專利名稱：一種甘藍(lán)型油菜品種ssr指紋的快捷檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種甘藍(lán)型油菜品種SSR指紋的快速檢測 方法，具體而言是一種利用SSR標(biāo)記進(jìn)行甘藍(lán)型油菜遺傳多樣性和品種真?zhèn)巍㈦s種純度的 快速檢測、鑒定方法。
背景技術(shù)：
眾所周知，與植物性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記主要包括四種類型，即形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo) 記、生化標(biāo)記和分子標(biāo)記。形態(tài)標(biāo)記數(shù)目很少，且許多標(biāo)記對植物育種利用來說是有害性 狀，因而難以廣泛應(yīng)用。細(xì)胞標(biāo)記通常僅能依靠染色體核型和帶型的差異，因而數(shù)量也十分 有限，難以廣泛應(yīng)用。生化標(biāo)記(也稱為同工酶標(biāo)記)以基因表達(dá)的產(chǎn)物為特征，因其在結(jié) 構(gòu)上的多樣性某種程度上能夠準(zhǔn)確反映植物DNA水平上的差異和遺傳多樣性，因而一直以 來得到一定程度上的發(fā)展和應(yīng)用。但因基因的表達(dá)易受發(fā)育時(shí)期的影響，且易受環(huán)境條件 的影響，因此數(shù)量及應(yīng)用上也存在明顯的局限性。二十世紀(jì)八十年代以來，現(xiàn)代分子生物學(xué) 的形成與快速發(fā)展為人類開發(fā)新型植物標(biāo)記奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，形成了檢測基于DNA 水平上變異的技術(shù)方法，也就是分子標(biāo)記技術(shù)。與形態(tài)、細(xì)胞、生化等標(biāo)記技術(shù)相比，分子標(biāo) 記更具有優(yōu)越性檢測對象是DNA片段，因此不受環(huán)境條件的限制，可用植物的任何發(fā)育時(shí) 期的任何組織進(jìn)行分析；理論上數(shù)量無限多(遍及整個(gè)植物基因組)；表現(xiàn)為中性，既不影 響目標(biāo)性狀的表達(dá)，也與不利性狀無必然的連鎖；多態(tài)性高，通過引物或探針即可完成全基 因組分析；部分標(biāo)記為共顯性，可以鑒別基因型(純合或雜合)。 迄今，科學(xué)工作者開發(fā)形成的分子標(biāo)記技術(shù)包括有RFLP、 RAPD、 SCAR、 AFLP、 SSR、 ISSR、 EST、 SNP、 STS、 RBM、 SRAP、 TRAP等。SSR也稱為微衛(wèi)星標(biāo)記，它是一種基于PCR擴(kuò)增 的DNA標(biāo)記技術(shù)。其原理是根據(jù)微衛(wèi)星片段的兩端互補(bǔ)序列設(shè)計(jì)引物，通過擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn) 物的凝膠分離，依據(jù)分離片段的有無和大小決定基因型并計(jì)算等位基因的頻率。因其具有 數(shù)量豐富、共顯性、重復(fù)性好、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于植物遺傳圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣 性分析、植物品種真?zhèn)涡詸z測及雜種純度鑒定等方面。 油菜基因組中存在大量SSR標(biāo)記位點(diǎn)。但研究工作者發(fā)現(xiàn)，并非所有SSR引物具 有同等檢測效率，多數(shù)引物多態(tài)性檢測效率一般，而有些引物檢測效率極低。因此，通常的 做法是在進(jìn)行資源多樣性分析或品種真?zhèn)舞b定時(shí)，先隨機(jī)挑選3至8份材料進(jìn)行引物篩 選，然后利用篩選出的多態(tài)性較好的引物分析全部材料；在進(jìn)行圖譜構(gòu)建和雜種純度鑒定 分析時(shí)，先用雙親篩選出多態(tài)性好的引物，然后利用篩選出的引物分析分離群體或雜種&。 顯然，這是一個(gè)十分繁瑣且費(fèi)時(shí)、費(fèi)錢的過程。