專利名稱：：一種提高半纖維素木聚糖降解率的酶組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及兩種木聚糖酶和一種木糖苷酶，特別涉及在嗜熱脫氮芽孢桿菌(Geobacillusthermodentitrificans)NG80-2中兩種可以降解木聚糖的木聚糖酶和一種可降解木糖苷的木糖苷酶對木聚糖的協(xié)同作用。
背景技術(shù)：
：隨著當(dāng)今社會的飛速發(fā)展，人口增長和資源消耗使得可再生資源的開發(fā)與利用成為國際社會和學(xué)術(shù)界共同關(guān)注的問題。木聚糖是半纖維素的主要組成成份，廣泛分布于高等植物的細(xì)胞壁中，是自然界中一種巨大的可再生生物資源，也是最容易提取、降解和利用的一類半纖維素。木聚糖酶和P木糖苷酶是降解木聚糖最主要的酶。P-l，4-內(nèi)切木聚糖酶(EC.3.2.1.8)以內(nèi)切方式作用于木聚糖主鏈內(nèi)部的P_l，4_木糖苷鍵，使木聚糖降解為短鏈的低聚木糖，并有少量木糖生成；而13-D-木糖苷酶(13-xylosidase，EC.3.2.1.37.)則作用于短鏈的低聚木糖，通過催化低聚木糖的末端來釋放木糖殘基(見圖1)。兩種酶協(xié)同作用，可以增加木聚糖的降解效率，其產(chǎn)物具有重要的工業(yè)應(yīng)用價值。例如，在能源工業(yè)中，工農(nóng)業(yè)廢棄物中的木聚糖可被木聚糖酶和木糖苷酶轉(zhuǎn)化為木糖，而木糖又可被細(xì)菌及真菌轉(zhuǎn)化成酒精等有價值的燃料；在造紙工業(yè)的紙漿漂白中，P-木糖苷酶與木聚糖酶協(xié)同作用可以有效提高漂白性能；在醫(yī)藥行業(yè)中，木聚糖酶和木糖苷酶水解特定底物可產(chǎn)生在醫(yī)藥行業(yè)具有重要應(yīng)用價值的中間轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。因此對于木聚糖酶和木糖苷酶協(xié)同作用的研究具有廣泛而重要的用途。本發(fā)明人曾于2004年11月17日申請嗜熱脫氮芽孢桿菌及其篩選和應(yīng)用(申請?zhí)?00410072759)該菌株在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMC-1228;隨后本發(fā)明人在08.11.14，又分別申請了耐高溫木聚糖酶XynAl和編碼該酶的基因與應(yīng)用(申請?zhí)?00810153076.2);耐高溫木聚糖酶XynA2和編碼該酶的基因與應(yīng)用(申請?zhí)?00810153077.7)耐高溫木糖苷酶XynBl和編碼該酶的基因與應(yīng)用(申請?zhí)?00810153078.1)耐高溫木糖苷酶XynB2和編碼該酶的基因與應(yīng)用(200810153079.6)公開了由嗜熱脫氮芽孢桿菌(Geobacillusthermodenitrificans)NG80-2基因組DNA借助PCR擴(kuò)增而得到的木聚糖酶XynAl、XynA2構(gòu)建表達(dá)載體在大腸桿菌中表達(dá)出該基因編碼的重組木聚糖酶。以及由嗜熱脫氮芽孢桿菌(Geobacillusthermodenitrificans)NG80-2基因組DNA借助PCR擴(kuò)增而得到的木糖苷酶XynBl、XynB2構(gòu)建表達(dá)載體在大腸桿菌中表達(dá)出該基因編碼的重組木糖苷酶。這些公開文件作為參考文獻(xiàn)一并引入本發(fā)明。業(yè)界公知的國外有關(guān)利用木聚糖酶和木糖苷酶協(xié)同作用于木聚糖底物的文獻(xiàn)報道集中在Anoxybacillus(厭氧芽孢桿菌屬)、Sulfolobus(硫化葉菌)、Thermomonospora(高？