專利名稱：：一種碳酸鈣結(jié)合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種碳酸鈣結(jié)合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：珍珠不僅是一種美麗的裝飾品，還具有重要的醫(yī)用、藥用價值。在我國古代醫(yī)書記載中，使用珍珠粉的中藥就有20余種，如六神丸、鎮(zhèn)驚丸、珍珠散、珠黃散等等；現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科學(xué)分析更進一步顯示，珍珠粉中含有人體中必不可少的多種氨基酸和微量元素，能增強人體細胞ATP酶的活力和調(diào)節(jié)血液酸堿度。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，珍珠層還具有良好的生物兼容性以及促進成骨的活性，是一種理想的骨替代材料。鑒于珍珠的應(yīng)用如此廣泛，需要建立高效合成珍珠的方法，以供市場之需。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供一種用于珍珠合成的蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供的蛋白，名稱為ACCBP，是如下a)或b)的蛋白質(zhì)a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)由序列表中序列2所示的氨基酸序列自N端起第25-240位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；c)將a)或b)所述的蛋白質(zhì)的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a)或b)衍生的蛋白質(zhì)。為了使a)、b)或c)中的蛋白便于純化，可在所述蛋白的N端或C端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1.標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>上述a)、b)或c)中的蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(b)中的蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列1所示的DNA序列缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。本發(fā)明所提供的編碼基因具體可為如下1)、2)、3)或4)所示的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；2)其核苷酸序列是序列表中序列1自5'末端起第73-723位核苷酸所示DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；4)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為在6XSSC，0.5XSDS的溶液中，在5(TC以上、65t:下雜交，然后用2XSSC，0.1%SDS和1XSSC，0.1%SDS各洗膜一次。擴增上述任一所述編碼基因全長或其任意片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述引物對具體可為如下1)、2)或3)所示1)—條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所示；2)—條引物序列如序列表中序列5所示，另一條引物序列如序列表中序列6所示。含有上述任一所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系或表達盒也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述重組菌是通過將所述編碼基因?qū)虢湍妇械玫降?；所述酵母菌?yōu)選為畢赤酵母菌。本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備蛋白ACCBP的方法。本發(fā)明所提供的制備蛋白ACCBP的方法，發(fā)酵上述任一所述重組菌，得到所述蛋白。上述任一所述蛋白或編碼基因在體外合成珍珠中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。在高鎂飽和碳酸氫鈣溶液中加入本發(fā)明蛋白質(zhì)，可以使碳酸鈣晶體形成類似于珍珠層小片的文石晶體。本發(fā)明蛋白及其編碼基因可用于體外合成珍珠，提高珍珠的產(chǎn)量與質(zhì)量。