針對這些問題，本發(fā)明人收集了目前油菜上 開發(fā)并公布的SSR引物，重新進(jìn)行了大量的引物篩選，改良并優(yōu)化了現(xiàn)有油菜基因組DNA提 取方法，建立了一種快速、高效的甘藍(lán)型油菜品種指紋檢測方法，可用于商業(yè)用雜種純度鑒 定、品種真?zhèn)螜z測和育種材料及種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種甘藍(lán)型油菜品種特異SSR指紋的高效、快速、簡便的檢 測方法。該方法可用于甘藍(lán)型油菜遺傳材料的多樣性分析，品種真?zhèn)涡澡b別和雜種純度鑒 定方面。 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案 —種甘藍(lán)型油菜品種SSR指紋的快捷檢測方法，其步驟如下 A、采用CTAB小量法提取待測甘藍(lán)型油菜樣品基因組DNA ; B、采用如序列表SEQ ID NO :1-40所示的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述的引物的核苷酸 序列如序列表SEQ ID NO :1-40所示; C、將步驟B的擴(kuò)增產(chǎn)物用聚丙烯胺凝膠電泳分離，經(jīng)顯影、定影得到樣品的指紋 圖譜。 本發(fā)明的貢獻(xiàn)還在于，對現(xiàn)有的從油菜幼嫩組織中提取基因組DNA的方法進(jìn)行了 改良和優(yōu)化，只需要一次純化就可以得到用于指紋分析的DNA樣品。其具體步驟(即上述 步驟A)如下將幼嫩植株或葉片放入研缽中加0. 75-1. Oml CTAB抽提緩沖液，立即用研磨 棒將其搗碎成勻漿，再移入2. OmL離心管中，然后在55°C _601:水浴45_60min，其間輕輕地
上下?lián)u動，取出離心管冷卻至室溫，再加等體積的體積比為25 : 24 : i的苯酚氯仿
異戊醇或用等體積的體積比為24 : 1的氯仿異戊醇充分混勻10-20min， 12000r/min離 心12-15min，轉(zhuǎn)移上清液到另一個(gè)2. OmL離心管中，在裝有上清液的離心管中加入60ul 5mmol/LNH4AC，然后再加入2倍體積的預(yù)先冰凍的無水乙醇或異丙醇沉淀DNA，在-2(TC放 置l-2hrs或過夜，用槍頭挑出或10000r/min離心3min沉淀DNA，再用含10mM NH4Ac 70% 乙醇氨浸泡DNA 5hrs，除去乙醇溶液，在室溫下或通風(fēng)櫥中干燥DNA，再加300 y 1 TE緩沖 溶液或300 ii 1 ddH20溶解DNA， -2(TC保存?zhèn)溆茫?
其中 CTAB抽提緩沖液成份為2% CTAB， 1. 4M NaCl，20mM EDTA，0.2% P巰基乙醇， lOOmMTris-HCl， pH 8. O，加水定容至1L ;TE緩沖溶液配制方法如下500ml TE緩沖液中含10mM Tris-HCl和ImM EDTA-Na2，pH 8. 0， 121。C滅菌后室溫保存。
這些引物的具體序列見表1。
表l本發(fā)明的引物序列
4引物對代薛正向引物序列反向引物序列
1ACGAAGTGGGTTAGTAGGCG (序列1)GAAGCCTTTCTCCACCATTG (序列2)
2TTGAAGTAGTTGGAGTAATTGGAGG (序列3)CAGCAGCCACAACCTTACG (序列4)
3AATTTAAACCTCATTTTCTTC (序列5)ACCTCCATTGTGTCTGAT (序列6)
4CGGCTTGTAAACCTTG (序列40)GACTCGAAAATCACTAACAC (序列7)
5CTGCACATTTGAAATTGGTC (序列8)AAATCAACGCTTACCCACT (序列9)
6ATTCATCTCCTGCTCGCTTAG (序列10)AAACCCAAACCAAAGTAAGAA (序列11)
7CTAGGCTAAGGAAGATTGTCA (序列12)TAGTTTCTl'CCTCCTGCTATC (序列13)
8ATTGGTCTCTTAACCCGC (序列14)TTCTCGAATCCCTCGAA (序列15)
9TACAGGTTCCTTGCGATG (序列16)ATGGACGAGACAACATGG (序列17)
10AGGCGAGTTTACGAGGAT (序列18)ACCTGCACCAGTCATTTG (序列19)
11GAGACGATGCAAAGATCG (序列20)TGCAGACACATTCGAACA (序列21)
12CATTCACAGGACCAGAGC (序列22)CAAAGCCAAGACAACCAT (序列23)
13CGGTCAGATTCCAACAGA (序列24)GCCATCTCAGAGACGACA (序列25)
14TCCCAACAAAAGAGTCCA (序列26) CAGCGAACCGAGTCTAAA (序列27)
