專利名稱：：一種固態(tài)機械發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種木聚糖酶的制備方法，特別是采用固態(tài)機械法生產(chǎn)的方法。
背景技術(shù)：
：木聚糖是半纖維素的主要成分，后者是植物性纖維材料的重要組成成分之一，每年地球上植物光合作用所產(chǎn)生的巨大資源，約有三分之一是半纖維素。木聚糖結(jié)構(gòu)為4-木糖苷鍵連接的木糖聚合物，大多數(shù)木聚糖鏈都含有其它糖基作為側(cè)鏈，根據(jù)側(cè)鏈上連接的糖基可以決定這種多糖分子是酸性的還是中性的。中性木聚糖的側(cè)鏈常常是單個L-阿拉伯呋喃糖或它的短鏈所組成，而含一個甲氧基的C-4上的D-葡萄糖醛酸則常常是酸性木聚糖的側(cè)鏈。由于木聚糖酶在食品、釀酒、詞料添加劑及造紙工業(yè)上的廣泛應(yīng)用，目前國內(nèi)外都非常關(guān)注這方面的研究，這主要是利用微生物的液體發(fā)酵或固體發(fā)酵來生產(chǎn)酶。國外研究所涉及的微生物主要有霉菌、放線菌和細菌等。如巴西的R.C.Simao等利用Aspergillustamarii所得的木聚糖活力為120u/ml;奧地利的AloisSachslehner等利用Sckrotiumrolfsill生產(chǎn)木聚糖酶、產(chǎn)酶活力達104u/mi;加拿大的A.W.Khan利用細菌和真菌的培養(yǎng)物得到的酶活達104u/ml;印度的A.Archana和T.Satyanarayana利用ThermophilicBacilluslicheniformisA99固體發(fā)酵，酶活力達19.13ug—'DBB(drybacterialbran);法國的P.L.pham等人利用Bacillusp.產(chǎn)酶活力達2388nkat/ml(lnkat定義為特定條件下酶催化底物每秒鐘產(chǎn)生的1nmol)。最近幾年的資料表明國外的研究重點是細菌，并通過各種耐酸、耐堿、耐高溫細菌來發(fā)展耐酸、耐堿、耐高溫的木聚糖酶，拓寬木聚糖酶的應(yīng)用范圍。近年來有關(guān)木聚糖酶的研究也有較多論文發(fā)表，有人利用黑曲霉(Aspetgillusniger)An-76菌株，所產(chǎn)木聚糖酶活力達353.61u/ml;也有人用黑曲霉A3菌株固體發(fā)酵，得到的固體酶粉活力達15395lu/g;還有人利用芽孢桿菌L23，所得酶活力為301u/ml。除此之外，另有人利用木聚糖酶基因克隆和表達，獲得一些高產(chǎn)菌株，例如Whitehead應(yīng)用大腸桿菌一類固體穿梭載體PVAL-1將棲瘤擬桿菌木聚糖酶基因轉(zhuǎn)入脆弱擬桿菌或單形擬桿菌，轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生的酶活力比原菌株高出1400倍。Suominen等將木聚糖酶基因與具高產(chǎn)纖維素酶性能的瑞氏木霉突變株ALK0233基因重組，使其失去編碼纖維素酶的作用，但仍然保留著高蛋白產(chǎn)生功能，從而得到了高產(chǎn)木聚糖酶的菌株。酶制劑在醫(yī)藥、食品、皮草等行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用，以詞料行業(yè)為例，酶制劑添加劑可以提高內(nèi)源酶不能作用的多糖和蛋白質(zhì)的利用率；打破飼料中不能被內(nèi)源酶分解的特定化學鏈，得到更多的營養(yǎng)物質(zhì)；可以克服幼年動物由于內(nèi)源酶產(chǎn)生不足所引起的消化不良；還可以降解許多飼料中的抗營養(yǎng)因子，增加飼料的營養(yǎng)價值。而木聚糖酶制劑則是這類酶制劑中重要的一種。有研究表明，在豬的日糧中添加0.05%的木聚糖酶制劑，觀察木聚糖酶制劑對40%次粉日糧20—57Kg生長育豬的飼養(yǎng)效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實驗組比對照組日增重提高8.1%，詞料轉(zhuǎn)化率提高4.3%，每公斤增重飼料成本降低3.2%。另有研究在小麥或燕麥為基礎(chǔ)的飼料中添加木聚糖酶和e—葡聚糖酶，結(jié)果詞料轉(zhuǎn)化率分別提高了6.2%和23%。還有的在雞的詞料中添加O.5%的木聚糖酶和0.2%的0—葡聚糖酶，可以提高日增重達7%10%,降低飼料消耗3%14%。