專利名稱：一株高產(chǎn)耐溫性β-葡聚糖酶畢赤酵母及其構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在啤酒工業(yè)中，啤酒廠在糖化過程中使用β -葡聚糖酶已經(jīng)比較普遍，國(guó)外許多 公司如NOVO、諾維信、DMS等早已有商品化的酶制劑出售。在糖化過程中，大麥胚乳細(xì)胞壁 中的β-葡聚糖雖然在制麥階段大部分被降解，但因植物β-葡聚糖酶耐溫性差，在糖化時(shí) 其剩余活力會(huì)被完全破壞，殘留的β “葡聚糖仍有可能會(huì)導(dǎo)致麥汁粘度過大，致使過濾困 難，延長(zhǎng)糖化醪過濾時(shí)間，降低浸出物含量。在發(fā)酵過程中，過量的葡聚糖會(huì)導(dǎo)致酵母 早期沉降，降低發(fā)酵度。在成品啤酒中，β -葡聚糖會(huì)與蛋白質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致霧狀混濁和凝膠沉 淀，降低啤酒的非生物穩(wěn)定性。啤酒生產(chǎn)中添加β-葡聚糖酶可將β-葡聚糖降解為低聚 糖和葡萄糖，降低麥汁粘度，從而大大提高過濾速度，增加生產(chǎn)效率。大麥一般不用做人類 食物的直接來源，價(jià)格低廉，但若直接作為動(dòng)物飼料使用時(shí)其中含有的葡聚糖會(huì)造成 單胃哺乳動(dòng)物(如豬)和禽類消化道液體粘稠，影響營(yíng)養(yǎng)成分的吸收，故葡聚糖被稱為 抗?fàn)I養(yǎng)因子。在大麥為主要原料的飼料中添加β_1，3-1，4-葡聚糖酶，降解β-葡聚糖，降 低消化道內(nèi)液體的粘度，改善禽畜腸胃道環(huán)境，提高營(yíng)養(yǎng)的吸收效率，消除抗?fàn)I養(yǎng)因子的作 用。這對(duì)幫助飼料工業(yè)開辟一條具有高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的道路具有實(shí)際意義。Cantwell于1983 年首次克隆和表達(dá)了來自β -1,3-1,4-葡聚糖酶，此后不斷有芽孢桿菌屬和非芽孢桿菌屬 的該基因得到克隆和表達(dá)。巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)是一種能高效表達(dá)重組蛋白的酵母品種， 一方面由于其是屬于真核生物，因此表達(dá)出來的蛋白可以進(jìn)行糖基化修飾，另一方面畢赤 酵母生長(zhǎng)速度快，可以將表達(dá)的蛋白分泌到培養(yǎng)基中，方便蛋白純化。畢赤酵母表達(dá)載體 pPICZ在多克隆位點(diǎn)(MCR) 3'端帶有his-tag和c-myc印itopes，這些tag有利于常規(guī)檢測(cè) 和純化，而且在MCR5'端引入了 alpha factor( α -factor)用以增加表達(dá)，并且在表達(dá)后α -factor可以自動(dòng)被切除。在進(jìn)行克 隆的時(shí)候，如果你選擇的是EcoRI，那么只需在目標(biāo)蛋白中增加兩個(gè)氨基酸序列即可完成。 另外pPICZ系列選用的是Zeocin抗生素作為篩選標(biāo)記，而誘導(dǎo)表達(dá)的載體需要甲醇(甲醇 比一般用于大腸桿菌表達(dá)誘導(dǎo)使用的IPTG便宜)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株高產(chǎn)耐高溫β -葡聚糖酶畢赤酵母及其構(gòu)建。本發(fā)明的 技術(shù)方案為1.淀粉液化芽孢桿菌β-1，3_1，4-葡聚糖酶熱穩(wěn)定性提高突變體基因的開放閱 讀框序列為序列1。2. 一株高產(chǎn)耐溫性β-葡聚糖酶畢赤酵母，其含有基因序列1，分類命名為巴斯 德畢赤酵母(Pichia pastoris GS115_pPICZ α A_bgl)，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理
3委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為=CGMCC No. 35203.以重組質(zhì)粒 pET-28a-bgl 為樽板，PPICZ α A~F (AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGAAACG AGTGTTGCTAAT)和 PPICZ α A-R (GCTCTAGACCTTTTTTTGTATAGCGCAC)為 PCR 引物擴(kuò)增，擴(kuò)增的 DNA片段與實(shí)際大小一致，約720bp。通過PCR產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到 耐溫性β-葡聚糖酶基因bgl。4.基因bgl。及質(zhì)粒pPICZaA經(jīng)NotI和Xba I雙酶切回收后，再經(jīng)T4DNA連接 酶連接，轉(zhuǎn)化Trans 5α，在Zeisin LLB平板上篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。結(jié)果如表1，表2，表3所
