專利名稱：使用弱化了l-精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的表達(dá)的腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)生l-精氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物工業(yè)，具體涉及一種產(chǎn)生L-精氨酸的方法。該方法使用腸桿菌科(Enterobacteriaceae family)的細(xì)菌，其經(jīng)過修飾而弱化了一個(gè)或數(shù)個(gè)編碼L-精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(L-arginine transporter)的基因的表達(dá)。

背景技術(shù)：
傳統(tǒng)上，L-氨基酸是利用來自天然來源的微生物的菌株或其突變體通過發(fā)酵方法來進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)的。通常，對(duì)這些微生物加以修飾以增強(qiáng)目標(biāo)L-氨基酸的生產(chǎn)收率(production yield)。
已經(jīng)報(bào)道了許多增強(qiáng)L-氨基酸生產(chǎn)收率的技術(shù)，包括利用重組DNA轉(zhuǎn)化微生物(參見，例如，美國(guó)專利No.4,278,765)。其他用于增強(qiáng)生產(chǎn)收率的技術(shù)包括增加氨基酸生物合成中所牽涉的酶的活性和/或使目標(biāo)酶對(duì)產(chǎn)生的L-氨基酸所致的反饋抑制脫敏(參見，例如，WO 95/16042或美國(guó)專利No.4,346,170、No.5,661,012和No.6,040,160)。
增強(qiáng)L-氨基酸生產(chǎn)收率的其他方式是弱化一種或數(shù)種下述的基因的表達(dá)參與目標(biāo)L-氨基酸的降解的基因，使目標(biāo)L-氨基酸的前體從L-氨基酸生物合成途徑改道的基因，參與碳流、氮流和磷流(flux)的再分配(redistribution)的基因，以及編碼毒素的基因等。
一種依賴于大腸桿菌(Escherichia coli)中的L-精氨酸特異性結(jié)合蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)已通過遺傳和生物化學(xué)手段得到了表征。該系統(tǒng)由五個(gè)相鄰的基因即artPIQMJ(“art”代表精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)所構(gòu)成，這五個(gè)基因被組織在兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單位(artPIQM和artJ)中。artI和artJ基因的產(chǎn)物ArtI和ArtJ是周質(zhì)結(jié)合蛋白，它們與極性或堿性氨基酸的結(jié)合蛋白具有序列相似性。artQ、artM和artP的產(chǎn)物與已知的跨膜蛋白質(zhì)和結(jié)合蛋白依賴性載體的ATP酶類似。成熟的ArtI和ArtJ蛋白位于周質(zhì)中，且缺乏具有19個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽。ArtI和ArtJ是從過量生產(chǎn)性菌株中分離的。ArtJ以高親和性特異地結(jié)合L-精氨酸，而ArtJ的過量生產(chǎn)刺激了細(xì)菌的L-精氨酸攝取。ArtI的底物是未知的，而分離的ArtI不結(jié)合常見(common)的氨基酸、多種堿性的不常見(uncommon)氨基酸、或胺(amines)。有人總結(jié)稱，artPIQM artJ基因編碼的是除已知的鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)和大腸桿菌的argThisJQMP系統(tǒng)以及大腸桿菌的精氨酸(-鳥氨酸)載體(aps)之外的第三種精氨酸攝取系統(tǒng)(Wissenbach U.等，Mol Microbiol.；17(4)675-86(1995))。
但是目前，還沒有為了生產(chǎn)L-精氨酸而弱化L-精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的表達(dá)的報(bào)道。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)方面包括增強(qiáng)產(chǎn)生L-精氨酸的菌株的生產(chǎn)力和提供使用這些菌株產(chǎn)生L-精氨酸的方法。
本發(fā)明提供增加了產(chǎn)生L-精氨酸的能力的腸桿菌科細(xì)菌。
本發(fā)明的一個(gè)方面在于提供產(chǎn)生L-精氨酸的腸桿菌科細(xì)菌，其中該細(xì)菌已經(jīng)過修飾而弱化了一個(gè)或數(shù)個(gè)編碼L-精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因的表達(dá)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面在于提供如上所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌已經(jīng)過修飾而弱化了artI基因的表達(dá)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面在于提供如上所述的細(xì)菌，其中所述artI基因的表達(dá)是通過使該artI基因失活而弱化的。
本發(fā)明的另一個(gè)方面在于提供如上所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌已經(jīng)過修飾而弱化了artPIQM-artJ簇(cluster)的表達(dá)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面在于提供如上所述的細(xì)菌，其中所述artPIQM-artJ簇的表達(dá)是通過使該artPIQM-artJ簇失活而弱化的。
本發(fā)明的另一個(gè)方面在于提供如上所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌屬于埃希氏菌屬。
本發(fā)明的另一個(gè)方面在于提供如上所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌屬于泛菌屬(Pantoea)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面在于提供一種產(chǎn)生L-精氨酸的方法，其包括 -培養(yǎng)如上所述的細(xì)菌，和 -從培養(yǎng)基收集L-精氨酸。
下面詳細(xì)描述本發(fā)明。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示的是引物對(duì)P1和P2以及P5和P6在質(zhì)粒pMW118-attL-Cm-attR上的相對(duì)位置。
圖2顯示的是包含失活的artI基因或artPIQM-artJ簇的染色體DNA片段的構(gòu)建。

具體實(shí)施例方式 1.本發(fā)明的細(xì)菌 該細(xì)菌是產(chǎn)生L-精氨酸的腸桿菌科細(xì)菌，其中該細(xì)菌經(jīng)過修飾而弱化了一個(gè)或數(shù)個(gè)編碼L-精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因的表達(dá)。
術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)生L-精氨酸的細(xì)菌”是指當(dāng)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)能夠產(chǎn)生L-精氨酸并將L-精氨酸分泌到培養(yǎng)基中的細(xì)菌。
術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)生L-精氨酸的細(xì)菌”還可以指能夠產(chǎn)生L-精氨酸并導(dǎo)致L-精氨酸在培養(yǎng)基中積累且積累的量大于腸桿菌科細(xì)菌(例如大腸桿菌，如大腸桿菌K-12)的野生型菌株或親本菌株的量的細(xì)菌；優(yōu)選地表示該細(xì)菌能夠?qū)е翷-精氨酸在培養(yǎng)基中以不小于0.5g/L，更優(yōu)選不小于1.0g/L的量積累。
