專利名稱：轉(zhuǎn)基因木瓜品系18-2-4的核酸分子及其檢測(cè)方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有廣泛性抗木瓜環(huán)斑病毒特性的轉(zhuǎn)基因木瓜品系18-2-4的核 酸分子。本發(fā)明也涉及應(yīng)用前述序列的一種用于檢測(cè)對(duì)于木瓜環(huán)斑病毒具有廣泛抗性的轉(zhuǎn) 基因木瓜品系18-2-4的方法，以及依據(jù)前述序列所設(shè)計(jì)出的引物、探針及試劑盒。
背景技術(shù)：
木瓜(Papaya) (Carica papaya L.)生長(zhǎng)于熱帶與亞熱帶地區(qū)。量產(chǎn)木瓜所面 臨的最大問(wèn)題是在于木瓜環(huán)斑病毒(papaya ringspot virus, PRSV)造成的破壞性疾病 (Purcifull et al. 1984)。1975 年，PRSV 首次在南臺(tái)灣地區(qū)發(fā)現(xiàn)(Wang et al. 1978)，至 今已經(jīng)摧毀了商業(yè)果園大部分的木瓜生產(chǎn)。I3RSV是屬于馬鈴薯Y群病毒(Potyvirus)的一 員，此族群病毒是最龐大且影響經(jīng)濟(jì)甚巨的植物病毒族群(Fauquetet al. 2005)。I3RSV可 以通過(guò)蚜蟲(chóng)傳遞并且誘發(fā)葉部斑點(diǎn)以及變形、莖桿條紋以及生長(zhǎng)停滯的發(fā)生，而導(dǎo)致果實(shí) 品質(zhì)及產(chǎn)量的驟減(Purcifull et al. 1984)。目前被使用來(lái)保護(hù)木瓜免于rasv感染的控制措施，主要包括選擇種植時(shí)間， 以避開(kāi)蚜蟲(chóng)生長(zhǎng)高峰期；使用銀色覆蓋物(silver mulch)，以驅(qū)離蚜蟲(chóng)遠(yuǎn)離種苗；以及 應(yīng)用減弱的PRSV病毒株的交叉保護(hù)作用(cross protection) (Yeh et al. 1988 ；Yehand Gonsalves,1994) 0然而，這些方法皆無(wú)法提供對(duì)抗I3RSV的長(zhǎng)期有效的保護(hù)。目前在臺(tái) 灣，將木瓜種植于網(wǎng)室內(nèi)已經(jīng)變成用于避免木瓜遭受經(jīng)蚜蟲(chóng)傳遞的I3RSV感染的最有效的 控制方法。然而，網(wǎng)室構(gòu)筑需要較高的成本，且所使用的塑料材料于自然中難以分解，這 將會(huì)對(duì)環(huán)境造成危害，且熱帶風(fēng)暴造成損害的高度風(fēng)險(xiǎn)亦為需要考量的重要問(wèn)題(Bau et al. 2003)。近年來(lái)，以病源體衍生的抗性(pathogen-derived resistance, PDR)的觀念 (Sanfordand Johnson, 1985)為基礎(chǔ)，含有植物病毒基因組片段的轉(zhuǎn)基因植物的研發(fā)已經(jīng) 廣泛地被使用作為控制病毒的對(duì)策(Beachy，1997)。在大部分的實(shí)例中，會(huì)產(chǎn)生后轉(zhuǎn)錄性的 抗性(posttranscriptional resistance)機(jī)制，這是因一種以序列特異性方式針對(duì)病毒的 RNA 以及轉(zhuǎn)基因 mRNA 降解的 RNA 調(diào)節(jié)路徑所致(English et al. 1996 ；Lindboet al. 1993 ； Sijen and Kooter 2000 ；Vaucheret et al. 1998)。PRSV 的外殼蛋白(coatprotein, CP)基 因通過(guò)粒子轟炸法(particle bombardment)予以轉(zhuǎn)移至木瓜中(Fitch etal. 1990)，并且 蹄選出對(duì)PRSV感染具有高度抗性的轉(zhuǎn)基因品系(Fitch et al. 1992 ；Lius et al. 1997)。轉(zhuǎn)基因木瓜自1998年起已成功地于夏威夷商業(yè)化(Gonsalves，2002 ；Tripathi etal. 2007)。在臺(tái)灣，帶有臺(tái)灣嚴(yán)重病毒株I3RSV (的CP基因的轉(zhuǎn)基因木瓜品系則通過(guò) 農(nóng)桿菌媒介的轉(zhuǎn)化方法(Agrobacterium-mediated transformation)已成功的被制造出 (Cheng et al. 1996)。當(dāng)前述轉(zhuǎn)基因木瓜被接種予PRSV (時(shí)，它們對(duì)病毒的反應(yīng)落在高 度易感性(high susceptibility)到具有完全抗性(complete resistance)的范圍內(nèi)(Bau et al. 2003) 0在溫室條件下，轉(zhuǎn)基因品系16-0-1、17-0-1、17_0_5以及18-2-4對(duì)于源自不 同地理來(lái)源的I3RSV具有廣泛的抗性(Bau et. al.，2003)，而于田野試驗(yàn)中則有高度的抗性(Bau et al. 2004)，顯示這些品系具有控制不同地理區(qū)域中的PRSV的能力。實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)16-0-1、17-0-5以及18_2_4于植株生長(zhǎng)至5公分高度時(shí)，會(huì)表現(xiàn) 高度的轉(zhuǎn)基因，然而其他諸如18-0-9、19-0-1則于相同階段完全沒(méi)有表現(xiàn)，可見(jiàn)16-0-1、 17-0-5以及18-2-4等轉(zhuǎn)基因木瓜品系中的轉(zhuǎn)基因插入于基因組的位點(diǎn)必然有其特殊性。 