益單抱菌屬)禾口Aureobasidium(短梗毒)等菌株中，例如A麗ybacillusflavithe麗sBC中的木聚糖酶與Sulfolobussolfataricus0a(硫磺礦硫化葉菌)中的木糖苷酶協(xié)同作用時，對燕麥木聚糖、樺樹木聚糖和山毛櫸木聚糖的降解率比木聚糖酶單獨(dú)作用時提高了2倍、1倍和0.8倍，分別達(dá)到3.48、2.19禾口4.79mg/ml(Kambourova，M.，etal，Hydrolysisofxylanathightemperaturebyco_actionofthexylanasefromAnoxybaci1lusflavithermusBCandtheP-xylosidase/a-arabinosidasefromSulfolobussolfataricus0aa，J.Appl.Microbiol.2007Jun.102(6):1586-93.);ThermomonosporafuscaBD25(褐色熱單孢菌)中的木聚糖酶與木糖苷酶協(xié)同作用時對燕麥木聚糖的降解率是比木聚糖酶單獨(dú)作用時提高了1倍，達(dá)到5.6mg/ml(T皿cer，M.，ecal，Co-operativeactionsanddegradationanalysisofpurifiedxylan—degradingenzymesfromThermomonosporafuscaBD25onoat—speltxylan，J.Appl.Microbiol.2003.94:1030—1035);Aureobasidi咖pullulans(出芽短梗霉菌)中的木聚糖酶與木糖苷酶協(xié)同作用時對亞硫酸鹽紙漿的降解率比木聚糖酶單獨(dú)作用時提高了1.45倍，達(dá)到127.0iig/g(Christov，L.P.，etal，ModificationoftheCarbohyirateCompositionofSulfitePulpbyPurifiedaridCharacterizedP—XylanaseandP—XylosidaseofAureobasidi咖pullulans，Biotechnol.Prog.1999.15:196-200)。目前，國內(nèi)有關(guān)利用木聚糖酶和木糖苷酶協(xié)同作用于木聚糖底物的文獻(xiàn)報道主要有Trichodermareesei(里氏木霉)RutC230中的木聚糖酶和木糖苷酶協(xié)同作用對麥草漿的降解率比木聚糖酶單獨(dú)作用時提高了8.6倍，達(dá)到94.62IU/ml(毛連山，尤紀(jì)雪，宋向陽，勇強(qiáng)，余世袁，內(nèi)切木聚糖酶與木糖苷酶預(yù)處理對麥草漿漂白性能的影響，林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè).2003.6)。目前，工業(yè)降解木聚糖常用的方法有酸法、堿法和酶法，其中酸法、堿法應(yīng)用較為廣泛，但酸堿水解液中含有較多的有毒物質(zhì)，對于后期微生物發(fā)酵有抑制作用；另外，采用酸法或堿法降解木聚糖，生產(chǎn)環(huán)保壓力很大，日益受到國家的限制，故從長期生產(chǎn)效果來看，酶法降解木聚糖將是未來木聚糖降解的主要的方式。隨著研究的不斷深入，本發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)于嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80-2中分離得到的木聚糖酶XynAl、木聚糖酶XynA2和木糖苷酶XynBl按一定的比例混合后在增加木聚糖的降解效率方面，具有明顯的協(xié)同作用，而關(guān)于木聚糖酶和一種木糖苷酶混合的專利文獻(xiàn)，國內(nèi)外尚未見報道。本發(fā)明的目的是通過復(fù)合酶法降解木聚糖，重點(diǎn)需要解決的問題是提高單位菌體的酶產(chǎn)率、提高木聚糖酶和木糖苷酶的協(xié)同作用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案—種提高半纖維素木聚糖降解率的酶組合物，其特征在于它是由木聚糖酶XynAl或XynA2與木糖苷酶XynBl組成；其中XynAl或XynA2:XynBl的重量份數(shù)比是1000:1。