腸桿菌科包括屬于下列屬的細(xì)菌埃希氏菌屬(Escherichia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、泛菌屬(Pantoea)、光桿菌屬(Photorhabdus)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、志賀氏菌屬(Shigella)、摩根氏菌屬(Morganella)和耶爾森氏菌屬(Yersinia)等。具體地，可以使用根據(jù)NCBI(NationalCenter for Biotechnology Information(國(guó)家生物技術(shù)信息中心))數(shù)據(jù)庫(kù)中所用的分類法(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi？id＝91347)歸類為腸桿菌科的細(xì)菌。屬于埃希氏菌屬或泛菌屬的細(xì)菌是優(yōu)選的。
短語(yǔ)“屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌”是指所述細(xì)菌根據(jù)微生物領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的分類法被歸類于埃希氏菌屬。屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌的一個(gè)實(shí)例是，但不限于，大腸桿菌(E.coli)。
對(duì)于屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌沒有特別的限制，舉例而言，包括Neidhardt，F(xiàn).C.等(Escherichia coli and Salmonella typhimurium，American Society forMicrobiology，Washington D.C.，1208，表1)所述的細(xì)菌。
短語(yǔ)“屬于泛菌屬的細(xì)菌”是指所述細(xì)菌根據(jù)微生物領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的分類被歸類于泛菌屬。近來，基于16S rRNA的核苷酸序列分析等，成團(tuán)腸桿菌(Enterobacter agglomerans)中的一些種已被重新歸類為成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)、Pantoea ananatis、斯氏泛菌(Pantoea stewartii)等。
短語(yǔ)“細(xì)菌已經(jīng)過修飾而弱化了一個(gè)或數(shù)個(gè)編碼L-精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因的表達(dá)”可以表示細(xì)菌已經(jīng)以這樣的方式被修飾，使得經(jīng)修飾的細(xì)菌與未修飾的細(xì)菌相比，所含的L-精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其任何亞基的量減少；或者，該短語(yǔ)還可表示所述細(xì)菌不能合成L-精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或其任何亞基。
L-精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)由五個(gè)相鄰的基因即artPIQMJ的產(chǎn)物構(gòu)成，這五個(gè)基因被組織在兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單位即artPIQM和artJ中。artI和artJ基因產(chǎn)物，即ArtI和ArtJ，是周質(zhì)結(jié)合蛋白(periplasmic binding protein)，與極性或堿性氨基酸的結(jié)合蛋白具有序列相似性。artQ、artM和artP產(chǎn)物與已知的跨膜蛋白質(zhì)以及結(jié)合蛋白依賴性載體(binding-protein-dependent carriers)的ATP酶類似。
短語(yǔ)“使基因失活”意指經(jīng)修飾的基因編碼完全非功能性的蛋白。亦有可能的是，經(jīng)修飾的DNA區(qū)由于基因的部分或全部缺失、基因閱讀框的移動(dòng)、錯(cuò)義/無義突變的引入、或基因的鄰近區(qū)(包括控制基因表達(dá)的序列，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、弱化子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)等)的修飾，而不能天然地表達(dá)基因。
基因在細(xì)菌的染色體上的存在與否可以通過公知的方法(包括PCR、Southern印跡等)來加以檢測(cè)。此外，可以使用多種公知的方法(包括Northern印跡、定量RT-PCR等)測(cè)量由基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA的量，據(jù)此來估計(jì)基因表達(dá)的水平。由基因編碼的蛋白質(zhì)的量可通過公知的方法來測(cè)量，包括進(jìn)行SDS-PAGE而后再進(jìn)行免疫印跡測(cè)定(Western印跡分析)等。
artP基因(同義詞ECK0855，b0864)編碼位于細(xì)胞質(zhì)中的精氨酸ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ArtP蛋白亞基(同義詞B0864)。artP基因(與GenBank登錄號(hào)NC_000913.2；gi49175990中的核苷酸902，229至902，957互補(bǔ)的核苷酸；SEQID NO1)位于大腸桿菌K-12株的染色體上ybjP與artI基因之間。artP基因的核苷酸序列以及由artP基因編碼的ArtP蛋白的氨基酸序列分別示于SEQID NO1和SEQ ID NO2中。
artI基因(同義詞ECK0854，b0863)編碼位于壁膜間隙(periplasmic space)中的精氨酸ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ArtI蛋白亞基(同義詞B0863)。artI基因(與GenBank登錄號(hào)NC_000913.2；gi49175990中的核苷酸901，480至902，211互補(bǔ)的核苷酸；SEQ ID NO3)位于大腸桿菌K-12株的染色體上artQ和artP基因之間。artI基因的核苷酸序列以及由artI基因編碼的ArtI蛋白的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO3和SEQ ID NO4中。
artQ基因(同義詞ECK0853，b0862)編碼位于內(nèi)膜中的精氨酸ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的ArtQ蛋白亞基(同義詞B0862)。artQ基因(與GenBank登錄號(hào)NC_000913.2；gi49175990中的核苷酸900，757至901，473互補(bǔ)的核苷酸；SEQ ID NO5)位于大腸桿菌K-12菌株的染色體上artI與artM基因之間。artQ基因的核苷酸序列以及由artQ基因編碼的ArtQ蛋白的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO5和SEQ ID NO6中。
artM基因(同義詞ECK0852，b0861)編碼位于內(nèi)膜中的精氨酸ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ArtM蛋白亞基(同義詞B0861)。artM基因(與GenBank登錄號(hào)NC_000913.2；gi49175990中的核苷酸900，089至900，757互補(bǔ)的核苷酸；SEQ ID NO7)位于大腸桿菌K-12株的染色體上artQ與artJ基因之間。artM基因的核苷酸序列以及由artM基因編碼的ArtM蛋白的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO7和SEQ ID NO8中。