因此，本發(fā)明蛋白及其編碼基因在珍珠培育領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。合浦珠母貝(Pinctadafocata)購自廣西北海國發(fā)海洋生物產(chǎn)業(yè)股份有限公司。實施例1、無定形碳酸鈣結(jié)合蛋白ACCBP及其編碼基因ACCBP的獲得1、提取合浦珠母貝(Pinctadafocata)外套膜組織的總RNA;2、設(shè)計如下簡并引物F1/R1:F1:CANTGYNNNNTNAARNTNGGNWSNTGGACRl:TGYTGYCCNGARCCNTAY;3、5，-RACE和3，-RACE按照Clontech公司的RACE試劑盒說明書進行；4、根據(jù)步驟3中獲得的基因片段序列設(shè)計引物F3/R3;F3:ACGGGGGGACGCTTGTTCTG(序列3);R3:CTTGCCTTTTGAATGGGGAC(序列4);5、通過PCR的方法擴增目的基因的全長序列，其中PCR反應(yīng)的體系為50iU，其中引物各lyM，DNA模板2iU，ExTaqDNA聚合酶2U;PCR反應(yīng)條件是首先95°CDNA變性5min，然后95。C變性30sec，55。C退火30sec，72。C延伸lmin，30個循環(huán)后于72t:延伸10min;6、對所得的PCR產(chǎn)物進行序列分析。結(jié)果，得到的基因序列如序列表中序列l(wèi)所示，將該基因命名為ACCBP。該基因編碼的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示，將該蛋白命名為無定形碳酸鈣結(jié)合蛋白ACCBP。序列2自N端起第l-24位氨基酸為信號肽序列，第25-240位氨基酸為蛋白ACCBP的序列。序列1中自5'末端起第l-72位核苷酸編碼上述信號肽序列，序列l(wèi)中自5'末端起第73-723位核苷酸編碼上述蛋白ACCBP。實施例2、基因ACCBP的制備及無定形碳酸鈣結(jié)合蛋白ACCBP的表達—、制備基因以合浦珠母貝(Pinctadafucata)外套膜組織的基因組DNA為模板，用如下引物對F2/R2進行PCR擴增，得到的擴增產(chǎn)物進行克隆測序，對PCR產(chǎn)物進行0.8X瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到分子量約為700bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TIANGEN)回收該片段。將該回收片段與pGEM-TEasy(Promega)連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，根據(jù)pGEM-TEasy載體上的羧卞青霉素抗性標(biāo)記篩選陽性克隆，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒。以該重組質(zhì)粒載體上的T7和SP6啟動子序列為引物對其進行核苷酸序列測定。測序結(jié)果表明，擴增到的基因的核苷酸序列如序列表中序列1自5'末端起第73-723位核苷酸序列所示，該基因由651個脫氧核糖核苷酸組成，該基因編碼的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2自N端起第25-240位氨基酸殘基所示。F2:TGCCGCCTACGTAAAATGTGATTATCCCGAAGC(下劃線為限制性內(nèi)切酶SnaBI的識別序列)(序列5)ATCGTTATGTTC(下劃線為限制性內(nèi)切酶Notl的識別序列)(該引物中含有His-tag序列)(序列6)二、重組表達載體的構(gòu)建表達載體pPIC9K購自invitrogen，產(chǎn)品目錄號為V17520;將步驟一得到的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶SnaBI和Notl進行酶切，將表達載體pPIC9K也用相同的限制性內(nèi)切酶SnaBI和Notl進行酶切，連接，將連接產(chǎn)物進行酶切和測序驗證，得到插入基因ACCBP序列正確的、結(jié)構(gòu)正確的重組表達載體pPIC9-ACCBP。三、轉(zhuǎn)化畢赤酵母所用的畢赤酵母為GS115,購自Invitrogen,產(chǎn)品目錄號為C18100;[OO54]轉(zhuǎn)化方法參照Invitrogen公司的Pichiaexpressionkit的說明書進行，貨號K1710-01，具體如下1、提取質(zhì)粒pPIC9-ACCBP，然后進行SalI酶切使質(zhì)粒線性化；2、將畢赤酵母GS115菌株單菌落接種到10mlYPD液體培養(yǎng)基(l^酵母浸出物、2%胃蛋白胨、2%葡萄糖)中，28°C、250rpm培養(yǎng)過夜，取10iU上述培養(yǎng)液接種200mlYPD液體培養(yǎng)基，28°C、250rpm培養(yǎng)至0D6。。