專利名稱：具有改變的特性的變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及親代Termamyl樣oc-淀粉酶的變體(突變體)，這些變體具有 oc淀粉酶的活性，并且在如下幾方面的性質(zhì)中，顯示出至少一種與所述親 代a淀粉酶有所不同底物特異性，底物結(jié)合性，底物裂解模式，熱穩(wěn)定 性，pH/活性特征曲線，pH/穩(wěn)定性特征曲線，針對氧化的穩(wěn)定性，Ca^依賴 性，比活性，和溶解度，特別是在生產(chǎn)與應(yīng)用環(huán)境下。
背景技術(shù)：
cc淀粉酶(ot-l，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，E.C. 3.2丄1)組成一組催化淀 粉和其它直鏈和支鏈1 ，4-糖苷鍵寡糖和多糖水解的酶。
在現(xiàn)代工業(yè)生物技術(shù)中，在發(fā)酵、純化、回收過程的中和產(chǎn)物配制中可 出現(xiàn)高蛋白濃度。
在發(fā)酵過程中，蛋白的濃度取決于所用的宿主細(xì)胞。在工業(yè)生產(chǎn)過程中， 蛋白濃度一般為0.1克/升發(fā)酵液以上。而在芽孢桿菌中大量重組生產(chǎn)oc-淀粉 酶時，蛋白濃度可高達(dá)250克/升發(fā)酵液。經(jīng)過純化，蛋白濃度可以達(dá)到大 約1000克/升水平。這樣的高濃度導(dǎo)致不希望有的沉淀，而使得活性蛋白丟 失。增加產(chǎn)物的強(qiáng)度是目前的趨勢，這種增加的強(qiáng)度可使酶在更重要的溶 液中得以維持。蛋白溶液濃度的升高通常導(dǎo)致蛋白的沉淀，而沉淀的蛋白 很難溶解成活性蛋白。
所以，本發(fā)明的目標(biāo)是提供具有以下改變的特性的a-淀粉酶，特別是 使其溶解度增加。
發(fā)明簡述本發(fā)明的目的是提供Termamyl樣淀粉酶的變體，它們與相應(yīng)親代oc-淀 粉酶即未突變的oc淀粉酶相比，具有oc-淀粉酶活性，并且相對于親代oc-淀 粉酶，顯示如下性質(zhì)中至少一種性質(zhì)的改變底物特異性，底物結(jié)合性，底 物裂解模式，熱穩(wěn)定性，pH/活性特征曲線，pH/穩(wěn)定性特征曲線，針對氧化 的穩(wěn)定性，Ca"依賴性，比活性和溶解度，特別是在制備條件下的溶解度。
命名法
在本說明書和權(quán)利要求中，用到了常用的I個字母和3個字母的氨基 酸代碼。為便于參考，本發(fā)明中的ct-淀粉酶變體用下面的命名法來描述 原氨基酸位置取代的氨基酸
依照這種命名法，舉例來說，將第30位的丙氨酸取代為天冬酰胺，表 示為Ala30Asn或A3 ON
在相同位置缺失丙氨酸表示為 Ala3(^或A30*
插入另外一個氨基酸殘基，如賴氨酸，表示為 Ala30AlaLys或A30AK
—段連續(xù)的氨基酸殘基的缺失，例如，第30-33位的氨基酸殘基被缺失， 表示為(30-33^或A(A30-N33)。
當(dāng)某一cc-淀粉酶與其他oc-淀粉酶相比有一個"缺失"，并在該位置上 又插入了一個氨基酸則表示為
*36Asp或*360
即，在第36位插入了天冬氨酸。 多突變被"+"號分隔開，如 Ala30Asp + Glu34Ser或A30N+E34S
代表第30位的丙氨酸和第34位的谷氨酸分別被天冬酰胺和絲氨酸取代。
當(dāng)一個或多個可選擇的氨基酸殘基插入同一給定位點(diǎn)時，表示為 A30N,E或 A30N或A30E
另外，當(dāng)本文中鑒定出 一個適于修飾的位點(diǎn)而沒有提示任何特定的修飾 時，應(yīng)理解為任何一個氨基酸殘基都可以取代這個位點(diǎn)上現(xiàn)有的氨基酸。例如，當(dāng)提到在位點(diǎn)30的丙氨酸的修飾，而又沒有特別指明進(jìn)行何種修飾時， 應(yīng)理解為該丙氨酸可以被缺失或被下列任何一個氨基酸所取代
R，N,D,A，C,Q,E，GH，I，L,K，M，F(xiàn)，P，S，T,W,Y，V。
進(jìn)一步的，"A30X"代表下列任何一種取代
A30R, A30N, A30D， A30C， A30Q， A30E， A30G A30H, A30I, A30L, A30K, A30M, A30F, A30P, A30S， A30T, A30W, A30Y,或A30V;或簡寫為 A30R，N,D,C,Q,E朋,I，L,K，M,F，P,S,T，W，Y,V。


圖1是五種親代Termamyl樣oc-淀粉酶氨基酸序列的比對。最左邊的數(shù) 字分別代表如下的氨基酸序列 l:SEQIDNO:4(SP722) 2: SEQ ID NO: 2 (SP690) 3: SEQIDNO: 10 (BAN) 4: SEQ ID NO: 8 (BLA) 5: SEQ IDNO: 6(BSG)。
圖2顯示由4個酶分子組成的晶格的格點(diǎn)視圖。每個分子都有8個相 互作用的區(qū)域。
圖3顯示由4個酶分子組成的晶格的頂視圖。
發(fā)明詳述
本發(fā)明的目的是提供多肽(如酶，特別是ot-淀粉酶)，這些多肽相對于 所述親代多肽在如下性質(zhì)中有至少一種性質(zhì)改變底物特異性，底物結(jié)合 性，底物裂解模式，熱穩(wěn)定性，pH/活性特征曲線，pH/穩(wěn)定性特征曲線， 針對氧化的穩(wěn)定性，Ca^依賴性，比活性和溶解度，特別是在制備條件下的 溶解度。以下有對這些性質(zhì)的進(jìn)一步描述。
多肽
本發(fā)明的多肽包括具有生物活性，抗微生物活性，和酶活性的蛋白質(zhì)。 涉及的酶活性包括蛋白酶，淀粉酶，CGT酶(CGTase)，甘露聚糖酶 (m隱anase)，產(chǎn)麥芽糖淀粉酶(maltogenic amylase), 葡萄糖淀粉酶，糖酶 (carbohydrase)，轉(zhuǎn)移酶，裂解酶，氧化還原酶，脂肪酶的活性。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，所述酶是一種CX-淀粉酶，特別是芽孢桿菌屬
或曲霉屬(X-淀粉酶。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，芽孢桿菌屬oc-淀粉酶是 Termamyl樣淀粉酶。
具有生物活性的多肽包括紅細(xì)胞生成素(EPO)， TPO,生長激素，調(diào)節(jié) 肽，凝血因子，抗體等。
改變了溶解度的多肽
蛋白(多肽)晶體是由系統(tǒng)排列的相同單位在三維結(jié)構(gòu)上緊密堆積而成。 晶格可以包含一個或多個蛋白分子和大量的水。在三級結(jié)構(gòu)中也發(fā)現(xiàn)有離 子例如鈣離子，鈉離子，氯離子，疏酸根離子和較大的分子如表面活性劑 和底物(在晶體生長過程中出現(xiàn))。雖然單個分子和單個原子很小，但相同單 位的重復(fù)排列有利于進(jìn)行X-線衍射，從而為蛋白質(zhì)工程提供結(jié)構(gòu)信息。
相對于晶體來說，沉淀物與聚集體是較小的單位，并且單個分子比在 晶體中時更加無序。然而分子間的某些作用與在非常有序的晶體中所見相 同，并因此可用三級結(jié)構(gòu)(三維結(jié)構(gòu))和分子間信息來設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)工程改造 的、具有改變的特性的oc-淀粉酶變體，所述特性特別是沉淀趨勢下降，即 溶解度增加。
由于蛋白分子為球形和通常有不規(guī)則的表面結(jié)構(gòu)，晶格中會出現(xiàn)大孔， 這些大孔被更加雜亂的溶劑如水占據(jù)。實(shí)際上，大多數(shù)蛋白質(zhì)表面都覆蓋 著水層，這就是為什么通過X光晶體學(xué)方法得到的蛋白結(jié)構(gòu)與溶液中的蛋 白結(jié)構(gòu)相同的一個原因。蛋白分子只在極少區(qū)域直接相互接觸，但溶劑介 導(dǎo)的接觸可以象"膠水，， 一樣把晶體粘在一起。
通常，蛋白的溶解度受有機(jī)溶劑，鹽類如硫酸銨、氯化鈉和氯化鈣， 和改變分子表面電荷的pH變化的影響。這些因素在將酶維持于溶液中的酶 生產(chǎn)以及得到有效晶體的結(jié)晶學(xué)實(shí)驗(yàn)中都有涉及。大的對稱晶體需要緩慢 增加蛋白質(zhì)濃度或者改變蛋白表面來加強(qiáng)分子間相互接觸而得到。
