專利名稱：區(qū)分萊姆病病原基因型的試劑及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于區(qū)分某種病原的基因類(lèi)型的試劑方法，以及這種試劑的使用 方法，更確切講，本發(fā)明是一種用于區(qū)分萊姆病病原基因型的試劑和其使用方法。
背景技術(shù)：
萊姆病(Lyme disease)又稱萊姆包柔體病或萊姆疏螺旋體病，是一種蜱傳性的 自然疫源性人獸共患螺旋體病，因首次在美國(guó)康涅狄格州的萊姆鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)而得名。目前已在 全球30多個(gè)國(guó)家和地區(qū)報(bào)告有本病和本病的自然疫源地存在，年發(fā)病人數(shù)在30萬(wàn)左右， 仍有不斷增多的趨勢(shì)，在美國(guó)有“第二艾滋病”之稱(Gratz N. Emerging and resurging vector-borne disease. Ann Rev Entomol，1999，44 :51)。1992 年，世界衛(wèi)生組織(WHO)將 此病列為重點(diǎn)防治研究對(duì)象。我國(guó)于1986年首次在黑龍江省海林縣林區(qū)發(fā)現(xiàn)了該病，到目 前，我國(guó)至少30個(gè)省(區(qū)、市)均已發(fā)現(xiàn)有萊姆病分布，每年新發(fā)病例高達(dá)萬(wàn)余例，某些省 份林區(qū)的發(fā)病率在1_40%。人感染萊姆病后的臨床癥狀主要表現(xiàn)為慢性炎癥性多系統(tǒng)損傷，除皮膚慢性游 走性紅斑、關(guān)節(jié)炎和慢性萎縮性肢皮炎外，常常會(huì)伴有心臟和神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，從而引起 腦膜炎、路神經(jīng)炎、運(yùn)動(dòng)及感覺(jué)神經(jīng)根炎、神經(jīng)叢炎、多發(fā)單神經(jīng)炎小腦共濟(jì)失調(diào)等等癥 狀，嚴(yán)重影響人類(lèi)健康。伯氏疏螺旋體的基因型與萊姆病的致病性和臨床表現(xiàn)是密切相 關(guān)的，不同的基因型致病性不同，產(chǎn)生的臨床癥狀也不同。萊姆病的病原體為伯氏疏螺旋 體，可分為11個(gè)基因型或群，我國(guó)已發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的萊姆病螺旋體主要是狹義伯氏疏螺旋 體(Borreliaburgdorferi sensus stricto)、嘎氏疏螺旋體(B. afzelii)和伽氏疏螺旋體 (B. garinii)三個(gè)基因型。對(duì)萊姆病病原分離株進(jìn)行基因型的鑒定在流行病學(xué)、臨床、診斷、 治療和疫苗研制方面具有重要的指導(dǎo)意義。到目前為止，區(qū)分萊姆病病原基因型的方法主要以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、限制性 片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)和反向線狀印跡(RLB)方法為主，但是PCR、RFLP以及RLB在區(qū)分 本病原時(shí)需要復(fù)雜的系統(tǒng)，對(duì)操作實(shí)驗(yàn)要求較高，現(xiàn)有技術(shù)中進(jìn)行萊姆病分型可參考以下 文獻(xiàn)Rauter C，Meuller M，Diterich I，et al. Critical evaluation of urine-based PCR assay for diagnosis of Lyme borreliosis. ClinDiag Lab Immunol,2005，12 910-917 ；Moran-Cadenas F，Schneider H，et al.，Acomparison of two DNA extraction approaches in the detection of Borreliaburgdorferi sensu Iato from live Ixodes ricinus ticks by PCR and reverse line blotting. Vector Borne Zoonotic Dis. 2007 ；7 (4) :555_561) ；Daniele Postic，Marc V. Assous, Patrick A. D. Grimont, Guy Baranton. Diversity of Borrelia burgdorferi Sensu Latoevidenced by restriction fragment length polymorphism of rrf (5S)-rrl(23S)intergenic spacer amp1 icons. International Journal of Systematic Bacteriology，1994，44(4) :743_752。