值在0.20.3，然后1500g室溫離心5min收集細胞；3、用20ml無菌水洗滌細胞一次，然后用20ml新鮮配制的SED溶液(1M山梨醇、25mMEDTA、50mMDTT、pH8.0)重懸細胞，1500g室溫離心5min收集細胞；4、用20ml的1M山梨醇洗滌細胞一次，然后用20mlSCE溶液(1M山梨醇、lmMEDTA、10mM檸檬酸鈉、pH5.8)重懸細胞，加入蝸牛酶消化細胞壁，同時監(jiān)測原生質(zhì)體的生成率，當(dāng)原生質(zhì)體達到70%后立即750g室溫離心lOmin收集細胞；5、用10ml的1M山梨醇洗滌原生質(zhì)體一次，再用10mlCaS溶液(1M山梨醇、lOmMTris-HCl、10mMCaC12、pH7.5)洗滌原生質(zhì)體一次，然后用0.4mlCaS溶液重懸原生質(zhì)體；6、取lOOiU上述重懸液，加入lOiig線性化質(zhì)粒，室溫放置10min，然后向其中加入新鮮配制的PEG/CaT溶液(10mMTris-HCl、10mMCaCl2、20%PEG3350、pH7.5)，輕輕混勻，室溫放置lOmin后離心去除上清。7、將原生質(zhì)體重懸于150iUS0S溶液(1M山梨醇、30XYPD液體培養(yǎng)基、10mMCaCl2)中，室溫孵育20min，之后加入850y1的1M山梨醇，混勻后取300y1與lOml融化的RD半固體培養(yǎng)基(lM山梨醇、2%葡萄糖、1.34%酵母氮堿、0.00004%生物素、0.005%氨基酸混合物、不含組氨酸、1%瓊脂)混勻，倒于RD固體培養(yǎng)基(1M山梨醇、2%葡萄糖、1.34%酵母氮堿、0.00004%生物素、0.005%氨基酸混合物、不含組氨酸、2%瓊脂)平板上，冷凝后2『C倒置培養(yǎng)46天，挑取單克隆進行蛋白表達研究。得到重組畢赤酵母，命名為GS115-pPIC9K-ACCBP。四、重組畢赤酵母GS115-pPIC9K-ACCBP的表達1、將重組畢赤酵母GS115-pPIC9K-ACCBP單菌落接種至IJ100mlBMGY液體培養(yǎng)基中，28°C、250rpm培養(yǎng)至OD600到2-6;2、1500g室溫離心5min收集細胞，用500mlBMMY液體培養(yǎng)基重懸細胞，28°C、250rpm培養(yǎng)，每24小時補加一次0.5%甲醇；甲醇誘導(dǎo)2天。酵母浸出物購自O(shè)xoid，產(chǎn)品目錄號為LP0021;胃蛋白胨購自Amresco，產(chǎn)品目錄號為J636;酵母氮堿購自Amresco，產(chǎn)品目錄號J630;生物素購自Amresco，產(chǎn)品目錄號為0340。BMGY液體培養(yǎng)基由酵母浸出物、胃蛋白胨、磷酸鉀、酵母氮堿、生物素和甘油組成，酵母浸出物在BMGY液體培養(yǎng)基中的濃度為1%(質(zhì)量百分含量)、胃蛋白胨在BMGY液體培養(yǎng)基中的濃度為2%(質(zhì)量百分含量)、磷酸鉀在BMGY液體培養(yǎng)基中的濃度為100mM、酵母氮堿在BMGY液體培養(yǎng)基中的濃度為1.34%(質(zhì)量百分含量)、生物素在BMGY液體培養(yǎng)基中的濃度為0.00004%(質(zhì)量百分含量)、甘油在BMGY液體培養(yǎng)基中的濃度為1%(質(zhì)量百分含量)；BMGY液體培養(yǎng)基的pH值為6.0。BMMY液體培養(yǎng)基由酵母浸出物、胃蛋白胨、磷酸鉀、酵母氮堿、生物素和甲醇組成；酵母浸出物在BMMY液體培養(yǎng)基中的濃度為1%(質(zhì)量百分含量)、胃蛋白胨在BMMY液體培養(yǎng)基中的濃度為2%(質(zhì)量百分含量)、磷酸鉀在BMMY液體培養(yǎng)基中的濃度為100mM、酵母氮堿在BMMY液體培養(yǎng)基中的濃度為1.34%(質(zhì)量百分含量)、生物素在BMMY液體培養(yǎng)基中的濃度為0.00004%(質(zhì)量百分含量)、甲醇在BMMY液體培養(yǎng)基中的濃度為0.5%(質(zhì)量百分含量)；BMMY液體培養(yǎng)基的pH值為6.0。五、目的蛋白的分離和純化1、甲醇誘導(dǎo)兩天后離心收集培養(yǎng)基，濃縮透析到平衡緩沖液中，用5倍柱體積的平衡緩沖液平衡鎳柱Ni-NTAagarose(Qiagen)，之后將樣品過鎳柱，并用平衡緩沖液洗柱；2、用洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，通過15XSDS-PAGE電泳、考馬斯亮藍染色等檢測其純度；3、將純化的蛋白透析到5mMTris-HCl(pH7.5)中，濾菌后-70"凍存。平衡緩沖液為磷酸鈉和NaCl的混合水溶液；磷酸鈉在平衡緩沖液中的濃度為50mM、NaCl在平衡緩沖液中的濃度為500mM;平衡緩沖液的pH值為7.5。洗脫緩沖液為磷酸鈉、NaCl、和咪唑的混合水溶液；磷酸鈉在洗脫緩沖液中的濃度為50mM、NaCl在洗脫緩沖液中的濃度為500mM、咪唑在洗脫緩沖液中的濃度為200mM;洗脫緩沖液的pH值為7.5。