現(xiàn)有技術(shù)尚無(wú)法得知前述轉(zhuǎn)基因木瓜品系，特別是轉(zhuǎn)基因木瓜品系18-2-4的轉(zhuǎn)基因插入 位置旁側(cè)的基因組序列，若能了解其插入基因組位置，將可針對(duì)各種品種的木瓜直接進(jìn)行 諸如以同源性的基因重組有效率的產(chǎn)生具有抗木瓜環(huán)斑病毒特性的轉(zhuǎn)基因木瓜品系，而無(wú) 需經(jīng)由長(zhǎng)時(shí)間的篩選以及田間試驗(yàn)，以取得高抗病毒性的木瓜品系。另一方面，近年來(lái)，基因改造生物(genetically modified organism,GM0)的安全 性議題已引起相當(dāng)大的注意(Singh et al.，2006)。各國(guó)已經(jīng)實(shí)施各種不同的關(guān)于GM食物 認(rèn)證以及標(biāo)示(food apporval and labeling)的法規(guī)。歐盟法規(guī)第1830/2003條[European Union (EU) regulation (EC) No. 1830/2003]規(guī)定在生產(chǎn)至供應(yīng)鏈的市場(chǎng)中的各個(gè)階段必須 能夠追蹤基因改造生物及基因改造生物衍生的產(chǎn)品(EuropeanParliament and Council of European Union, 2003, p.1-5)。同樣的，臺(tái)灣對(duì)于基因改造作物(GM crop)的田間試驗(yàn)以及接續(xù)的品種權(quán)的法規(guī) 亦要求提供有關(guān)于特定轉(zhuǎn)基因品系的轉(zhuǎn)基因旁側(cè)的基因組序列的信息。因此，用以鑒定特 定基因改造生物的具特異性且可信賴的方法對(duì)于符合法令規(guī)定而言是必要的，且對(duì)于監(jiān)測(cè) 未授權(quán)的基因改造生物的銷售與耕種而言是具有重要性的。因此，在此技術(shù)領(lǐng)域中，對(duì)于有效率的產(chǎn)生具有廣泛性抗木瓜環(huán)斑病毒特性的轉(zhuǎn) 基因木瓜品系的需求，以及一種用以鑒定特定基因改造生物的方法存在有迫切的需求，其 中該方法對(duì)于前述的諸如18-2-4的轉(zhuǎn)基因木瓜品系而言必須是具有特異性、再現(xiàn)性、高敏 感度以及可信賴的。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明概要有鑒于現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域中的對(duì)于有效率的產(chǎn)生具有廣泛性抗木瓜環(huán)斑病毒特性的 轉(zhuǎn)基因木瓜品系的需求，以及現(xiàn)有技術(shù)缺乏對(duì)于轉(zhuǎn)基因木瓜品系具有特異性的鑒定方法， 本發(fā)明的目的即在于解決現(xiàn)有技術(shù)必須經(jīng)由長(zhǎng)時(shí)間的篩選以及田間試驗(yàn)，才能取得高抗病 毒性的木瓜品系的問(wèn)題，以及提供針對(duì)轉(zhuǎn)基因木瓜品系18-2-4進(jìn)行鑒定的問(wèn)題的各種相 關(guān)技術(shù)方案，例如具有廣泛性抗木瓜環(huán)斑病毒特性的轉(zhuǎn)基因木瓜品系的核酸分子、相關(guān)轉(zhuǎn) 基因木瓜品系的檢測(cè)方法、引物、探針、試劑盒，而前述的技術(shù)方案對(duì)于18-2-4的轉(zhuǎn)基因木 瓜品系而言必須是具有特異性、再現(xiàn)性、高敏感度以及可信賴的。為了達(dá)到上述目的，在第一方面，本發(fā)明提供一種分離的具有廣泛性抗木瓜環(huán)斑 病毒特性的轉(zhuǎn)基因木瓜品系18-2-4的核酸分子，其具有一位于5’端的右邊界旁側(cè)區(qū)域， 一位于3’端的左邊界旁側(cè)區(qū)域，以及一位于右邊界旁側(cè)區(qū)域與左邊界旁側(cè)區(qū)域之間的含有 木瓜環(huán)斑病毒外殼蛋白基因(PRSV CP gene)的轉(zhuǎn)基因序列，其中右邊界旁側(cè)區(qū)域包含一與 SEQ ID NO :30所示序列具有至少90%同源性(homology)的序列；左邊界旁側(cè)序列包含一 與SEQ ID NO 32所示序列具有至少90%同源性的序列；而該轉(zhuǎn)基因序列系包括一木瓜環(huán) 斑病毒外殼蛋白基因以及一可操作的連結(jié)于I3RSV CP基因上游的啟動(dòng)子。
在第二方面，本發(fā)明系提供一種用于擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因木瓜核酸序列的引物，其系選自 于由下列所構(gòu)成的群組一具有如SEQ ID NO 30所示序列或其互補(bǔ)序列之中的至少10個(gè) 連續(xù)序列的核酸片段；以及一具有如SEQ ID NO :32所示序列或其互補(bǔ)序列之中的至少10 個(gè)連續(xù)序列的核酸片段。在第三方面，本發(fā)明系提供一種用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因木瓜品系18-2-4的方法，其包括 下列步驟提供一木瓜核酸樣品以及一引物對(duì)，其中該引物對(duì)包括一正向引物以及一反向引 物；令該木瓜核酸樣品與該引物對(duì)形成一聚合酶鏈反應(yīng)混合物，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，得到 一擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物；以及檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，其中如有一預(yù)定大小的擴(kuò)增片段存在，則代表該木瓜核酸樣 品含有源自于轉(zhuǎn)基因木瓜品系18-2-4的基因組DNA ；其中該正向引物系選自于由下列者所構(gòu)成的群組一具有如SEQ ID N0:30所示序列 之中的至少10個(gè)連續(xù)序列的核酸片段；一具有如SEQ ID NO :34所示序列中的至少10個(gè)連 續(xù)序列的核酸片段；以及它們的互補(bǔ)序列；以及該反向引物系選自于由下列者所構(gòu)成的群組一具有如SEQ ID N0:32所示序列 的互補(bǔ)序列之中的至少10個(gè)連續(xù)序列的核酸片段；一具有如SEQ ID N0:34所示序列的互 補(bǔ)序列中的至少10個(gè)連續(xù)序列的核酸片段；以及它們的互補(bǔ)序列。