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種區(qū)分和鑒定萊姆病病原伯氏疏螺旋體的檢測(cè)試劑，以及這種試劑 的使用方法。本發(fā)明的用于區(qū)分萊姆病病原基因型的試劑中至少有a.狹義伯氏疏螺旋體LAMP特異性引物；b.嘎氏疏螺旋體LAMP特異性引物；c.伽氏疏螺旋體LAMP特異性引物。本發(fā)明的用于區(qū)分萊姆病病原基因型的試劑中各特異性引物序列為a.狹義伯氏疏螺旋體LAMP特異性引物為F3 :5， -tagcagccttgacgagaa-3，B3 :5， -tttgacctagatcgtcagaa-3，F(xiàn)IP 5' -gccgtctttgtttttttctttgcttttttcagcgtttcagtagatttgc-3，BIP :5，-gtagacaagcttgagcttaaaggatttttttgtcagcttttacgcctt-3，；b.嘎氏疏螺旋體LAMP特異性引物為F3 :5，-gccaaaacattagtgtcaaga-3，B3 5' -ggttccttcttttacttccaatg-3'FIP :5，-catggtttttgcagacaattcaccttttgttctaaagacaaaacatcaacaga-3，BIP —已t^cBg已已已tg已已已已gcg^tgg已已ctttt已gct^cttttccttc已已g&gt_3，； c.伽氏疏螺旋體LAMP特異性引物為F3 :5， -ttcaacgcaaaaggtgaat-3，B3 5' -caactgttatttctccagagtt-3，F(xiàn)IP :5，-ccggttccatcgctttttatttctgttttgaaaaaacaatactaagagcaaacg-3，BIP :5，-aagactttgctcttgaaggaacttttttgcttaaaacaacagtgcc-3‘0本發(fā)明的檢測(cè)試劑的使用方法是將待檢的蜱進(jìn)行研磨，然后離心沉淀，取上清液； 或者從待檢的動(dòng)物或人提取組織或關(guān)節(jié)滑液或血液樣品，用所得到的上清液或組織樣品培 養(yǎng)萊姆病病原螺旋體，再將培養(yǎng)液離心，取沉淀提取基因組DNA，將所提取的基因組DNA分 為三份，在LAMP反應(yīng)緩沖液中分別加入狹義伯氏疏螺旋體特異性引物、嘎氏疏螺旋體特異 性引物和伽氏疏螺旋體特異性引物，再分別在每個(gè)加有特異性引物的LAMP反應(yīng)緩沖液中 加入前述提取的DNA樣品一份、滅菌超純水以及Bst DNA聚合酶，然后進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，取擴(kuò) 增產(chǎn)物以TAE為緩沖液，在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)，根據(jù)電泳檢測(cè)結(jié)果的泳道中是否 存在的特異性條帶確定被檢樣品的萊姆病病原基因型。本發(fā)明的檢測(cè)試劑的使用方法也可以是將待檢的蜱進(jìn)行研磨，然后離心沉淀，取 上清液；或者從待檢的動(dòng)物或人提取組織或關(guān)節(jié)滑液或血液樣品，用所得到的上清液或組 織樣品培養(yǎng)萊姆病病原螺旋體，再將培養(yǎng)液離心，取沉淀提取基因組DNA，將所提取的基因 組DNA分為三份，在LAMP反應(yīng)緩沖液中分別加入狹義伯氏疏螺旋體特異性引物、嘎氏疏螺 旋體特異性引物和伽氏疏螺旋體特異性引物，再分別在每個(gè)加有特異性引物的LAMP反應(yīng) 緩沖液中加入前述提取的DNA樣品一份、滅菌超純水以及Bst DNA聚合酶，然后進(jìn)行LAMP 擴(kuò)增，在各擴(kuò)增產(chǎn)物中加入Mg2+試劑，根據(jù)相應(yīng)試管內(nèi)液體是否產(chǎn)生渾濁或白色沉淀的陽(yáng) 性反應(yīng)，確定被檢樣品的萊姆病病原基因型。
5CN 101967513 A
說(shuō)明書(shū)