artJ基因(同義詞ECK0851，b0860)編碼位于壁膜間隙中的精氨酸ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ArtJ蛋白亞基(同義詞B0860)。artJ基因(與GenBank登錄號(hào)NC_000913.2；gi49175990中的核苷酸899，067至899，798互補(bǔ)的核苷酸；SEQ ID NO9)位于大腸桿菌K-12株的染色體上artM和rlmC基因之間。artJ基因的核苷酸序列以及由artJ基因編碼的ArtJ蛋白的氨基酸序列分別示于SEQ ID NO9和SEQ ID NO10中。
由于腸桿菌科的各個(gè)屬或株之間可能在DNA序列上有一些差異，因此，要在染色體上使之失活的基因不限于SEQ ID NO1、3、5、7或9中所示的基因，而可以包括與SEQ ID No1、3、5、7和9同源并編碼相應(yīng)蛋白質(zhì)的變體蛋白的基因。短語(yǔ)“變體蛋白”意指在序列上有所改變(無論是氨基酸的缺失、插入、添加或取代)但仍保持產(chǎn)物作為所述蛋白質(zhì)的活性的蛋白。
變體蛋白中的改變的數(shù)目依賴于該蛋白的三維結(jié)構(gòu)中的位置或氨基酸殘基的類型。該數(shù)目可為1至30個(gè)，優(yōu)選1至15個(gè)，且更優(yōu)選1至5個(gè)。變體中的這些改變是保留蛋白質(zhì)的功能的保守突變。換句話說，變體中的這些改變可以發(fā)生在該蛋白中對(duì)于該蛋白的功能而言不重要的區(qū)域中。這是因?yàn)槟承┌被岜舜酥g具有高的同源性，因而三維結(jié)構(gòu)或活性不受這樣的改變的影響。保守突變是這樣的突變其中，如果取代位點(diǎn)是芳族氨基酸，則在Phe、Trp、Tyr之間相互進(jìn)行取代；如果取代位點(diǎn)是疏水氨基酸，則在Leu、Ile、Val之間相互進(jìn)行取代；如果取代位點(diǎn)是極性氨基酸，則在Gln、Ash之間相互進(jìn)行取代；如果取代位點(diǎn)是堿性氨基酸，則在Lys、Arg、His之間相互進(jìn)行取代；如果取代位點(diǎn)是酸性氨基酸，則在Asp、Glu之間相互進(jìn)行取代；如果取代位點(diǎn)是具有羥基的氨基酸，則在Ser、Thr之間相互進(jìn)行取代。代表性的保守突變是保守取代。保守取代的實(shí)例包括用Ser或Thr取代Ala，用Gln、His或Lys取代Arg，用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn，用Asn、Glu或Gln取代Asp，用Ser或Ala取代Cys，用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln，用Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu，用Pro取代Gly，用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His，用Leu、Met、Val或Phe取代Ile，用Ile、Met、Val或Phe取代Leu，用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys，用Ile、Leu、Val或Phe取代Met，用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe，用Thr或Ala取代Ser，用Ser或Ala取代Thr，用Phe或Tyr取代Trp，用His、Phe或Trp取代Tyr，和用Met、Ile或Leu取代Val。上述的氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等，包括由保留artI基因的微生物的個(gè)體差異或種間差異所決定的天然存在的突變(突變體或變體)?？梢酝ㄟ^修飾SEQID NO1中所示的核苷酸序列(例如，使用定點(diǎn)誘變)使得被編碼的蛋白質(zhì)中位點(diǎn)特異的氨基酸殘基包括取代、缺失、插入或添加，來獲得這樣的基因。由所述基因編碼的蛋白變體相對(duì)于SEQ ID NO.2、4、6、8或10中所示的完整氨基酸序列可以具有不低于80％，優(yōu)選不低于90％，最優(yōu)選不低于95％的同源性，只要該蛋白在失活之前與構(gòu)成L-精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的5種野生型蛋白中的其余4個(gè)亞基復(fù)合時(shí)，能夠發(fā)揮精氨酸ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能。
兩個(gè)氨基酸序列之間的同源性可以使用公知的方法來確定，例如的計(jì)算機(jī)程序BLAST 2.0，其計(jì)算以下三種參數(shù)得分(score)、同一性(identity)和相似性(similarity)。
此外，artP、artI、artQ、artM或art J基因中的任何一個(gè)都可以是與分別如SEQ ID NO1、3、5、7或9所示的序列的互補(bǔ)核苷酸序列或可由所述核苷酸序列制備的探針在嚴(yán)格條件下雜交的變體，只要所述變體編碼失活之前有功能的蛋白即可。“嚴(yán)格條件”包括這樣的條件，在該條件下形成特異性雜交體，例如具有不低于60％，優(yōu)選不低于70％，更優(yōu)選不低于80％，還更優(yōu)選不低于90％，最優(yōu)選不低于95％的同源性的雜交體，并且不形成非特異性雜交體，例如具有低于上述同源性的雜交體。例如，嚴(yán)格條件可例示為在對(duì)應(yīng)于1xSSC、0.1％SDS，優(yōu)選0.1xSSC、0.1％SDS的鹽濃度下在60℃洗滌一次，優(yōu)選二次或三次。洗滌的持續(xù)時(shí)間取決于用于印跡的膜的類型，一般而言可以使用制造商的推薦。例如，在嚴(yán)格條件下HybondTM N+尼龍膜(Amersham)的推薦的洗滌時(shí)長(zhǎng)是15分鐘。優(yōu)選地，洗滌可以進(jìn)行2至3次。探針的長(zhǎng)度可取決于雜交條件而合適地選擇，通常為100bp至1kbp。
基因表達(dá)的弱化可通過將突變引入染色體上的基因中使得由該基因編碼的蛋白的胞內(nèi)活性與未修飾的菌株相比降低來實(shí)現(xiàn)。導(dǎo)致基因表達(dá)弱化的突變包括替換一個(gè)或多個(gè)堿基而導(dǎo)致由該基因編碼的蛋白中發(fā)生氨基酸取代(錯(cuò)義突變)，導(dǎo)入終止密碼子(無義突變)，缺失或插入一個(gè)或兩個(gè)堿基而導(dǎo)致移框(frame shift)，插入藥物抗性基因，或缺失所述基因的部分或全部(Qiu，Z.和Goodman，M.F.，J.Biol.Chem.，272，8611-8617(1997)；Kwon，D.H.等，J.Antimicrob.Chemother.，46，793-796(2000))。也可通過修飾表達(dá)調(diào)控序列(如啟動(dòng)子、Shine-Dalgarno(SD)序列)等來弱化artI基因的表達(dá)(WO95/34672，Carrier，T.A.和Keasling，J.D.，Biotechnol Prog 15，58-64(1999))。
例如，可使用如下方法通過基因重組來引入突變。制備編碼活性降低的突變蛋白的突變基因，再用含有該突變基因的DNA片段轉(zhuǎn)化要修飾的細(xì)菌。然后，通過同源重組用突變基因替代染色體上的天然基因，并選擇所得的菌株。使用同源重組的基因替換可采用線性DNA來進(jìn)行，這稱為“Red-驅(qū)動(dòng)整合”(Datsenko，K.A.和Wanner，B.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，12，p6640-6645(2000))，或采用含有溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒來進(jìn)行(美國(guó)專利6,303,383或JP 05-007491A)。此外，基因取代所致的定點(diǎn)誘變還可以通過如上所述的同源重組，使用不能在宿主中復(fù)制的質(zhì)粒來引入。
基因的表達(dá)還可通過如下方法來弱化將轉(zhuǎn)座子或IS因子插入基因的編碼區(qū)(美國(guó)專利5,175,107)，或者利用常規(guī)方法，如通過以UV照射或亞硝基胍(N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍)處理的誘變。
