 的載體。圖 9 示出載體 PHP20234(SEQ ID NO 9)的圖譜。圖10示出目的載體PHP22655(SEQ ID NO 10)的圖譜。圖11示出用于篩選的五個品系(標記為1至5-每個品系有十一個個體)，加上野生型對照品系Cl (九個個體)的典型網格圖案。圖12示出通過圖像分析測定的若干個不同硝酸鉀濃度對植物顏色的效應。綠色區(qū)(色調50至66)對氮劑量的響應證明該區(qū)可被用于指示氮同化作用。圖13為實施例18中用于半水栽玉米生長的培養(yǎng)基。圖14是列出實施例18中與不同硝酸鹽濃度對Gaspe Flint衍生的玉米系生長和發(fā)育的影響相關的數(shù)據(jù)的圖表。圖15A-15G示出擬南芥LNT6多肽(SEQ ID NO 30)的全長氨基酸序列與SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28、31、33、37、和 38 的 LNT6 同源物的多重比對。圖16示出圖15A-15G中顯示的每對氨基酸序列的序列同一性百分比和趨異值的圖表。本文所附的序列描述和序列表遵循在37 C. F. R. § 1. 821-1. 825中所列出的用于專利申請公開中的核苷酸和/或氨基酸序列的規(guī)定。序列表包含遵循IUPAC-IUBMB標準的核苷酸序列的單字母編碼和氨基酸序列的三字母編碼，IUPAC-IUBMB標準描述于Nucleic Acids Res. 13 :3021-3030 (1985)和 Biochemical J. 219(2) :345_373 (1984)中，它們引入本文以供參考。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號和格式遵循在37 C.F.R. § 1.822中所列出的規(guī)定。表1列出了本文所述的某些多肽、包含編碼多肽全部或其主要部分的核酸片段的 cDNA克隆的命名、以及在所附序列表中使用的對應標識符(SEQ ID NO:))。^ 1耐低氮蛋白(LNT)
權利要求
1.在基因組中包含重組DNA構建體的植物，所述重組DNA構建體包含可操作地連接到至少一種調控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、 44、45、46、或47進行比較時具有至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出提高的氮脅迫耐受性。
2.在基因組中包含重組DNA構建體的植物，所述重組DNA構建體包含可操作地連接到至少一種調控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、 44、45、46、或47進行比較時具有至少50%的序列同一性，并且其中所述植物在與不包含所述重組DNA構建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出至少一種農學特性的改變。
3.權利要求2的植物，其中所述至少一種農學特性是選自下列的至少一種綠度、產量、生長速率、生物量、成熟時的鮮重、成熟時的干重、果實產量、種子產量、總植物含氮量、 果實含氮量、種子含氮量、總植物游離氨基酸含量、果實游離氨基酸含量、種子游離氨基酸含量、果實蛋白質含量、種子蛋白質含量、營養(yǎng)組織蛋白質含量、耐旱性、氮攝取、根倒伏、收獲指數(shù)、莖倒伏、植株高度、穗高、穗長、早期幼苗活力、和低溫脅迫下的出苗。
4.權利要求2或權利要求3的植物，其中在氮限制條件下與未包含所述重組DNA構建體的所述對照植物比較時，所述植物表現(xiàn)出所述至少一種農學特性的所述改變。
5.權利要求2至4中任一項的植物，其中所述至少一種農學特性是產量或生物量，并且進一步地，其中所述改變是提高。
6.權利要求1至5中任一項的植物，其中所述植物選自玉米、大豆、卡諾拉、稻、小麥、 大麥和高粱。
7.權利要求1至6中任一項的植物的種子，其中所述種子在其基因組中包含重組DNA 構建體，所述重組DNA構建體包含可操作地連接到至少一種調控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比對方法在與18、20、22、24、 26、28、30、31、33、37、38、40、41、42、43、44、45、46 或 47 進行比較時具有至少 50% 的序列同一性，并且其中從所述種子產生的植物在與不包含所述重組DNA構建體的對照植物進行比較時表現(xiàn)出提高的氮脅迫耐受性或至少一種農學特性的改變，或者它們兩者。
8.增加植物氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括(a)將重組DNA構建體弓丨入到可再生的植物細胞中，所述重組DNA構建體包含可操作地連接到至少一種調控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、 42、43、44、45、46或47進行比較時具有至少50%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細胞再生出轉基因植物，其中所述轉基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構建體；和(c)獲得源自步驟(b)的轉基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構建體，并且在與不包含該重組DNA構建體的對照植物比較時表現(xiàn)出提高的氮脅迫耐受性。