3/5頁(yè)本發(fā)明的檢測(cè)試劑的使用方法還可以是將待檢的蜱進(jìn)行研磨，然后離心沉淀，取 上清液；或者從待檢的動(dòng)物或人提取組織或關(guān)節(jié)滑液或血液樣品，用所得到的上清液或組 織樣品培養(yǎng)萊姆病病原螺旋體，再將培養(yǎng)液離心，取沉淀提取基因組DNA，將所提取的基因 組DNA分為三份，在LAMP反應(yīng)緩沖液中分別加入狹義伯氏疏螺旋體特異性引物、嘎氏疏螺 旋體特異性引物和伽氏疏螺旋體特異性引物，再分別在每個(gè)加有特異性引物的LAMP反應(yīng) 緩沖液中加入前述提取的DNA樣品一份、滅菌超純水以及Bst DNA聚合酶，然后進(jìn)行LAMP 擴(kuò)增，在各擴(kuò)增產(chǎn)物中加入SYBR Green I，根據(jù)相應(yīng)試管是否呈綠色的陽(yáng)性反應(yīng)確定被檢 樣品的萊姆病病原基因型。由以上內(nèi)容可知本發(fā)明的檢測(cè)方法是一種環(huán)介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù) (Loop-mediated isotheral amplification method， UVMP) 。 ^Fi帛白勺HiUifif *^ 2000年由日本科學(xué)家Notomi Τ.等發(fā)明的一種敏感性很高的DNA擴(kuò)增技術(shù)。本發(fā)明的方法 具有特異性高于PCR方法，同時(shí)不需要復(fù)雜的操作系統(tǒng)，在普通的實(shí)驗(yàn)室就可以進(jìn)行。具有 操作簡(jiǎn)單、特異性高、快速等特點(diǎn)，因此有關(guān)極好的實(shí)驗(yàn)研究和商業(yè)價(jià)值。


圖1為1，2，3，4號(hào)離心管經(jīng)狹義伯氏疏螺旋體特異性引物擴(kuò)增的結(jié)果；圖2為1， 2，3，4號(hào)離心管經(jīng)嘎氏疏螺旋體特異性引物擴(kuò)增的結(jié)果；圖3為1，2，3，4號(hào)離心管經(jīng)伽氏 疏螺旋體特異性引物擴(kuò)增的結(jié)果。其中1，2，3，4分別為狹義伯氏疏螺旋體、嘎氏疏螺旋體、 伽氏疏螺旋體、滅菌超純水。圖1-3中M為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量DL2000，泳道1分別為狹義伯 氏疏螺旋體經(jīng)3套LAMP特異性引物擴(kuò)增的結(jié)果，泳道2分別為嘎氏疏螺旋體經(jīng)3套LAMP 特異性引物擴(kuò)增的結(jié)果，泳道3分別為伽氏疏螺旋體經(jīng)3套LAMP特異性引物擴(kuò)增的結(jié)果， 泳道4分別為滅菌超純水經(jīng)3套LAMP特異性引物擴(kuò)增的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下給出
具體實(shí)施例方式1.陽(yáng)性基因組DNA的制備過(guò)程伯氏疏螺旋體的體外培養(yǎng)將標(biāo)準(zhǔn)的狹義伯氏、嘎氏和伽氏疏螺旋體菌株分別接 種于6mL玻璃試管中含有5mL BSKII (Sigma)培養(yǎng)基上。將接種狹義伯氏螺旋體菌株的試 管定為1號(hào)試管，將接種嘎氏螺旋體菌株的試管定為2號(hào)試管，將接種伽氏疏螺旋體菌株的 試管定為3號(hào)試管。將各試管置于33°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)1-3周(每周應(yīng)用暗視野顯微鏡檢測(cè)一 次)。當(dāng)菌液達(dá)到較高濃度時(shí)，收集菌液，4000rpm離心20分鐘，丟棄上清，沉淀用TBS (20mM Tris-HCl, 150mMNaCl)懸浮，同上離心洗滌3次，_20°C保存?zhèn)溆谩?.基因組DNA的提取應(yīng)用基因組提取試劑盒(Gentra)，根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行三種疏螺旋體基因組DNA的提 取。測(cè)定所制備的基因組DNA的濃度，并應(yīng)用稀釋液稀釋成lOOng/uL，_20°C保存?zhèn)溆谩?. 2 X LAMP反應(yīng)緩沖液的準(zhǔn)備首先應(yīng)用滅菌的超純水按照表1所示比例配制無(wú)dNTP的2X反應(yīng)緩沖液儲(chǔ)存液。 所配制的緩沖液可在4°C保存3個(gè)月，-20°C長(zhǎng)期保存。表 1.