不是所有的蛋白都結(jié)晶為有效于X光晶體學(xué)確定方法的形式，但是， 如果模板分子與目的分子的同源性足夠高，那么根據(jù)已有的三級結(jié)構(gòu)，可 以建立精確的模型。
當(dāng)同源多肽(如酶，特別是以下定義的Termamyl樣oc -淀粉酶)在三級結(jié) 構(gòu)基礎(chǔ)上相比較時，最主要差異在于分子表面。盡管如此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，Termamyl樣oc-淀粉酶(SP722，公開于SEQ ID NO: 4)表面的(直接或通過水分子間接)參與晶體形成的氨基酸殘基，在其 它Termamyl樣a淀粉酶的晶體形成中(以下描述)也起了關(guān)鍵作用。
以下描述了用另 一種Termamyl樣oc淀粉酶結(jié)構(gòu)(SP722結(jié)構(gòu)，附錄1中 公開)建立一個Termamyl樣cx淀粉酶的三級結(jié)構(gòu)模型的實(shí)例。
可以理解，本發(fā)明的概念與以下描述的建模方法可以推廣到所有的多肽， 蛋白，特別是酶，如ot淀粉酶。
SP722的三級結(jié)構(gòu)以及對另 一種Termamvl樣a淀粉酶三級結(jié)構(gòu)的建模
本發(fā)明的oc淀粉酶突變體是基于附錄1中SP722(SEQ ID NO: 4)的三級 結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)的，其它多肽的突變體通過其它的三級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)。堿性Termamyl 樣cx-淀粉酶的結(jié)晶(8 722)(如SEQ ID NO: 4中顯示，也在美國專利 5,824,531中有描述)是用懸滴法(本領(lǐng)域已知的方法)得到的，其三級結(jié)構(gòu)(三 維結(jié)構(gòu))見本文附錄1。
其晶格包含4個酶分子，每個分子有8個相互作用的區(qū)域(圖2和圖3)。 其中兩個區(qū)域被確定在酶的圍繞活性位點(diǎn)的一側(cè)，在a -淀粉酶上相對于活性 位點(diǎn)的背側(cè)發(fā)現(xiàn)了一個大的區(qū)域。所述側(cè)還有兩個相互作用的區(qū)域，分子的 頂部和底部各有一個相互作用的側(cè)面，形成"頂"對"底"的相互作用。
可以從圖2看出兩個環(huán)繞活性位點(diǎn)的相互作用區(qū)域與一個反向平行的 相鄰分子上的兩個相同區(qū)域之間相互作用。同樣，背側(cè)區(qū)域與第三個反向 平行的淀粉酶分子上的背側(cè)區(qū)域相接觸，但所有這些接觸都是由水分子介 導(dǎo)。還可以從圖2、圖3看出相互作用的區(qū)域分散在整個分子。
另 一堿性Termamyl樣ct -淀粉酶模型AA560是基于附錄1公開的SP722 的三級結(jié)構(gòu)建立的。ot-淀粉酶AA560與模板淀粉酶(SP722)大約有87%相 同，且序列對比排列不含有插入或缺失。在蛋白的生產(chǎn)過程中，即從發(fā)酵 到純化的過程中，由于存在高度的同源性(同一性)，相同的對稱性和相同的 晶體間相互作用，蛋白表面相同的相互作用區(qū)域參與蛋白濃度增加情況下 的晶體形成和沉淀(參見背景章節(jié))。
在這些相互作用區(qū)域中構(gòu)建突變，表達(dá)并純化酶，用"材料與方法" 章節(jié)中描述的方法，在實(shí)施例8和實(shí)施例9描述的不同條件下，對蛋白溶 解度進(jìn)行檢測。本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)可以應(yīng)用于如下Termamyl樣cc -淀粉酶與SEQ ID NO: 12所示的Termamyl樣ot-淀粉酶至少60%相同，優(yōu)選至少70%相同，更優(yōu) 選80%相同，甚至更優(yōu)選85%相同，甚至更優(yōu)選90%相同，甚至95%相同， 甚至97%相同，甚至99%相同。這些發(fā)現(xiàn)優(yōu)選適用于堿性Termamyl樣cc -淀 粉酶，特別是那些與SP722(SEQIDNO:4，在圖1的序列對比中顯示為1號 的序列)比較時，在對比的一級結(jié)構(gòu)中沒有添加或缺失氨基酸的，長度相同 的堿性Termamyl樣oc-淀粉酶。這些發(fā)現(xiàn)尤其可以用于以下堿性Termamyl 樣cc響淀粉酶SP690(SEQ ID NO: 2)， SP722(SEQ ID NO: 4), AA560(SEQ ID NO: 12), #707 ot-淀粉酶(SEQ ID NO: 13)，公開在KSM AP1378中的KSM APE 1738 oc-淀粉酶，WO 97/11324中公開的cc-淀粉酶，或者它們的片段 或截短形式。后面提到的這些堿性Termamyl樣oc淀粉酶在上述相互作用的 區(qū)域周圍有非常類似的晶體三級結(jié)構(gòu)，而且有485個氨基酸長的相同的一 級結(jié)構(gòu)。
與此不同的是，例如，Termamyl(圖1的對比中序列號為4的序列)與 SP722對比排列時，缺少兩個氨基酸殘基(l位和2位)；在174位和181-182 位有缺口；在378-381位多了 3個氨基酸殘基。
BAN(圖1的對比中序列號為3的序列)與SP722對比缺少5個氨基酸殘 基(1_4位和488位)；在174位、181-182位有缺口；在378-381位多了 3個 氨基酸殘基。
BSG(圖1的對比中序列號為5的序列)與SP722對比缺少1個氨基酸殘 基(l位)；在489-519位多了 31個氨基酸殘基。
KSM-K36和KSM-K38(EP 1,022,334-A)與SP722對比缺少5個氨基酸 殘基(1位和2位)，并在174位、181-182位有缺口。
AA180, AA20和Amrk385(丹麥專利申請PA 2000 00347或 PCT/DK01/00133)與SP722對比在261位多了 一個氨基酸。
以下描述如何根據(jù)一種Termamyl樣a -淀粉酶建立另 一種Termamyl樣 ct-淀粉酶的模型。在實(shí)施例4中描述了根據(jù)SP722建立AA560的模型。這 種方法可以推廣用于其它的多肽如以上所提到的多肽。
Termamyl樣a -淀粉酶才莫型的建立
WO 96/23874提供了 Termamyl樣oc -淀粉酶的三級結(jié)構(gòu)(三維結(jié)構(gòu))和X 光晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，所述Termamyl樣oc-淀粉酶由解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶衣芽孢桿菌ot-淀粉酶(SEQ ID NO: 8)C末端301-483位氨基酸殘基組成。WO 96/23874進(jìn)一步描述了 ，在分析親 代Termamyl樣a -淀粉酶的結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，建立該親代Termamyl樣oc -淀粉 酶的相對于其親代特性已改變的變體的模型的方法。
依照WO 96/23874可以建立其它Termamyl樣結(jié)構(gòu)模型，該文獻(xiàn)納入本 文作為參考。
至于獲得本發(fā)明的變體，如實(shí)施例l所述，基于SP722的三級結(jié)構(gòu)(附 錄l中公開)設(shè)計(jì)了 AA560的三級結(jié)構(gòu)(建模)。其它Termamyl樣oc-淀粉酶(例 如本文^Hf的)的結(jié)構(gòu)可以用類似的方法建立。
Termamyl樣oc淀粉酶
芽孢桿菌菌抹產(chǎn)生的多種oc淀粉酶在氨基酸水平上是高度同源(相同) 的。多種芽孢桿菌a-淀粉酶的同一性可從以下表1中觀察到 表1
百分比 同一性
707AP1378BANBSGSP690SP722AA560Terma
707100.086.466.966.587.686.295.568.1
