專利名稱：重組圈卷產(chǎn)色鏈霉菌及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組圈巻產(chǎn)色鏈霉菌及其制備方法與應(yīng)用。
技術(shù)背景尼可霉素屬于核苷肽類抗生素，與幾丁質(zhì)合成酶的天然底物UDP-N-乙酰葡萄糖胺 的結(jié)構(gòu)類似，是該幾丁質(zhì)合成酶的強(qiáng)競爭性抑制劑。由于幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞壁、昆蟲 以及其他無脊椎動(dòng)物外骨骼的重要組成部分，因此，尼可霉素能夠有效的抑制真菌、 昆蟲和螨蟲，而對哺乳動(dòng)物、蜜蜂和植物無毒或者毒性極低，并且其在自然界中易降 解，是一種理想的農(nóng)用抗生素。田間試驗(yàn)證明尼可霉素對很多植物病害都有很好的防 治效果，如小麥白粉病、煙草紅斑病、黃瓜菌核病、番茄葉霉病、蘋果輪斑病等。同 時(shí)，研究表明尼可霉素能夠有效抑制人體深部感染真菌一白色念珠菌(Cs/ 力Vs s7力ic朋力，尼可霉素Z (Nikkomycin Z)作為口服藥物對粗球孢子菌和芽生病菌有 明顯的療效。目前，越來越多的人面臨著自身免疫系統(tǒng)病(如艾滋病患者、器官移植 病人和接受放化療的癌癥患者)和其他原因引起的免疫能力下降而引起的危及生命的 真菌感染，因此，作為抗真菌藥物的尼可霉素有巨大的應(yīng)用和開發(fā)潛力。尼可霉素由尼可霉素生物合成基因簇編碼的多個(gè)酶和蛋白所合成，在尼可霉素生 物合成基因簇中有一個(gè)途徑特異性調(diào)控基因^/^， 21個(gè)結(jié)構(gòu)基因，分別為M/2K5\3/7《S朋K S朋S S朋7 , S朋C幼/7尸,5"朋Q S朋《S朋爽S朋厶S朋《S朋乂幼成S朋/' S朋尸，S朋AM/7《S朋GS朋Z^S朋Z。其中，結(jié)構(gòu)基因構(gòu)成三個(gè)轉(zhuǎn)錄單元，分別是 ■SaoO—513/7K S3"A^一5^3/2i",S3/ /7—5S/ yT ,其中51377。5^/7yV, 5^377,是三個(gè)轉(zhuǎn)錄單元白勺第一個(gè)基因。尼可霉素生物合成基因簇大于35kb，用一般的分子生物學(xué)方法很難得到全長的基因簇。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種重組圈巻產(chǎn)色鏈霉菌。本發(fā)明所提供的重組圈巻產(chǎn)色鏈霉菌，是將尼可霉素生物合成基因簇導(dǎo)入圈巻產(chǎn) 色鏈霉菌得到的重組菌。其中，所述尼可霉素生物合成基因簇可通過重組質(zhì)粒PNIK導(dǎo)入圈巻產(chǎn)色鏈霉菌； 所述重組質(zhì)粒pNIK按照以下方法制備1)將圈巻產(chǎn)色鏈霉菌的基因組DNA用&WAI消化，回收40-50kb的DNA片段，同時(shí) 用勘/dil酶切科斯質(zhì)粒，將回收的DNA片段連入所述科斯質(zhì)粒，得到重組科斯質(zhì)粒，用5所述重組科斯質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得重組科斯質(zhì)粒文庫，篩選得到含有尼^f霉素生物
合成基因簇片段a的重組科斯質(zhì)粒(cosG4)的陽性克隆A;篩選得到含有尼可霉素生 物合成基因簇片段b的重組科斯質(zhì)粒(cosG5)的陽性克隆B;所述尼可霉素生物合成 基因簇片段a至少含有幼刀6Lh游8. 9kb和s朋C， s朋K say tt saw7;幼"5; sa/2《s朋《 sa/7尸,513/7(7, 513/77^ sa"爽 S3/ Z, saov^ sao/; sa/7〃 5va/ , san尸,5137^， sa;i5， sao61
和部分S朋/^;所述部分S朋Z^為S朋Z 沖與S朋a目連的500bp片段；
所述尼可霉素生物合成基因簇片段b至少含有M"/， S3/7尸，幼W,S朋《幼/7C，
ot/ Z^， M/ 擬及ss/ rF游3. 0 kb DNA片段；
