專利名稱：一種生物催化2-氯-3-氰基吡啶生產(chǎn)2-氯煙酸的方法及菌株的制作方法
一種生物催化2-氯-3-氰基吡啶生產(chǎn)2-氯煙酸的方法及
菌株
(-)技術領域 本發(fā)明涉及一種利用腈轉化酶生物催化2-氯-3-氰基吡啶生產(chǎn)2-氯煙酸的 方法，以及可用于生產(chǎn)腈轉化酶的新菌株——紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis) ZJB-09149。
背景技術：
由于近年來隨著農(nóng)藥和醫(yī)藥科學的發(fā)展，煙酸系列化學品越來越受到廣泛地關注 和應用。煙酸的2位氯取代物2-氯煙酸則由于其特殊的生理活性，在醫(yī)藥、農(nóng)藥領域得到 了廣泛的應用，它可用于合成許多醫(yī)用止痛劑或抗炎劑，醫(yī)用抗菌素、治療心血管疾病的藥 物以及農(nóng)用殺菌劑、殺蟲劑和除草劑等，特別是在農(nóng)藥領域，2-氯煙酸的應用顯得尤為突 出。以吡啶及其衍生物為中間體的新一代農(nóng)藥具有高效、低毒、環(huán)境相容性好的特點，正在 成為開發(fā)熱點。由2-氯煙酸為母體開發(fā)的新農(nóng)藥，不僅農(nóng)藥毒性低，而且活性高，我國是一 個農(nóng)業(yè)大國，提高和改善人民的生活水平，生產(chǎn)出更多更好的農(nóng)藥以保證穩(wěn)定的豐收是非 常必要的。除此之外其衍生物2-氯煙酸甲酯、2-氯-N，N- 二甲基煙酰胺和2-巰基煙酸也 是重要的醫(yī)藥和農(nóng)藥中間體。由它們出發(fā)，也可合成許多醫(yī)用抗菌素、治療心血管疾病的藥 物以及農(nóng)用殺菌劑、殺蟲劑和除草劑等。鑒于2-氯煙酸已成為重要的農(nóng)藥和醫(yī)藥中間體， 應用前景十分廣闊。2002年，全球對2-氯煙酸的需求量約為300t，而2003年達到600t以 上，增長高達100%，隨著以2-氯煙酸作為原料的新的醫(yī)藥產(chǎn)品的開發(fā)，煙嘧磺隆專利的過 期，以及不斷發(fā)展的醫(yī)藥化工行業(yè)，2008年需求量在1500t以上。而現(xiàn)在國內產(chǎn)量大致在 600 700t左右，而2-氯煙酸的市場價格原來在128000元/t，現(xiàn)在達到14萬左右，市場 前景可觀。但由于缺乏合適的生產(chǎn)路線，2-氯煙酸在世界范圍內供不應求，嚴重制約著新醫(yī) 藥及新農(nóng)藥的研究與發(fā)展，在我國表現(xiàn)得尤為突出，這與2-氯煙酸急劇增加的市場需求相 悖，同時也表明目前缺乏較好的2-氯煙酸合成路線，因此，深入研究2-氯煙酸的生產(chǎn)具有 重大的經(jīng)濟效益和社會效益。目前2-氯煙酸主要是通過化學合成的方法獲得。其合成方法主要有(1)煙酸氮 氧化-氰化-水解法該方法原料價格較貴，所制得的產(chǎn)品成本較高，經(jīng)濟效益較差，此外在 后兩步反應中易產(chǎn)生2，6位的同分異構體，不易分離，產(chǎn)品純度也比較低，不符合醫(yī)藥和農(nóng) 藥的要求，總的收率較低，環(huán)境污染大；(2)3-氰基吡啶氮氧化法-氯化-水解法該方法國 內較為成熟，但總的反應收率較低，反應時間長，可操作性差，需要昂貴的催化劑并產(chǎn)生大 量酸性廢水，環(huán)境污染大；(3) 3-甲基吡啶氰化_氧化法該方法所用原料3-甲基吡啶國內 沒有工業(yè)化生產(chǎn)，氯化反應條件苛刻，并產(chǎn)生大量異構體，分離困難，生產(chǎn)成本大；(4)氰基 乙酸乙酯氰化_丙烯醛邁克爾加成-水解法該反應的缺點是反應原料丙烯醛毒性大，消耗 量也較大，易揮發(fā)，且整個工藝路線繁瑣，操作步驟冗長，反應中使用溶劑多，回收困難。因 此這些化學方法缺陷較多，一方面有大量廢酸排出，造成嚴重的環(huán)境污染，另一方面設備要 求高，反應條件苛刻，成本較高。由于污染大、成本高，這些方法都不適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。所以，2-氯煙酸的高效、清潔生產(chǎn)方法具有極大的社會和生態(tài)效益。近年來生物技術領域的突破性進展，使生物催化在化學合成中日趨重要。生物催 化是一種新型的轉化技術，特別適合于制藥及其相關工業(yè)中活性化合物的合成。當今社會 對“可持續(xù)發(fā)展”、“綠色化學”以及“環(huán)境友好制造”的呼聲越來越高，因此生物催化和生物 轉化過程受到前所未有的重視，被普遍認為是生物技術的第三次浪潮，正在極大地推動生 物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，具有重大的社會意義和經(jīng)濟效益。