發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明在過(guò)去十年來(lái)，在夏威夷以及臺(tái)灣地區(qū)已成功培育出商業(yè)上可取得的轉(zhuǎn)基因木瓜 品系，其因帶有木瓜環(huán)斑病毒(papaya ringspot virus,PRSV)的外殼蛋白(coatprotein， CP)基因，而可具有對(duì)抗各種不同地域來(lái)源的PRSV病毒的廣泛性病毒抗性。然而要篩選出 一對(duì)木瓜環(huán)斑病毒具有高度廣泛穩(wěn)定抗性的轉(zhuǎn)基因木瓜品系以現(xiàn)有技術(shù)的方法必須經(jīng)由 長(zhǎng)時(shí)間的篩選、田間試驗(yàn)才能取得。有鑒于此，本發(fā)明利用分子生物技術(shù)成功解析出轉(zhuǎn)基因木瓜品系18-2-4的含有 木瓜環(huán)斑病毒外殼蛋白的T-DNA插入的位點(diǎn)，并分析得到其右、左邊界旁側(cè)的基因組序列， 因而分離出一具有可適用于制造具有高度廣泛穩(wěn)定抗性的轉(zhuǎn)基因木瓜的核酸分子，其具 有一位于5’端的右邊界旁側(cè)區(qū)域，一位于3’端的左邊界旁側(cè)區(qū)域，以及一位于右邊界旁 側(cè)區(qū)域與左邊界旁側(cè)區(qū)域之間的含有木瓜環(huán)斑病毒外殼蛋白基因(PRSV CP gene)的轉(zhuǎn)基 因序列，其中右邊界旁側(cè)區(qū)域包含一與SEQID NO :30所示序列具有90%同源性的序列；左 邊界旁側(cè)序列包含一與SEQ ID NO :32所示序列具有90%同源性的序列；而該轉(zhuǎn)基因序列 系包括一木瓜環(huán)斑病毒外殼蛋白基因以及一可操作的連結(jié)于木瓜環(huán)斑病毒外殼蛋白基因 上游的啟動(dòng)子。另一方面，基于歐盟以及部分亞洲國(guó)家的法規(guī)對(duì)于基因改造生物的追蹤的 要求，本技術(shù)領(lǐng)域中迫切需要一種針對(duì)前述轉(zhuǎn)基因木瓜品系的事件特異性檢測(cè)方法 (event-specific detection)，此一事件特異性檢測(cè)方法具有高效率以及高靈敏度的特
點(diǎn)ο有鑒于此，本發(fā)明以聚合酶鏈反應(yīng)為基礎(chǔ)，針對(duì)rasv CP基因的轉(zhuǎn)基因木瓜品系的 特性研發(fā)出如前所述的檢測(cè)方法、引物及試劑盒。轉(zhuǎn)基因特異性產(chǎn)物可以通過(guò)使用針對(duì)轉(zhuǎn)基因中的啟動(dòng)子、終止子、篩選標(biāo)記以及轉(zhuǎn)基因的各種引物對(duì)予以擴(kuò)增出。此外，所述的利 用接頭-接合聚合酶鏈反應(yīng)(adaptor ligation-PCR, AL-PCR)所擴(kuò)增出的植物基因組DNA 與T-DNA插入物之間的連接區(qū)域(junction)于本發(fā)明中被選殖(cloned)及定序。另外，本發(fā)明提供一種針對(duì)轉(zhuǎn)基因及其旁側(cè)序列的事件-特異性檢測(cè)方法，其系 可用于鑒定特定的轉(zhuǎn)基因木瓜品系18-2-4。本發(fā)明中依據(jù)轉(zhuǎn)基因的左、右邊界的旁側(cè)序列 所設(shè)計(jì)出的引物，當(dāng)被使用于擴(kuò)增反應(yīng)中時(shí)，其所擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物的態(tài)樣系具有再現(xiàn)性 以及特異性。本發(fā)明亦證實(shí)I3RSV CP基因是插入至轉(zhuǎn)基因木瓜的基因組的不同位置中，且插 入的T-DNA的復(fù)本數(shù)目通過(guò)即時(shí)PCR被測(cè)定出。因此，本發(fā)明所提供的事件-特異性方法、 引物以及試劑盒對(duì)于法規(guī)要求需追蹤基因改造生物的國(guó)家以及對(duì)于保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)而言是 有用且重要的。此外，本發(fā)明所提供的方法、引物以及試劑盒有助于于育種計(jì)劃(breeding program)中迅速蹄選出純合子轉(zhuǎn)基因子代(homozygote-transgenic progeny)。依據(jù)本發(fā)明，用語(yǔ)“同源性(homology) ”意指二序列之間相關(guān)連的程度，其可以序 列間相同及/或保守(conservative)比率定的。由于核酸或氨基酸序列的變異并不必然 影響其所構(gòu)成的特性，因此只要核酸或其編碼出的氨基酸序列具有一定程度的同源性而不 影響核酸序列的特性或該蛋白質(zhì)的活性，即為本發(fā)明所涵蓋，上述一定程度的同源性優(yōu)選 是至少90%。在本發(fā)明的分離的具有廣泛性抗木瓜環(huán)斑病毒特性的轉(zhuǎn)基因木瓜品系18-2-4 的核酸分子的優(yōu)選實(shí)施例中，其中該啟動(dòng)子為花椰菜鑲嵌病毒35S啟動(dòng)子(Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter, CaMV 35S promoter)。在本發(fā)明的分離的具有廣泛性抗木瓜環(huán)斑病毒特性的轉(zhuǎn)基因木瓜品系18-2-4 的核酸分子的優(yōu)選實(shí)施例中，其中該轉(zhuǎn)基因序列系包含一與SEQ ID N0:34所示序列具有 90%同源性的序列。