AP137886.4跳O67.168.195.186.686.069.4
BAN66.967.1100.065.667.168.866.980.7
BSG66.568.165.6100.067.967.166.365.4
SP69087.695.167.167.9100.087.287.069.2
SP72286.286.668.867.187.2100.086.870,8
AA56095.586.066.966.387.086.8跳O68.3
Termamyl68.169.480.765.469.270.868.3100.0
例如，地衣芽孢桿菌oc淀粉酶包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列(可 以TermamylTM商品名購買到)，已發(fā)現(xiàn)其與包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序 列的解淀粉芽孢桿菌oc -淀粉酶有約81%的同源性，與包含SEQ ID NO:6所 示氨基酸序列的嗜熱脂肪芽孢桿菌的oc-淀粉酶有約65%的同源性。其它同 源的ot淀粉酶包括WO 95/26397中公開的SP690和SP722,本文中SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4分別對它們進(jìn)行了的描述。其它淀粉酶有來源于芽孢 桿菌的AA560 cc -淀粉酶(SEQ ID NO:12)和來源于芽孢桿菌的存707 cx -淀粉酶(顯示在SEQ ID NO: 13), Tsukamoto et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 151(1988), pp. 25-31對此有描述。
KSM AP1378 ct -淀粉酶公開于WO 97/00324(來自KAO公司)。另外， EP 1,022,334中公開了 K38和K38oc-淀粉酶，對此本發(fā)明也有涉及。
其他同源的oc-淀粉酶包括由EP 0252666描述的地衣芽孢桿菌菌才朱 (ATCC 27811)產(chǎn)生的ot-淀粉酶，以及WO 91/00353和WO 94/18314中所確 定的oc -淀粉酶。其它商品化的Termamyl樣a -淀粉酶包括用以下商品名稱 出售的產(chǎn)品Optitherm 和TakathermTM(Solvay出品)；MaxamylTM(Gist-brocades/Genencor出品),Spezym AA 和Spezyme AAA (Genencor出品)， 還有KeistaseTM(Daiwa出品)，Purastar ST 5000E, PURASTRA HPAM L(Genencor Int.出品)。
由于這些oc淀粉酶的結(jié)構(gòu)同源性，所以它們#1認(rèn)為屬于同 一類a -淀4分 酶，即"Termamyl才羊a-淀4分酶"。
因此，本文術(shù)語"Termamyl樣a-淀粉酶"意指那些在氨基酸水平上與 Termamyl ,即具有本文SEQ ID NO: 8所示氨基酸序列的地衣芽孢桿菌ot -淀粉酶基本相同的a -淀粉酶。
換言之，以下所有具有本文SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8， 10， 12,和13所示氨基 酸序列的a -淀粉酶，被認(rèn)為是"Termamyl樣ot -淀粉酶"。其它Termamyl樣 oc-淀粉酶是如下oc-淀粉酶i)與上述SEQ ID NO: 2,4, 6， 8, 10， 12,和13所 示氨基酸序列中至少一種氨基酸序列有至少60%,如至少70%,例如至少 75%，或至少80%，至少85%,至少90%,至少95%,至少97°/。，至少99% 的同源性，和/或ii)由能與編碼上述oc-淀粉酶的DNA序列(本說明書中SEQ ID NO: 1,3， 5， 7,9,它們分別編碼本文SEQ ID NO: 2, 4, 6， 8， 10, 12所示氨基 酸序列)雜交的DNA序列編碼。
關(guān)于特性i)，同源性是兩個序列之間提示第一個序列從第二個序列衍生的 同一性程度。同源性可通過本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序如GCG軟件包提供的 GAP程序適當(dāng)確定(如上所述)。這時，Gap GCGv8可以用如下默認(rèn)參數(shù)缺 口產(chǎn)生罰分為5.0,缺口延伸罰分為0.3,默認(rèn)得分矩P車，對核酸序列和蛋白質(zhì) 序列分別為3.0和0.1 。 GAP用Needleman/Wunsch/Sellers方法進(jìn)4亍排列對比。
Termamyl(SEQ ID NO: 8)和另 一種Termamyl樣a -淀粉酶的結(jié)構(gòu)對比可 以用來確定其它Termamyl樣a-淀粉酶中等效的/相應(yīng)的位置。 一種獲得所述結(jié)構(gòu)對比的方法是應(yīng)用GCG軟件包的Pile Up程序，采用缺口罰分默認(rèn)值， 即缺口產(chǎn)生罰分用3.0,缺口延伸罰分用O.l。其它結(jié)構(gòu)對比方法包括疏水簇 分析(Gaboriaud et al.， (1987), FEBS LETTERS 224, pp. 149-155)和反向穿 梭(reverse threading)法(Huber, T;Tord， AE， PROTEIN SCIENCE Vol. 7， No. 1 pp. 142-149(1998)。 雜交
用于鑒定多肽，如具有以上ii)特性的Termamyl樣a -淀粉酶的寡核苷酸 探針，可以在所述a -淀粉酶的全部或部分核苷酸或氨基酸序列&出上適當(dāng)制備。
雜交檢測的適當(dāng)條件包括在5xSSC中預(yù)浸泡，于 40。C,在含有20%曱 酰胺，5xDenhardt溶液，50mM磷酸鈉，pH 6.8,和50mg變性的超聲波處理的 小牛胸腺DNA的溶液中預(yù)雜交1小時，然后于 40。C,在補(bǔ)充有100mMATP 的上述相同溶液中雜交18小時，再于40。C,用2xSSC， 0.2% SDS洗濾膜 三次，每次30分鐘(低嚴(yán)緊度)，優(yōu)選在50。C(中等嚴(yán)緊度)，更優(yōu)選在65。C(高 嚴(yán)緊度)，甚至更優(yōu)選在約75。C(極高嚴(yán)緊度)進(jìn)行洗滌。雜交方法的更多細(xì) 節(jié)描述于Sambrook等,Molecular—Cloning: A Laboratory Manual,第二版Cold Spring Harbor, 1989。
本文中，"衍生" 一詞不僅指所述菌抹產(chǎn)生或可誘導(dǎo)產(chǎn)生的oc-淀粉酶， 還指由分離自這種菌林的DNA序列編碼的ot -淀粉酶和在所述DNA序列轉(zhuǎn) 化的宿主生物中產(chǎn)生的oc-淀粉酶。該術(shù)語還指由合成的和/或cDNA來源的 DNA序列編碼的oc-淀粉酶，其有所述oc淀粉酶的可鑒別的特征。該術(shù)語也 指親代a-淀粉酶的天然產(chǎn)生的變體，即天然產(chǎn)生的a-淀粉酶經(jīng)一個或多個 (幾個)氨基酸殘基的修飾(插入，取代，缺失)后產(chǎn)生的變體。
親代Termamvl樣a -淀粉酶
根據(jù)本發(fā)明，如上所述的所有Termamyl樣ot-淀粉酶，都可以作為親代 (即，骨架(backbone))a-淀粉酶。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，親代oc-淀粉 酶衍生自地衣芽孢桿菌，例如，上述那些a -淀粉酶之一，如具有SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列的地衣芽孢桿菌a-淀粉酶。尤其優(yōu)選的親代a-淀粉酶是 SP722a-淀粉酶和AA560oc-淀粉酶。在一個實(shí)施方案中，親代a-淀粉酶有 一個或多個以下突變/取代A(R81-G182); A(D183-G184); A(D183-G184)+N195F; RR181Q+N445Q+K446N; A(D183-G184)+R181Q。親代雜合體Termamyl樣oc -淀粉酶