利用腈轉化酶生物催化生產(chǎn)酰胺、羧酸及 其衍生物是一種非常有效的生產(chǎn)方法，可以極大地降低能耗、節(jié)省原料、減少污染，將生物 技術應用于腈化合物的轉化合成，已經(jīng)引起人們的高度重視和關注。這一切給生物法生產(chǎn) 2-氯煙酸的發(fā)展帶來了機遇。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是提供一種利用腈轉化酶生物催化2-氯-3-氰基吡啶生產(chǎn)2-氯煙酸 的方法，以及可用于生產(chǎn)腈轉化酶的新菌株——紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis) ZJB-09149。 本發(fā)明采用的技術方案是—種生物催化2-氯-3-氰基吡啶生產(chǎn)2-氯煙酸的方法，所述方法包括在以 2_氯-3-氰基吡啶為底物、以紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的 腈轉化酶為催化劑、以水或磷酸鹽緩沖液為溶劑的反應體系中，于PH7. O 9. 0、25 60°C 下進行催化水解反應，制得所述2-氯煙酸。所述腈轉化酶用量以使2-氯-3-氰基吡啶充 分反應為止，也可過量。所述腈轉化酶來自紅平紅球菌CCTCC NO =M 209194經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的含酶細胞， 所述反應體系中含酶細胞濃度以含酶細胞濕重計為10 20g/l。所述反應體系中，底物2-氯-3-氰基吡啶初始濃度為1. 0 5. 0g/l。所述含酶細胞由如下方法制備得到將紅平紅球菌接種至適用于紅平紅球菌的發(fā) 酵培養(yǎng)基中，在溫度25 30°C、起始pH 6. 5 7. 0、搖床轉速100 300rpm的條件下震蕩 培養(yǎng)48 72h，離心分離，得到所述含酶細胞。所述適用于紅平紅球菌的發(fā)酵培養(yǎng)基為常規(guī)適用于紅平紅球菌的液體培養(yǎng)基，本 發(fā)明中所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成如下麥芽糖5. 0 15. Og/Ι，酵母粉7. 0 18. 0g/l, 己內酰胺 4. 0 8. 0g/l, MgSO4 · 7Η20 0· 1 0. 5g/l, K2HPO4 · 3H20 0. 1 0. 5g/l, KH2PO4 0. 1 0. 5g/l, FeSO4 · 7H20 0. 01 0. 02g/l，溶劑為水，pH 值 6· 5 7· 0。具體的，所述方法如下(1)紅平紅球菌CCTCC NO =M 209194接種至種子培養(yǎng)基，25 30°C培養(yǎng)16 20h，得到種子液；所述種子培養(yǎng)基終濃度組成如下葡萄糖10. 0 20. Og/Ι，蛋白胨5. 0 10. Og/Ι,己內酰胺 4. 0 8. 0g/l, MgSO4 · 7Η20 0· 2 0. 5g/l, K2HPO4 · 3H20 0· 2 0. 5g/ 1，KH2PO4O. 2 0. 5g/l, FeSO4 · 7H20 0. 01 0. 02g/l，溶劑為水，pH 值 6· 5 7· 0 ；(2)步驟(1)種子液以3 10%體積比接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在25 30°C、初始 PH6. 5 7. 0條件下震蕩培養(yǎng)48 72h，離心分離，得到菌體含酶細胞；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終 濃度組成如下麥芽糖5. 0 15. Og/Ι，酵母粉7. 0 18. Og/Ι,己內酰胺4. 0 8. 0g/l, MgSO4 · 7Η200· 1 0. 5g/l, K2HPO4 · 3H20 0· 1 0. 5g/l, KH2PO4 0· 1 0. 5g/l, FeSO4 · 7H200. 01 0. 02g/l，溶劑為水，pH 值 6. 5 7. 0。