基因也可通過常規(guī)方法來失活，如通過使用UV照射或亞硝基胍(N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍)處理的誘變，定點(diǎn)誘變，使用同源重組的基因破壞，和/或插入-缺失誘變(Yu，D.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97125978-83和Datsenko，K.A.和Wanner，B.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97126640-45)，也稱為“Red-驅(qū)動(dòng)整合”。
用于制備質(zhì)粒DNA、消化和連接DNA、轉(zhuǎn)化、選擇作為引物的寡核苷酸等的方法可使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的普通方法。這些方法在例如Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，和Maniatis，T.，“Molecular Cloning A LaboratoryManual，第二版”，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中有記載。
產(chǎn)生L-精氨酸的細(xì)菌 可使用經(jīng)過修飾而弱化了編碼L-精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的一個(gè)或數(shù)個(gè)基因的表達(dá)，且能夠產(chǎn)生L-精氨酸的細(xì)菌。
可通過在具有天然的或固有的產(chǎn)生L-精氨酸的能力的細(xì)菌中使編碼L-精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的一個(gè)或數(shù)個(gè)基因失活來獲得所述細(xì)菌?；蛘?，可以通過將產(chǎn)生L-精氨酸的能力賦予已經(jīng)有一個(gè)或數(shù)個(gè)編碼L-精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因失活的細(xì)菌來獲得所述細(xì)菌。
可以用來得到產(chǎn)生L-精氨酸的細(xì)菌的親本菌株的實(shí)例包括，但不限于，屬于埃希氏菌屬的菌株，如大腸桿菌菌株237(VKPM B-7925)(美國(guó)專利申請(qǐng)2002/058315A1)及其帶有突變的N-乙酰谷氨酸合酶(N-acetylglutamatesynthase)的衍生菌株(俄羅斯專利申請(qǐng)No.2001112869)，大腸桿菌菌株382(VKPM B-7926)(EP1170358A1)，已引入編碼N-乙酰谷氨酸合成酶(N-acetylglutamate synthetase)的argA基因的產(chǎn)生精氨酸的菌株(EP1170361A1)，等等。
可以用來得到產(chǎn)生L-精氨酸的細(xì)菌的親本菌株的實(shí)例還包括增強(qiáng)了編碼L-精氨酸生物合成酶的一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)的菌株。這些基因的實(shí)例包括編碼下列酶的基因N-乙酰谷氨酰磷酸還原酶(argC)、鳥氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶(argD)、鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶(argF)、精氨琥珀酸合成酶(argG)、精氨琥珀酸裂合酶(argH)、和氨甲?；姿岷铣擅?carAB)。酶名稱后括號(hào)中的縮寫代表基因名稱。
2.本發(fā)明的方法 例示性方法包括通過如下方式產(chǎn)生L-精氨酸在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如本申請(qǐng)所述的細(xì)菌以產(chǎn)生L-精氨酸并將其分泌到培養(yǎng)基中，并從所述培養(yǎng)基收集L-精氨酸。
培養(yǎng)、從培養(yǎng)基中收集和純化L-精氨酸等過程可以通過常規(guī)的使用細(xì)菌產(chǎn)生氨基酸的發(fā)酵方法來進(jìn)行。
用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基可以為合成的或天然的培養(yǎng)基，只要該培養(yǎng)基包括碳源和氮源和無機(jī)物，以及(如果需要的話)適量的細(xì)菌生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物即可。碳源可以包括多種糖，如葡萄糖和蔗糖，和多種有機(jī)酸。取決于所選用的微生物的同化方式，可以使用醇，包括乙醇和甘油。作為氮源，可以使用多種銨鹽如氨(ammonia)和硫酸銨，其它含氮化合物如胺，天然氮源如蛋白胨、大豆水解物和經(jīng)消化的發(fā)酵性微生物。作為無機(jī)物，可以使用磷酸二氫鉀(potassium monophosphate)、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、氯化鈣等。作為維生素，可以使用硫胺素、酵母提取物等。
優(yōu)選地，培養(yǎng)在需氧條件下進(jìn)行，如振蕩培養(yǎng)和帶有通氣的攪拌培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20-40℃，優(yōu)選30-38℃。培養(yǎng)物的pH通常為5-9，優(yōu)選6.5-7.2。可以用氨、碳酸鈣、各種酸、各種堿和緩沖劑調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的pH。通常，歷時(shí)1-5天的培養(yǎng)導(dǎo)致L-精氨酸在液體培養(yǎng)基中的積累。
培養(yǎng)之后，可以通過離心或膜過濾將固體如細(xì)胞從液體培養(yǎng)基中去除，然后可以通過離子交換、濃縮和/或結(jié)晶方法來收集并純化L-精氨酸。
實(shí)施例 下面，將結(jié)合下述非限制性實(shí)施例更具體地說明本發(fā)明。
實(shí)施例1.artI基因失活的菌株的構(gòu)建 1.artI基因的缺失 通過由Datsenko，K.A.和Wanner，B.L.首創(chuàng)的名為“Red-驅(qū)動(dòng)整合”的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97(12)，6640-6645)來缺失細(xì)菌菌株中的artI基因。根據(jù)此方法，構(gòu)建了PCR引物P1(SEQ ID NO11)和P2(SEQ ID NO12)，它們與artI基因的鄰近區(qū)域及模板質(zhì)粒中賦予抗生素抗性的基因均同源。質(zhì)粒pMW118-attL-Cm-attR(WO 05/010175)用作PCR反應(yīng)的模板。PCR的條件如下初始DNA變性95℃5分鐘，繼之以25個(gè)95℃變性30秒、54℃退火30秒、72℃延長(zhǎng)40秒的循環(huán)；和+72℃最終延長(zhǎng)5分鐘。
從瓊脂糖凝膠純化出1.7kb的PCR產(chǎn)物(圖1)，并用它來對(duì)含有質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌菌株MG1655(ATCC 700926)進(jìn)行電穿孔。pKD46質(zhì)粒(Datsenko，K.A.和Wanner，B.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97126640-45)含有一個(gè)溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)，還包含λ噬菌體的一個(gè)2,154個(gè)核苷酸的DNA片段(核苷酸位置31088至33241，GenBank登錄號(hào)J02459)，以及處于阿拉伯糖誘導(dǎo)型ParaB啟動(dòng)子控制下的λRed同源重組系統(tǒng)基因(γ、β、exo基因)。pKD46質(zhì)粒是PCR產(chǎn)物整合到MG1655菌株的染色體中所必需的。菌株MG1655可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type CultureCollection)(P.O.Box 1549 Manassas，VA 20108，U.S.A.)獲得。