2)將步驟l)得到的陽性克隆A中所含有的尼可霉素生物合成基因簇片段a插入 pLXP，得到重組質(zhì)粒pLXP-NRPS，使用勘/dH酶切pLXP-NRPS，將得到的線性片段轉(zhuǎn)入 重組Acoh' BW25113/pIJ790菌株中，得到pNIK;
所述重組冗co"' BW25113/pIJ790菌株是將步驟l)得到的陽性克隆A中的重組科 斯質(zhì)粒轉(zhuǎn)入A BW25113/pIJ790菌株得到的重組菌株；
所述pLXP按照如下方法構(gòu)建用"s/in和Z力oI雙酶切陽性克隆B中的重組科斯質(zhì) 粒，回收ll.O kb DNA片段并連接到pUC19的"3/ziHI和J力oI位點(diǎn)上得到重組質(zhì)粒pLXP9; 然后用fcoRI和歷'/7dlII雙酶切pLXP9，回收ll.O kb DNA片段與經(jīng)同樣處理的 pBluescript II KS (-)連接，得到重組質(zhì)粒pLXP10;再用ifeWI和fcoRI酶切pLXP10， 將回收的ll.O kb DNA片段克隆到pSET152的fe/^1-fcoRI位點(diǎn)上從而獲得pLXP。
所述重組圈巻產(chǎn)色鏈霉菌具體可為圈巻產(chǎn)色鏈霉菌(5Yrepto/^ces a/7Wc力r咖oge/2es) 7100 DNik CGMCC No. 3087。
圈巻產(chǎn)色鏈霉菌(5Yre/^o/z yce5 a;^oc力ro/iK^e/7es) 7100 DNik CGMCC No. 3087 己于2009年06月01日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡 稱為CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏號(hào)為CGMCC No. 3087。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利用上述重組圈巻產(chǎn)色鏈霉菌生產(chǎn)生產(chǎn)尼可霉素的 方法。
本發(fā)明所提供的生產(chǎn)尼可霉素的方法，是發(fā)酵所述重組圈巻產(chǎn)色鏈霉菌得到尼可 霉素。
含有尼可霉素生物合成基因簇的重組質(zhì)粒pNIK也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。 本發(fā)明采用RED/ET同源重組技術(shù)使尼可霉素生物合成全長基因簇完整的縫合在 一起，所釆用的RED/ET重組工程技術(shù)是基于同源重組的一種對大分子DNA分子和細(xì) 菌染色體進(jìn)行修飾的主要方法，其應(yīng)用不受分子大小的限制，能有效的克服現(xiàn)有基因操作面臨的技術(shù)難題。
與圈巻產(chǎn)色鏈霉菌菌株7100 CGMCC4.321相比，本發(fā)明的重組圈巻產(chǎn)色鏈霉菌可 使尼可霉素Z的產(chǎn)量提高1.8倍左右，尼可霉素X的產(chǎn)量提高3倍左右。本發(fā)明顯著 地提高了尼可霉素的產(chǎn)量，為大規(guī)模生產(chǎn)尼可霉素提供了必要的技術(shù)準(zhǔn)備。


圖1為重組質(zhì)粒pNIK的構(gòu)建策略。
其中，構(gòu)建過程如下
1、 將來自cosG4的4. 5kb片段插入pLXP;
2、 ^arfH酶切pLXP-NRPS和去磷酸化得到線性片段；
3、 RED/ET技術(shù)整合pLXP-NRPS和cosG4。
圖2為圈巻產(chǎn)色鏈霉菌菌株7100 CGMCC4. 321和圈巻產(chǎn)色鏈霉菌 (5Yrepz^/Hyces a/Lsoc力ro/Hoge/7es) 7100 DNik CGMCC No. 3087的尼可霉素產(chǎn)量 比較。
其中，O為圈巻產(chǎn)色鏈霉菌(6Yr印z^z yces a/7soc力1^7wge77as) 7100 DNik CGMCC No. 3087;翻為圈巻產(chǎn)色鏈霉菌菌株7100 CGMCC4. 321。
Nikkomycin X表示尼可霉素X， NikkomycinZ代表尼可霉素Z。 圖3為pNIK的酶切驗(yàn)證。