(3)將步驟(2)菌體含酶細胞添加至含有2-氯-3-氰基吡啶的反應體系中，所述 反應體系中菌體含酶細胞以含酶細胞濕重計濃度為10 20g/l，2-氯-3-氰基吡啶初始濃 度為1. 0 5. Og/Ι，于pH7. 0 9. 0,25 60°C下進行催化水解反應10 12h，制得所述 2-氯煙酸。反應液中2-氯煙酸濃度的測定對步驟(3)獲得的反應液1ml，離心，上清液進行 液相色譜分析測定底物的含量。液相色譜的條件日本島津液相色譜儀，不銹鋼填充柱，填料為C18，長0. 25m,內徑 4. 6mm,流速lml/min，柱溫室溫，流動相為乙腈0. 1 %磷酸水溶液(25V 75V)，進樣量為 IOul0其中，2-氯煙酸出峰時間為4. 2min。采用外標法確定樣品中2-氯煙酸的含量。本發(fā)明還涉及一株篩選到的產(chǎn)腈轉化酶的新菌株——紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis) ZJB-09149，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢武漢大學， 430072，保藏日期2009年9月4日，保藏編號CCTCC NO =M 209194。本發(fā)明所涉及的菌株是通過如下方法篩選得到的(1)將由全國各地農(nóng)藥廠附件采集的土樣和污水樣接種到富集培養(yǎng)基中，在 30°C,150rpm的搖床上富集培養(yǎng)72h后，再取Iml培養(yǎng)液接種到新鮮的富集培養(yǎng)基上培養(yǎng) 72h。如此重復3個循環(huán)。富集培養(yǎng)基的配方如下(終濃度)葡萄糖5 10g/l，K2HPO4 0. 2 0. 5g/l, KH2PO4O. 2 0. 5g/l, MgSO4 0. 2 0. 5g/l, NaCl 1 2g/l, FeSO4 0. 01 0. 02g/l，2-氯-3-氰基吡啶 0. 7 1. 4g/l，pH 6. 5 7. 0。(2)最后一次培養(yǎng)液稀釋后涂布到平板培養(yǎng)基上，挑取單菌落到斜面保藏。平板培 養(yǎng)基為富集培養(yǎng)基中加入1. 5-2. 0%的瓊脂。(3)挑取的單菌落接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，組分含量如下(終濃度)葡萄糖10. 0 20. Og/Ι，蛋白胨 5. 0 10. Og/Ι，己內酰胺 4. 0 8. Og/1，MgSO4 · 7Η20 0· 2 0. 5g/l， K2HPO4 · 3H20 0· 2 0. 5g/l, KH2PO4 0· 2 0· 5g/l, FeSO4 · 7H20 0· 01 0. 02g/l，溶劑為 水，pH值6. 5 7. 0 ；在25 30°C、初始pH6. 5 7. 0條件下震蕩培養(yǎng)48 72h，離心分 離，得到菌體含酶細胞；離心后懸浮于磷酸緩沖體系中。(4)通過加入2-氯-3-氰基吡啶進行轉化實驗，共分離獲得3株可生物催化制備 2-氯煙酸的菌株；經(jīng)進一步復篩，最終獲得目標菌株ZJB-09149。本發(fā)明篩選得到的菌株ZJB-09149，按《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》以及《伯杰氏細菌 鑒定手冊(第八版)》的生理生化鑒定，菌株為革蘭氏陽性，形態(tài)近似為桿狀，成對生，寬約 0. 5 1. 0 μ m，長約1. 0 1. 5 μ m，在篩選平板上30°C培養(yǎng)36h，菌落形態(tài)特征呈圓形，邊緣 整齊，中間略突起，易挑取，菌落呈粉紅色，于30°C恒溫培養(yǎng)24h，單菌落直徑約2 3mm。16S rDNA序列分析以提取到的細胞總DNA為模板，利用引物pl6S_8 5' -aga gtt tga tcc tgg ctc ag-3‘禾口 pl6S_1541 5‘ -aag gag gtg ate cagccg ca~3‘ ^im 菌株的16S rDNA基因，將基因產(chǎn)物同T載體連接，經(jīng)測序確認該片段實際長度為1434bp， 將該序列與GenBank中相關數(shù)據(jù)進行相似性分析發(fā)現(xiàn)，該菌與紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)的同源性最高。根據(jù)以上微生物學特征鑒定，該新菌株ZJB-09149屬于紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)，該株微生物不屬于現(xiàn)己公開菌種的任何一種，該株微生物具有生物催化2-氯-3-氰基吡啶生產(chǎn)2-氯煙酸的能力，可以用于2-氯煙酸的生產(chǎn)。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(1)本發(fā)明從微生物群中篩選得到可生物催化 生產(chǎn) 2-氯煙酸的紅平紅球菌 ZJB-09149 (Rhodococcuserythropolis ZJB-09149) =CCTCC NO =M 209194。其在適合條件下，能有效生產(chǎn)2-氯煙酸；(2)本發(fā)明將紅平紅球菌菌株 ZJB-09149用于生物催化生產(chǎn)2-氯煙酸實驗，結果表明，該菌可有效生物催化生產(chǎn)2-氯煙 酸，12h內2-氯-3-氰基吡啶轉化率達到60 100% (見實施例3 5)，因此該菌在生物 催化生產(chǎn)2-氯煙酸的領域中具有廣泛的應用前景。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此實施例1 新菌株ZJB-09149的篩選