親代cc -淀粉酶(即骨架a -淀粉酶)也可以是雜合體a -淀粉酶，即包含來 自至少兩種oc-淀粉酶的部分氨基酸序列之組合的oc-淀粉酶。
親代雜合體a -淀粉酶可以是這樣一種oc -淀粉酶，在氨基酸序列同源性 (同一性)和/或DNA雜交(如以上所確定的)基礎(chǔ)上，能確定其屬于Termamyl 樣ot-淀粉酶家族。在此情況下，雜合體a-淀粉酶通常由以下部分組成 Termamyl樣a-淀粉酶的至少一部分和從微生物(細(xì)菌或真菌)和/或哺乳動物 來源的Termamyl樣oc -淀粉酶或非Termamyl樣a -淀粉酶中選定的一種或多 種其它的a -淀粉酶的部分。
所以，親代雜合體oc-淀粉酶可包含來源于至少兩種Termamyl樣ct-淀 粉酶，或來源于至少 一種Termamyl樣和至少 一種非Termamyl才羊細(xì)菌a -淀 粉酶，或來源于至少 一種Termamyl樣a-淀粉酶和至少 一種真菌cx -淀粉酶的 部分氨基酸序列的組合。作為部分氨基酸序列的來源的Termamyl樣a-淀粉 酶，可以是本文所涉及的那些具體Termamyl樣cc -淀粉酶中的任何一種。
例如，親代ot-淀粉酶可以包含來源于地衣芽孢桿菌菌抹a-淀粉酶的C 末端部分和來源于解淀粉芽孢桿菌菌抹或嗜熱脂肪芽孢桿菌菌抹a-淀粉酶 的N末端部分。例如，親代ot-淀粉酶可包含地衣芽孢桿菌cx-淀粉酶的C末 端部分至少430個氨基酸，并且可包含a)相當(dāng)于解淀粉芽孢杵菌具有SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列的a -淀粉酶N末端37個氨基酸殘基的氨基酸片段， 和相當(dāng)于地衣芽孢桿菌具有SEQ ID NO: 8所示氨基酸序列的a -淀粉酶C末 端445個氨基酸殘基的氨基酸片段，或與該Termamyl序列相同的雜合體 Termamyl樣cx -淀粉酶，即SEQ ID NO: 8所示地衣芽孢桿菌a -淀粉酶，但 其成熟蛋白的N末端35個氨基酸殘基，已被BAN(成熟蛋白)即SEQ ID NO: 10所示的解淀粉芽孢桿菌cx -淀粉酶N末端33個殘基取代；或b)相當(dāng)于 嗜熱脂肪芽胞桿菌具有SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列的a -淀粉酶N末端68 個氨基酸殘基的氨基酸片段和相當(dāng)于地衣芽孢桿菌具有SEQ ID NO: 8所示 氨基酸序列的a -淀粉酶C末端415個氨基酸殘基的氨基酸片段。
另一種適合的親代雜合體a-淀粉酶是此前WO 96/23874(出自Novo Nordisk)中描述的，其由BAN,解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶的N末端(成熟蛋 白的1-300位氨基酸)和Termamyl的C末端(成熟蛋白的301-483位氨基酸) 構(gòu)成。改變的特性 以下討i侖表現(xiàn)為本發(fā)曰/
親代Termamyl樣a -淀粉酶)之間的相互關(guān)系。
如上所述，本發(fā)明涉及特性改變的，特別是在生產(chǎn)條件下特性改變的 Termamyl樣a -淀粉酶。
涉及到改變的特性時，尤其涉及的親代Termamyl樣a-淀粉酶是上述提 到的親代Termamyl樣cx-淀粉酶和親代雜合體Termamyl樣oc-淀粉酶。以 SP722 oc-淀粉酶作為起點(diǎn)，但例如Termamyl, BSQ BAN, AA560, SP690, AA180,KSM，AP1378,和#707, K38,和K36的相應(yīng)位點(diǎn)也應(yīng)理解為已〃>開。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的變體的溶解度已經(jīng)增加，尤其是在洗滌或 清洗條件下。
本發(fā)明一方面涉及上述具有特性改變的變體。
第一方面，親代Termamyl樣oc-淀粉酶的變體在選自下組的一個或多個 位點(diǎn)(用SEQIDNO: 12的氨基酸編號)包含改變
R28, R118, N174; R181, G182, D183, G184, G186, W189, N195, M202, Y298， N299， K302， S303， N306, R310， N314; R320， H324, E345, Y396, R400， W439， R444, N445， K446, Q449, R458, N471， N484，
其中
(a) 所述每一改變是
(i)在占據(jù)該位點(diǎn)的氨基酸下游插入一個氨基酸，
Cii)缺失占據(jù)該位點(diǎn)的氨基酸，或
(iii)用另一氨基酸取代占據(jù)該位點(diǎn)的氨基酸，
(b) 變體有cx淀粉酶活性和
(c) 每一位點(diǎn)都對應(yīng)于具有SEQIDNO: 12所示AA560氨基酸序列的親 代Termamyl樣oc -淀粉酶的氨基酸序列位點(diǎn)。
在SP722(SEQ ID NO: 4)中，這種相應(yīng)位點(diǎn)是R28; N94; L118; N125; Q174; R181; G182; D183; G184; A186; W189; N195, M202, Y298; N299; N302; S303; N306; A310; N314; K320; H324; Q345; F396， T400, W439, Q444; N445, K446, Q449， K458; N471; K484。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的變體有一個或多個如下突變/取代(用SEQ ID NO: 12的編號)△G184; A(R181-G182); A(D183-G184); R28N,K; S94K; R118K; N125A，R，K; N174D; R181Q，E，K; G186R; W189R，K; N195F; M202L; Y298H,F; N299A; K302R; S303Q; N306QD,R，K; R31 OA，K,Q,E,H，D,N; N314D; R320K; H324K; E345R，D，K，N; Y396F; R400T，K; W439R; R444K; N445K,Q; K446N: Q449E; R458K; N471E; N484Q。
優(yōu)選的雙重，三重和多重突變(以SEQIDNO: 12為編號^5il0包括
A(D183-G184)+R181Q;
A(D183-G184)+G186R;
A(D183-G184)+磨5F;
A(D183-G184)+M202L;
△(D183-G184)+G186R+N195F;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+R400T;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+W439R;
△(D183-G 184)+Nl 95F+Q449E;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+N484Q;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+K446N;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+N445Q+K446N+N484E;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+N445Q+K446N+Q449E;
△(D183-Gl 84)+磨5F催71E;
△(D183畫G 184)+N 195F+H324K;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+Y396F;
△(D183-G 184)+N 195F+K446D;
A(D183-G184)+N195F+R181Q;
A(D183-G184)+N195F+R181E;
△(D183-G 184)+N 195F+N445Q+K446N;
N445Q+K446N;
N445Q+K446N+N484E;