15TTGTGTTTTGCCTTCTGA (序列28)TTTGCGCACAAACAATAA (序列29)
16CGTTGGCAAAAAGCCTACTC (序列30)CTCAGGGACGTCGTAAGAGC (序列31)
17TTGCTTCCAGAGATCTGGTTC (序列32)TGCGACTACTAAATTGTCGTGTT(序列33)
18GCGATCTCCTCAGGCATAGT (序列34)CCACGCAAGCTGAAACATAA (序列35)
19CCGGCTTGGTTCGATACTTA (序列36)TTGCGAATCTTTAAGGGACG (序列37)
20CACACCCTTACCACGTTCCT (序列38)GCAACAAAGCATACTTCGCA (序列39) 其中，基因組DNA提取方法如下 選取待測甘藍(lán)型油菜材料幼嫩植株(或葉片)，采用CTAB小樣法并稍作改進(jìn)，提 取基因組總DNA見文獻(xiàn)Doyle J J， Doyle J L. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus，1990，12 :1315。 PCR反應(yīng)體系見文獻(xiàn)沈金雄等.甘藍(lán)型油菜SSR、 ISSR標(biāo)記的遺傳多樣性及其 與雜種表現(xiàn)的關(guān)系.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37(4) :477-483。所得擴(kuò)增產(chǎn)物冷藏保存?zhèn)溆谩?
擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離、銀染及顯影見文獻(xiàn)陸光遠(yuǎn)等.應(yīng)用于油菜研究的簡便 銀染AFLP標(biāo)記技術(shù)的構(gòu)建.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，20 :413-415。顯影后觀察、記載材 料的擴(kuò)增指紋。 更具體的技術(shù)方案由以下所述
1、基因組DNA提取方法 選取待測材料幼嫩植株(或葉片)，采用CTAB小樣法并稍作改進(jìn)，提取基因組總 DNA:將植株(或葉片)放入研缽中加0.75-1. Oml CTAB抽提緩沖液(成份為2% CTAB， 1. 4M NaCl，20mM EDTA，O. 2% P巰基乙醇，100mM Tris-HCl，pH 8. 0，加水定容至1L)，立即用研磨 棒將其搗碎成勻漿，再移入2. OmL離心管中。在55°C -6(TC水浴45-60min，其間輕輕地上下
搖動。取出離心管冷卻至室溫，再加等體積苯酚氯仿異戊醇(體積比為25 : 24 : i)
或者用等體積的氯仿異戊醇(體積比為24 : 1)充分混勻10-20min，12000r/min離心 12-15min，小心轉(zhuǎn)移上清液到另一個(gè)新的2.0mL離心管中。在裝有上清液的離心管中加入 60ul 5mmol/LNH4AC，然后再加入約2倍體積的預(yù)先冰凍的無水乙醇(或異丙醇)沉淀DNA， 在-2(TC放置l-2hrs或過夜。用槍頭輕輕挑出或10000r/min離心3min沉淀DNA，再用70%
5乙醇氨(70%乙醇中含10mM NH4Ac)浸泡DNA 5hrs，除去乙醇溶液，在室溫下或通風(fēng)櫥中干 燥DNA，再加300 ii 1 TE緩沖溶液(500ml TE緩沖液中含10mM Tris-HCl和ImM EDTA_Na2， pH 8. 0， 121。C滅菌后室溫保存)或者300 ii 1 ddH20溶解DNA， -2(TC保存以用于指紋分析。
2、PCR擴(kuò)增
PCR反應(yīng)體系如下 10 ii 1體系中含IX擴(kuò)增緩沖液，2mmol/L MgCl2，0. 2,1/L dNTPs，O. 5U Taq酶， 2. 5mmol/L上下游引物，50ng/ml DNA模板，用(1朋20(雙蒸水)稀釋至10iU。
PCR熱循環(huán)程序?yàn)?反應(yīng)在普通PCR儀上進(jìn)行。熱循環(huán)程序?yàn)椋?4t:預(yù)變性2min，1個(gè)循環(huán)；94。C變 性lmin，60。C復(fù)性30s，72。C延伸45s， 10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)復(fù)性溫度降低0. 5°C ;94。C變性 lmin，55。C復(fù)性30s，72。C延伸45s，30個(gè)循環(huán)；1(TC保存。所得擴(kuò)增產(chǎn)物冷藏保存?zhèn)溆谩?