從將由全國各地農(nóng)藥廠附件采集的土樣和污水樣接種到富集培養(yǎng)基中；在30°C， 150rpm的搖床上富集培養(yǎng)72h后，再取Iml培養(yǎng)液接種到新鮮的富集培養(yǎng)基上培養(yǎng)72h。 如此重復3個循環(huán)。最后一次培養(yǎng)液稀釋后涂布到平板培養(yǎng)基上，挑取單菌落到斜面保藏。 挑取的單菌落接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，在25 30°C、初始pH6. 5 7. O條件下震蕩培養(yǎng)48 72h，離心分離，得到菌體含酶細胞；懸浮于磷酸緩沖體系中，通過加入2-氯-3-氰基吡啶進 行轉化實驗。將0. Ig濕菌體加入終濃度為1. 38g/l的2-氯-3-氰基吡啶的反應液中，反應 12h后，分別測定2-氯煙酸的含量，從中篩選出生產(chǎn)2-氯煙酸能力最強的菌株ZJB-09149， 作為進一步研究的出發(fā)菌株。所述富集培養(yǎng)基配方為(終濃度)葡萄糖5g/l，K2HPO4 · 3H20 0. 5g/l，KH2PO4 0. 5g/l，MgSO4 · 7H20 0. 5g/l，NaCl lg/1，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 02g/l，2_ 氯-3-氰基吡啶 0. 7g/ 1，ρΗ 7.0，溶劑為水。所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(終濃度)葡萄糖20g/l，蛋白胨5g/l，已內酰胺4g/l， Κ2ΗΡ04 · 3H20 0. 5g/l, KH2PO4 0. 5g/l, MgSO4 · 7H20 0. 5g/l, FeSO4 · 7H20 0. 02g/l, pH 7. 0， 溶劑為水。實施例2 新菌株ZJB-09149的鑒定對實施例1篩選得到的菌株ZJB-09149按《伯杰氏細菌鑒定手冊(第八版)》，以 及《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》進行生理生化特性鑒定。該菌株菌落呈圓形，邊緣整齊，中間略突起，易挑取，菌落呈粉紅色，于30。C恒溫培 養(yǎng)24h，單菌落直徑約2 3mm。在上述基礎上，進一步將菌株ZJB-09149按精編分子生物學 實驗指南方法提取染色體DNA，以提取到的細胞總DNA為模板，利用引物pl6S-8 5' -aga gtt tga tcc tgg ctc ag-3‘禾口 pl6S_1541 :5‘ -aag gag gtg ate cag ccg ca~3‘擴 增菌株的16S rDNA基因，將基因產(chǎn)物同T載體連接后，委托上海皓嘉科技發(fā)展有限公司 對該菌16SrDNA擴增及測序，得到該菌株的16S rDNA序列后，在NCBI網(wǎng)站上用BLAST檢 索GenBank中相關菌株的16S rDNA基因序列，并進行同源性比對；基于形態(tài)、生理生化特 征和16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育學分析等方面的鑒定，將菌株ZJB-09149鑒定為紅平紅球 菌,擬命名為紅平紅球菌ZJB-09149 (Rhodococcus erythropolis ZJB-09149)，此菌株已于 2009年9月4日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO =M 209194。菌株ZJB-09149, CCTCC NO :M 209194 的 16S rDNA 序列如下TTGTTACGACTTCGTCCCAATCGCCGATCCCACCTTCGACGGCTCCCTCCCACAAGGGGTTAAGCCACCGGCTTCGGGTGTTACCGACTTTCATGACGTG ACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCGTTGCTGATCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCACGGGGTCGAGTTGCAGACCCCGATCCGAACTGAGACCAGCTTTAAGGGATTCGCTCCACCTCACGGTCTCGC