試劑總體積900mLIM Tris-Cl (pH 8.8) stock sol.40mLKCl1.49gMgSO4 (MgSO4TH2O)1.93g(3.94g)(NH4)2S042.64gTween 202mLBetaine187.4g使用前每900uL的2X反應(yīng)緩沖液儲(chǔ)存液中加入IOOuL 25mM dNTP,混勻，制備成 2X反應(yīng)緩沖液工作液，-20°C保存?zhèn)溆谩?.檢測(cè)過(guò)程在1. 5mL的離心管中按如下比例加入待檢樣品，同時(shí)設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性、陰性和超純 水的空白的對(duì)照
2X反應(yīng)緩沖液工作液 引物反應(yīng)混合物 滅菌的超純水 DNA樣品 Bst DNA聚合酶
12. 5uL 0. 9uL 8. 6uL 2. OuL 1. OuL
25uL
總體積
將各離心管輕輕混勻，瞬間離心。裝于1號(hào)離心管的狹義伯氏疏螺旋體的鑒定在 60°C水浴鍋中擴(kuò)增60分鐘；裝于2號(hào)離心管的嘎氏疏螺旋體的鑒定在65°C水浴鍋中擴(kuò)增 40分鐘；裝于3號(hào)離心管的伽氏疏螺旋體的鑒定在60°C水浴鍋中擴(kuò)增60分鐘。各試管擴(kuò) 增完成后立刻轉(zhuǎn)入80°C水浴鍋中滅活2分鐘。各取擴(kuò)增產(chǎn)物5uL，以TAE為緩沖液，在2% 的瓊脂糖凝膠(含0. 5ug/mL溴化乙錠)中，在電壓75V電泳中進(jìn)行檢測(cè)。4.檢測(cè)實(shí)例取12個(gè)PCR管，每組4支分為三組Bb、Ba和Bg。每組PCR管分別標(biāo)記1、2、3和
4號(hào)管。然后按如下加樣順序加樣。在第一組的四個(gè)離心管中各加入2X反應(yīng)緩沖液工作液12. 5uL，滅菌的超純水 8. 6uL，Bst DNA聚合酶1. OuL ；狹義伯氏疏螺旋體LAMP特異性引物反應(yīng)混合物0. 9uL，在第 二組的四個(gè)離心管中各加入2X反應(yīng)緩沖液工作液12. 5uL，嘎氏疏螺旋體LAMP特異性引 物反應(yīng)混合物0. 9uL，滅菌的超純水8. 6uL，BstDNA聚合酶1. OuL ；在第三組的四個(gè)離心管中 各加入2X反應(yīng)緩沖液工作液12. 5uL，伽氏疏螺旋體引物反應(yīng)混合物0. 9uL，滅菌的超純 水 8. 6uL, Bst DNA 聚合酶 1. OuL。然后在所有的1，2，3和4號(hào)離心管中分別加入狹義伯氏疏螺旋體、嘎氏疏螺旋體 和伽氏疏螺旋體DNA樣品和滅菌超純水2. OuL，將各離心試管輕輕混勻，瞬間離心。第一組 和第三組的樣品在60°C水浴鍋中擴(kuò)增60分鐘，然后立刻轉(zhuǎn)入80°C水浴鍋中滅活2分鐘。第 二組的樣品在65°C水浴鍋中擴(kuò)增40分鐘，立刻轉(zhuǎn)80°C水浴鍋中滅活2分鐘。分別取擴(kuò)增 產(chǎn)物5uL，以TAE為緩沖液，在2%的瓊脂糖凝膠(含0.5ug/mL溴化乙錠)中，在電壓75V 電泳中進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1-3所示。結(jié)果表明狹義伯氏疏螺旋體、嘎氏疏螺旋體、伽氏疏螺旋體基因組DNA都能被其
7特異性的引物擴(kuò)增，種間沒(méi)有交叉反應(yīng)。滅菌超純水的反應(yīng)管中也沒(méi)有擴(kuò)增。以上檢測(cè)結(jié)果參見(jiàn)表2表2
權(quán)利要求
一種用于區(qū)分萊姆病病原基因型的試劑，其特征是試劑中至少有a.狹義伯氏疏螺旋體LAMP特異性引物；b.嘎氏疏螺旋體LAMP特異性引物；c.伽氏疏螺旋體LAMP特異性引物。
2.權(quán)利要求1所述的a.狹義伯氏疏螺旋體LAMP特異性引物為 F3 -tagcagccttgacgagaa-3‘B3 :5， -tttgacctagatcgtcagaa-3‘FIP -gccgtctttgtttttttctttgcttttttcagcgtttcagtagatttgd' BIP -gtagacaagcttgagcttaaaggatttttttgtcagcttttacgcctt-S'；b.嘎氏疏螺旋體LAMP特異性引物為 F3 -gccaaaacattagtgtcaaga-3‘ B3 -ggttccttcttttacttccaatg-S'FIP -catggtttttgcagacaattcaccttttgttctaaagacaaaacatcaacaga-S'BIP —已t^cBg已已已tg已已已已gcg^tgg已已ctttt已gct^cttttccttc已已g&gt_3，；C.伽氏疏螺旋體LAMP特異性引物為 F3 :5， -ttcaacgcaaaaggtgaat-3， B3 -caactgttatttctccagagtt-S'FIP -ccggttccatcgctttttatttctgttttgaaaaaacaatactaagagcaaacg-S' BIP :5， _aagactttgctcttgaaggaacttttttgcttaaaacaacagtgcc_3，0