如下制備電感受態(tài)細(xì)胞將大腸桿菌MG1655/pKD46細(xì)胞在含有氨芐青霉素(100mg/l)的LB培養(yǎng)基中在30℃培養(yǎng)過夜，然后用5ml的含有氨芐青霉素和L-阿拉伯糖(1mM)的SOB培養(yǎng)基(Sambrook等，“MolecularCloningA Laboratory Manual，第二版”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)將培養(yǎng)物稀釋100倍。將細(xì)胞在30℃通氣培養(yǎng)至OD600≈0.6，然后通過濃縮100倍及用冰冷的去離子H2O洗滌三次來制成電感受態(tài)。使用70μl的細(xì)胞和≈100ng的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電穿孔。將電穿孔后的細(xì)胞用1ml的SOC培養(yǎng)基(Sambrook等，“Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)在37℃培育2.5小時(shí)，然后涂布于含有氯霉素(30μg/ml)的L-瓊脂上，并在37℃培養(yǎng)以選擇CmR重組體。然后，為了消除pKD46質(zhì)粒，在42℃在含Cm的L-瓊脂上進(jìn)行兩次傳代(passage)，并測(cè)試菌落對(duì)于氨芐青霉素的敏感性。
2.通過PCR驗(yàn)證artI基因的缺失 使用基因座特異性(locus-specific)引物P3(SEQ ID NO13)和P4(SEQ IDNO14)通過PCR驗(yàn)證了已缺失artI基因并被Cm抗性基因標(biāo)記的突變體。為此，將一個(gè)新鮮分離的菌落懸浮于20μl水中，然后將1μl的懸浮液用于PCR。溫度曲線如下初始DNA變性95℃5分鐘，然后是30個(gè)95℃變性30秒、55℃退火30秒、72℃延長(zhǎng)1分鐘的循環(huán)；和+72℃最終延長(zhǎng)5分鐘。使用親本artI+菌株MG1655的細(xì)胞作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)所獲得的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)為803bp。使用突變的MG1655ΔartI::cat菌株的細(xì)胞作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)所獲得的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)為1453個(gè)核苷酸(圖2)。將該突變菌株命名為MG1655ΔartI。
實(shí)施例2.artPIQM-artJ簇失活的菌株的構(gòu)建 1.artPIQM-artJ簇的缺失 通過Red驅(qū)動(dòng)整合來缺失細(xì)菌菌株中的artPIQM-artJ簇。根據(jù)此方法，構(gòu)建了PCR引物P5(SEQ ID NO15)和P6(SEQ ID NO16)，它們與artPIQM-artJ簇的鄰近區(qū)域以及模板質(zhì)粒中賦予抗生素抗性的基因均同源。質(zhì)粒pMW118-attL-Cm-attR(WO 05/010175)用作PCR反應(yīng)的模板。PCR的條件如上所述。
從瓊脂糖凝膠純化1.7kb的PCR產(chǎn)物(圖1)，并用它來對(duì)含有質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌菌株MG1655(ATCC 700926)進(jìn)行電穿孔。
如上文所述制備電感受態(tài)細(xì)胞。使用70μl的細(xì)胞和≈100ng的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電穿孔。將電穿孔后的細(xì)胞用1ml的SOC培養(yǎng)基在37℃培育2.5小時(shí)，然后涂布于含有氯霉素(30μg/ml)的L-瓊脂上，并在37℃培養(yǎng)以選擇CmR重組體。然后，為了消除pKD46質(zhì)粒，在42℃在含Cm的L-瓊脂上進(jìn)行兩次傳代(passage)，并測(cè)試菌落對(duì)于氨芐青霉素的敏感性。
2.通過PCR驗(yàn)證artPIQM-artJ簇的缺失 如上所述，使用基因座特異性引物P7(SEQ ID NO17)和P8(SEQ IDNO18)通過PCR驗(yàn)證了已缺失artPIQM-artJ簇并被Cm抗性基因標(biāo)記的突變體。在使用突變的MG1655ΔartPIQM-artJ::cat菌株的細(xì)胞作為模板的PCR反應(yīng)中獲得的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)為1.5kb核苷酸(圖2)。將突變菌株命名為MG1655ΔartPIMQ-artJ。
實(shí)施例3.通過大腸桿菌382ΔartI和大腸桿菌382ΔartPIMQ-artJ產(chǎn)生L-精氨酸 為了測(cè)試artI基因或artPIMQ-artJ簇的失活對(duì)于L-精氨酸生產(chǎn)的影響，將來自上述大腸桿菌MG1655ΔartI和大腸桿菌MG1655ΔartPIMQ-artJ的染色體的DNA片段通過P1轉(zhuǎn)導(dǎo)(Miller，J.H.(1972)Experiments in MolecularGenetics，Cold Spring Harbor Lab.Press，Plainview，NY)轉(zhuǎn)入產(chǎn)生L-精氨酸的大腸桿菌菌株382，以分別獲得大腸桿菌382ΔartI和382ΔartPIMQ-artJ菌株。菌株382已于2000年4月10日以登錄號(hào)VKPM B-7926保藏在俄羅斯國(guó)立工業(yè)微生物保藏中心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms)(VKPM)(Russia，117545 Moscow，1 Dorozhny proezd，1)，然后于2001年5月18日轉(zhuǎn)為根據(jù)布達(dá)佩斯條約的保藏物。
將大腸桿菌菌株382、382ΔartI和382ΔartPIMQ-artJ分別在37℃在3ml營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)18小時(shí)，然后將0.3ml的培養(yǎng)物接種于20x200-mm試管中的2ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，在旋轉(zhuǎn)搖床上32℃培養(yǎng)48小時(shí)。
培養(yǎng)后，使用如下流動(dòng)相丁醇∶乙酸∶水＝4∶1∶1(v/v)通過紙層析來測(cè)定培養(yǎng)基中積累的L-精氨酸的量。使用茚三酮(2％)的丙酮溶液作為顯示試劑(visualizing reagent)。切下一個(gè)含有L-精氨酸的斑點(diǎn)，在0.5％的CdCl2水溶液中洗脫L-精氨酸，通過540nm的分光光度測(cè)定估計(jì)L-精氨酸的量。
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(g/l)如下 葡萄糖 48.0 (NH4)2SO435.0 KH2PO4 2.0 MgSO4·7H2O 1.0 鹽酸硫胺素(Thiamine HCl) 0.0002 酵母提取物(Yeast extract)1.0 L-異亮氨酸 0.1 CaCO35.0 葡萄糖和硫酸鎂單獨(dú)滅菌。CaCO3在180℃干熱(dry-heat)滅菌2小時(shí)。將pH調(diào)節(jié)至7.0。
試管發(fā)酵的結(jié)果示于表1中。從表1可見，與產(chǎn)生L-精氨酸的親本大腸桿菌菌株382相比，artI基因或artPIMQ-artJ簇失活的菌株引起更高量的L-精氨酸積累。
表1 雖然已結(jié)合本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案詳細(xì)地描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易想到進(jìn)行多種改變和采用等同物而不背離本發(fā)明的范圍。本文引用的所有參考文件通過提述并入作為本申請(qǐng)的一部分。
序列表