大麥、黑麥中的抗營養(yǎng)因子(ANF)主要是阿拉伯木聚糖，而木聚糖酶能水解其中的阿拉伯木聚糖，降低動物腸道食糜粘度，使養(yǎng)分利用率提高，所以現(xiàn)在木聚糖酶在飼料行業(yè)中的應(yīng)用已經(jīng)相當廣泛，并面臨著更廣闊的前景。在歐洲以木聚糖酶為主的酶制劑占到了飼料行業(yè)酶制劑消耗量的40%。但總起來說，目前研發(fā)的固態(tài)發(fā)酵木聚糖酶的活力不高，酶對熱和環(huán)境因子的適應(yīng)性不強，不穩(wěn)定，容易在加工或使用中失活，另外，生產(chǎn)成本高，容易染菌，高污染，也是當前酶制劑生產(chǎn)中存在的一個比較普遍的問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服上述已有技術(shù)之缺陷而提供一種固態(tài)機械發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶方法。本發(fā)明的目的是以如下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種固態(tài)機械發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶方法，它包括菌種培育、制備種子懸浮液、固態(tài)發(fā)酵、干燥和粉碎工藝，各工序按如下步驟進行-a.菌種培育出發(fā)菌株采用黑曲霉菌，采用平板透明圈及測酶活力的方法，從待測菌株中選出生產(chǎn)良好且產(chǎn)酶活力高的菌株；b.配制培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基/PDA培養(yǎng)基；固體發(fā)酵培養(yǎng)基的配制，原料采用麩皮、玉米芯粉、(NH4)2S04、MgS04.7H20、K2HP04以及水，各原料按質(zhì)量單位份計為麩皮80;玉米芯20;(NH4)2S041.5;MgS04.7H200.15;K2HP040.2;水100200;pH為5.0。C.滅菌器滅菌、物料輸送至固體發(fā)酵器中木聚糖酶的生產(chǎn)首先在滅菌器內(nèi)進行滅菌，將清洗后空消(滅菌設(shè)備在未裝物料之前空罐先殺菌消毒)的滅菌器內(nèi)放底水50升，攪拌，投入培養(yǎng)基物料后鎖緊罐蓋，通入空氣，將罐壓升至1.3-1.6kg/cm2，溫度120-125。C時保持40分鐘，降溫至8(TC以下；滅菌后的物料由無菌管道輸送到固體發(fā)酵器中發(fā)酵，攪拌，使物料均勻攤鋪于篩盤表面，風冷，降溫，溫度達到2830。C;d.接種物料達到工藝要求溫度后，停止通風，將種液噴灑到物料表面，經(jīng)篩盤翻攪，物料全面均勻接觸種液，停止翻攪；利用攤刮出料機構(gòu)使物料平整攤鋪在篩盤表面，使物料溫度一致、發(fā)酵菌體生長一致；e.靜止培養(yǎng)、發(fā)酵隨時監(jiān)測發(fā)酵品溫，觀察生長情況；控制發(fā)酵器內(nèi)溫度在283(TC;噴灑補水保持物料含水量在60%左右；在生長旺盛期，生物熱高時啟動篩盤、翻攪工作，降低品溫。f.干燥、粉碎達到工藝生長要求，發(fā)酵結(jié)束，打開出料門，轉(zhuǎn)動篩盤，啟動出料機構(gòu)，使物料從出料門均勻排出；發(fā)酵后的物料進行干燥，使含水量低于8%;干燥后的物料進行粉碎，粉碎粒徑在2毫米。上述固態(tài)機械發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶方法，在菌種培育工序，將選出的菌株進行誘變育種a.以篩選出來的高產(chǎn)菌株為出發(fā)菌株，在生長良好的純種斜面中加入10ml無菌水，洗下孢子，移入裝有玻璃珠和190m無菌水的三角瓶中，震蕩，將孢子充分散開，用脫脂棉過濾至另一無菌三角瓶中，用血球計數(shù)板計數(shù)，依次稀釋，調(diào)整孢子濃度為106個/ml;b.誘變處理取10ml孢子懸液于4)90培養(yǎng)皿中，置于誘變箱的磁力攪拌器上，照射時6間分別為0.05分鐘、1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、6分鐘、8分鐘，各取lml處理液經(jīng)稀釋后，以每平板10-12菌落為宜，置于平皿中；C.