其中，M表示lkb分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、 2、 3道分別表示pLXP， cosG4， pNIK用 fcoRI酶切的結(jié)果；4、 5、 6表示上述三種質(zhì)粒用^a/z;HI酶切的結(jié)果；7、 8、 9表 示上述三種質(zhì)粒用《p/3l酶切的結(jié)果；10、 11、 12表示上述三種質(zhì)粒用酶切 的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的實(shí)施作詳細(xì)的說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案 為前提下進(jìn)行實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí) 施例
實(shí)施例1、含有尼可霉素生物合成基因簇的重組質(zhì)粒pNIK的構(gòu)建
1、制備含有尼可霉素生物合成基因簇片段的重組科斯質(zhì)粒
圈巻產(chǎn)色鏈霉菌7100 CGMCC 4. 321 (購自中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微 生物中心)，它的孢子呈絲鉤狀，或圈巻，很少成圈環(huán)；孢子為球形或橢圓形。
從圈巻產(chǎn)色鏈霉菌7100 CGMCC 4. 321中提取其基因組DNA，用fe^AI消化，脈 沖電泳分離后回收40-50kb的DNA片段，同時(shí)用(5"3w3AI同尾酶)酶切科斯質(zhì) 粒s叩ercosl (Stratagene)，去磷酸化后與回收的DNA片段以T4 DNA連接酶鏈接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL l-blue MR (Stratagene)，獲得含有尼可霉素生物合成基因簇片段 的重組科斯質(zhì)粒文庫，利用m/W基因的部分片段(500 bp，序列l(wèi))的地高辛標(biāo)記的 探針篩選得到含有尼可霉素生物合成基因簇片段a的重組科斯質(zhì)粒(cosG4)的陽性 克隆A;篩選得到含有尼可霉素生物合成基因簇片段b的重組科斯質(zhì)粒(cosG5)的陽 性克隆B。
尼可霉素生物合成基因簇片段a從5'—3'依次為m/^上游8. 9kb， ^/^，
s朋仏s朋r， s朋S 5"朋y ' 5V3/7ft 5朋尸,s朋q s朋7V; s朋爽5"3賦s朋丄5\3嫂s朋/,
s朋,，幼/l4， s朋《s朋C和部分s朋/^";該部分s朋Z^為^9/2/^中與s朋C相連的500bp 片段；
尼可霉素生物合成基因簇片段b從5'—3'依次為^/2/，^/7,， sa/ /i m/7《m/^， s朋"f， s朋I和s朋Z下游3. 0 kb DNA片段。
2、構(gòu)建含有尼可霉素生物合成基因簇的重組質(zhì)粒pNIK pNIK的構(gòu)建過程如圖1所示，具體步驟如下
1) 質(zhì)粒pLXP的構(gòu)建
用^gMH和雙酶切重組科斯質(zhì)粒cosG5，回收11. 0 kb DNA片段并連接到 pUC19 (Fermentas)的AaMH和i7wl位點(diǎn)上得到重組質(zhì)粒pLXP9。然后用fcoRI和 A'/win雙酶切pLXP9，回收11. 0 kb DNA片段與經(jīng)同樣處理的pBluescript II KS (-)(Stratagene)相連接，構(gòu)建成到重組質(zhì)粒pLXP10。再用Aa^I和fcoRI酶切 pLXP10，將回收的ll.O kb DNA片段克隆到pSET152 (John innes institute, Norwich, UK)的Aa出I-fcd I位點(diǎn)上從而獲得pLXP;