N445Q+K446N+Q449E;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N;
A(D 183-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+K446N;
△(D183-G 184)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+N484E;△(D183-G184)+N 195F+R181E+N445Q+K446N;
A(D 183 -G184)+N 195F+R181E+K446N;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+R181E+N445Q+K446N+N484E;
A(D183-G184)+N195F+N445Q+K446N+Y243F;
A(D183-G184)+N195F+N445Q+K446N+V209I;
△(D183-G 184)+N 195F+E212R;
△(D183-G 184)+N 195F+M116R;
A(D183-G184)+N195F+K142H+D144H+R158H;
△(D183 -G184)+N 195F+K142H+D144H;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+R158H;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+E345R;
△(D183-G 184)+Nl 95F+W189R;
A(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+Y298H;
A(D 183 -G184)+N 195F+N299A;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+K302R+S303Q;
△(D183 -G184)+N 195F+N3 06G;
A(D183-G184)+N195F+N125A; △(D183-G184)+N195F+N125R;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+Rl 81Q+N445Q+K446N+R31 OA;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+R320K;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+Rl 81Q+N445Q+K446N+Q319K+R320D;
A(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+N306A;
A(D 183-G 184)+N 195F+R181Q+N445Q+K446N+K3 02N;
△(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+E345N;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+Rl 81Q+N445Q+K446N+Y298F;
△(D183-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+R28N;
A(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+R28N+R310A;
A(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+N128D+N306D;
A(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+N128D;△(Dl 83-G184)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+N306D; N174D+N314D;
A(Dl 83-G84)+Nl 95F+N306D+R310H+E345D;
△(D183-G184)+Rl 81 Q+Nl 95F+W189R+S94K;
A(D 183-G184)+R 181 Q+Wl 89R+S94K;
△(D183-G 184)+N 195F+R181Q+S94K;
△(D183-G184)+N195F+R181K+N125R;
△(D183-G184)+N195F+R181K+N125K;
△(D183-G184)+Nl 95F+R118K+R320K+R458K;
△(D183-G 184)+Rl 81Q+N195F+R118K+R320K+R45 8K;
△(Dl 83-GI 84)+Nl 95F+RI81Q+N306G;
△(Dl 83-G184)+Nl 95F+R181 Q+Wl 89R;
△(D183-G 184)+Rl 81 Q+N 195F+R118K+N125K+R444K+N445K △(Dl 83-GI 84)+Rl 81 Q+Nl 95F+R118K+N125K+R320K+R458K;
△(D183-GI 84)+Rl 81 Q+Nl 95F+S94K+R118K+R320K+R458K; △(Dl 83-GI 84)+Rl 81Q+N195F+R118K+N306R+R320K+R458K; A(D 183-GI 84)+Nl 95F+R118K+R320K+R458K+R444K+N445K; △(D183-G184)+N195F+S94K+R118K+N306R+R320K+R458K;
考慮的變體包括在實(shí)施例中提到的具體變體和上述突變與一種或多種 如下突變/取代的進(jìn)一步組合A(D183-G184); N195F; R181Q; G186R; M202L; V206F,L,M;N193S，T,P。
增加的溶解度
當(dāng)把所有上述突變?nèi)缦滤鲇糜谝唤MTermamyl樣oc-淀粉酶中的任何 一種a-淀粉酶，都會導(dǎo)致產(chǎn)生溶解度改變的Termamyl樣oc-淀粉酶變體。
所以，在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的變體是親代Termamyl樣a-淀粉酶 的變體，其與親代Termamyl樣cc-淀粉酶相比，溶解度已提高(如上定義)， 并包含選自下組的一個或多個位點(diǎn)的改變(用SEQ ID NO: 12進(jìn)行氨基酸編 號)R28， R118， N174, R181, G182， D183, G184, G186, W189, N195， M202, Y298, N299， K302， S303， N306, R310, N314, R320， H324, E345, Y396, R400, W439， R444, N445, K446, Q449, R458, N471, N484,
其中
(a) 所述每一改變是
(i) 在占據(jù)該位點(diǎn)的氨基酸下游插入一個氨基酸，
(ii) 缺失占據(jù)該位點(diǎn)的氨基酸，或
(iii) 用另一氨基酸取代占據(jù)該位點(diǎn)的氨基酸，
(b) 變體有cc淀粉酶活性和
(c) 每一位點(diǎn)都對應(yīng)于具有SEQIDNO: U所示AA560氨基酸序列的親 代Termamyl樣a -淀粉酶的氨基酸序列位點(diǎn)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明中溶解度增加的變體與親代a -淀粉酶相比 具有一種或多種如下取代
△G184; A(R181-G182); A(D183-G184); R28N,K; S94K; R118K; N125A,R, K; N174D; R181Q，E，K; G186R; W189R，K; N195F; M202L; Y298H,F; N299A; K302R; S303Q;難6GD，R，K; R310A,K，Q，E，H,D，N; N314D; R320K; H324K; E345R,D,K,N; Y396F; R400T,K; W439R; R444K; N445K,Q; K446N; Q449E; R458K;N471E;N484Q。