傾注法分離取各種稀釋濃度的孢子懸液各0.5ml，(一般為5種左右濃度的孢子懸液進行分離)，分別置于平皿中，待培養(yǎng)基冷至45-50°C，迅速注入平皿，搖勻，以使菌落分散；d.長出菌落以后，將單個菌落分別挑到斜面上；e.將各斜面菌株利用搖瓶液體發(fā)酵后，測其酶活力，選出產(chǎn)酶活力高的菌株即為所需生產(chǎn)菌種。上述固態(tài)機械發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶方法，所述滅菌后的物料輸送到固體發(fā)酵器中發(fā)酵時，其接種量選擇為10%。上述固態(tài)機械發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶方法，所述滅菌后的物料輸送到固體發(fā)酵器中發(fā)酵時，其發(fā)酵溫度選擇為28°C。上述固態(tài)機械發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶方法，所述滅菌后的物料輸送到固體發(fā)酵器中發(fā)酵時，物料層厚度選擇為20-25cm。本發(fā)明采用固態(tài)機械發(fā)酵法，該方法與液態(tài)法、及通常固態(tài)法不同，它采用固態(tài)原料進行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶，從配備物料開始全程采用機械自動化進行生產(chǎn)操作。物料從進入高溫滅菌設(shè)備開始，就在全封閉、連續(xù)化、無菌狀態(tài)下輸送和發(fā)酵，所以生產(chǎn)過程染菌率極低，產(chǎn)品質(zhì)量好、活性高、成本低。本發(fā)明解決了傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵易污染、傳熱和傳質(zhì)困難、發(fā)酵過程參數(shù)無法控制等技術(shù)難題。通過誘變育種，使固態(tài)發(fā)酵木聚糖酶活力達到8萬單位/克以上，酶活力為國內(nèi)同類產(chǎn)品4倍左右，優(yōu)于國內(nèi)外其它采用霉菌生產(chǎn)木聚糖酶的工藝。本發(fā)明采用細菌深層發(fā)酵生產(chǎn)食品級木聚糖酶，用于30t發(fā)酵罐，可連續(xù)穩(wěn)定生產(chǎn)，發(fā)酵酶活2500U/mL，固體酶活力》100000U/g，發(fā)酵周期在18h，發(fā)酵成功率達到99%，酶活收率>87%。采用價格低廉的農(nóng)副產(chǎn)品作為發(fā)酵原料，原料成本降低50%，適合大批量工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明所生產(chǎn)的木聚糖酶應(yīng)用于草粉粗纖維降解，粗纖維的含量比對照普通木聚糖酶降低了3.24%;提高了飼料利用率，喂養(yǎng)奶牛試驗表明，每天每頭奶牛比對照組平均增加產(chǎn)奶0.57千克，乳脂率提高0.13%，每頭奶牛全年可增加收益約356.85元；將其用于酒精濃醪發(fā)酵，發(fā)酵酒精濃度提高l.16度，出酒率提高3.06%。具體實施方式a.菌種培育:出發(fā)菌株黑曲霉S13(AspergillusnigerS13(原始的菌株代號))。黑曲霉是半知菌亞門絲孢綱絲孢目叢梗孢科曲霉屬真菌中的一個常見菌種。分生孢子梗自基質(zhì)中伸出，直徑1520pm，長約13咖，壁厚而光滑。頂部形成球形頂囊，其上全面覆蓋一層?；鸵粚有」＃」Ｉ祥L有成串褐黑色的球狀分生孢子。孢子直徑2.54.0um。分生孢子頭球狀，直徑700800um，褐黑色。菌落蔓延迅速，初為白色，后變成鮮黃色直至黑色厚絨狀。背面無色或中央略帶黃褐色。有時在新分離的菌株中能找到白色、圓形、直徑約lmm的菌核。廣泛分布于世界各地的糧食、植物性產(chǎn)品和土壤中，是重要的發(fā)酵工業(yè)菌種，可生產(chǎn)淀粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、檸檬酸、葡糖酸和沒食子酸等，有的菌株還可將羥基孕甾酮轉(zhuǎn)化為雄烯。常引起糧食和其他工業(yè)器材霉變。篩選高產(chǎn)菌株采用平板透明圈及測酶活力的方法，從待測菌株中選出生產(chǎn)良好且產(chǎn)酶活力高的菌株。