2) pLXP和cosG4有大約6 kb的重疊區(qū)域，這6 kb DNA片段可以作為同源重組 的下游臂。為構(gòu)建同源重組的上游臂，用AcoRI和屈ol酶切重組科斯質(zhì)粒cosG4，回 收4.5 kb的DNA片段(sanG上游片段)，連入vfe/dn-尸Wl酶切、補(bǔ)平并自連接的 質(zhì)粒pBluescript II KS (-) (Stratagene)中，獲得質(zhì)粒pNRPS。使用勘I和fe蘊(yùn) 雙酶切pNRPS，并連接到J力3l和^a/^I雙酶切的pLXP上，獲得重組質(zhì)粒pLXP-NRPS。 使用"a/^I酶切pLXP-NRPS，用小牛磷酸化酶去磷酸化，獲得的線性片段電轉(zhuǎn)化含有 重組科斯質(zhì)粒cosG4的重組coh'柳25113/pIJ790菌株(該重組￡ BW25113/pIJ790菌株是將重組科斯質(zhì)粒cosG4轉(zhuǎn)入￡BW25113/pIJ790 (John Innes Institute, Norwich, UK)得到的重組菌)，通過安普霉素抗性篩選，質(zhì)粒抽 提，得到pNIK。
分別用fcoRI、 5a/dl1、 7T/mI和J力ol酶切pNIK、 pLXP和cosG4，酶切結(jié)果如圖3 所示，結(jié)果顯示pNIK既含有pLXP的片段也含有cosG4的片段，同時(shí)因?yàn)槎咧亟M，出現(xiàn)了一些新的酶切片段。酶切驗(yàn)證顯示獲得了含有全長尼可霉素生物合成f夷的重組 質(zhì)粒pNIK。該質(zhì)粒不僅含有尼可霉素生物合成的全長基因簇，還含有接合轉(zhuǎn)移序列
oriT，噬菌體phiC31整合酶和整合位點(diǎn)attP，能夠使用接合轉(zhuǎn)移方法方便地整合到 宿主的基因組上。
實(shí)施例2、尼可霉素工程菌的構(gòu)建
1、 轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒pNIK的重組圈巻產(chǎn)色鏈霉菌(5Yrepfo歷yces 朋soc/ rovz 。ge77650的獲得
含有整個(gè)尼可霉素生物合成基因簇的重組質(zhì)粒pNIK可以用來在圈巻產(chǎn)色鏈霉菌 基因組上增加尼可霉素生物合成基因簇的拷貝數(shù)，由于重組質(zhì)粒pNIK能夠整合在圈 巻產(chǎn)色鏈霉菌基因組上隨染色體一同復(fù)制，因此用此質(zhì)粒構(gòu)建的尼可霉素高產(chǎn)工程菌 在遺傳上是穩(wěn)定的。具體方法如下所述
將重組質(zhì)粒pNIK轉(zhuǎn)入￡ET12567 (John Innes Institute, Norwich, UK) 以去除限制修飾，以安普霉素為篩選標(biāo)記，通過接合轉(zhuǎn)移，將重組質(zhì)粒pNIK轉(zhuǎn)入圈 巻產(chǎn)色鏈霉菌菌株7100 CGMCC4. 321中，得到轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒pNIK的重組圈巻產(chǎn)色 鏈霉菌(5"tre/^a!7/ces朋soc/ r咖t^e/7es)。將其中一株編號(hào)為7100 DNik的重組圈 巻產(chǎn)色鏈霉菌(5Yr印f咖yces朋soc力ro/oc^e/ es)于2009年06月01日保藏于中國 微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱為CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)大 屯路，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏號(hào)為CGMCC No. 3087。
2、 圈巻產(chǎn)色鏈霉菌(5^rep^M77ce5"朋wc力r咖^ey7es) 7100 DNik CGMCC No. 3087 的尼可霉素產(chǎn)量檢測