7J\ ο5.將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行質(zhì)粒抽提，用Not I和Xba I雙酶切進(jìn)行鑒定和PCR檢測(cè)，發(fā) 現(xiàn)重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后釋放一條720bp左右的片段，該片段與PCR產(chǎn)物大小一致，初步表明重 組質(zhì)粒PPICZ α A-bgl構(gòu)建成功。經(jīng)測(cè)序證明，bgl基因序列嵌入到pPICZ α A的5，AOX 1 和AOX ITT之間，并保持了 AOX 1控制下的正確閱讀框。表IPCR擴(kuò)增產(chǎn)物NotI和Xba I雙酶切體系(50 μ L)

表 2pPICZα A Not I和Xba I雙酶切體系(50 μ L)
表3表達(dá)載體pPICZa A與目的基因的連接體系(10 μ L)

CN 101899458 A6.將含有pPICZ α A-bgl的TranS5 α重組菌大量培養(yǎng)，經(jīng)質(zhì)粒提取后，采用Pme I 線性化并純化后用于畢赤酵母轉(zhuǎn)導(dǎo)。表4重組質(zhì)粒的線性化酶切體系(50 μ L)
ORIGIN
1ATGAAACGAGTGTTGCTAATTCTTGTCACCGGATTGTTTATGAGTTTGTGTGGGATCACT
61TCTAGTGTTTCGGCTCAAACAGGCGGATCGTTTTTTGAACCTTTTAACAGCTATAACTCC
121GGGTTATGGCAAAAAGCTGATGGTTACTCAAATGGAGATATGTTTAACTGCACTTGGCGT
181GCGAATAACGTCTCTATGACGTCATCAGGTGAAATGCGTTTGGCGCTGACAAGTCCGTCT
241TATAACAAGTTTGACTGCGGGGAAAACCGCTCGGTTCAAACATATGGCTATGGACTTTAT
301GAAGTCAGAATGAAACCGGCTAAAAACACAGGGATTGTTTCATCGTTCTTCACTTATACA
361GGTCCAACGGAGGGGACTCCTTGGGATGAGATTGATATCGAATTTTTGGGAAAAGACACA
421ACAAAGGTTCAATTTAACTATTATACAAATGGCGCAGGAAACCATGAGAAGTTGGCGGAT
481CTCGGATTTGATGCAGCCAATGCCTATCATACGTATGCGTTCGATTGGCAGCCAAACTCT
541ATTAAATGGTATGTCGATGGGCAATTAAAACATACTGCGACAACCCAAATACCGGCAGCG
601CCGGGGAAAATCATGATGAATTTGTGGAATGGTACGGGTGTCGATGATTGGCTCGGTTCC
661TACAATGGCGTAAATCCGCTATACGCTCATTACGACTGGGTGCGCTATACAAAAAAA
2.耐溫性淀粉液化芽孢桿菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bgl)編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列
1MKRVLLILVTGLFMSLCGITSSVSAQTGGSFFEPFNSYNS
4IGLffQKADGYSNGDMFNCTffRANNVSMTSSGEMRLALTSPS
81YNKFDCGENRSVQTYGYGLYEVRMKPAKNTGIVSSFFTYT
12IGPTEGTPffDEIDIEFLGKDTTKVQFNYYTNGAGNHEKLAD
161LGFDAANAYHTYAFDffQPNSIKffYVDGQLKHTATTQIPAA
20IPGKIMMNLffNGTGVDDffLGSYNGVNPLYAHYDffVRYTKK *
權(quán)利要求
淀粉液化芽孢桿菌β 1，3 1，4 葡聚糖酶熱穩(wěn)定性提高突變體基因的開放閱讀框序列為序列1。
2.—株高產(chǎn)耐溫性葡聚糖酶畢赤酵母，其含有基因序列1，分類命名為巴斯德畢 赤酵母(Pichia pastoris GS115_pPICZ α A_bgl)，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員 會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 3520。
3.高產(chǎn)耐溫性β-葡聚糖酶畢赤酵母巴斯德畢赤酵母(Pichia pastorisGS115-pPICZa A-bgl)的構(gòu)建法，其特征如下A.以重組質(zhì)粒pET-28a-bgl 為模板，PPICZ α A~F(AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGAAACGAGTG TTGCTAAT)和 PPICZ α A-R (GCTCTAGACCTTTTTTTGTATAGCGCAC)為 PCR 引物擴(kuò)增，擴(kuò)增的 DNA 片段與實(shí)際大小一致，約720bp。通過PCR產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到耐溫 性β-葡聚糖酶基因bgl。B.基因bgl。