在本發(fā)明的分離的具有廣泛性抗木瓜環(huán)斑病毒特性的轉(zhuǎn)基因木瓜品系18-2-4的 核酸分子的優(yōu)選實(shí)施例中，如前所述的核酸分子，其是由下列者所構(gòu)成一位于5’端的右 邊界旁側(cè)區(qū)域，一位于3’端的左邊界旁側(cè)區(qū)域，以及一位于右邊界旁側(cè)區(qū)域與左邊界旁側(cè) 區(qū)域之間的含有木瓜環(huán)斑病毒外殼蛋白基因的轉(zhuǎn)基因序列，其中右邊界旁側(cè)區(qū)域具有如 SEQ ID NO 30所示序列；左邊界旁側(cè)序列具有如SEQID NO 32所示序列；而該轉(zhuǎn)基因序列 具有如SEQ ID NO 34所示序列。依據(jù)本發(fā)明的方法，所述的用于擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因木瓜核酸序列的引物系選自于由下列 所構(gòu)成的群組一具有如SEQ ID NO 30所示序列或其互補(bǔ)序列之中的至少10個(gè)連續(xù)序列 的核酸片段；以及一具有如SEQ ID NO :32所示序列或其互補(bǔ)序列之中的至少10個(gè)連續(xù)序 列的核酸片段。優(yōu)選的，前述引物是選自于由下列所構(gòu)成的群組一具有如SEQ ID N0:30所示序 列或其互補(bǔ)序列之中的至少15個(gè)連續(xù)序列的核酸片段；以及一具有如SEQID NO :32所示序 列或其互補(bǔ)序列之中的至少15個(gè)連續(xù)序列的核酸片段。依據(jù)本發(fā)明的方法，前述用于擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因木瓜核酸序列的引物優(yōu)選的是選自于由 下列引物所構(gòu)成的群組Papa32引物，其具有如SEQ ID NO 18所示序列；以及Papa59引 物，其具有如SEQ ID N0:22所示序列。依據(jù)本發(fā)明，“引物(primer)”可以利用此技術(shù)領(lǐng)域中所知的任何化學(xué)或生化的
7合成方法制備。例如，當(dāng)引物為核酸所構(gòu)成時(shí)，其可通過(guò)遺傳工程領(lǐng)域中常見(jiàn)的核酸合成 方法制備。例如，核酸可通過(guò)使用DNA合成儀直接合成。而為了使得到的核酸可于細(xì)胞 內(nèi)較為穩(wěn)定，可進(jìn)一步針對(duì)核酸的堿基、醣基以及磷酸部分進(jìn)行化學(xué)性修飾，諸如烷基化 (alkylation)、酰基化(acylation)或其他類似作用。用語(yǔ)“探針”意指可產(chǎn)生可辨識(shí)特定序列并且可產(chǎn)生供檢測(cè)的信號(hào)的材料，如此處 所示用的探針包括經(jīng)標(biāo)記的核酸片段，其中該標(biāo)記包括但不限于放射性物質(zhì)、熒光染料以
及受質(zhì)專一性酵素等。依據(jù)本發(fā)明的用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因木瓜品系18-2-4的方法，其包括提供一木瓜核酸 樣品以及一引物對(duì)，其中該引物對(duì)包括一正向引物以及一反向引物；令該木瓜核酸樣品與 該引物對(duì)形成一聚合酶鏈反應(yīng)混合物，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，得到一擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物；以及檢測(cè)擴(kuò)增 反應(yīng)產(chǎn)物，其中如有一預(yù)定大小的擴(kuò)增片段存在，則代表該木瓜核酸樣品含有源自于轉(zhuǎn)基 因木瓜品系18-2-4的基因組DNA ；其中該正向引物系選自于由下列者所構(gòu)成的群組一具 有如SEQ ID NO 30所示序列之中的至少10個(gè)連續(xù)序列的核酸片段；優(yōu)選的，至少15個(gè)連 續(xù)序列的核酸片段；以及一具有如SEQ ID NO 33介于第4468至M68核苷酸位點(diǎn)的序列 之中的至少10個(gè)連續(xù)序列的核酸片段；優(yōu)選的，至少15個(gè)連續(xù)序列的核酸片段；以及該反 向引物系選自于由下列者所構(gòu)成的群組一具有如SEQ ID NO :32所示序列的互補(bǔ)序列之 中的至少10個(gè)連續(xù)序列的核酸片段；優(yōu)選的，至少15個(gè)連續(xù)序列的核酸片段；以及一具有 如SEQ ID NO 33介于第1至1000核苷酸位點(diǎn)的序列的互補(bǔ)序列之中的至少10個(gè)連續(xù)序 列的核酸片段；優(yōu)選的，至少15個(gè)連續(xù)序列的核酸片段。在本發(fā)明的一優(yōu)選的實(shí)施例中，前述的正向引物系選自于由下列引物所構(gòu)成的群 組Papa32引物，其具有如SEQ ID NO 18所示序列；Pl引物，其具有如SEQ ID N0:13所示 序列；Papa34引物，其具有如SEQ ID NO 15所示序列；Papa52引物，其具有如SEQ ID NO 14所示序列；Papa56引物，其具有如SEQ ID NO 19所示序列；Papa58引物，其具有如SEQ ID N0:21所示序列；以及m引物，其具有如SEQ ID NO 16所示序列；而反向引物系選自于 由下列引物所構(gòu)成的群組S18引物，其具有SEQ ID N0:11所示序列；Papa27引物，其具有 如 SEQ IDNO :12 ；以及 Papa59 引物，其具有如 SEQ ID NO :22。依據(jù)本發(fā)明，所述的擴(kuò)增片段(amplified fragment)意指利用前述引物以核酸樣 品為模板進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)所擴(kuò)增出的特定片段，例如使用Papa32引物(SEQ IDNO 18)為 正向引物以及Papa27引物(SEQ ID NO 12)為反向引物，以轉(zhuǎn)基因木瓜品系18_2_4的基因 組DNA為模板，于適當(dāng)?shù)木酆厦告湻磻?yīng)條件下，則可擴(kuò)增出一 384堿基對(duì)的擴(kuò)增片段。