優(yōu)選XynAl或XynA2:XynBl的重量份數(shù)比是1000:1;木聚糖酶XynAl、XynA2濃度為0.001mg/ml;木糖苷酶XynBl的終濃度為0.000001mg/ml。本發(fā)明所述的酶組合物，其中的兩種木聚糖酶和一種木糖苷酶于嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80-2中分離得到。本發(fā)明所述的酶組合物，其中兩種木聚糖酶和一種木糖苷酶協(xié)同作用的底物包括燕麥木聚糖、樺樹木聚糖、山毛櫸木聚糖中的至少一種。本發(fā)明所述的酶組合物，其中XynAl或XynA2的濃度為0.001mg/ml，木糖苷酶XynBl的濃度為0.000001mg/ml
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所述的酶組合物，其中兩種木聚糖酶和一種木糖苷酶協(xié)同作用的反應(yīng)溫度為60-65"C，協(xié)同反應(yīng)pH為5.6-7.6。本發(fā)明所述的酶組合物，其中XynA1與XynB1協(xié)同反應(yīng)的pH為5.6，XynA2與XynB1協(xié)同反應(yīng)的pH為7.6。本發(fā)明的較佳實施例中，上述的兩種木聚糖酶和一種木糖苷酶協(xié)同作用的酶的重量份數(shù)比是IOOO:1。其中XynAl或XynA2:XynBl的重量份數(shù)比是1000:1。例如木聚糖酶XynAl、XynA2濃度為0.OOlmg/ml;木糖苷酶XynBl的終濃度為0.000001mg/ml。本發(fā)明較佳實施例中，上述的兩種木聚糖酶和一種木糖苷酶協(xié)同作用的反應(yīng)溫度為6(TC，協(xié)同反應(yīng)pH為5.6-7.6。本發(fā)明所述的酶組合物，其中XynAl與XynBl協(xié)同反應(yīng)pH為5.6時，兩者協(xié)同作用效率最高；XynA2與XynBl協(xié)同反應(yīng)pH為7.6時，兩者協(xié)同作用效率最高。本發(fā)明的木聚糖酶和木糖苷酶協(xié)同作用于不同來源的木聚糖底物可使其降解效率有不同程度的提高，說明嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80-2對各種環(huán)境的適應(yīng)能力。本發(fā)明公開的提高半纖維素木聚糖降解率的酶組合物與現(xiàn)有技術(shù)相比，有益效果在于本發(fā)明的木聚糖酶和木糖苷酶協(xié)同作用于不同來源的木聚糖底物可使其降解效率有不同程度的提高，在工業(yè)化應(yīng)用中具有明顯的優(yōu)勢。圖1是本發(fā)明的木糖苷酶降解寡聚木聚糖作用示意圖；圖2是本發(fā)明的木聚糖酶XynAl和木糖苷酶XynBl在不同pH下的相對活力；圖3是本發(fā)明的木聚糖酶XynAl和木糖苷酶XynBl在不同溫度下的相對活力；圖4是本發(fā)明的木聚糖酶XynA2和木糖苷酶XynBl在不同pH下的相對活力；圖5是本發(fā)明的木聚糖酶XynA2和木糖苷酶XynBl在不同溫度下的相對活力。具體實施例方式以下結(jié)合較佳實施例，對依據(jù)本發(fā)明提供的具體實施方式詳細(xì)說明如下；同時為了簡單和清楚的目的，下文恰當(dāng)?shù)氖÷粤斯夹g(shù)的描述，以免那些不必要的細(xì)節(jié)影響對本技術(shù)方案的描述。木聚糖酶XynAl、XynA2、XynBl的活力測定方法如下實施例11.木聚糖酶XynAl的制備將重組菌H1739(構(gòu)建方法見專利200810153076.2)單克隆接入20ml含50yg/mlKan的LB培養(yǎng)基中，37°C，180rpm培養(yǎng)12小時，然后將培養(yǎng)物按1%(v/v)接種量接入200ml含50iig/mlKan的LB培養(yǎng)基，37°C，220rpm培養(yǎng)至0D6。。