3、擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分離、銀染及顯影技術(shù) 用洗滌劑和自來水將玻璃板徹底洗凈，晾干，用無水乙醇擦洗干凈。在長玻璃板 上用裁成小塊的濾紙均勻涂抹2ml硅化液(AMRESCO)。在短玻璃板上均勻涂lml反硅化液 (95%乙醇，5%冰乙酸，2111反硅化劑)，5min后用沾有無水乙醇的濾紙輕輕洗擦以除去多 余的硅化液和反硅化液。將玻璃裝配好并以邊條(0.4mm)隔開，裝配好電泳系統(tǒng)。準(zhǔn)備就 緒后用注射器將配制好變性凝膠液(50ml，含6X丙烯酰胺，7mol/L尿素，0. 5XTBE緩沖液， 灌膠前加入300ii1 10%過硫酸銨和30111 TEMED并迅速混勻)從底板中間小孔緩緩注入， 注意不要有氣泡，最后于上部插入梳子并加壓保護(hù)，凝聚2h后即可電泳。
將膠板底板取下，擦凈并將其垂直固定于底座上，上槽加0. 5XTBE緩沖液500ml， 下槽加同樣濃度的電泳緩沖液500ml，將梳子拔出，接通電源100-120W電泳預(yù)熱30min。預(yù) 熱完成后，將梳齒朝下插入梳子，并沖洗點(diǎn)樣孔。在步驟(3)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物中加入等體 積的上樣緩沖液(98X去離子甲酰胺，10mmol/L EDTA，O. 005%二甲苯青FF，O. 005%溴酚 藍(lán))，95。C變性3-5min后立即冰浴冷卻，上樣2 yl (97孔)，70-90W電泳1. 5h，當(dāng)二甲苯青 FF于1/3 1/2膠板時(shí)中止電泳。電泳所用儀器為Sequi-Gen sequencingcell (Bio-Rad， USA)。 電泳完成后，小心剝下膠板，將其浸入12L固定液(10%冰乙酸)，輕輕搖動20 30min或至指示劑消失為止，然后用去離子水漂洗膠板2次，每次不少于10min，然后轉(zhuǎn)至 1.2L染色液中(含O. 1% AgN03，0.056% HCHO)染色，輕輕搖動30min。取出膠板，在去離 子水中迅速漂洗10s，立即轉(zhuǎn)入到1.2L預(yù)冷(4-10。C )的顯影液(含3% Na2C03，0.056% HCHO， 2mg/LNa2S203 5H20)中，輕輕搖動至帶型清晰可見，迅速取出放入固定液(10%冰乙 酸)中停止顯影，然后用自來水漂洗5min，室溫下自然晾干，觀察、記載譜帶類型。
與背景技術(shù)相比，本發(fā)明具有的顯著特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)是PCR擴(kuò)增中所用的20對引物 是發(fā)明人進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上篩選出來的，它們多態(tài)性豐富(附圖l)，帶型穩(wěn)定，均勻分 布在油菜基因組中，且特異性指紋譜帶大小在50-400bp之間。因此，在需要進(jìn)行甘藍(lán)型油 菜遺傳材料的多樣性分析(附圖1)、品種真?zhèn)涡澡b別或雜種純度鑒定(附圖2、3)時(shí)，可直 接應(yīng)用這些引物。顯然，其利用有利于降低油菜品種指紋分析成本；建立了科學(xué)、準(zhǔn)確、客 觀、實(shí)用的油菜材料鑒定技術(shù)體系，為保護(hù)油菜育種產(chǎn)權(quán)、新品種登記、鑒別和檢測油菜品 種的真?zhèn)涡浴㈦s交制種純度等提供了技術(shù)保障。
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通過以下實(shí)施例將更具體地對本發(fā)明進(jìn)行說明，但是，所述實(shí)施例僅是為了說明 本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。


圖1 :用引物CB10587擴(kuò)增52份油菜資源圖譜。 圖2 :用引物BRAS067A檢測的華雜7號雜交制種純度(1)。圖中P1P2為雙親的圖 譜，其他為雜種的圖譜。箭頭所指示的三條帶均有的為真雜種，僅有母本帶型的為偽雜種。