依據(jù)本發(fā)明，所述的聚合酶鏈反應(yīng)混合物如此技術(shù)領(lǐng)域所知的包括引物、模板、聚 合酶、去氧核苷三磷酸(deoxyribonucleotide triphosphate, dNTP)以及反應(yīng)緩沖液，并可 進(jìn)行一擴(kuò)增反應(yīng)，得到一擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物。在本發(fā)明的一優(yōu)選的實(shí)施例中，所述的聚合酶鏈反 應(yīng)混合物更包含一染料，該染料系可與擴(kuò)增片段結(jié)合，并且接受適當(dāng)?shù)臒晒饧ぐl(fā)而放出可 檢測(cè)的熒光信號(hào)，例如，但不限于SYBR Green0依據(jù)本發(fā)明，所述的木瓜核酸樣品系可通過(guò)任何本技術(shù)領(lǐng)域中已知的核酸萃取方 法從木瓜的各個(gè)器官、部位(諸如根、莖、葉、花、果實(shí)、種子等)所制得。優(yōu)選的是從木瓜的 葉部利用溴化鯨蠟基三甲基銨(cetyltrimethylammonium bromide, CTAB)純化而得。依據(jù)本發(fā)明，檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物優(yōu)選的系包括通過(guò)電泳分析以及直接檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)的熒光信號(hào)等方式進(jìn)行，其中直接檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)的熒光信號(hào)的方式系包括檢測(cè)經(jīng)染料標(biāo) 記的特異性探針或使用SYBR .Green等染料經(jīng)適當(dāng)熒光激發(fā)后所發(fā)射出的熒光信號(hào)。依據(jù)本發(fā)明，前述檢測(cè)步驟，優(yōu)選的系包括通過(guò)電泳分析以及直接檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng) 的熒光信號(hào)等方式進(jìn)行，其中直接檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)的熒光信號(hào)系包括檢測(cè)經(jīng)標(biāo)記的特異性探 針或使用SYBR Green等染料經(jīng)適當(dāng)熒光激發(fā)后所發(fā)射出的熒光信號(hào)。


圖1顯示轉(zhuǎn)基因木瓜品系中的T-DNA的旁側(cè)區(qū)域，其中圖1 (a)區(qū)顯示位于木瓜基 因組內(nèi)的T-DNA插入物，圖1 (b)區(qū)顯示右邊界旁側(cè)的基因組序列的擴(kuò)增策略，以及圖1 (c) 區(qū)顯示左邊界旁側(cè)的基因組序列的擴(kuò)增策略。圖2利用類型1、2、3的PCR檢測(cè)鑒定轉(zhuǎn)基因木瓜品系；其中圖2(a)區(qū)顯示針對(duì)35S啟動(dòng)子的類型1檢測(cè)的結(jié)果，其利用35S啟動(dòng)子特異性引 物對(duì)35S-F/35S-R擴(kuò)增而得一 836堿基對(duì)的產(chǎn)物；圖2(b)區(qū)顯示針對(duì)nptll的類型1檢測(cè)的結(jié)果，其利用nptll特異性引物對(duì) npt-l/npt-2擴(kuò)增而得一 8 堿基對(duì)的產(chǎn)物；圖2(c)區(qū)顯示針對(duì)nos終止子的類型1檢測(cè)的結(jié)果，其利用nos終止子特異性引 物對(duì)nos-l/nos-2擴(kuò)增而得一 1 堿基對(duì)的產(chǎn)物；圖2(d)區(qū)顯示針對(duì)轉(zhuǎn)基因的類型2檢測(cè)的結(jié)果，其利用I5RSV CP基因特異性引物 對(duì)PRSV-F/PRSV-R擴(kuò)增而得一 840堿基對(duì)的產(chǎn)物；以及圖2(e)區(qū)顯示針對(duì)CaMV 35S啟動(dòng)子以及I3RSV CP轉(zhuǎn)基因的類型3檢測(cè)的結(jié)果， 其利用引物對(duì)35S-F/PRSV-R擴(kuò)增而得一 700堿基對(duì)的產(chǎn)物。圖3顯示T-DNA右邊界/木瓜基因組DNA連接區(qū)域的序列分析，其中T-DNA序列 以及其右邊界是以小寫(xiě)表示，SspI的辨識(shí)位點(diǎn)(ATT)如箭頭標(biāo)示，此外Apl、Ap2、Papa27、 Papa31以及Papa32等引物位置如圖所標(biāo)示；其中圖3(a)區(qū)顯示轉(zhuǎn)基因品系16-0-1以及17_0_5的T-DNA右邊界的基因組旁側(cè)序 列(SEQ ID NO 29)；以及圖3 (b)區(qū)顯示轉(zhuǎn)基因品系18-2-4的T-DNA右邊界的基因組旁側(cè)序列(SEQ IDNO 30)。圖4顯示T-DNA左邊界/木瓜基因組DNA連接區(qū)域的序列分析，其中T-DNA序列 以及其左邊界是以小寫(xiě)表示，DraI以及EcoRV的辨識(shí)位點(diǎn)(TTT以及GAT)分別如箭頭標(biāo)示， 此外Apl、Ap2、Papa52、Papa56、Papa57、Papa58Papa59以及附等引物位置如圖所標(biāo)示；其 中圖4(a)區(qū)顯示轉(zhuǎn)基因品系16-0-1以及17_0_5的T-DNA左邊界的基因組旁側(cè)序 列(SEQ ID NO 31)；以及圖4(b)區(qū)顯示轉(zhuǎn)基因品系18-2-4的T-DNA左邊界的基因組旁側(cè)序列(SEQ IDNO 32)。圖5顯示轉(zhuǎn)基因木瓜品系的事件特異性檢測(cè)，其是利用對(duì)基因組旁側(cè)序列以及 T-DNA序列具有特異性的引物對(duì)產(chǎn)生跨越T-DNA右邊界以及植物基因組的DNA產(chǎn)物或者跨 越T-DNA左邊界以及植物基因組的DNA產(chǎn)物；其中