AGCCCTCTGTACTGGCCATTGTAGCATGTGTGAAGCCCTGGACATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCAGTCTCTTACGAGTCCCCACCATAACGTGCTGGCAACATAAGATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGTATACCGACCACAAGGGGGGCCACATCTCTGCAGCTTTCCGGTATATGTCAAACCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCACATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGCGCTTAATGCGTTAGCTACGGCACGGATTCCGTGGAAGGAACCCACACCTAGCGCCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCACGCTTTCGTTCCTC
AGCGTCAGTTACTGCCCAGAGACCCGCCTTCGCCACCGGTGTTCCTCCTGATATCTGCGCATTTCACCGCTACACCAGGAATTCCAGTCTCCCCTGCAGTACTCAAGTCTGCCCGTATCGCCTGCAAGCCAGCAGTTGAGCTGCTGGTTTTCACAAACGACGCGACAAACCGCCTACGAACTCTTTACGCCCAGTAATTCCGGACAACGCTTGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCAGGTACCGTCACTTGCGCTTCGTCCCTGCTGAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTTCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGTCACCCTCTCAGGTCGGCTACCCGTCGTCGCCTTGGTAGGCCATTACCCCACCAACAAGCTGATAGGCCGCGGGCCCATCCTGCACCGATAAATCTTTCCACCACCCACCATGCGATAGGAGGTCATATCCGGTATTAGACCCAGTTTCCCAGGCTTATCCCGAAGTGCAGGGCAGATCACCCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCGCTCGTGTACCCCGAAAGGCCTTACCGCTCGACTTGCATGTGTAAGCA實施例3 利用菌株ZJB-09149生物催化生產(chǎn)2_氯煙酸按以下步驟進行(1)斜面培養(yǎng)基的配制葡萄糖10g/l，酵母膏3g/l，NaCl lg/1，K2HPO4 · 3H20 0. 2g/l，MgSO4 · 7H20 0. 2g/l，瓊脂 20g/l，pH 7. O，溶劑為水；(2)菌種的活化培養(yǎng)采用步驟(1)斜面培養(yǎng)基，將新菌株ZJB-09149，在30°C活 化、培養(yǎng)24h后，備用；(3)種子液的制備將步驟(2)活化后的菌種1環(huán)接入種子培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)條件 30 0C，200r/min 下培養(yǎng) 20h。(4)菌種的發(fā)酵培養(yǎng)將步驟(3)菌種液按10%體積比接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)條件30°C，200r/min下培養(yǎng)72h，進行離心分離，得到菌體；發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(終濃度)麥芽糖 5. Og/Ι，酵母粉 7. Og/Ι,己內酰胺 8. Og/Ι，MgSO4 ·7Η20 0. 5g/l，K2HPO4 · 3Η20 0. 5g/l, KH2PO4O. 5g/l, FeSO4 · 7H20 0. 02g/l，溶劑為水，pH 值 6· 5 7· 0。(5)生物催化2-氯-3-氰基吡啶生產(chǎn)2-氯煙酸將步驟(4)得到的濕菌體0. Ig 加入到IOml含有0.0138g 2-氯-3-氰基吡啶的磷酸鹽緩沖液(pH7. 0)反應體系中，30°C， 150r/min 反應 12h ；(6)轉化液中2-氯煙酸含量的測定取Iml轉化液，離心，上清液進行液相色譜分 析日本島津液相色譜儀，不銹鋼填充柱，填料為C18，長0. 25m,內徑4. 6mm，流速lml/min，柱 溫室溫，流動相為乙腈0. 磷酸水溶液(25V 75V)進樣量為10 μ 1其中，2-氯煙酸出 峰時間為4. 