將上述步驟1中得到的圈巻產(chǎn)色鏈霉菌(5Yrep"/H/ces朋socAro歷oge/7es) 7100 DNik CGMCC No. 3087和圈巻產(chǎn)色鏈霉菌菌株7100 CGMCC4. 321分別接種在YEME培養(yǎng) 基(Difco Yeast Extract 3 g ， Difco Tryptone 5 g， 0xoid Malt Extract 3 g ， Sucrose 200 g，加蒸餾水定容至1000 ml使用前加入下列滅過菌的溶液MgCl2 6H20 (2. 5M) 2 ml, Glucose (50%) 20 ml， Glycine (10%) 50 ml)中，28°C，轉(zhuǎn)速180 rpm培養(yǎng)48 h后，轉(zhuǎn)移1 ml菌液到50 ral發(fā)酵培養(yǎng)基SP培養(yǎng)基(甘露醇30 g，可 溶性淀粉10 g，中性大豆蛋白胨5 g，酵母提取物8 g，蒸餾水定容至1000 ml)中， 28°C，轉(zhuǎn)速180 rpm培養(yǎng)，分別于發(fā)酵1、 2、 3、 4和5天后用濾紙過濾菌體，烘箱 烘干，發(fā)酵濾液用直徑0.22 um的微孔濾膜過濾，濾液即作為HPLC檢測樣品。發(fā) 酵實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次
所用儀器為Agilent 1100 HPLC，分析柱為Agilent公司的Z0RBAX SB-C18柱(4. 6 X 150mm, 3. 5陶)，并使用Agilent公司的SB C-18預(yù)柱(4. 6X 12. 5mm， 5Pm)。所用試劑為，試劑A: 10 mM庚垸磺酸鈉鹽和O. 72 ml/L冰乙酸的水溶液；試劑B: 10 mM 己烷磺酸鈉鹽和0.72ml/L冰乙酸的水一乙腈(6:4)溶液。HPLC梯度洗脫條件為流速 1 ml/min， 25分鐘內(nèi)，試劑B的線性梯度從13%到45%，試劑A的線性梯度從87%到 55%。
尼可霉素Z標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma)在上述HPLC條件下的保留時(shí)間為22.3分鐘，尼可 霉素X標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間為23. 8分鐘，并且以尼可霉素Z和尼可霉素X的峰面積制 作標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間一致，分別為尼可霉素Z為22.3 分鐘，尼可霉素X為23.8分鐘。
其中，進(jìn)行定量的尼可霉素Z標(biāo)準(zhǔn)曲線是Y二6.7357X-181.52 (Y為峰面積，X為 尼可霉素Z濃度mg/L)，尼可霉素X標(biāo)準(zhǔn)曲線是Y^ 0. 0763X- 14. 263 (Y為峰面積， X為尼可霉素X濃度mg/L)。三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)測得的圈巻產(chǎn)色鏈霉菌菌株7100 CGMCC4. 321 發(fā)酵5天的發(fā)酵液中的濾液中的尼可霉素Z的峰面積為198. 97±7. 98，尼可霉素X的 峰面積為149.90±4.03。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，測得的圈巻產(chǎn)色鏈霉菌(5"fre; &邁yce^ a/^ocAra77塔e"es) 7100 DNik CGMCC No. 3087發(fā)酵5天后的發(fā)酵液的濾液中的尼可霉 素Z的峰面積為337. 22±20. 11，尼可霉素X的峰面積為578. 64±14. 62。
結(jié)果如圖2所示，在相同條件下圈巻產(chǎn)色鏈霉菌(5Yrepfo/z 7ces 朋soc力ro/Hoge/7es) 7100 DNik CGMCC No. 3087的尼可霉素產(chǎn)量要高于圈巻產(chǎn)色鏈霉菌 菌株7100 CGMCC4. 321的尼可霉素產(chǎn)量，并且導(dǎo)入基因簇后，對尼可霉素的兩個(gè)主要 組分尼可霉素X和尼可霉素Z有不同的增產(chǎn)效果，尼可霉素Z提高1.8土0.05倍，尼 可霉素X提高3士0.21倍。
3、圈巻產(chǎn)色鏈霉菌(6Yrept咖yces朋socAr，oge/2es) 7100 DNik CGMCC No. 3087的穩(wěn)定性