圖5 (a)區(qū)顯示針對(duì)16-0-1品系(右邊界)利用引物對(duì)Papa31/Papa27擴(kuò)增出-241堿基對(duì)的特異性產(chǎn)物；圖5 (b)區(qū)顯示針對(duì)18-2-4品系(右邊界)利用引物對(duì)Papa32/Papa27擴(kuò)增出-384堿基對(duì)的特異性產(chǎn)物；圖5 (c)區(qū)顯示針對(duì)16-0-1品系(左邊界)利用引物對(duì)Papa56/Papa57擴(kuò)增出-106堿基對(duì)的特異性產(chǎn)物；圖5 (d)區(qū)顯示針對(duì)18-2-4品系(左邊界)利用引物對(duì)Papa58/Papa59擴(kuò)增出-140堿基對(duì)的特異性產(chǎn)物；
及


圖5(e)區(qū)顯示利用引物對(duì)Papa31/Papa57擴(kuò)增出一 227堿基對(duì)的特異性產(chǎn)物；以
圖5 (f)區(qū)顯示利用引物對(duì)Papa32/Papa59擴(kuò)增出一 345堿基對(duì)的特異性產(chǎn)物。 圖6顯示利用Southern印跡分析測(cè)定PRSV CP轉(zhuǎn)基因復(fù)本數(shù)目。 圖7顯示I3RSV CP轉(zhuǎn)基因的即時(shí)PCR擴(kuò)增圖，其中to數(shù)值差值(delta Rn value) 以報(bào)導(dǎo)子染劑從TaqMan 探針被釋放出來(lái)時(shí)的經(jīng)歸一化的熒光發(fā)射表示；其中圖7 (a)區(qū)顯示16-0-1雜合子Ttl植物體的典型擴(kuò)增曲線圖7 (b)區(qū)顯示16-0-1純合子T1植物體的典型擴(kuò)增曲線圖7 (c)區(qū)顯示18-2-4雜合子Ttl植物體的典型擴(kuò)增曲線；以及圖7(d)區(qū)顯示18-2-4純合子T1植物體的典型擴(kuò)增曲線。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明將進(jìn)一步通過(guò)下面的實(shí)施例來(lái)作說(shuō)明，但應(yīng)明了的是，該等實(shí)施例僅為說(shuō) 明之用，而不應(yīng)被視為本發(fā)明的實(shí)施上的限制。實(shí)施例一般材料與方法1.植物材料下述實(shí)施例中所使用的植物材料是具有rasv的CP基因以及對(duì)rasv具高度抗性 的轉(zhuǎn)基因木瓜(Cheng et al.，1996)，其中包括16-0-1、17-0-5以及18-2-4品系的T0植物 體以及16-0-1以及18-2-4品系雜合子或純合子子代的T1植物體，其皆以組織培養(yǎng)的方式 進(jìn)行微體繁殖(micropropagated) (Yang et al.，1996)。使用作為比較的非轉(zhuǎn)基因的物種 (varieties)為臺(tái)農(nóng)一號(hào)(Tainung No. 1，1^1)、臺(tái)農(nóng)二號(hào)(TainungNo. 2，TN2)、臺(tái)農(nóng)五號(hào) (Tainung No. 5, TN5)、臺(tái)農(nóng)六號(hào)(Tainung No. 6, TN6)、日升(Sunrise)、紅妃(Red Lady)、 穗中紅(Red Ear)、馬大瓜(Mai Tai Kua)以及泰國(guó)(Thailand)。它們的種苗是由位于臺(tái) 灣行政院農(nóng)委會(huì)農(nóng)業(yè)試驗(yàn)所(Taiwan AgriculturalResearch Institute, TARI)的鳳山熱 帶園藝試驗(yàn)分所(Fengshan Tropical HorticulturalExperiment Branch)所提供。轉(zhuǎn)基 因品系與非轉(zhuǎn)基因品種的植物是于TARI附設(shè)的溫室中培育生長(zhǎng)。2.木瓜基因組 DNA (genomic DNA)純化木瓜基因組DNA是從0. 5g轉(zhuǎn)基因木瓜品系以及非轉(zhuǎn)基因物種的新鮮葉片中所純 化出，其是以Dolyle等人所使用的方法(Doyle and Doyle, 1990)利用溴化鯨蠟基三甲基 銨(cetyltrimethylammonium bromide, CTAB)(SIGMA-ALDRICH Inc.，St. Louis, MO, USA)純化而得。將聚乙烯基吡咯并吲哚[poly (vinylpolypyrrolidone)，PVPP) (SIGMA-ALDRICH Inc.)予以加入至萃取緩沖液，用以增加萃取的DNA的純度。DNA濃度通過(guò)光譜儀(U-3000 Spectrophotometer, Hitachi Instruments Inc. , SanJose, CA, USA)予以評(píng)估測(cè)量 OD260, 而DNA品質(zhì)是利用瓊脂醣凝膠進(jìn)行分析。3.利用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)的轉(zhuǎn)基因特異性檢測(cè)作為類型1 的鑒定，引物對(duì) 35S-F/35S-R、npt-l/npt-2 以及 nos-l/nos-2， 如表1所示，分別被使用來(lái)檢測(cè)花椰菜鑲嵌病毒35S啟動(dòng)子(Cauliflower mosaic virus 35Spromoter, CaMV 35S promoter)、康納霄素蹄選標(biāo)記基因 npt II (kanamycin selectionmarker gene nptll)以及 i若中白林合成 Sl 終 it 子(nopaline synthase terminator, nosterminator) (Hoist-Jensen et al. ,2003)。對(duì)于類型 2 鑒定，是使用如表 1所示的對(duì)PRSVCP基因序列具有特異性的引物對(duì)PRSV-F/PRSV-R(Bau et al.，2003)。對(duì)于 類型3鑒定，是使用對(duì)35S啟動(dòng)子(35S promoter)具有特異性的引物對(duì)以及對(duì)I3RSV CP基 因具有特異性的引物對(duì)35S-F/PRSV-R。