2min，確定樣品中2-氯煙酸的含量為0. 95g/l，摩爾轉化率為60%。實施例4 利用菌株ZJB-09149生物催化生產(chǎn)2_氯煙酸(1)斜面培養(yǎng)基的配制葡萄糖10g/l，酵母膏3g/l，NaCl lg/1，K2HPO4 · 3H20 0. 2g/l，MgSO4 · 7H20 0. 2g/l，瓊脂 20g/l，pH 7. 0，溶劑為水；(2)菌種的活化培養(yǎng)采用步驟(1)斜面培養(yǎng)基，將新菌株ZJB-09149，在30°C活 化、培養(yǎng)24h后，備用；(3)種子液的制備將步驟(2)活化后的菌種1環(huán)接入種子培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)條件 30 0C，200r/min 下培養(yǎng) 20h。(4)菌種的發(fā)酵培養(yǎng)將步驟(3)菌種液按10%體積比接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中， 在培養(yǎng)條件30°C，在200r/min下培養(yǎng)72h，進行離心分離，得到菌體；發(fā)酵培養(yǎng)基配方為 麥芽糖 5. Og/Ι，酵母粉 7. Og/Ι，己內酰胺 8. Og/1，MgSO4 · 7H20 0. 5g/l，K2HPO4 · 3H20 0. 5g/ 1，KH2PO4 0. 5g/l，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 02g/l，溶劑為水，pH 值 6. 5 7. 0。(5)生物催化2-氯-3-氰基吡啶生產(chǎn)2-氯煙酸生物催化2_氯_3_氰基吡啶生 產(chǎn)2-氯煙酸將步驟(4)得到的濕菌體0. 2g加入到IOml含有0. 0138g 2-氯-3-氰基吡 啶的磷酸鹽緩沖液(PH7. 0)反應體系中，30°C，150r/min反應12h ；(6)轉化液中2-氯煙酸含量的測定同實施例3。確定樣品中2-氯煙酸的含量為 1.6g/l，轉化率為99%。實施例5 利用菌株ZJB-09149生物催化生產(chǎn)2_氯煙酸(1)斜面培養(yǎng)基的配制葡萄糖10g/l，酵母膏3g/l，NaCl lg/1, K2HPO4 · 3H20 0. 2g/l，MgSO4 · 7H20 0. 2g/l，瓊脂 20g/l，pH 7. 0，溶劑為水；(2)菌種的活化培養(yǎng)采用步驟(1)斜面培養(yǎng)基，將新菌株ZJB-09149，在30°C活 化、培養(yǎng)24h后，備用；(3)種子液的制備將步驟(2)活化后的菌種1環(huán)接入種子培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)條件 30 0C，200r/min 下培養(yǎng) 20h。(4)菌種的發(fā)酵培養(yǎng)將步驟(3)菌種液按10%體積比接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中， 在培養(yǎng)條件30°C，200r/min下培養(yǎng)72h，進行離心分離，得到菌體；發(fā)酵培養(yǎng)基配方為麥 芽糖 5. Og/Ι，酵母粉 7. Og/Ι,己內酰胺 8. Og/Ι，MgSO4 · 7H20 0. 5g/l，K2HPO4 · 3H20 0. 5g/l， KH2PO4 0. 5g/l, FeSO4 · 7H20 0. 02g/l，溶劑為水，pH 值 6· 5 7· 0。(5)生物催化2-氯-3-氰基吡啶生產(chǎn)2-氯煙酸生物催化2_氯_3_氰基吡啶生 產(chǎn)2-氯煙酸將步驟(4)得到的濕菌體0. Ig加入到IOml含有0. 0138g 2-氯-3-氰基吡啶的磷酸鹽(pH7. 0)反應體系中，35°C，150r/min反應12h ；(6)轉化液中2-氯煙酸含量的測定同實施例3。確定樣品中2-氯煙酸的含量為1.3g/l，轉化率為84% οSEQUENCE LISTING〈110〉浙江工業(yè)大學〈120〉一種生物催化2-氯-3-氰基吡啶生產(chǎn)2_氯煙酸的方法及菌株〈130〉<160>1<170>PatentIn version 3.4<210>1<211>1434<212>DNA<213>Rhodococcus erythropolis<400>1ttgttacgac ttcgtcccaa tcgccgatcc caccttcgac ggctccctcc cacaaggggt 60taagccaccg gcttcgggtg ttaccgactt tcatgacgtg acgggcggtg tgtacaaggc 120ccgggaacgt