誘變育種(1)以篩選出來的高產(chǎn)菌株為出發(fā)菌株，在生長良好的純種斜面中加入10ml無菌7jC，洗下孢子，移入裝有玻璃珠和190m無菌水的三角瓶中，震蕩，將孢子充分散開，用脫脂棉過濾至另一無菌三角瓶中，用血球計數(shù)板計數(shù)，依次稀釋，調(diào)整孢子濃度為l(^個/ml。(2)誘變處理取10ml孢子懸液于cb90培養(yǎng)皿中(帶磁棒)置于誘變箱的磁力攪拌器上，照射時間分別為0.05分鐘、1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、6分鐘、8分鐘，各取lml處理液經(jīng)稀釋后(每平板10-12菌落為宜)，置于平皿中。本工序主要采用的設(shè)備是離子注入機和誘變箱。(3)傾注法分離取5種稀釋濃度的孢子懸液各0.5ml，分別置于平皿中，待培養(yǎng)基冷至45-5(TC，迅速注入平皿，搖勻，以使菌落分散。(4)長出菌落以后，將單個菌落分別挑到斜面上。(5)將各斜面菌株利用搖瓶液體發(fā)酵后，測其酶活力，選出產(chǎn)酶活力高的菌株。具體操作如下將生長良好的菌株，接入霉菌產(chǎn)酶培養(yǎng)基中。觀察其中的DWC、Rutc兩株纖維素酶高產(chǎn)菌株發(fā)酵期長，需五天，其他各菌均發(fā)酵兩天，其中黑曲霉A7及黑曲霉S13長勢最好，發(fā)酵兩天后，菌絲已布滿培養(yǎng)基表面并有少量孢子生成，其余各菌生長情況各異。用腦S法測酶活，列表如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>分離培養(yǎng)基(g/L)的配制木聚糖20，NaN033，K2HP041，MgS04.7H200.5，KCIO.5，F(xiàn)eS040.01，瓊脂20，Ph為5.0。固體發(fā)酵培養(yǎng)基的配制，原料采用麩皮、玉米芯粉、(NH4)2S04、MgS04.7H20、K2HP04以及水，各原料按質(zhì)量單位份計為麩皮80;玉米芯20;(NH4)2S041.5;MgS04.7H200.15;K2HP040.2;以及水，訓200;pH為5.0。C.滅菌器滅菌、物料輸送至發(fā)酵器中木聚糖酶的生產(chǎn)在滅菌器內(nèi)進行，將清洗后空消(滅菌設(shè)備在未裝物料之前空罐先殺菌消毒)的滅菌器內(nèi)放底水50升，開攪拌，投入培養(yǎng)基物料后鎖緊罐蓋，開啟罐頂排氣節(jié)門少許后打開罐底進氣節(jié)門，同時進氣，待罐壓升至1.3-1.6kg/ci^，溫度120-125'C時保持40分鐘，降溫至8(TC以下。滅菌后的物料由無菌管道輸送到發(fā)酵器中，攪拌，使物料均勻攤鋪于篩盤表面，風冷使物料迅速降溫，溫度達到283(TC。d.接種物料達到工藝要求溫度，停止通風，將種液噴灑到物料表面，在篩盤翻攪作用下，物料全面均勻接觸種液，達到要求停止噴灑種液，停止翻攪。利用攤刮出料機構(gòu)使物料平整攤鋪在篩盤表面，這樣就可以達到物料溫度一致，發(fā)酵菌體生長一致的效果，達到要求后停止篩盤和攤刮機構(gòu)工作。e.靜止培養(yǎng)、發(fā)酵按工藝要求隨時監(jiān)測發(fā)酵品溫，觀察生長情況。通過鼓引風通風降溫啟動換熱器升溫，達到控制發(fā)酵器內(nèi)溫度的目的；噴灑補水保持物料含水量；在生長旺盛期，生物熱高時啟動篩盤、翻攪工作，降低品溫。f.干燥、粉碎達到工藝生長要求，發(fā)酵結(jié)束，打開出料門，轉(zhuǎn)動篩盤，啟動出料機構(gòu)，使物料從出料門均勻排出。發(fā)酵后的物料需要進入干燥工序進行干燥，要求含水量低于8%。干燥在汽流干燥設(shè)備中進行，對于產(chǎn)能在150KG/H的設(shè)備，可選擇其蒸發(fā)量在600KG/H.。干燥后的物料需要粉碎，可選擇500型粉碎機，粉碎粒徑在2毫米。l.種子罐發(fā)酵時間的確定微生物的生長可分為延遲期、對數(shù)期、穩(wěn)定期及衰老期四個階段。當接入對數(shù)期的種子，菌體以幾何級數(shù)增長，代謝旺盛，生長迅速，這樣可以縮短延遲期，利于產(chǎn)酶。種齡為1224小時時，菌體處于延遲期或?qū)?shù)生長前期，接入固體發(fā)酵器后，菌體生長相對緩慢，所以發(fā)酵兩天后表現(xiàn)出產(chǎn)酶活力低；種齡為36小時時菌體處于對數(shù)生長期，接入固體發(fā)酵器后生長迅速，表現(xiàn)出產(chǎn)酶活力高；種齡為48小時以上時，菌體過分生長，相對老化，在固體發(fā)酵器中則生長慢，產(chǎn)酶活力低，所以種子罐培養(yǎng)時間定為36小時。