及質(zhì)粒pPICZaA經(jīng)NotI和Xba I雙酶切回收后，再經(jīng)T4DNA連接酶連 接，轉(zhuǎn)化TranS5 α，在Zeisin LLB平板上篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。C.將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行質(zhì)粒抽提，用NotI和Xba I雙酶切進(jìn)行鑒定和PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn) 重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后釋放一條720bp左右的片段，該片段與PCR產(chǎn)物大小一致，初步表明重組 質(zhì)粒pPICZ α A-bgl構(gòu)建成功。經(jīng)測(cè)序證明，bgl基因序列嵌入到pPICZ α A的5，AOX 1和 AOX ITT之間，并保持了 AOX 1控制下的正確閱讀框。D.將含有pPICZα A-bgl的TranS5 α重組菌大量培養(yǎng)，經(jīng)質(zhì)粒提取后，采用PmeI線性 化并純化后用于畢赤酵母轉(zhuǎn)導(dǎo)。Ε.重組表達(dá)載體pPICZ α A-bgl經(jīng)Pme I完全酶切線性化后，電轉(zhuǎn)化Pichia pastorisGS115并涂布Zeocin YPDS平板，30°C倒置培養(yǎng)2 4天直至菌落出現(xiàn)。挑選陽(yáng) 性轉(zhuǎn)化子，接種含有Zeocin YPD液體培養(yǎng)基。對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行Mut表型鑒定，得到Mut+菌 株，進(jìn)一步經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)和酶活測(cè)定，篩選得到高產(chǎn)畢赤酵母工程菌Pichia pastoris GS 115-pPICZa A-bgl。F.將Pichiapastoris GS115_pPICZ α A_bgl按Mut+誘導(dǎo)方式誘導(dǎo)產(chǎn)酶，通過重組菌株 培養(yǎng)條件的優(yōu)化，β_1，3-1，4-葡聚糖酶的最佳表達(dá)條件為pH7.0，0D_為2.5，甲醇的日 誘導(dǎo)添加量為1%，甲醇誘導(dǎo)后菌體的培養(yǎng)時(shí)間為2. 5-3天。在此條件下葡聚糖酶分泌 到培養(yǎng)基中的蛋白表達(dá)量為190mg/L，比酶活達(dá)到4312U/mg蛋白。SDS-PAGE結(jié)果顯示表達(dá) 蛋白的大小為31KDa左右，與理論分子量大小吻合。
全文摘要
本發(fā)明公開了基因工程領(lǐng)域中的一種巴斯德畢赤酵母重組菌及其應(yīng)用。本研究室通過體外分子進(jìn)化技術(shù)，對(duì)淀粉液化芽孢桿菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因進(jìn)行了熱穩(wěn)定性提高定向進(jìn)化，獲得多株熱穩(wěn)定性提高突變體。本發(fā)明首次在巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)中表達(dá)了其中一株熱穩(wěn)定提高最明顯β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因bgl。將該基因克隆到畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA上，構(gòu)建到AOX I甲醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子下游，得到重組質(zhì)粒pPICZαA-his6-bgl，將其經(jīng)Pme I線性化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，bgl基因通過同源重組被整合到畢赤酵母染色體上，并處于酵母α因子的下游，實(shí)現(xiàn)了異源分泌表達(dá)。通過重組菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化，β-1，3-1，4-葡聚糖酶的最佳表達(dá)條件為pH7.0，OD600為2.5，甲醇的日誘導(dǎo)添加量為1％，甲醇誘導(dǎo)后菌體的培養(yǎng)時(shí)間為2.5-3天。在此條件下β-葡聚糖酶分泌到培養(yǎng)基中的蛋白表達(dá)量為190mg/L，比酶活達(dá)到4312U/mg蛋白。SDS-PAGE結(jié)果顯示表達(dá)蛋白的大小為27KDa左右，與理論分子量大小吻合。
文檔編號(hào)C12N1/19GK101899458SQ200910264850
公開日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2009年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日
發(fā)明者劉春鳳, 李崎, 李永仙, 秦久福, 鄭飛云, 顧國(guó)賢 申請(qǐng)人:江南大學(xué)