將圈巻產(chǎn)色鏈霉菌(5Yr印t咖yces朋soc力r咖oge/ es) 7100 DNik CGMCC No. 3087 接種在沒有任何選擇壓力的基本培養(yǎng)基(麗培養(yǎng)基)(瓊脂10 g， L-天冬酰胺0.5g， K2HP04 0 . 5 g， MgS04 7H20 0 . 2 g， FeS04 7H20 0. 01 g，加蒸餾水定容至1000 ml， 使用前加入50 ml 10%甘露醇)上，在28。C下培養(yǎng)；傳5代后重新轉(zhuǎn)接至含安普霉素 的MM基本培養(yǎng)基(瓊脂10 g， L-天冬酰胺0. 5 g， K2HP04 0. 5 g， MgS04 7H20 0. 2 g， FeS(WH20 0 . 01 g，加蒸餾水定容至1000 ml，使用前加入50 ml 10%甘露醇和50
100 mg/ml的安普霉素)上，結(jié)果仍然是安普霉素抗性。隨機(jī)挑取三株進(jìn)行如上 述步驟2中的發(fā)酵，發(fā)酵5天后的結(jié)果表明圈巻產(chǎn)色鏈霉菌(5Yrep^/^ces 朋soc力ro/ffog朋es) 7100 DNik CGMCC No. 3087仍然比圈巻產(chǎn)色鏈霉菌菌株7100 CGMCC4.321產(chǎn)生的尼可霉素產(chǎn)量高，其中，尼可霉素Z提高1.8倍，尼可霉素X提高3倍。這表明導(dǎo)入的全基因簇穩(wěn)定的整合在圈巻產(chǎn)色鏈霉菌的基因組上，工程菌在遺 傳上是穩(wěn)定的。序列表
〈110〉中國科學(xué)院微生物研究所
〈120>重組圈巻產(chǎn)色鏈霉菌及其制備方法與應(yīng)用
<160> 1
<210> 1
<211〉 500
〈212> DNA 〈213〉人工序列
<400〉 1
cgatccccgg cagcggccgg gcagcgaacc gacgaggggt cggcaggggc ccgcggacag 60
gctgtggcca ggtcaggccc gggccgtccc gggcccacgc atcgacccca aggagacacc 120
gtggtgctga cgctcgactc ggcgctggag gaacgtaccc agccgttcca gctxttccgc 180
ggccgtgacc tgctcgacga cgggcaactg gacgagctgc tcgcgaccgt gccgaccgcc 240
gacgtcgcga agatcgcggt cgaggacccg aagcacgaga agcagtaccg gatgaacctc 300
gtggacctca tcgtcctcga aaaggaagcc ccggtcttcc cccgcctgcc cggggtctgg 360
cgcgacctcg tggaggacct gcgcggcgcc gagttcaccg cctggctgga gaagtcgacc 420
gggatcgaac tggccggcct gcagcgcagc atcggcctct acacccaccg caacggtgac 480
tacctgtcgg tacacaagga
500
權(quán)利要求
1、一種重組圈卷產(chǎn)色鏈霉菌，是將尼可霉素生物合成基因簇導(dǎo)入圈卷產(chǎn)色鏈霉菌得到的重組菌。
2、 如權(quán)利要求l所述的重組圈巻產(chǎn)色鏈霉菌，其特征在于所述尼可霉素生物合 成基因簇通過重組質(zhì)粒PNIK導(dǎo)入圈巻產(chǎn)色鏈霉菌；所述重組質(zhì)粒PNIK按照以下方法制備1) 將圈巻產(chǎn)色鏈霉菌的基因組DNA用6^/JAI消化，回收40-50kb的DNA片段，同時(shí) 用^3^H酶切科斯質(zhì)粒，將回收的DNA片段連入所述科斯質(zhì)粒，得到重組科斯質(zhì)粒，用 所述重組科斯質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得重組科斯質(zhì)粒文庫，篩選得到含有尼可霉素生物 合成基因簇片段a的重組科斯質(zhì)粒的陽性克隆A;篩選得到含有尼可霉素生物合成基因 簇片段b的重組科斯質(zhì)粒的陽性克隆B;所述尼可霉素生物合成基因簇片段a至少含有 s朋6"上游8.9kb禾口s朋(？