PCR擴(kuò)增反應(yīng)混合物(最終體積30 μ L)含有USng HIS.DNA (template DNA) UR^] 1. 2unit FastStart Polymerase (RocheDiagnotics GmbH, Penzberg, Germany) ,2. 5mM MgCl2、200yM dNTP 以及 0. 2 μ M 引物，它們系配于 PCR 緩沖液 (50mM KCl ；IOmM Tris-HCl，pH9. O ；0. 1 % TritonX-IOO)中。PCR是以包括下列步驟的 30 個(gè) 循環(huán)利用一熱循環(huán)機(jī)(thermocycler) (Gene Amp PCR System 9700,Applied Biosystem, Foster City, CA, USA)進(jìn)行于94°C下歷時(shí)1分鐘，用以裂解(melting)，于不同的黏合溫 度下歷時(shí)1分鐘，用以黏合(annealing)，以及于72°C歷時(shí)2分鐘，用以合成(synthesis)。 PCR產(chǎn)物通過(guò)2%瓊脂醣凝膠于TAE緩沖液(Tris acetate, pH8. O ； ImM EDTA)中以電泳進(jìn) 行分析。PCR產(chǎn)物直接使用 310 Genetic Analyzer (ABI PRISM ,Applied Biosystems)予 以定序。PCR延長(zhǎng)作用(PCR elongation)的定序過(guò)程是進(jìn)行于前述熱循環(huán)機(jī)中歷經(jīng)25個(gè)循 環(huán)。最后的延長(zhǎng)作用之后，該定序的產(chǎn)物接而被沉淀、萃取以及復(fù)溶(redissolved)于定序 電泳緩沖液(sequencing running buffer) (Hi-Di Formamide,Applied Biosystems)。樣 品接而利用61公分毛細(xì)管被裝載至ABI 310，以進(jìn)行定序。Lasergen Software (DNASTAR, 2001，DNASTAR Inc.，Madison，WI，USA)被使用來(lái)排列比較(align)擴(kuò)增的序列與特定的已 知序列。表1本發(fā)明中所使用的引物的序列及其黏合溫度
1權(quán)利要求
1.一種分離的具有廣泛性抗木瓜環(huán)斑病毒特性的轉(zhuǎn)基因木瓜品系18-2-4的核酸分 子，其具有一位于5’端的右邊界旁側(cè)區(qū)域，一位于3’端的左邊界旁側(cè)區(qū)域，以及一位于右 邊界旁側(cè)區(qū)域與左邊界旁側(cè)區(qū)域之間的含有木瓜環(huán)斑病毒外殼蛋白基因的轉(zhuǎn)基因序列，其 中右邊界旁側(cè)區(qū)域包含一與SEQ IDNO :30所示序列具有至少90%同源性的序列；左邊界旁 側(cè)序列包含一與SEQ ID NO :32所示序列具有至少90%同源性的序列；而該轉(zhuǎn)基因序列系 包括一木瓜環(huán)斑病毒外殼蛋白基因以及一可操作的連結(jié)于木瓜環(huán)斑病毒外殼蛋白基因上 游的啟動(dòng)子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸分子，其中該啟動(dòng)子為花椰菜鑲崁病毒35S啟動(dòng)子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸分子，其中該轉(zhuǎn)基因序列進(jìn)一步包括一抗生素抗性基因 以及一終止子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸分子，其中該轉(zhuǎn)基因序列系包含一與SEQID N0:34所 示序列具有90%同源性的序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸分子，其是由下列者所構(gòu)成一位于5’端的右邊界旁側(cè) 區(qū)域，一位于3’端的左邊界旁側(cè)區(qū)域，以及一位于右邊界旁側(cè)區(qū)域與左邊界旁側(cè)區(qū)域之間 的含有木瓜環(huán)斑病毒外殼蛋白基因的轉(zhuǎn)基因序列，其中右邊界旁側(cè)區(qū)域具有如SEQ ID NO 30所示序列；左邊界旁側(cè)序列具有如SEQ ID NO 32所示序列；而該轉(zhuǎn)基因序列具有如SEQ ID NO 34所示序列。
6.一種用于擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因木瓜核酸序列的引物，其系選自于由下列所構(gòu)成的群組一具 有如SEQ ID NO 30所示序列或其互補(bǔ)序列之中的至少10個(gè)連續(xù)序列的核酸片段；以及一 具有如SEQ ID NO :32所示序列或其互補(bǔ)序列之中的至少10個(gè)連續(xù)序列的核酸片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的引物，其系選自于由下列引物所構(gòu)成的群組Papa32引物，其 具有如SEQ ID NO 18所示序列；以及Papa59引物，其具有如SEQ ID NO 22所示序列。