2.接種量對S13-15產(chǎn)木聚糖酶的影響接種量也對S13-15產(chǎn)酶有影響，為使菌體在固體發(fā)酵器中生長適量而產(chǎn)酶活力高，必須確定一個合適的接種量，接種量為5%時，菌體生長量偏少，產(chǎn)酶活力也相應(yīng)較低；接種量為10%時，菌體生長旺盛，產(chǎn)酶活力最高；而當接種量為15%時，菌體生長過于旺盛，營養(yǎng)物質(zhì)相對缺乏，導致產(chǎn)酶活力反而低，因此，選擇接種量為10%。3.溫度對S13-15產(chǎn)酶的影響控制固體發(fā)酵器溫度偏低，菌體生長較慢，產(chǎn)酶活力較低28'C時最為合適，菌體生長良好，產(chǎn)酶達到最高；而超過28'C，菌體生長過于迅速，同時發(fā)酶過程中的酶也因較高的溫度而消耗較快，導致酶活力不高，所以選擇在28'C溫度時發(fā)酵較為合適。4.通氣量對S13-15產(chǎn)酶的影響。黑曲霉S13-15是需氧生長，如果發(fā)酵過程物料中溶氧濃度太低，則會抑制菌體的生長繁殖，進而影響菌體產(chǎn)酶；而溶氧量過高，則會導致菌體過度生長，加劇菌體的老化，降低產(chǎn)酶量。因而合適的溶氧量將對菌體生長及木聚糖酶的分泌是十分有利的?？刂乒腆w發(fā)酵罐物料厚度可以達到控制通氣量的目的，料層薄時，通氧量大，菌體老化，酶活力低；料層過厚時，由于裝料量大，物料透氣性差，固體發(fā)酵料表面和內(nèi)部溶氧量相對較低，從而使得菌體生長受到一定的抑制，產(chǎn)酶也不高；而裝料量為20-25cm厚時，產(chǎn)酶活力達到最高。所以選擇裝料量為20-25cm。5固態(tài)發(fā)酵木聚糖酶發(fā)酵周期的確定菌體的生長與它的木聚糖酶的分泌密切相關(guān)。菌體生長過少會則產(chǎn)酶少，但如果菌體過于旺盛地生長，以致老化，也會使酶活力降低，為確定一個最佳的發(fā)酵周期，固定其它發(fā)酵條件，在固態(tài)發(fā)酵12小時、24小時、36小時、48小時、60小時、72小時、84小時、96小時的時候分別取樣測ra值及酶活力，其結(jié)果見表3-8:表4發(fā)酵時間對酶活的影響13<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>權(quán)利要求1.一種固態(tài)機械發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶方法，其特征在于，它包括菌種培育、制備種子懸浮液、固態(tài)發(fā)酵、干燥和粉碎工藝，各工序按如下步驟進行a.菌種培育出發(fā)菌株采用黑曲霉菌，采用平板透明圈及測酶活力的方法，從待測菌株中選出生產(chǎn)良好且產(chǎn)酶活力高的菌株；b.配制培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基/PDA培養(yǎng)基；固體發(fā)酵培養(yǎng)基的配制，原料采用麩皮、玉米芯粉、(NH4)2SO4、MgSO4.7H2O、K2HPO4以及水，各原料按質(zhì)量單位份計為麩皮80；玉米芯20；(NH4)2SO41.5；MgSO4.7H2O0.15；K2HPO40.2；水100～200；pH為5.0。C.滅菌器滅菌、物料輸送至固體發(fā)酵器中木聚糖酶的生產(chǎn)首先在滅菌器內(nèi)進行滅菌，將清洗后空消的滅菌器內(nèi)放底水50升，攪拌，投入培養(yǎng)基物料后鎖緊罐蓋，通入空氣，將罐壓升至1.3-1.6kg/cm2，溫度120-125℃時保持40分鐘，降溫至80℃以下；滅菌后的物料由無菌管道輸送到固體發(fā)酵器中，攪拌，使物料均勻攤鋪于篩盤表面，風冷，降溫，溫度達到28～30℃；d.接種物料達到工藝要求溫度后，停止通風，將種液噴灑到物料表面，經(jīng)篩盤翻攪，物料全面均勻接觸種液，停止翻攪；利用攤刮出料機構(gòu)使物料平整攤鋪在篩盤表面，使物料溫度一致、發(fā)酵菌體生長一致；e.靜止培養(yǎng)、發(fā)酵隨時監(jiān)測發(fā)酵品溫，觀察生長情況；控制發(fā)酵器內(nèi)溫度在28～30℃；噴灑補水保持物料含水量在60％左右；在生長旺盛期，生物熱高時啟動篩盤、翻攪工作，降低品溫。