<110>味之素株式會(huì)社(Ajinomoto Co.，Inc.)
<120>使用弱化了L-精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的表達(dá)的腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)生L-精氨酸的方法
<130>D010-C9317
<160>18
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>729
<212>DNA
<213>大腸桿菌(Escherichia coli)
<220>
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<213>大腸桿菌(Escherichia coli)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(717)
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gcg ctg gtc agt ttg att agt gtg aat gat tta atg ctg caa aca aaa576
Ala Leu Val Ser Leu Ile Ser Val Asn Asp Leu Met Leu Gln Thr Lys
180 185 190
agc atc gct act cgt acc cag gaa cca ttt acc tgg tac att gtg gcg624
Ser Ile Ala Thr Arg Thr Gln Glu Pro Phe Thr Trp Tyr Ile Val Ala
195 200 205
gcg gcg att tac ctg gtg atc acc ctg ctc agt cag tac att ctc aaa672
Ala Ala Ile Tyr Leu Val Ile Thr Leu Leu Ser Gln Tyr Ile Leu Lys
210 215 220
cgc att gac ctg cgc gcg aca cgt ttt gag cgg agg ccc agc taa717
Arg Ile Asp Leu Arg Ala Thr Arg Phe Glu Arg Arg Pro Ser
225 230 235
<210>6
<211>238
<212>PRT
<213>大腸桿菌(Escherichia coli)
<400>6
Met Asn Glu Phe Phe Pro Leu Ala Ser Ala Ala Gly Met Thr Val Gly
1 5 10 15
Leu Ala Val Cys Ala Leu Ile Val Gly Leu Ala Leu Ala Met Phe Phe
20 25 30
Ala Val Trp Glu Ser Ala Lys Trp Arg Pro Val Ala Trp Ala Gly Ser
35 40 45
Ala Leu Val Thr Ile Leu Arg Gly Leu Pro Glu Ile Leu Val Val Leu
50 55 60
Phe Ile Tyr Phe Gly Ser Ser Gln Leu Leu Leu Thr Leu Ser Asp Gly
65 70 75 80
Phe Thr Ile Asn Leu Gly Phe Val Gln Ile Pro Val Gln Met Asp Ile
85 90 95
Glu Asn Phe Asp Val Ser Pro Phe Leu Cys Gly Val Ile Ala Leu Ser
100 105 110
Leu Leu Tyr Ala Ala Tyr Ala Ser Gln Thr Leu Arg Gly Ala Leu Lys
115 120 125
Ala Val Pro Val Gly Gln Trp Glu Ser Gly Gln Ala Leu Gly Leu Ser
130 135 140
Lys Ser Ala Ile Phe Phe Arg Leu Val Met Pro Gln Met Trp Arg His
145 150 155 160
Ala Leu Pro Gly Leu Gly Asn Gln Trp Leu Val Leu Leu Lys Asp Thr
165 170 175
Ala Leu Val Ser Leu Ile Ser Val Asn Asp Leu Met Leu Gln Thr Lys
180 185 190
Ser Ile Ala Thr Arg Thr Gln Glu Pro Phe Thr Trp Tyr Ile Val Ala
195 200 205
Ala Ala Ile Tyr Leu Val Ile Thr Leu Leu Ser Gln Tyr Ile Leu Lys
210 215 220
Arg Ile Asp Leu Arg Ala Thr Arg Phe Glu Arg Arg Pro Ser
225 230 235
<210>7
<211>669
<212>DNA
<213>大腸桿菌(Escherichia coli)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(669)
<400>7
atg ttt gag tat tta ccc gaa ctg atg aaa ggg cta cac acc agc ctg48
Met Phe Glu Tyr Leu Pro Glu Leu Met Lys Gly Leu His Thr Ser Leu
1 5 10 15
acg cta acc gtt gcc tcg ctg att gtg gca ctg att ctg gca ttg att96
Thr Leu Thr Val Ala Ser Leu Ile Val Ala Leu Ile Leu Ala Leu Ile
20 25 30
ttt acc atc atc ctg acg ctg aaa acg ccg gtg ctg gtg tgg ctg gtg144
Phe Thr Ile Ile Leu Thr Leu Lys Thr Pro Val Leu Val Trp Leu Val
35 40 45
cgg ggt tat atc acg ctg ttt acc ggt acg ccg ctg ctg gtg cag atc192
Arg Gly Tyr Ile Thr Leu Phe Thr Gly Thr Pro Leu Leu Val Gln Ile
50 55 60
ttc ctg att tat tac ggg ccg ggc cag ttt ccg act ttg cag gag tat240
Phe Leu Ile Tyr Tyr Gly Pro Gly Gln Phe Pro Thr Leu Gln Glu Tyr
65 70 75 80
ccg gca ctg tgg cat ttg ttg tca gaa ccg tgg tta tgt gcg ctg att288
Pro Ala Leu Trp His Leu Leu Ser Glu Pro Trp Leu Cys Ala Leu Ile
85 90 95
gcg ttg tcg ctg aat agt gcg gcg tat acc acg cag ctg ttt tac ggt336
Ala Leu Ser Leu Asn Ser Ala Ala Tyr Thr Thr Gln Leu Phe Tyr Gly
100 105 110
gca att cgt gcg atc ccg gaa ggt cag tgg cag tcc tgt agc gcc ctg384
Ala Ile Arg Ala Ile Pro Glu Gly Gln Trp Gln Ser Cys Ser Ala Leu
115 120 125
gga atg agc aaa aaa gat acg ctg gcg atc ctg ctg ccg tat gcc ttt432
Gly Met Ser Lys Lys Asp Thr Leu Ala Ile Leu Leu Pro Tyr Ala Phe
130 135 140
aaa cgc tcg ctc tct tct tat tcc aac gaa gtg gtg ctg gta ttc aaa480
Lys Arg Ser Leu Ser Ser Tyr Ser Asn Glu Val Val Leu Val Phe Lys
145 150 155 160
agt acc tct ctg gca tac acc att acg ctg atg gaa gtg atg gga tac528