為0.6時，加入IPTG至終濃度為O.05mM，45tH秀導(dǎo)3小時。5000rpm離心5min收集菌體，懸于含50mMTris-HCl(pH8.0)緩沖液中，利用超聲波破碎細(xì)胞，14000g離心20min，上清液為醇脫氫酶的粗提液。此上清液經(jīng)螯合瓊脂糖凝膠(ChelatingS印harose)鎳親合柱層析純化，得純品。2.木糖苷酶XynBl的制備將重組菌H1749(構(gòu)建方法見專利200810153078.1)單克隆接入20ml含50yg/mlKan的LB培養(yǎng)基中，37°C，180rpm培養(yǎng)12小時，然后將培養(yǎng)物按1%(v/v)接種量接入200ml含50iig/miKan的LB培養(yǎng)基，37°C，220rpm培養(yǎng)至0D600為0.6時，加入IPTG至終濃度為0.lmM，在37t:、180rpm誘導(dǎo)3小時。5000rpm離心5min收集菌體，懸于含50mMTris-HCl(pH8.0)緩沖液中，利用超聲波破碎細(xì)胞，14000g離心20min，上清液為醇脫氫酶的粗提液。此上清液經(jīng)螯合瓊脂糖凝膠(ChelatingS印harose)鎳親合柱層析純化，得純<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>3.木聚糖酶XynAl與木糖苷酶XynBl協(xié)同作用1)反應(yīng)體系pH的確定上述實施例1中得到的木聚糖酶XynAl和木糖苷酶XynBl在不同pH下的比活力如圖2所示，從該圖可以看出，在pH5.6時，木聚糖酶XynAl具有50%的活性，木糖苷酶XynBl具有100%的活性，兩者協(xié)同作用效率最高。2)反應(yīng)體系溫度的確定上述實施例1中得到的木聚糖酶XynAl和木糖苷酶XynBl在不同溫度下的比活力如圖2所示，從該圖可以看出，在6(TC時，木聚糖酶XynAl具有87%的活性，木糖苷酶XynBl具有100%的活性，兩者協(xié)同作用效率最高。3)協(xié)同作用效率檢測本實驗以目前可購買到的三種木聚糖燕麥木聚糖(Sigma貨號為X0627)、山毛櫸木聚糖(Sigma貨號為X4252)、樺樹木聚糖(Sigma貨號為X0502)為底物，對上述實施例1中得到的木聚糖酶XynAl和木糖苷酶XynBl進(jìn)行了協(xié)同作用檢測。具體方法為配制木聚糖酶XynAl與木糖苷酶XynBl的協(xié)同作用的反應(yīng)體系(100iU):分別加入燕麥木聚糖、山毛櫸木聚糖、樺樹木聚糖底物至終濃度1%(w/v)，木聚糖酶XynAl終濃度為0.001mg/ml，木糖苷酶XynBl的終濃度為0.OOOOOlmg/ml(陰性對照不加木糖苷酶)，用50mMpH5.6的citrate-sodiumcitrate緩沖液補(bǔ)至100ii1?；靹颍?(TC水浴中反應(yīng)15分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，冰浴終止反應(yīng)，加入150iU的1%DNS試劑(3，5二硝基水楊酸1%;苯酚0.2%;硫酸鈉0.05%;酒石酸鉀鈉20%;氫氧化鈉1%。避光放置兩周后使用。)沸水浴10分鐘，然后在540nm處測定光吸收。以木糖為標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算每分鐘生成lymol還原糖所需酶量，定義為1個酶活力單位。測定結(jié)果參見表1。實施例21.木聚糖酶XynA2的制備將重組菌H1398(構(gòu)建方法見專利200810153077.7)單克隆接入20ml含50yg/mlKan的LB培養(yǎng)基中，37°C，180rpm培養(yǎng)12小時，然后將培養(yǎng)物按1%(v/v)接種量接入200ml含50iig/mlKan的LB培養(yǎng)基，37°C，220rpm培養(yǎng)至0D600為0.6時，加入IPTG至終濃度為0.lmM，在37t:、180rpm誘導(dǎo)3小時。