在更優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明溶解度增加的變體(由"材料與方法"部 分描述的方法之一確定)包括(以SEQIDNO: 12為基礎(chǔ)編號)
A(D183-G184)+R181Q;
A(D183-G184)+G186R;
A(D183-G184)+N195F;
A(D183-G184)+M202L;
△(Dl 83-G184)+Gl 86R+N195F;
A(D 183-G184)+N 195F+R400T;
A(D183-G184)+N195F+W439R;
A(D 183 -G184)+N 195F+Q449E;
△(D183-G184)+N 195F+N484Q;
A(D183-G184)+N195F+K446N;
△(D183-G184)+N 195F+N445Q+K446N+N484E;△(D183-G 184)+Nl 95F+N445Q+K446N+Q449E;
△(D183-Gl 84)+Nl 95F+N47 IE;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+H324K;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+Y396F;
A(D 183-G 184)+N 195F+K446D;
A(D183-G184)+N195F+R181Q;
A(D 183 -G184)+N 195F+R181E;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+N445Q+K446N;
N445Q+K446N;
N445Q+K446N+N484E;
N445Q+K446N+Q449E;
△(D183-G 184)+N 195F+R181Q+N445Q+K446N;
△(D183-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+K446N;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+N484E;
△(D183-G184)+Nl 95F+R181E+N445Q+K446N;
A(D 183-G 184)+N 195F+R181E+K446N;
A(D 183-Gl 84)+Nl 95F+R181E+N445Q+K446N+N484E;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+N445Q+K446N+Y243F;
A(D183-G184)+N195F+N445Q+K446N+V209I;
A(D 183 -G184)+N 195F+E212R;
A(D183陽G184)+N195F+M116R;
△(D183 -G184)+N 195F+K142H+D144H+R15 8H;
A(D 183 -G184)+N 195F+K142H+D144H;
A(D 183 -G184)+N 195F+R15 8H;
A(D183-G184)+N195F+E345R;
△(D183陽G 184)+N 195F+W1 ■;
△(D183-G 184)+Nl 95F+Y298H;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+N299A;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+K302R+S303Q;
△(D183-Gl 84)+N195F+N306G;
△(Dl 83-Gl 84)+N195F+Y298H+N299A+K302R+S303Q+N306G;A(D183-G184)+N195F+N125A; A(D183-Gl 84)+N195F+N125R;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+R31 OA;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+R310A+Q31 IN;
A(D 183-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+R320K;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+Q319K+R320D;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+N306A;
△(D183-G 184)+N 195F+R181Q+N445Q+K446N+K302N;
△(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+E345N;
△(D183-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+Y298F;
A(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+R28N;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+R28N+R31 OA;
A(Dl 83-Gl 84)+N195F+Rl 81Q+N445Q+K446N+N128D+N306D;
A(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+N128D;
A(D 183-Gl 84)+Nl 95F+R181Q+N445Q+K446N+N306D;
N174D+N314D;
△(Dl 83-Gl 84)+,5F+N306D+R310H+E345D;
A(D 183 -G184)+R 181Q+N195F+W189R+S94K;
A(Dl 83-Gl 84)+Rl 81 Q+Wl 89R+S94K;
△(D183-G 184)+N 195F+R181Q+S94K;
△(D183-G184)+N195F+R181K+N125R;
△(D183-G184)+N195F+R181K+N125K;
△(Dl 83-Gl 84)+Nl 95F+R118K+R320K+R458K;
△(Dl 83-Gl 84)+Rl 81Q+N195F+R118K+R320K+R458K;
A(D 183-G 184)+N 195F+R181Q+N3 06G;
△(D183-G 184)+Nl 95F+R181 Q+W 189R;
△(Dl 83-Gl 84)+Rl 81Q+N195F+R118K+N125K+R444K+N445K A(D 183 -G184)+R 181 Q+N 195F+R118K+N12 5K+R320K+R45 8K; △(Dl 83-Gl 84)+Rl 81 Q+Nl 95F+R118K+N125R+R320K+R458K; △(D183 -G184)+R 181 Q+N 195F+S94K+R118K+R320K+R45 8K; △(D183 -G184)+R 181 Q+N 195F+R118K+N3 06R+R320K+R45 8K;A(D183-G184)+N195F+S94K+R118K+N306R+R320K+R458K; 本發(fā)明的其它組合包括實(shí)施例中提到的具體組合和一種或多種如下取 代N195F; R181Q; G186R; M202L; V206F,L,M; N193P。 穩(wěn)定性
在本發(fā)明的上下文中，那些獲得改變的穩(wěn)定性，尤其是在特別高的pH 值(即pH 8-10.5)條件下，獲得改進(jìn)的穩(wěn)定性(提高或降低)的重要突變(包括氨 基酸取代和缺失)，包括"改變的特性"部分所列舉的任何一種突變。
Ca2+穩(wěn)定性
改變的Ca"穩(wěn)定性是指酶在Ca^損耗的條件下穩(wěn)定性已得到改進(jìn)，即， 提高或降低了穩(wěn)定性。在本發(fā)明的上下文中，那些獲得改變的Ca^穩(wěn)定性， 尤其是在特別高的pH值(即pH 8-10.5)條件下，獲得改進(jìn)的Ca"穩(wěn)定性(提 高或降低的穩(wěn)定性)的重要突變(包括氨基酸取代和缺失)，包括"改變的特性 "部分所列舉的任何一種突變。