圖3 :用引物BRAS067A檢測華雜7號雜交制種純度(2)。圖中全部為雜種的圖譜。
箭頭所指示的三條帶均有的為真雜種，僅有母本帶型的為偽雜種。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 :鑒定甘藍(lán)型油菜品種X是否為已知品種A
鑒定操作流程如下
(l)DNA提取 用培養(yǎng)皿發(fā)芽甘藍(lán)型油菜品種A(已知的品種)和X(未知的品種)種子5-7天，取 幼嫩植株用改良的CTAB小樣法提取基因組總DNA :將幼嫩植株用朋20清洗干凈并吸干水分 后，放入研缽中加0. 75-1. OmlCTAB抽提緩沖液(成份為2% CTAB， 1. 4M NaCl，20mM EDTA， 0.2% P巰基乙醇，100mM Tris-HCl，pH 8. O，加水定容至1L)，立即用研磨棒將其搗碎成勻 漿，再移入2. OmL離心管中。在55°C-60"水浴45-60111111，其間輕輕地上下?lián)u動。取出離
心管冷卻至室溫，再加等體積苯酚氯仿異戊醇(體積比為25 : 24 : i)或者用等體積
的氯仿:異戊醇(體積比為24 : 1)充分混勻10-20min， 12000r/min離心12-15min，小心 轉(zhuǎn)移上清液到另一個(gè)新的2.0mL離心管中。在裝有上清液的離心管中加入60ul 5mmol/L MVVC，然后再加入約2倍體積的預(yù)先冰凍的無水乙醇(或異丙醇)沉淀DNA，在-201:放置 l-2hrs或過夜。用槍頭輕輕挑出或10000r/min離心3min沉淀DNA，再用70%乙醇氨(70% 乙醇中含10mM NH4Ac)浸泡DNA 5hrs，除去乙醇溶液，在室溫下或通風(fēng)櫥中干燥DNA，再加 300 ii 1 TE緩沖溶液(500ml TE緩沖液中含10mMTris-HCl和lmM EDTA_Na2，pH 8. 0， 121°C 滅菌后室溫保存)或者300 ii 1 ddH20溶解DNA， -2(TC保存。
(2)引物合成 合成了如序列表SEQ ID NO :1_40所示的20對引物。本實(shí)施例的引物合成由上海 生工生物工程技術(shù)有限公司完成，用1. 5ml離心管包裝，每管2 0D。
(3) PCR擴(kuò)增 以品種A和X葉片基因組總DNA為模板，用20對引物分別對它們進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
PCR反應(yīng)體系如下 10 ii 1體系中含IX擴(kuò)增緩沖液，2mmol/L MgCl2，0. 2mmol/L d證s，O. 5U Taq酶， 2. 5mmol/L上下游引物，50ng/ml DNA模板，用(1朋20(雙蒸水)稀釋至10iU。
PCR熱循環(huán)程序?yàn)?反應(yīng)在PTC-225型PCR儀上進(jìn)行。熱循環(huán)程序?yàn)椋?4。C預(yù)變性2min， 1個(gè)循環(huán)；94。C 變性lmin，60。C復(fù)性30s，72。C延伸45s， 10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)復(fù)性溫度降低0. 5°C ;94。C變 性lmin，55。C復(fù)性30s，72。C延伸45s，30個(gè)循環(huán)；10。C保存。
(4)電泳檢測
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用洗滌劑和自來水將玻璃板徹底洗凈，晾干，用無水乙醇擦洗干凈。在長玻璃板上 用裁成小塊的濾紙均勻涂抹2ml硅化液(AMRESCO公司出品)。在短玻璃板上均勻涂1ml反 硅化液(95%乙醇，5%冰乙酸，2111反硅化劑)，5min后用沾有無水乙醇的濾紙輕輕洗擦以 除去多余的硅化液和反硅化液。將玻璃裝配好并以邊條(0. 4mm)隔開，裝配好電泳系統(tǒng)。準(zhǔn) 備就緒后用注射器將配制好變性凝膠液(50ml，含6X丙烯酰胺，7mol/L尿素，0.5XTBE緩 沖液，灌膠前加入300ii1 10%過硫酸銨和30111 TEMED并迅速混勻)從底板中間小孔緩緩 注入，注意不要有氣泡，最后于上部插入梳子并加壓保護(hù)，凝聚2h后即可電泳。