， s朋K, s朋〃，s朋T， s朋S s朋《 s朋^ s朋G 幼"t^5"朋爽 5V37 Z, 5\3威S朋乂 5m 《S朋/,S朋/7, 5"朋j， 5^/z51，5^/ 6^口部分S朋鵬所述部分s朋Z^為s朋朋中與s朋a目連的500bp片段；所述尼可霉素生物合成基因簇片段b至少含有S3/7/， M/Li 5V3/ i5; S朋G5^/ Z^， sa/ 擬及A3/LTf游3. 0 kb DNA片段；2) 將步驟l)得到的陽性克隆A中所含有的尼可霉素生物合成基因簇片段a插入 pLXP，得到重組質(zhì)粒pLXP-服PS，使用^3/dH酶切pLXP-NRPS，將得到的線性片段轉(zhuǎn)入 重組Eco^' BW25113/pIJ790菌株中，得到pNIK;所述重組Ecoh' BW25113/pIJ790菌株是將步驟l)得到的陽性克隆A中的重組科 斯質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E BW25113/pIJ790菌株得到的重組菌株；所述pLXP按照如下方法構(gòu)建用"3MH和i7 o[雙酶切陽性克隆B中的重組科斯質(zhì) 粒，回收ll.O kb DNA片段并連接到pUC19的^3/sHI和Z力oI位點(diǎn)上得到重組質(zhì)粒pLXP9; 然后用^^RI和歷'/7dlII雙酶切pLXP9，回收ll.O kb DNA片段與經(jīng)同樣處理的 pBluescript II KS (-)連接，得到重組質(zhì)粒pLXP10;再用^/dn和^coRI酶切pLXP10， 將回收的ll.O kb DNA片段克隆到pSET152的5a/dn-AcoRI位點(diǎn)上從而獲得pLXP。
3、 如權(quán)利要求2所述的重組圈巻產(chǎn)色鏈霉菌，其特征在于所述重組圈巻產(chǎn)色鏈 霉菌為圈巻產(chǎn)色鏈霉菌(^5Yr印f咖j^es ai^oc力r咖c^e/7es) 7100 DNik CGMCC No. 3087。
4、 權(quán)利要求卜3中任一所述的重組圈巻產(chǎn)色鏈霉菌的構(gòu)建方法，是將尼可霉素生 物合成基因簇通過重組質(zhì)粒pNIK導(dǎo)入圈巻產(chǎn)色鏈霉菌得到重組圈巻產(chǎn)色鏈霉菌；1)將圈巻產(chǎn)色鏈霉菌的基因組DNA用fewJAI消化，回收40-50kb的DNA片段，同時(shí)用勘/dil酶切科斯質(zhì)粒，將回收的DNA片段連入所述科斯質(zhì)粒，得到重組科斯質(zhì)粒，用 所述重組科斯質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得重組科斯質(zhì)粒文庫，篩選得到含有尼可霉素生物 合成基因簇片段a的重組科斯質(zhì)粒的陽性克隆A;篩選得到含有尼可霉素生物合成基因 簇片段b的重組科斯質(zhì)粒的陽性克隆B;所述尼可霉素生物合成基因簇片段a至少含有 s朋6Lh游8.9kb禾口s朋C s朋K， s朋〃，s朋T' s朋S 5vs賦 s朋。,s朋Q s朋《S朋爽 S朋Z, S3斌 S朋乂 5^/7《S朋工 S朋尸，5"朋J， s朋《 s朋6Sl部分s朋鵬所述部分s朋Z^為與幼/3鄰連的500bp片段；所述尼可霉素生物合成基因簇片段b至少含有^9/ /， JV372A M"C，s朋Z^， s朋il^及s朋Xr游3. 0 kb DNA片段；2)將步驟l)得到的陽性克隆A中所含有的尼可霉素生物合成基因簇片段a插入 pLXP，得到重組質(zhì)粒pLXP-NRPS，使用feMII酶切pLXP-NRPS，將得到的線性片段轉(zhuǎn)入 重組Acoh' BW25113/pIJ790菌株中，得到pNIK;所述重組f. coh' BW25113/pIJ790菌株是將步驟l)得到的陽性克隆A中的重組科 斯質(zhì)粒轉(zhuǎn)入￡ coh' BW25113/pIJ790菌株得到的重組菌株；所述pLXP按照如下方法構(gòu)建用^aMII和J力oI雙酶切陽性克隆B中的重組科斯質(zhì) 粒，回收ll.O kb DNA片段并連接到pUC19的^/ziil和Z力oI位點(diǎn)上得到重組質(zhì)粒pLXP9; 然后用fcoRI和忠V dlII雙酶切pLXP9,回收ll.O kb DNA片段與經(jīng)同樣處理的 pBluescript II KS (-)連接，得到重組質(zhì)粒pLXP10;再用5ayrflI和^boRI酶切pLXP10， 將回收的ll.O kb DNA片段克隆到pSET152的fe;aHI-fcoRI位點(diǎn)上從而獲得pLXP。