Ser Thr Ser Leu Ala Tyr Thr Ile Thr Leu Met Glu Val Met Gly Tyr
165 170 175
agc cag ttg ttg tac gga cgc acc tac gat gta atg gtg ttc ggt gcg576
Ser Gln Leu Leu Tyr Gly Arg Thr Tyr Asp Val Met Val Phe Gly Ala
180 185 190
gca ggg att att tac ctg gtc gtt aac ggc ctg ctg acg ctg atg atg624
Ala Gly Ile Ile Tyr Leu Val Val Asn Gly Leu Leu Thr Leu Met Met
195 200 205
cgt ctg atc gag cgc aaa gcg ctg gca ttc gaa cgg cga aat taa669
Arg Leu Ile Glu Arg Lys Ala Leu Ala Phe Glu Arg Arg Asn
210 215 220
<210>8
<211>222
<212>PRT
<213>大腸桿菌(Escherichia coli)
<400>8
Met Phe Glu Tyr Leu Pro Glu Leu Met Lys Gly Leu His Thr Ser Leu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Val Ala Ser Leu Ile Val Ala Leu Ile Leu Ala Leu Ile
20 25 30
Phe Thr Ile Ile Leu Thr Leu Lys Thr Pro Val Leu Val Trp Leu Val
35 40 45
Arg Gly Tyr Ile Thr Leu Phe Thr Gly Thr Pro Leu Leu Val Gln Ile
50 55 60
Phe Leu Ile Tyr Tyr Gly Pro Gly Gln Phe Pro Thr Leu Gln Glu Tyr
65 70 75 80
Pro Ala Leu Trp His Leu Leu Ser Glu Pro Trp Leu Cys Ala Leu Ile
85 90 95
Ala Leu Ser Leu Asn Ser Ala Ala Tyr Thr Thr Gln Leu Phe Tyr Gly
100 105 110
Ala Ile Arg Ala Ile Pro Glu Gly Gln Trp Gln Ser Cys Ser Ala Leu
115 120 125
Gly Met Ser Lys Lys Asp Thr Leu Ala Ile Leu Leu Pro Tyr Ala Phe
130 135 140
Lys Arg Ser Leu Ser Ser Tyr Ser Asn Glu Val Val Leu Val Phe Lys
145 150 155 160
Ser Thr Ser Leu Ala Tyr Thr Ile Thr Leu Met Glu Val Met Gly Tyr
165 170 175
Ser Gln Leu Leu Tyr Gly Arg Thr Tyr Asp Val Met Val Phe Gly Ala
180 185 190
Ala Gly Ile Ile Tyr Leu Val Val Asn Gly Leu Leu Thr Leu Met Met
195 200 205
Arg Leu Ile Glu Arg Lys Ala Leu Ala Phe Glu Arg Arg Asn
210 215 220
<210>9
<211>732
<212>DNA
<213>大腸桿菌(Escherichia coli)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(732)
<400>9
atg aaa aag tta gtt ctt gcc gct tta ctt gct tcc ttt act ttc ggt48
Met Lys Lys Leu Val Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ser Phe Thr Phe Gly
1 5 10 15
gct tct gcc gca gag aaa atc aat ttt ggc gtt tca gcc acc tat cca96
Ala Ser Ala Ala Glu Lys Ile Asn Phe Gly Val Ser Ala Thr Tyr Pro
20 25 30
ccc ttt gaa tct ata ggt gct aat aat gag att gtc ggc ttt gat atc144
Pro Phe Glu Ser Ile Gly Ala Asn Asn Glu Ile Val Gly Phe Asp Ile
35 40 45
gat ctg gca aaa gcc ttg tgc aaa caa atg cag gca gaa tgt act ttt192
Asp Leu Ala Lys Ala Leu Cys Lys Gln Met Gln Ala Glu Cys Thr Phe
50 55 60
act aat cac gcg ttc gac agc ctg atc ccg tcc ctg aaa ttc aga aaa240
Thr Asn His Ala Phe Asp Ser Leu Ile Pro Ser Leu Lys Phe Arg Lys
65 70 75 80
tat gac gcc gta atc tcc ggt atg gat atc acc ccg gag cgt agc aaa288
Tyr Asp Ala Val Ile Ser Gly Met Asp Ile Thr Pro Glu Arg Ser Lys
85 90 95
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Gln Val Ser Phe Thr Thr Pro Tyr Tyr Glu Asn Ser Ala Val Val Ile
100 105 110
gcc aaa aaa gat acc tac aaa acg ttt gcc gat ctg aaa ggc aaa cgt384
Ala Lys Lys Asp Thr Tyr Lys Thr Phe Ala Asp Leu Lys Gly Lys Arg
115 120 125
att ggg atg gaa aac ggt act acg cac cag aaa tat att cag gat cag432
Ile Gly Met Glu Asn Gly Thr Thr His Gln Lys Tyr Ile Gln Asp Gln
130 135 140
cac ccg gaa gtg aaa act gtc tct tat gac agt tat cag aat gcc ttt480
His Pro Glu Val Lys Thr Val Ser Tyr Asp Ser Tyr Gln Asn Ala Phe
145 150 155 160
atc gat ctg aaa aat ggt cgt att gat ggg gta ttt ggt gac aca gcg528
Ile Asp Leu Lys Asn Gly Arg Ile Asp Gly Val Phe Gly Asp Thr Ala
165 170 175
gtg gta aac gaa tgg ctg aaa acc aat cca caa ctt ggt gtt gct act576
Val Val Asn Glu Trp Leu Lys Thr Asn Pro Gln Leu Gly Val Ala Thr
180 185 190
gag aaa gtg acc gat ccg caa tat ttt ggc acc ggc ctg ggc atc gct624
Glu Lys Val Thr Asp Pro Gln Tyr Phe Gly Thr Gly Leu Gly Ile Ala
195 200 205
gta cgt ccg gat aac aaa gcc ctg ctg gaa aaa ctg aat aac gcg ctg672
Val Arg Pro Asp Asn Lys Ala Leu Leu Glu Lys Leu Asn Asn Ala Leu
210 215 220