3.權(quán)利要求1或2所述的用于區(qū)分萊姆病病原基因型的試劑的使用方法，其特征是將 待檢的蜱進(jìn)行研磨，然后離心沉淀，取上清液；或者從待檢的動(dòng)物或人提取組織或關(guān)節(jié)滑液 或血液樣品，用所得到的上清液或組織樣品培養(yǎng)萊姆病病原螺旋體，再將培養(yǎng)液離心，取沉 淀提取基因組DNA，將所提取的基因組DNA分為三份，在LAMP反應(yīng)緩沖液中分別加入狹義 伯氏疏螺旋體特異性引物、嘎氏疏螺旋體特異性引物和伽氏疏螺旋體特異性引物，再分別 在每個(gè)加有特異性引物的LAMP反應(yīng)緩沖液中加入前述提取的DNA樣品、滅菌超純水以及 BstDNA聚合酶，然后進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，取擴(kuò)增產(chǎn)物以TAE為緩沖液，在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳 檢測(cè)，根據(jù)電泳檢測(cè)結(jié)果的泳道中是否存在的特異性條帶確定被檢樣品的萊姆病病原基因 型。
4.權(quán)利要求1或2所述的用于區(qū)分萊姆病病原基因型的試劑的使用方法，其特征是將 待檢的蜱進(jìn)行研磨，然后離心沉淀，取上清液；或者從待檢的動(dòng)物或人提取組織或關(guān)節(jié)滑液 或血液樣品，用所得到的上清液或組織樣品培養(yǎng)萊姆病病原螺旋體，再將培養(yǎng)液離心，取沉 淀提取基因組DNA，將所提取的基因組DNA分為三份，在LAMP反應(yīng)緩沖液中分別加入狹義 伯氏疏螺旋體特異性引物、嘎氏疏螺旋體特異性引物和伽氏疏螺旋體特異性引物，再分別 在每個(gè)加有特異性引物的LAMP反應(yīng)緩沖液中加入前述提取的DNA樣品、滅菌超純水以及 BstDNA聚合酶，然后進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，在各擴(kuò)增產(chǎn)物中加入Mg2+試劑，根據(jù)相應(yīng)試管內(nèi)液體 是否產(chǎn)生渾濁或白色沉淀的陽(yáng)性反應(yīng)，確定被檢樣品的萊姆病病原基因型。
5.權(quán)利要求1或2所述的用于區(qū)分萊姆病病原基因型的試劑的使用方法，其特征是將 待檢的蜱進(jìn)行研磨，然后離心沉淀，取上清液；或者從待檢的動(dòng)物或人提取組織或關(guān)節(jié)滑液或血液樣品，用所得到的上清液或組織樣品培養(yǎng)萊姆病病原螺旋體，再將培養(yǎng)液離心，取沉 淀提取基因組DNA，將所提取的基因組DNA分為三份，在LAMP反應(yīng)緩沖液中分別加入狹義 伯氏疏螺旋體特異性引物、嘎氏疏螺旋體特異性引物和伽氏疏螺旋體特異性引物，再分別 在每個(gè)加有特異性引物的LAMP反應(yīng)緩沖液中加入前述提取的DNA樣品、滅菌超純水以及 BstDNA聚合酶，然后進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，在各擴(kuò)增產(chǎn)物中加入SYBR Green I，根據(jù)相應(yīng)試管是 否呈綠色的陽(yáng)性反應(yīng)確定被檢樣品的萊姆病病原基因型。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于區(qū)分萊姆病病原基因型的試劑和其使用方法。本發(fā)明的用于區(qū)分萊姆病病原基因型的試劑中至少有狹義伯氏疏螺旋體LAMP特異性引物；嘎氏疏螺旋體LAMP特異性引物和伽氏疏螺旋體LAMP特異性引物；本發(fā)明的檢測(cè)方法采用環(huán)介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12R1/01GK101967513SQ20091025820
公開(kāi)日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2009年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月10日
發(fā)明者關(guān)貴全, 楊吉飛, 殷宏, 牛慶麗, 羅建勛 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所