attcaccgca gcgttgctga tctgcgatta ctagcgactc cgacttcacg 180gggtcgagtt gcagaccccg atccgaactg agaccagctt taagggattc gctccacctc 240acggtctcgc agccctctgt actggccatt gtagcatgtg tgaagccctg gacataaggg 300gcatgatgac ttgacgtcgt ccccaccttc ctccgagttg accccggcag tctcttacga 360gtccccacca taacgtgctg gcaacataag ataggggttg cgctcgttgc gggacttaac 420ccaacatctc acgacacgag ctgacgacag ccatgcacca cctgtatacc gaccacaagg 480ggggccacat ctctgcagct ttccggtata tgtcaaaccc aggtaaggtt cttcgcgttg 540catcgaatta atccacatgc tccgccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc ctttgagttt 600tagccttgcg gccgtactcc ccaggcgggg cgcttaatgc gttagctacg gcacggattc 660cgtggaagga acccacacct agcgcccacc gtttacggcg tggactacca gggtatctaa 720tcctgttcgc tacccacgct ttcgttcctc agcgtcagtt actgcccaga gacccgcctt 780cgccaccggt gttcctcctg atatctgcgc atttcaccgc tacaccagga attccagtct 840cccctgcagt actcaagtct gcccgtatcg cctgcaagcc agcagttgag ctgctggttt 900tcacaaacga cgcgacaaac cgcctacgaa ctctttacgc ccagtaattc cggacaacgc 960ttgcacccta cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta gccggtgctt cttctgcagg 1020taccgtcact tgcgcttcgt ccctgctgaa agaggtttac aacccgaagg ccgtcatccc 1080tcacgcggcg tcgctgcatc aggctttcgc ccattgtgca atattcccca ctgctgcctc 1140ccgtaggagt ctgggccgtg tctcagtccc agtgtggccg gtcaccctct caggtcggct 1200acccgtcgtc gccttggtag gccattaccc caccaacaag ctgataggcc gcgggcccat 1260cctgcaccga taaatctttc caccacccac catgcgatag gaggtcatat ccggtattag 1320acccagtttc ccaggcttat cccgaagtgc agggcagatc acccacgtgt tactcacccg 1380ttcgccgctc gtgtaccccg aaaggcctta ccgctcgact tgcatgtgta agca143權利要求
一種生物催化2-氯-3-氰基吡啶生產(chǎn)2-氯煙酸的方法，所述方法包括在以2-氯-3-氰基吡啶為底物、以紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的腈轉化酶為催化劑、以水或磷酸鹽緩沖液為溶劑的反應體系中，于pH7～9、25～60℃下進行催化水解反應，制得所述2-氯煙酸。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述腈轉化酶來自紅平紅球菌CCTCCNO :M 209194經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的含酶細胞，所述反應體系中含酶細胞濃度以含酶細胞濕重計為 10 20g/l。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述反應體系中，底物2-氯-3-氰基吡啶初 始濃度為1.0 5. Og/1。