六、蛋白產(chǎn)量將實驗五中得到的洗脫液(或蛋白純化液)中的蛋白進行定量分析，再換算每毫升發(fā)酵液中的蛋白量。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均數(shù)。表明，每毫升發(fā)酵液中目的蛋白的量為lPg目的蛋白/ml發(fā)酵液。在高鎂飽和碳酸氫鈣溶液中加入本發(fā)明蛋白質(zhì)，可以使碳酸鈣晶體形成類似于珍珠層小片的文石晶體。本發(fā)明蛋白及其編碼基因可用于體外合成珍珠，提高珍珠的產(chǎn)量與質(zhì)量。序列表<110>清華大學(xué)<120>—種碳酸鈣結(jié)合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用<160>6<210>1<211>723<212>DNA<213>合浦珠母貝(Pinctadafocata)<223><400>1atgagaaaaaccatggagggatttttgtcttattctatttgtttctgtgttttattctcc60gcagtggtagccaaatgtgattatcccgaagcaaagcttctgaaattcctgctggatgac120tatgagaaattagtaagaccagtccctaaggatggcaatgccactgtcgtctctatgggc180ttctccttgaatcacattgatgattatgattcagacagcatggaattgaaatctaacgca240tggttatctcttaaatggaatgatccaaggctgacatggaacaaagatggtggaccgttt300ggtaacgtcaaagcacttcacttgccgccgtcagatatctgggtcccggatgttgtctta360ttgaatggcctccaaccattccagccacagtttccagatagacttacagcactggtcaaa420gacacaggggatatctacctcatcactccttctgttctagaaaccaggtgtacacccgat480aaagcagatggcgacaaagccacttgtcgttttaagttcatgtcctggacgtacgacggt540ggggaggtagaactcgaccttggctttggtggactgagcttctcggagtacaagtctaca600cctggtcttacaatcctcggcaatagctccaacattaactccaggttctacgactgctgt660cccgaaccgtattatgacatagagttcaacattaatattgaacataacgataaggataag720taa723<210>2<211>240<212>PRT<213>合浦珠母貝(Pinctadafocata)<223><400>2MetArgLysThrMetGluGlyPheLeuSerTyrSerlieCysPheCys151015ValLeuPheSerAlaValValAlaLysCysAspTyrProGluAlaLys202530LeuLeuLysPheLeuLeuAspAspTyrGluLysLeuValArgProVal354045ProLysAspGlyAsnAlaThrValValSerMetGlyPheSerLeuAsn505560HislieAspAspTyrAspSerAspSerMetGluLeuLysSerAsnAla65707580TrpLeuSerLeuLysTrpAsnAspProArgLeuThrTrpAsnLysAsp859095GlyGlyProPheGlyAsnValLysAlaLeuHisLeuProProSerAsp100105110lieTrpValProAspValValLeuLeuAsnGlyLeuGinProPheGin115120125ProGinPheProAspArgLeuThrAlaLeuValLysAspThrGlyAsp130135140lieTyrLeulieThrProSerValLeuGluThrArgCysThrProAsp145150155160LysAlaAspGlyAspLysAlaThrCysArgPheLysPheMetSerTrp165170175ThrTyrAspGlyGlyGluValGluLeuAspLeuGlyPheGlyGlyLeu:0131]180185190:0132]SerPheSerGluTyrLysSerThrProGlyLeuThrlleLeuGlyAsn:0133]195200205:0134]SerSei.AsnlleAsnSerArgPheTyrAspCysCysProGluProTyr:0135]210215220225:0136]TyrAsplieGluPheAsnlieAsnlieGluHisAsnAspLysAspLys:0137]230235240:0138]<210>3:0139]<211>20:0140]<