gca gca att aaa gct gac ggt act tat caa aaa atc agt gac cag tgg720
Ala Ala Ile Lys Ala Asp Gly Thr Tyr Gln Lys Ile Ser Asp Gln Trp
225 230 235 240
ttc cca cag taa732
Phe Pro Gln
<210>10
<211>243
<212>PRT
<213>大腸桿菌(Escherichia coli)
<400>10
Met Lys Lys Leu Val Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ser Phe Thr Phe Gly
1 5 10 15
Ala Ser Ala Ala Glu Lys Ile Asn Phe Gly Val Ser Ala Thr Tyr Pro
20 25 30
Pro Phe Glu Ser Ile Gly Ala Asn Asn Glu Ile Val Gly Phe Asp Ile
35 40 45
Asp Leu Ala Lys Ala Leu Cys Lys Gln Met Gln Ala Glu Cys Thr Phe
50 55 60
Thr Asn His Ala Phe Asp Ser Leu Ile Pro Ser Leu Lys Phe Arg Lys
65 70 75 80
Tyr Asp Ala Val Ile Ser Gly Met Asp Ile Thr Pro Glu Arg Ser Lys
85 90 95
Gln Val Ser Phe Thr Thr Pro Tyr Tyr Glu Asn Ser Ala Val Val Ile
100 105 110
Ala Lys Lys Asp Thr Tyr Lys Thr Phe Ala Asp Leu Lys Gly Lys Arg
115 120 125
Ile Gly Met Glu Asn Gly Thr Thr His Gln Lys Tyr Ile Gln Asp Gln
130 135 140
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145 150 155 160
Ile Asp Leu Lys Asn Gly Arg Ile Asp Gly Val Phe Gly Asp Thr Ala
165 170 175
Val Val Asn Glu Trp Leu Lys Thr Asn Pro Gln Leu Gly Val Ala Thr
180 185 190
Glu Lys Val Thr Asp Pro Gln Tyr Phe Gly Thr Gly Leu Gly Ile Ala
195 200 205
Val Arg Pro Asp Asn Lys Ala Leu Leu Glu Lys Leu Asn Asn Ala Leu
210 215 220
Ala Ala Ile Lys Ala Asp Gly Thr Tyr Gln Lys Ile Ser Asp Gln Trp
225 230 235 240
Phe Pro Gln
<210>11
<211>64
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>11
aaaaagttct gattgccgcg ttaattgcag gttttacgct caagttagta taaaaaagct60
gaac 64
<210>12
<211>64
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>12
gtttcgtaag tgccatcttt cttcactttt tccagctgaa gcctgctttt ttatactaag60
ttgg 64
<210>13
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>13
atgaaaaaag ttctgattgc cg 22
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>14
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<210>15
<211>64
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>15
tagctatcag actgccagta tacgagtgtc aatgagcgct caagttagta taaaaaagct60
gaac 64
<210>16
<211>64
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>16
tctcaagccg cggttgcggc tttctgaatc ttactgtgaa gcctgccttt ttatactaag60
ttgg 64
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>17
gacatttatg ctcgccgacc20
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>18
aggcctgata agcgtagcgc20
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生L-精氨酸的腸桿菌科細(xì)菌，其中所述細(xì)菌已經(jīng)被修飾而弱化了一個(gè)或數(shù)個(gè)編碼L-精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因的表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌已經(jīng)被修飾而弱化了artI基因的表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的細(xì)菌，其中所述artI基因的表達(dá)是通過使該artI基因失活而弱化的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌已經(jīng)被修飾而弱化了artPIQM-artJ簇的表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的細(xì)菌，其中所述artPIQM-artJ簇的表達(dá)是通過使該artPIQM-artJ簇失活而弱化的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌屬于埃希氏菌屬。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌屬于泛菌屬。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是大腸桿菌。
9.一種產(chǎn)生L-精氨酸的方法，其包括
-在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的細(xì)菌，和
-從所述培養(yǎng)基收集L-精氨酸。
全文摘要
本發(fā)明提供使用L-精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因的表達(dá)弱化的腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)生L-精氨酸的方法，具體地，本發(fā)明提供使用腸桿菌科的細(xì)菌，特別是屬于埃希氏菌屬或泛菌屬的細(xì)菌來產(chǎn)生L-精氨酸的方法，所述細(xì)菌已經(jīng)過修飾而弱化了編碼L-精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的一個(gè)或數(shù)個(gè)基因的表達(dá)。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101760441SQ200910225200
公開日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2009年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月9日
發(fā)明者米克海爾·Y·吉爾尤金, 尤莉亞·G·羅斯托瓦, 埃爾韋拉·B·沃羅西羅瓦, 米克海爾·M·古斯亞蒂納 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社