將膠板底板取下，擦凈并將其垂直固定于底座上，上槽加0. 5XTBE緩沖液500ml， 下槽加同樣濃度的電泳緩沖液500ml，將梳子拔出，接通電源100-120W電泳預(yù)熱30min。預(yù) 熱完成后，將梳齒朝下插入梳子，并沖洗點(diǎn)樣孔。在步驟(3)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物中加入等體 積的上樣緩沖液(98X去離子甲酰胺，10mmol/L EDTA，O. 005%二甲苯青FF，O. 005%溴酚 藍(lán))，95。C變性3-5min后立即冰浴冷卻，上樣2 yl (97孔)，70-90W電泳1. 5h，當(dāng)二甲苯青 FF于1/3 1/2膠板時(shí)中止電泳。電泳所用儀器為Sequi-Gen sequencingcell (Bio-Rad， USA)。 電泳完成后，小心剝下膠板，將其浸入1. 2L固定液(10%冰乙酸)，輕輕搖動20 30min或至指示劑消失為止，然后用去離子水漂洗膠板2次，每次不少于10min，然后轉(zhuǎn)至 1.2L染色液中(含O. l%AgN03，0.056% HCHO)染色，輕輕搖動30min。取出膠板，在去離 子水中迅速漂洗10s，立即轉(zhuǎn)入到1.2L預(yù)冷(4-10。C )的顯影液(含3% Na2C03，0.056% HCH0，2mg/L Na2S203 5H20)中，輕輕搖動至帶型清晰可見，迅速取出放入固定液(10%冰乙 酸)中停止顯影，然后用自來水漂洗5min，室溫下自然晾干，檢測譜帶類型。
結(jié)果分析若品種X的20對引物擴(kuò)增出的多態(tài)性帶型與品種A完全相同，說明品 種X就是品種A。 實(shí)施例2 :鑒定油菜雜交品種R的制種純度
鑒定操作流程如下
(l)DNA提取 隨機(jī)選取油菜品種R雜交種子IOO粒以上，同時(shí)選取品種R的雙親種子，用培養(yǎng)皿 發(fā)芽5-7天，雜交種子分單株、雙親可以混合多個(gè)單株用改良的CTAB小樣法，分別提取基因 組DNA :將幼嫩植株用dH20清洗干凈并吸干水分后，放入研缽中加0. 75-1. Oml CTAB抽提 緩沖液(成份為2% CTAB，1.4M NaCl，20mM EDTA，0.2% P巰基乙醇，lOOmM Tris-HCl， pH 8. 0，加水定容至1L)，立即用研磨棒將其搗碎成勻漿，再移入2. OmL離心管中。在55°C _60°C 水浴45-60min，其間輕輕地上下?lián)u動。取出離心管冷卻至室溫，再加等體積苯酚氯仿異
戊醇(體積比為25 : 24 : i)或者用等體積的氯仿異戊醇(體積比為24 : i)充分混
勻10-20min， 12000r/min離心12-15min，小心轉(zhuǎn)移上清液到另一個(gè)新的2. OmL離心管中。 在裝有上清液的離心管中加入60ul 5mmol/LNH4AC，然后再加入約2倍體積的預(yù)先冰凍的無 水乙醇(或異丙醇)沉淀DNA，在-2(TC放置l-2hrs或過夜。用槍頭輕輕挑出或lOOOOr/ min離心3min沉淀DNA，再用70%乙醇氨(70%乙醇中含10mM NH4Ac)浸泡DNA 5hrs，除去 乙醇溶液，在室溫下或通風(fēng)櫥中干燥DNA，再加300 ii 1 TE緩沖溶液(500ml TE緩沖液中含 10mM Tris-HCl和lmM EDTA_Na2， pH 8. 0， 12TC滅菌后室溫保存)或者300 ii 1 ddH20溶解 DNA， -20。C保存。[ooeo](2)引物合成 合成了如序列表SEQ ID NO :1_40所示的20對引物。本實(shí)施例的引物合成由上海生工生物工程技術(shù)有限公司完成，用1. 5ml離心管包裝，每管2 OD。
(3) PCR擴(kuò)增 先用雙親基因組DNA篩選20對引物，選用可區(qū)分雙親的l對引物分別對雜種巳各單株基因組DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
PCR反應(yīng)體系如下 10 ii 1體系中含IX擴(kuò)增緩沖液，2mmol/L MgCl2，0. 2,1/L dNTPs，O. 5U Taq酶，2. 5mmol/L上下游引物，50ng/ml DNA模板，用(1朋20(雙蒸水)稀釋至10iU。