比活性
本發(fā)明另一方面，與獲得比活性改變，尤其在10-60°C溫度下，優(yōu)選 20-50°C，尤其30-40°C溫度下增強(qiáng)或降低比活性的變體有關(guān)的重要突變(包 括氨基酸取代和缺失)，包括"改變的特性"部分所列舉的任何突變。
本發(fā)明變體的一般突變
那些能夠增加酶活性位點(diǎn)周圍流動性(mobility)的突變(包括氨基酸的取 代與缺失)是特別令人關(guān)注的。這可以通過破壞活性位點(diǎn)附近(即在優(yōu)選距離 構(gòu)成活性位點(diǎn)的任何氨基酸殘基IOA，或8A,或6A,或4A的范圍內(nèi))的穩(wěn) 定作用而實(shí)現(xiàn)。
以下是降低側(cè)鏈大小的突變實(shí)例
Ala突變?yōu)镚ly
Val突變?yōu)锳la或Gly
lie突變?yōu)長eu， Val， Ala或Gly
Thr突變?yōu)镾er
期望通過這些突變使活性位點(diǎn)區(qū)的柔性增加，這可用引入空腔或通過填 充突變留下的空間的結(jié)構(gòu)重排來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的變體優(yōu)選除上述突變外還包含一種或多種修飾。因此，OC-淀 粉酶變體部分存在的一個或多個(幾個)脯氨酸殘基被非脯氨酸殘基取代可能 是有利的，所述非脯氨酸殘基可以是任何可能的天然產(chǎn)生的非脯氨酸殘基， 優(yōu)選是丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸或亮氨酸。
同樣，親代OC -淀粉酶中 一個或多個(幾個)半胱氨酸殘基被非半胱氨酸殘 基，如，絲氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或亮氨酸取代可能是優(yōu) 選的。
此外，本發(fā)明的變體或者只經(jīng)歷一種修飾，或者以任何上述修飾的組合
方式被修飾，以使對應(yīng)于SEQ ID NO: 10的185-209位氨基酸的氨基酸片段 中存在的天冬氨酸和/或谷氨酸，各自被天冬酰胺和/或谷氨酰胺取代。 在這 些Termamyl樣oc -淀4分酶中，對應(yīng)于SEQ ID NO: 10序歹'J 185-209位氨基酸 片段的氨基酸片段中存在的一個或多個(幾個)賴氨酸殘基被精氨酸取代，也 是人們所關(guān)注的。
可以理解，本發(fā)明包含引入二種或多種上述修飾的變體。
此外，在如下一個或多個位點(diǎn)引入突變可能是有利的(用SEQ ID NO: 10(TermamylTM)來編號)
M15， V128, Alll， H133, W138， T149， M197, N188， A209， A210, H405, T412,尤其是如下單個，雙重，三重或多重突變
M15X,特別是M15T,L;
V128X，特別是V128E;
H133X，特別是H133Y;
N188X,特別是N188S,T，P;
M197X,特別是M197T,L;
A209X,特別是A209V;
M197T/W138F; M197T/W138Y; M15窗133Y鹿88S;
M15/V12犯/H133Y/N188S; E119C/S130C; D124C/R127C; H133Y/T149I;
G475R， H133Y/S187D; H133Y/A209V;
在AA560中所述修飾對應(yīng)于
L17X，特別是L17T;
E130Xj
Y135X;W140X,特別是W140F，Y; T193X;特別是S,P; M202X,特別是M202T，L; V214X;
涉及的突變組合包括
M202T/W140F; M202T/W140Y; L17T/T193S; L17窗193P; E121C/S132C; N126C/Q129C; T151I; G480R。
制備本發(fā)明oc-淀粉酶變體的方法
將突變引入基因的多種方法為本領(lǐng)域所知。在簡短討論如何克隆oc -淀粉 酶編碼DNA序列后，以下討論在oc-淀粉酶編碼序列的特定位點(diǎn)產(chǎn)生突變 的方法。
克隆編碼oc -淀粉酶的DNA序列
編碼親代oc-淀粉酶的DNA序列可以用本領(lǐng)域熟知的多種方法，從任何 產(chǎn)生所需ot-淀粉酶的細(xì)胞或微生物中分離出來。首先，從具有目的a-淀粉 酶的生物中獲得染色體DNA和/或信使RNA，建立基因組DNA和/或cDNA 文庫。然后，如果a-淀粉酶的氨基酸序列是已知的，可合成同源的經(jīng)標(biāo)記 的寡核苷酸探針，用于從所述生物中制備的基因組文庫中鑒定a -淀粉酶編 碼克隆?；蛘撸阎猳c-淀粉酶基因同源序列的標(biāo)記寡核苷酸探針用作 探針，在較低嚴(yán)緊度的雜交和洗滌條件下，鑒定a-淀粉酶編碼克隆。
鑒定oc-淀粉酶編碼克隆的另一種方法是將基因組DNA插入到表達(dá)載 體，如質(zhì)粒，用所得基因組DNA文庫轉(zhuǎn)化的a-淀粉酶陰性菌，然后，在 含有ct-淀粉酶底物的瓊脂培養(yǎng)基上涂板培養(yǎng)，以獲得能表達(dá)所要鑒定的ct-淀粉酶的克隆。
另外，編碼酶的DNA序列還可以用已建立的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如，亞磷酰 胺'法(長口 S丄.Beaucage ,口 M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1981， pp. 1859-1869所述)或Matthes等描述的方法(Matthes et al., The EMBO J. 3, 1984. pp. 801-805)得到。在亞磷酰胺法中，寡聚核苷酸是例如用DNA自動合成儀 合成的，對其進(jìn)行純化，退火，連接，并克隆到合適的載體。
最后，DNA序列可以是采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制得的、基因組序列與合成的序列， 合成的序列與cDNA來源的序列，或基因組序列與cDNA來源的序列的混合(適當(dāng)?shù)兀@些片段對應(yīng)于整個DNA序列的各部分)。DNA序列還可以用特 定引物通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)得到，如US 4,683,202或R.K. Saiki et al., Science 239, 1988， pp. 487-491所述。
oc-淀粉酶變體的表達(dá)
根據(jù)本發(fā)明，可使用表達(dá)載體，以酶的形式表達(dá)通過上述方法，或通 過本領(lǐng)域已知的任何其它方法產(chǎn)生的編碼變體的DNA序列，所述表達(dá)載體 一般包括編碼啟動子，操縱子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，翻譯起始信號的控制序 列，并任選包括阻抑基因或多種激活基因。
攜有編碼本發(fā)明ot-淀粉酶變體的DNA序列的重組表達(dá)載體可以是能 對其方便地進(jìn)行重組DNA操作的任何載體，載體的選擇經(jīng)常取決于導(dǎo)入該 載體的宿主細(xì)胞。因此，載體可以是自我復(fù)制的載體，即作為染色體外實(shí) 體存在的載體，所述載體的復(fù)制獨(dú)立于染色體的復(fù)制，所述載體包括例如 質(zhì)粒，噬菌體或染色體外元件，微型染色體或人工染色體。或者，載體可 以是當(dāng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞時可以整合至宿主細(xì)胞基因組，并與整合了該載體的 染色體一起復(fù)制的載體。
在載體中，DNA序列應(yīng)該與適當(dāng)?shù)膯幼有蛄锌刹僮飨噙B。啟動子可 以是在選定宿主細(xì)胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，啟動子可以得自 編碼與宿主細(xì)胞同源或異源之蛋白質(zhì)的基因。介導(dǎo)編碼本發(fā)明a-淀粉酶變