8.一種用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因木瓜品系18-2-4的方法，其包括提供一木瓜核酸樣品以及一引物對(duì)，其中該引物對(duì)包括一正向引物以及一反向引物；令該木瓜核酸樣品與該引物對(duì)形成一聚合酶鏈反應(yīng)混合物，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，得到一擴(kuò) 增反應(yīng)產(chǎn)物；以及檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，其中如有一預(yù)定大小的擴(kuò)增片段存在，則代表該木瓜核酸樣品含 有源自于轉(zhuǎn)基因木瓜品系18-2-4的基因組DNA ；其中該正向引物系選自于由下列者所構(gòu)成的群組一具有如SEQ ID N0:30所示序列之中 的至少10個(gè)連續(xù)序列的核酸片段；一具有如SEQ ID NO :34所適序列中的至少10個(gè)連續(xù)序 列的核酸片段；以及它們的互補(bǔ)序列；以及該反向引物系選自于由下列者所構(gòu)成的群組一具有如SEQ ID N0:32所示序列的互 補(bǔ)序列之中的至少10個(gè)連續(xù)序列的核酸片段；一具有如SEQ ID NO :34所示序列的互補(bǔ)序 列之中的至少10個(gè)連續(xù)序列的核酸片段；以及它們的互補(bǔ)序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中該正向引物系選自于由下列者所構(gòu)成的群組一 具有如SEQ ID NO :30所示序列之中的至少10個(gè)連續(xù)序列的核酸片段；一具有如SEQ ID NO :34介于第4468至討68核苷酸位點(diǎn)的序列之中的至少10個(gè)連續(xù)序列的核酸片段；以及 它們的互補(bǔ)序列；以及該反向引物系選自于由下列者所構(gòu)成的群組一具有如SEQ ID N0:32所示序列的互補(bǔ)序列之中的至少10個(gè)連續(xù)序列的核酸片段；一具有如SEQ ID N0:34介于第1至1000核 苷酸位點(diǎn)的序列的互補(bǔ)序列之中的至少10個(gè)連續(xù)序列的核酸片段；以及它們的互補(bǔ)序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中該正向引物系選自于由下列引物所構(gòu)成的群組Papa32引物，其具有如SEQ IDNO 18 所示序列；Pl引物，其具有如SEQ ID NO 13所示序列；Papa34引物，其具有如SEQ ID NO 15所示序列；Papa52引物，其具有如SEQ ID NO 14所示序列；Papa56引物，其具有如SEQ ID NO: 19所示序列；Papa58引物，其具有如SEQ ID NO :21所示序列；以及m引物，其具有 如SEQ ID NO 16所示序列；而該反向引物系選自于由下列引物所構(gòu)成的群組S18引物，其具有SEQ ID N0:11所示 序列；Papa27引物，其具有如SEQ ID NO 12 ；以及Papa59引物，其具有如SEQ ID NO :22。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中該正向引物為Papa32引物，其具有如SEQID NO 18所示序列；反向引物為Papa27引物，其具有如SEQ ID NO :12所示序列，而該擴(kuò)增片段的 預(yù)定大小為384堿基對(duì)。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中該正向引物為Papa58引物，其具有如SEQID NO 21所示序列，反向引物為Papa59引物，其具有如SEQ ID NO :22所示序列，而該擴(kuò)增片段的 預(yù)定大小為140堿基對(duì)。
13.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中該木瓜核酸樣品來(lái)源系單一木瓜植物體；該正向 引物為Papa32引物，其具有如SEQ IDNO 18所示序列；而反向引物為Papa59引物，其具有 如SEQ ID NO :22所示序列；并且該擴(kuò)增反應(yīng)系包括使用一聚合酶于具有一介于55至65°C 的黏合溫度的聚合酶鏈反應(yīng)條件下進(jìn)行；以及該檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物步驟進(jìn)一步包括檢測(cè) 一 345堿基對(duì)的擴(kuò)增片段存在，則代表該木瓜植物體非為純合子轉(zhuǎn)基因木瓜品系。
全文摘要
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因木瓜品系18-2-4的核酸分子及其檢測(cè)方法及應(yīng)用。本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因木瓜品系18-2-4的方法，其包括提供一木瓜核酸樣品以及一引物對(duì)；令該木瓜核酸樣品與該引物對(duì)形成一聚合酶鏈反應(yīng)混合物，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，得到一擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物；以及檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，其中當(dāng)有一預(yù)定大小的擴(kuò)增片段存在，則代表該樣品含有轉(zhuǎn)基因木瓜品系18-2-4的DNA。本發(fā)明也提供用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因木瓜品系18-2-4的引物、探針以及試劑盒。前述序列、方法、引物以及試劑盒有助于符合法規(guī)要求、知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)及迅速篩選出純合子轉(zhuǎn)基因子代。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102071207SQ200910226180
公開(kāi)日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2009年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月24日
發(fā)明者包慧俊, 葉錫東, 蘇天財(cái), 范宗宸, 鄭櫻慧, 陳述, 龔怡蓉 申請(qǐng)人:包慧俊, 葉錫東, 蘇天財(cái), 范宗宸, 鄭櫻慧, 陳述, 龔怡蓉