5、 一種生產(chǎn)尼可霉素的方法，是發(fā)酵權(quán)利要求1-3中任一所述的重組圈巻產(chǎn)色鏈 霉菌得到尼可霉素。
6、 含有尼可霉素生物合成基因簇的重組質(zhì)粒pNIK;所述重組質(zhì)粒pNIK按照以下 方法制備1)將圈巻產(chǎn)色鏈霉菌的基因組DNA用&WAI消化，回收40-50kb的DNA片段，同時(shí) 用5s/^I酶切科斯質(zhì)粒，將回收的DNA片段連入所述科斯質(zhì)粒，得到重組科斯質(zhì)粒，用 所述重組科斯質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得重組科斯質(zhì)粒文庫，篩選得到含有尼可霉素生物 合成基因簇片段a的重組科斯質(zhì)粒的陽性克隆A;篩選得到含有尼可霉素生物合成基因 簇片段b的重組科斯質(zhì)粒的陽性克隆B;所述尼可霉素生物合成基因簇片段a至少含有 s朋6Lb游8.9kb禾口s朋C s朋K' s朋仏 s朋7' s朋S "5朋《 s朋。,s朋尸's朋G s朋" s朋爽 s朋Z, s朋《 5vs/2乂 sa成s朋/, s朋/7， s朋力，s朋《 s朋鄰部分s朋鵬所述部 分s朋"f為sa/ Z 沖與^a/ "目連的500bp片段；所述尼可霉素生物合成基因簇片段b至少含有s朋/， M77尸，sa/H s朋《s朋C，幼/ Zte; 5"s/7擬及幼/ Xf游3. 0 kb DNA片段；2)將步驟l)得到的陽性克隆A中所含有的尼可霉素生物合成基因簇片段a插入 pLXP，得到重組質(zhì)粒pLXP-NRPS，使用&WI酶切pLXP-NRPS，將得到的線性片段轉(zhuǎn)入 重組Aco/i BW25113/pIJ790菌株中，得到pNIK;所述重組Aco力'BW25113/pIJ790菌株是將步驟l)得到的陽性克隆A中的重組科 斯質(zhì)粒轉(zhuǎn)入A "力'BW25113/pIJ790菌株得到的重組菌株；所述pLXP按照如下方法構(gòu)建用^3^n和Z力at雙酶切陽性克隆B中的重組科斯質(zhì) 粒，回收ll.O kb DNA片段并連接到pUC19的^a^I和Z^I位點(diǎn)上得到重組質(zhì)粒pLXP9; 然后用fcoRI和歷V dlII雙酶切pLXP9，回收ll.O kb DNA片段與經(jīng)同樣處理的 pBluescript II KS (-)連接，得到重組質(zhì)粒pLXP10;再用^a出I和i"cd I酶切pLXP10， 將回收的ll. 0 kb DNA片段克隆到pSET152的及力WI-iboRI位點(diǎn)上從而獲得pLXP。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組圈卷產(chǎn)色鏈霉菌及其制備方法與應(yīng)用。該重組圈卷產(chǎn)色鏈霉菌，是將尼可霉素生物合成基因簇導(dǎo)入圈卷產(chǎn)色鏈霉菌得到的重組菌。其中，尼可霉素生物合成基因簇可通過重組質(zhì)粒pNIK導(dǎo)入圈卷產(chǎn)色鏈霉菌。與圈卷產(chǎn)色鏈霉菌菌株7100 CGMCC4.321相比，本發(fā)明的重組圈卷產(chǎn)色鏈霉菌可使尼可霉素Z的產(chǎn)量提高1.8倍左右，尼可霉素X的產(chǎn)量提高3倍左右。本發(fā)明顯著地提高了尼可霉素的產(chǎn)量，為大規(guī)模生產(chǎn)尼可霉素提供了必要的技術(shù)準(zhǔn)備。
文檔編號(hào)C12N15/74GK101591635SQ200910088489
公開日2009年12月2日 申請日期2009年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月2日
發(fā)明者廖國建, 李金娥, 譚華榮 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所