體之DNA序列轉(zhuǎn)錄，尤其是在細(xì)菌宿主中的轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)啟動子的例子是 大腸桿菌/ac操縱子的啟動子，天藍(lán)色鏈霉菌瓊脂酶基因^gA啟動子，地 衣芽孢桿菌a-淀粉酶基因(a^y丄)啟動子，嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽糖淀粉酶 基因Ow^W)啟動子，解淀粉芽孢桿菌a-淀粉酶(a/^0啟動子，枯草芽孢桿 菌xylA和xy舊基因的啟動子等。為了在真菌宿主中轉(zhuǎn)錄，有用的啟動子的 例子是得自編碼下列酶的基因的啟動子米曲霉TAKA淀粉酶，米赫根毛 霉(i /z&owwcor m/e/^')天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性a-淀粉酶，黑曲霉酸穩(wěn) 定的a-淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，米赫根毛霉脂肪酶，米曲霉堿性蛋白 酶，米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶或構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶。
本發(fā)明的表達(dá)載體還含有適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止子，在真核生物中，還含有 與編碼本發(fā)明a-淀粉酶變體的DNA序列可操作相連的聚-腺苦酸化序列。終 止和聚腺苦酸化序列可適當(dāng)?shù)氐米耘c啟動子相同的來源。載體可進(jìn)一步含有能使載體在所述宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。所述 序列的例子是質(zhì)粒pUC19， pACYC177, pUB110, pE194， pAMBl和pIJ702的
復(fù)制起點(diǎn)。
載體也可含有選擇標(biāo)記，例如其產(chǎn)物可以補(bǔ)償宿主細(xì)胞缺陷的基因， 如枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的^ /基因，或能賦予抗生素抗性的基因，
所述抗生素抗性如氨節(jié)青霉素，卡那霉素，氯霉素或四環(huán)素抗性。另外， 載體可含有曲霉屬選擇標(biāo)記，如amdS，argB,niaD和sC,產(chǎn)生潮霉素抗性的 標(biāo)記，或者可通過WO 91/17243中所述的共-轉(zhuǎn)化來完成選擇。
盡管細(xì)胞內(nèi)表達(dá)在某些方面(例如當(dāng)使用某些細(xì)菌作為宿主細(xì)胞時)有 利，但一般優(yōu)選在細(xì)胞外進(jìn)行表達(dá)。通常，本文所述的芽孢桿菌a-淀粉酶 含有允許表達(dá)的蛋白酶分泌至培養(yǎng)基的前區(qū)(preregion)。必要時，該前區(qū)可 被不同的前區(qū)或信號序列取代，通過取代編碼各個前區(qū)的DNA序列可以方 便地實(shí)現(xiàn)此目的。
分別連接編碼a-淀粉酶變體的本發(fā)明DNA構(gòu)建體，啟動子，終止子和 其它元件，并將它們插入含有復(fù)制所需信息的適當(dāng)載體的方法是本領(lǐng)域技 術(shù)人員眾所周知的(參見例如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，第2版， 冷泉港，1989)。
含有上文所定義的本發(fā)明DNA構(gòu)建體或表達(dá)載體的本發(fā)明細(xì)胞可以 有利地用作宿主細(xì)胞，以重組產(chǎn)生本發(fā)明的a-淀粉酶變體?？梢苑奖愕赝?過將編碼變體的本發(fā)明DNA構(gòu)建體(一個或多個拷貝)整合至宿主染色體， 用所述DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。 一般認(rèn)為整合是有利的，因?yàn)檎虾驞NA 序列可以在細(xì)胞中更加穩(wěn)定地維持。根據(jù)常規(guī)方法，例如通過同源或異源 重組可以將DNA構(gòu)建體整合至宿主染色體?；蛘?，可用與不同類型的宿主 細(xì)胞有關(guān)的上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
本發(fā)明的細(xì)胞可以是高等生物，如哺乳動物或昆蟲的細(xì)胞，但優(yōu)選其 為微生物細(xì)胞，例如細(xì)菌或真菌(包括酵母)細(xì)胞。
適合的細(xì)菌為革蘭氏陽性菌，如枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，遲緩 芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌(及a汰a/o/ Mw", 解淀粉芽孢桿菌，凝結(jié)芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，巨大芽 孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌，淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌，或革蘭氏陰性菌如大腸桿菌。細(xì)菌的轉(zhuǎn)化可以通過，例如原生質(zhì)轉(zhuǎn)化或通過已知的方式用 感受態(tài)細(xì)胞實(shí)現(xiàn)。
酵母生物可優(yōu)選糖酵母屬或裂殖酵母屬，例如釀酒酵母。絲狀真菌優(yōu) 選屬于曲霉屬，例如，米曲霉或黑曲霉。真菌細(xì)胞可用一種方法轉(zhuǎn)化，該 方法涉及原生質(zhì)形成、原生質(zhì)轉(zhuǎn)化、然后細(xì)胞壁以其本身已知的方式再生。
曲霉屬宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的適合方法如EP 238 023所述。
在另一方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)本發(fā)明ot-淀粉酶變體的方法，該方法包 含在有利于變體生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)如上所述宿主細(xì)胞以及從細(xì)胞和/或培養(yǎng) 液中回收變體。
用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是適于培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，并表達(dá)本發(fā)明 ot-淀粉酶變體的任何常規(guī)培養(yǎng)基。適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基可以商購，或者可根據(jù)公 開的配方(例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心目錄中所述的配方)生產(chǎn)。
通過眾所周知的方法，包括通過離心或過濾將培養(yǎng)基與細(xì)胞分開，利 用鹽如硫酸銨沉淀培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)成分，接著利用層析法，如離子交換 層析，親和層析等，從培養(yǎng)基中方便地回收宿主細(xì)胞分泌的a-淀粉酶變體。
工業(yè)化應(yīng)用
本發(fā)明的cc淀粉酶變體有許多在工業(yè)應(yīng)用中有價(jià)值的特性。具體地，本 發(fā)明的酶變體可以作為洗滌，清洗餐具，洗滌硬表面的洗滌劑組合物的成分。 本發(fā)明的具有改變的特性的變體還可用于淀粉加工，特別是淀粉轉(zhuǎn)化，特別 是淀粉的液化等過程(參見，例如US 3,912,590, EP專利
發(fā)明者卡斯滕·安德森, 托本·V·博徹特, 比賈尼·R·尼爾森 申請人:諾維信公司