9.評估植物氮脅迫耐受性的方法，所述方法包括(a)將重組DNA構建體引入到可再生的植物細胞中，所述重組DNA構建體包含可操作地連接到至少一種調控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、 42、43、44、45、46或47進行比較時具有至少50%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細胞再生出轉基因植物，其中所述轉基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構建體；(c)獲得源自所述轉基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構建體；和(d)評價所述子代植物在與不包含所述重組DNA構建體的對照植物進行比較時的氮脅迫耐受性。
10.測定植物農學特性的改變的方法，所述方法包括(a)將重組DNA構建體弓丨入到可再生的植物細胞中，所述重組DNA構建體包含可操作地連接到至少一種調控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼多肽，所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V 比對方法在與 SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28、30、31、33、37、38、40、41、 42、43、44、45、46或47進行比較時具有至少50%的序列同一性；(b)在步驟(a)之后，從所述可再生的植物細胞再生出轉基因植物，其中所述轉基因植物在其基因組中包含所述重組DNA構建體；(c)獲得源自所述轉基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因組中包含所述重組DNA構建體；和(d)測定所述子代植物在與未包含所述重組DNA構建體的對照植物比較時是否表現(xiàn)出至少一種農學特性的改變。
11.權利要求10的方法，其中所述測定步驟(d)包括測定所述轉基因植物在氮限制條件下與未包含所述重組DNA構建體的對照植物比較時是否表現(xiàn)出至少一種農學特性的改變。
12.權利要求10或權利要求11的方法，其中所述至少一種農學特性是選自下列的至少一種綠度、產量、生長速率、生物量、成熟時的鮮重、成熟時的干重、果實產量、種子產量、 總植物含氮量、果實含氮量、種子含氮量、總植物游離氨基酸含量、果實游離氨基酸含量、種子游離氨基酸含量、果實蛋白質含量、種子蛋白質含量、營養(yǎng)組織蛋白質含量、耐旱性、氮攝取、根倒伏、收獲指數(shù)、莖倒伏、植株高度、穗高、穗長、早期幼苗活力、和低溫脅迫下的出苗。
13.權利要求10至12中任一項的方法，其中所述至少一種農學特性是產量或生物量， 并且進一步地，其中所述改變是提高。
14.權利要求8至13中任一項的方法，其中所述植物選自玉米、大豆、卡諾拉、稻、小麥、大麥和高粱。
15.分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含(a)編碼具有LNT6多肽活性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽的氨基酸序列基于 Clustal V比對方法在與SEQ ID NO :20、對、26、沘、37或40進行比較時具有至少90%的序列同一性，其中所述Clustal V比對方法采用以下逐對比對默認參數(shù)=KTUPLE = 1，GAP PENALTY = 3，WINDOW = 5，和 DIAGONALS SAVED = 5，或(b)(a)的核苷酸序列的全長互補序列。
16.權利要求15的多核苷酸，其中所述多肽的氨基酸序列包括SEQID NO =20,24,26,`28,37.或 40。
17.權利要求15的多核苷酸，其中所述核苷酸序列包括SEQID NO 19、23、25、27、36或39。
18.包含重組DNA構建體的植物或種子，其中所述重組DNA構建體包含可操作地連接到至少一種調控序列的權利要求15至17中任一項的多核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了尤其可用于在氮限制條件下改變植物農學特性的分離的多核苷酸和多肽以及重組DNA構建體，包含這些重組DNA構建體的組合物(如植物或種子)、以及利用這些重組DNA構建體的方法。所述重組DNA構建體包含可操作地連接至在植物中有功能的啟動子的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼LNT6多肽或其同源物。
文檔編號C12N15/82GK102203263SQ200980143409
公開日2011年9月28日 申請日期2009年9月9日 優(yōu)先權日2008年10月29日
發(fā)明者D·勞塞爾特, H·薩凱, M·奧克曼, S·M·艾倫, S·V·廷蓋, S·盧克 申請人:先鋒國際良種公司, 納幕爾杜邦公司