4.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述含酶細胞由如下方法制備得到將紅平 紅球菌接種至適用于紅平紅球菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度25 30°C、起始pH 6. 5 7. 0、 搖床轉速100 300rpm的條件下震蕩培養(yǎng)48 72h，離心分離，得到所述含酶細胞。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于所述適用于紅平紅球菌的發(fā)酵培養(yǎng)基終濃 度組成如下麥芽糖5.0 15. 0g/l，酵母粉7.0 18. 0g/l，己內酰胺4.0 8. 0g/l, MgS04 7H20 0. 1 0. 5g/l，K2HP04 3H20 0. 1 0. 5g/l,KH2P04 0. 1 0. 5g/l，F(xiàn)eS04 7H20 0. 01 0. 02g/l，溶劑為水，pH 值 6. 5 7. 0。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下(1)紅平紅球菌CCTCCNO :M 209194接種至種子培養(yǎng)基，25 30°C培養(yǎng)16 20h， 得到種子液；所述種子培養(yǎng)基終濃度組成如下葡萄糖10. 0 20. 0g/l，蛋白胨5. 0 10. 0g/l,己內酰胺 4. 0 8. 0g/l, MgS04 7H20 0. 2 0. 5g/l, K2HP04 3H20 0. 2 0. 5g/ 1，KH2P040. 2 0. 5g/l, FeS04 7H20 0. 01 0. 02g/l，溶劑為水，pH 值 6. 5 7. 0。(2)步驟(1)種子液以3 10%體積比接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，在25 30°C、初始pH6.5 7. 0條件下震蕩培養(yǎng)48 72h，離心分離，得到菌體含酶細胞；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成 如下麥芽糖5. 0 15. 0g/l，酵母粉7. 0 18. 0g/l，己內酰胺4. 0 8. 0g/l，MgS04 '7H200.1 0. 5g/l，K2HP04.3H20 0. 1 0. 5g/l，KH2P04 0. 1 0. 5g/l，F(xiàn)eS04 7H200. 01 0. 02g/ 1，溶劑為水，pH值6. 5 7.0。(3)將步驟(2)菌體含酶細胞添加至含有2-氯-3-氰基吡啶的反應體系中，所述反應 體系中菌體含酶細胞以含酶細胞濕重計濃度為10 20g/l，2-氯-3-氰基吡啶初始濃度為1.0 5. 0g/l，于pH7. 0 9. 0,25 60°C下進行催化水解反應10 12h，制得所述2-氯 煙酸。
7.紅平紅球菌(Rhodococcuserythropolis)ZJB-09149，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏 中心，地址中國武漢武漢大學，430072，保藏日期2009年9月4日，保藏編號CCTCC NO M 209194。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種生物催化2-氯-3-氰基吡啶生產(chǎn)2-氯煙酸的方法及其菌株，所述方法包括在以2-氯-3-氰基吡啶為底物、以紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis)經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的腈轉化酶為催化劑、以水或磷酸鹽緩沖液為溶劑的反應體系中，于pH7.0～9.0、25～60℃下進行催化水解反應，制得所述2-氯煙酸。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(1)本發(fā)明從微生物群中篩選得到可生物催化生產(chǎn)2-氯煙酸的紅平紅球菌CCTCC NOM 209194，其在適合條件下，能有效生產(chǎn)2-氯煙酸；(2)本發(fā)明將紅平紅球菌菌株ZJB-09149用于生物催化生產(chǎn)2-氯煙酸實驗，結果表明，該菌可有效生物催化生產(chǎn)2-氯煙酸，12h內2-氯-3-氰基吡啶轉化率達到60～100％，因此該菌在生物催化生產(chǎn)2-氯煙酸的領域中具有廣泛的應用前景。
文檔編號C12N1/20GK101857889SQ20091015489
公開日2010年10月13日 申請日期2009年11月26日 優(yōu)先權日2009年11月26日
發(fā)明者李亞飛, 沈寅初, 鄭裕國, 金利群 申請人:浙江工業(yè)大學