212>DNA:0141]<213>人工序列:0142]<220>:0143]<223>:0144]<400>3:0145]acggggggacgcttgttctg20:0146]<210>4:0147]<211>20:0148]<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>4cttgccttttgaatggggac20<210>5<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>5tgccgcctacgtaaaatgtgattatcccgaage33<210>6<211>58<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>6ataagaatgcggccgcttaatgatgatgatgatgatgcttatccttatcgttatgttc58權(quán)利要求一種蛋白質(zhì)，是如下a)、b)或c)的蛋白質(zhì)a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)由序列表中序列2所示的氨基酸序列自N端起第25-240位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；c)將a)或b)所述的蛋白質(zhì)的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a)或b)衍生的蛋白質(zhì)。2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述蛋白的編碼基因為如下l)、2)、3)或4)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；2)其核苷酸序列是序列表中序列1自5'末端起第73-723位核苷酸所示DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；4)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。4.擴增權(quán)利要求2或3所述基因全長或其任意片段的引物對。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的引物對，其特征在于所述引物對為下述l)、2)或3)所示1)一條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所示；2)—條引物序列如序列表中序列5所示，另一條引物序列如序列表中序列6所示。6.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系或表達盒。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體，其特征在于所述重組菌是通過將權(quán)利要求2或3中所述編碼基因?qū)虢湍妇械玫降?；所述酵母菌?yōu)選為畢赤酵母菌。8.—種制備權(quán)利要求1中所述蛋白的方法，是發(fā)酵權(quán)利要求7中所述重組菌，得到所述蛋白。9.權(quán)利要求1所述的蛋白在體外合成珍珠中的應(yīng)用。10.權(quán)利要求2或3所述的編碼基因在體外合成珍珠中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種碳酸鈣結(jié)合蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。該蛋白質(zhì)是如下a)、b)或c)的蛋白質(zhì)a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)由序列表中序列2所示的氨基酸序列自N端起第25-240位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；c)將a)或b)所述的蛋白質(zhì)的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由a)或b)衍生的蛋白質(zhì)。實驗證明，在高鎂飽和碳酸氫鈣溶液中加入本發(fā)明蛋白質(zhì)，可以使碳酸鈣晶體形成類似于珍珠層小片的文石晶體。本發(fā)明蛋白及其編碼基因可用于體外合成珍珠，提高珍珠的產(chǎn)量與質(zhì)量。因此，本發(fā)明蛋白及其編碼基因在珍珠培育領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。文檔編號C12N15/12GK101691401SQ200910235549公開日2010年4月7日申請日期2009年10月19日優(yōu)先權(quán)日2009年10月19日發(fā)明者張榮慶,張貴友,王洪鐘,謝麗萍,馬卓君,黃晶申請人:清華大學(xué)