f.干燥、粉碎達到工藝生長要求，發(fā)酵結(jié)束，打開出料門，轉(zhuǎn)動篩盤，啟動出料機構(gòu)，使物料從出料門均勻排出；發(fā)酵后的物料進行干燥，使含水量低于8％；干燥后的物料進行粉碎，粉碎粒徑在2毫米。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固態(tài)機械發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶方法，其特征在于，在菌種培育工序，將選出的菌株進行誘變育種a.以篩選出來的高產(chǎn)菌株為出發(fā)菌株，在生長良好的純種斜面中加入10ml無菌水，洗下孢子，移入裝有玻璃珠和190m無菌水的三角瓶中，震蕩，將孢子充分散開，用脫脂棉過濾至另一無菌三角瓶中，用血球計數(shù)板計數(shù)，依次稀釋，調(diào)整孢子濃度為106個/1111;b.誘變處理取10ml孢子懸液于d)90培養(yǎng)皿中，置于誘變箱的磁力攪拌器上，照射時間分別為O.05分鐘、l分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、6分鐘、8分鐘，各取lml處理液經(jīng)稀釋后，以每平板10-12菌落為宜，置于平皿中；C.傾注法分離取5種濃度稀釋度的孢子懸液各0.5ml進行分離，分別置于平皿中，待培養(yǎng)基冷至45-5(TC，迅速注入平皿，搖勻，以使菌落分散；d.長出菌落以后，將單個菌落分別挑到斜面上；e.將各斜面菌株利用搖瓶液體發(fā)酵后，測其酶活力，選出產(chǎn)酶活力高的菌株即為所需生產(chǎn)菌種。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的固態(tài)機械發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶方法，其特征在于，所述滅菌后的物料輸送到固體發(fā)酵器中發(fā)酵時，其接種量選擇為10%。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的固態(tài)機械發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶方法，其特征在于，所述滅菌后的物料輸送到固體發(fā)酵器中發(fā)酵時，其發(fā)酵溫度選擇為28'C。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的固態(tài)機械發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶方法，其特征在于，所述滅菌后的物料輸送到固體發(fā)酵器中發(fā)酵時，物料層厚度選擇為20-25cm。全文摘要一種固態(tài)機械發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶方法，它包括菌種培育、制備種子懸浮液、固態(tài)發(fā)酵、干燥和粉碎工藝，制得木聚糖酶。本發(fā)明解決了傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵易污染、傳熱和傳質(zhì)困難、發(fā)酵過程參數(shù)無法控制等技術(shù)難題。通過誘變育種，使固態(tài)發(fā)酵木聚糖酶活力達到8萬單位/克以上，酶活力為國內(nèi)同類產(chǎn)品4倍左右，優(yōu)于國內(nèi)外其它采用霉菌生產(chǎn)木聚糖酶的工藝。本發(fā)明用于30t發(fā)酵罐，可連續(xù)穩(wěn)定生產(chǎn)，發(fā)酵酶活2500U/mL，固體酶活力≥100000U/g，發(fā)酵周期在18h，發(fā)酵成功率達到99％，酶活收率≥87％。采用價格低廉的農(nóng)副產(chǎn)品作為發(fā)酵原料，原料成本降低50％，適合大批量工業(yè)化生產(chǎn)。文檔編號C12N9/42GK101638645SQ20091007519公開日2010年2月3日申請日期2009年8月20日優(yōu)先權(quán)日2009年8月20日發(fā)明者尤文武申請人:承德避暑山莊企業(yè)集團有限責任公司