PCR熱循環(huán)程序?yàn)?反應(yīng)在PTC-225型PCR儀上進(jìn)行。熱循環(huán)程序?yàn)椋?4。C預(yù)變性2min， 1個(gè)循環(huán)；94°C變性lmin，60。C復(fù)性30s，72。C延伸45s， 10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)復(fù)性溫度降低0. 5°C ;94。C變性lmin，55。C復(fù)性30s，72。C延伸45s，30個(gè)循環(huán)；10。C保存。
(4)電泳檢測 用洗滌劑和自來水將玻璃板徹底洗凈，晾干，用無水乙醇擦洗干凈。在長玻璃板上用裁成小塊的濾紙均勻涂抹2ml硅化液(AMRESCO)。在短玻璃板上均勻涂lml反硅化液(95%乙醇，5%冰乙酸，2111反硅化劑)，5min后用沾有無水乙醇的濾紙輕輕洗擦以除去多余的硅化液和反硅化液。將玻璃裝配好并以邊條(0.4mm)隔開，裝配好電泳系統(tǒng)。準(zhǔn)備就緒后用注射器將配制好變性凝膠液(50ml，含6X丙烯酰胺，7mol/L尿素，0. 5XTBE緩沖液，灌膠前加入300ii1 10%過硫酸銨和30111 TEMED并迅速混勻)從底板中間小孔緩緩注入，注意不要有氣泡，最后于上部插入梳子并加壓保護(hù)，凝聚2h后即可電泳。
將膠板底板取下，擦凈并將其垂直固定于底座上，上槽加0. 5XTBE緩沖液500ml，下槽加同樣濃度的電泳緩沖液500ml，將梳子拔出，接通電源100-120W電泳預(yù)熱30min。預(yù)熱完成后，將梳齒朝下插入梳子，并沖洗點(diǎn)樣孔。在步驟(3)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物中加入等體積的上樣緩沖液(98X去離子甲酰胺，10mmol/L EDTA，O. 005%二甲苯青FF，O. 005%溴酚藍(lán))，95。C變性3-5min后立即冰浴冷卻，上樣2 yl (97孔)，70-90W電泳1. 5h，當(dāng)二甲苯青FF于1/3 1/2膠板時(shí)中止電泳。電泳所用儀器為Sequi-Gen sequencingcell (Bio-Rad，USA)。 電泳完成后，小心剝下膠板，將其浸入1. 2L固定液(10%冰乙酸)，輕輕搖動20 30min或至指示劑消失為止，然后用去離子水漂洗膠板2次，每次不少于10min，然后轉(zhuǎn)至1.2L染色液中(含O. l%AgN03，0.056% HCHO)染色，輕輕搖動30min。取出膠板，在去離子水中迅速漂洗10s，立即轉(zhuǎn)入到1.2L預(yù)冷(4-10。C )的顯影液(含3% Na2C03，0.056%HCH0，2mg/L Na2S203 5H20)中，輕輕搖動至帶型清晰可見，迅速取出放入固定液(10%冰乙酸)中停止顯影，然后用自來水漂洗5min，室溫下自然晾干，檢測譜帶類型。
結(jié)果分析統(tǒng)計(jì)雜交種中與雙親指紋相同的樣本數(shù)量，除以檢測雜種樣本總數(shù)即可得到油菜雜交品種R的制種純度。
〈110〉華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 〈120〉 一種甘藍(lán)型油菜SSR指紋的快捷鑒定方法
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〈141>2009-12-10〈160>40〈170〉Patentln version3. 1〈210>1<211>20〈212>DNA〈213〉甘藍(lán)型油菜(Brassican即us)〈220〉<221>primer_bind〈222〉 (1) . (20)〈223〉〈400>13Cga;agtggg ttagteggcg20〈210>2〈211>20〈212>DNA<213>甘藍(lán)型油菜(Brassican即us)〈220〉〈221>primer—bind〈222〉 (1) (20)<223>〈400>2gaagcctttc tccaccattg20〈210>3〈211>25〈212>DNA〈213>甘藍(lán)型油菜(Brassican即us)〈220〉〈221>primer_bind〈222〉 (1) . (25)〈223>〈400>3ttg朋gtegt tggagt朋ttggagg 25
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一種甘藍(lán)型油菜品種SSR指紋的快捷檢測方法，其特征在于步驟如下A、采用CTAB小量法提取待測甘藍(lán)型油菜樣品基因組DNA；B、采用如序列表SEQ ID NO1-40所示的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述的引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1-40所示；C、將步驟B的擴(kuò)增產(chǎn)物用聚丙烯胺凝膠電泳分離，經(jīng)顯影、定影得到樣品的指紋圖譜；其中步驟A所述的方法如下將幼嫩植株或葉片放入研缽中加0.75-1.0ml CTAB抽提緩沖液，立即用研磨棒將其搗碎成勻漿，再移入2.0mL離心管中，然后在55℃-60℃水浴45-60min，其間輕輕地上下?lián)u動，取出離心管冷卻至室溫，再加等體積的體積比為25∶24∶1的苯酚∶氯仿∶異戊醇或用等體積的體積比為24∶1的氯仿∶異戊醇充分混勻10-20min，12000r/min離心12-15min，轉(zhuǎn)移上清液到另一個(gè)2.0mL離心管中，在裝有上清液的離心管中加入60ul5mmol/L NH4AC，然后再加入2倍體積的預(yù)先冰凍的無水乙醇或異丙醇沉淀DNA，在-20℃放置1-2hrs或過夜，用槍頭挑出或10000r/min離心3min沉淀DNA，再用含10mM NH4Ac 70％乙醇氨浸泡DNA 5hrs，除去乙醇溶液，在室溫下或通風(fēng)櫥中干燥DNA，再加300μl TE緩沖溶液或300μl ddH2O溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆?；其中CTAB抽提緩沖液成份為2％CTAB，1.4M NaCl，20mM EDTA，0.2％β巰基乙醇，100mM Tris-HCl，pH 8.0，加水定容至1L；TE緩沖溶液配制方法如下500ml TE緩沖液中含10mM Tris-HCl和1mM EDTA-Na2，pH 8.0，121℃滅菌后室溫保存。
2. 適用于甘藍(lán)型油菜品種DNA指紋識別的引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: 1-40所示。
3. 權(quán)利要求3所示的引物在甘藍(lán)型油菜品種DNA指紋識別中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于油菜技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種甘藍(lán)型油菜品種SSR指紋的快捷檢測方法。其特征在于步驟如下A、采用CTAB小量法提取待測甘藍(lán)型油菜樣品基因組DNA；B、采用如序列表SEQ ID NO1-40所示的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述的引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1-40所示；C、將步驟B的擴(kuò)增產(chǎn)物用聚丙烯胺凝膠電泳分離，經(jīng)顯影、定影得到樣品的指紋圖譜。本發(fā)明的引物特異性強(qiáng)，靈敏度高，能有效用于油菜真?zhèn)纹贩N的DNA指紋快速檢測。
文檔編號C12N15/11GK101768639SQ20091027321
公開日2010年7月7日 申請日期2009年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月15日
發(fā)明者傅廷棟, 文靜, 易斌, 李興華, 楊軍, 沈金雄, 涂金星, 馬朝芝 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)