5000rpm離心5min收集菌體，懸于含50mMTris-HCl(pH8.0)緩沖液中，利用超聲波破碎細(xì)胞，14000g離心20min，上清液為醇脫氫酶的粗提液。此上清液經(jīng)螯合瓊脂糖凝膠(ChelatingS印harose)鎳親合柱層析純化，得純ci1)反應(yīng)體系pH的確定上述實施例2中得到的木聚糖酶XynA2和上述實施例1中得到的木糖苷酶XynBl在不同pH下的比活力如圖4所示，從該圖可以看出，只有在pH7.6時，兩者才具有10X的活性，協(xié)同作用效率最高。2)反應(yīng)體系溫度的確定上述實施例2中得到的木聚糖酶XynA2和上述實施例1中得到的木糖苷酶XynBl在不同溫度下的比活力如圖2所示，從該圖可以看出，在6(TC時，木聚糖酶XynA2具有96%的活性，木糖苷酶XynBl具有100%的活性，兩者協(xié)同作用效率最高。3)協(xié)同作用效率檢測本實驗以目前可購買到的三種木聚糖燕麥木聚糖(Sigma貨號為X0627)、山毛櫸木聚糖(Sigma貨號為X4252)、樺樹木聚糖(Sigma貨號為X0502)為底物，對上述實施例2中得到的木聚糖酶XynAl和上述實施例1中得到的木糖苷酶XynBl進(jìn)行了協(xié)同作用檢測。具體方法為配制木聚糖酶XynA2與木糖苷酶XynBl的協(xié)同作用的反應(yīng)體系(100iU):分別加入燕麥木聚糖、山毛櫸木聚糖、樺樹木聚糖底物至終濃度1%(w/v)，木聚糖酶XynA2終濃度為0.001mg/ml，木糖苷酶XynBl的終濃度為0.000001mg/ml(陰性對照不加木糖苷酶)，用50mMpH7.6的glycine-NaOH緩沖液補(bǔ)至100yl?；靹?，在6(TC水浴中反應(yīng)15分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，冰浴終止反應(yīng)，加入150iil的1%DNS試劑(3，5二硝基水楊酸1%;苯酚0.2%;硫酸鈉0.05%;酒石酸鉀鈉20%;氫氧化鈉1%。避光放置兩周后使用。)沸水浴10分鐘，然后在540nm處測定光吸收。以木糖為標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算每分鐘生成1Pmol還原糖所需酶量，定義為1個酶活力單位。測定結(jié)果參見表1。表l木聚糖酶和木糖苷酶的協(xié)同作用7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>從表1可以看出，當(dāng)木聚糖酶XynAl與木糖苷酶XynBl協(xié)同作用或木聚糖酶XynA2與木糖苷酶XynBl協(xié)同作用時，對木聚糖的降解率比木聚糖酶XynAl或木聚糖酶A2單獨(dú)降解木聚糖的效率高，木糖苷酶XynBl單獨(dú)作用時，并不能降解木聚糖。以燕麥木聚糖為底物時(飼料酶角度考慮)，XynA2和XynBl協(xié)同作用后對木聚糖底物的降解率提高最明顯，是XynA2單獨(dú)作用時的8.7倍；以樺樹木聚糖為底物時(適用于造紙)，XynAl和XynBl協(xié)同作用后對木聚糖的降解率是XynAl單獨(dú)作用時的1.9倍。結(jié)果表明，木聚糖酶與木糖苷酶協(xié)同作用可增加木聚糖降解生成木糖的效率，而木糖產(chǎn)率的提高具有巨大的工業(yè)應(yīng)用價值。實施例3工業(yè)應(yīng)用實例由于小麥、大麥、燕麥、黑麥等飼料原料中存在大量的非淀粉多糖，對動物消化吸收存在一定的抗?fàn)I養(yǎng)作用，在飼料中添加多糖降解酶不僅可以將其轉(zhuǎn)化為營養(yǎng)性物質(zhì)，還消除了抗?fàn)I養(yǎng)作用，具有十分重要的意義。Graham等人(1992)研究發(fā)現(xiàn)，高木聚糖活性的半纖維素酶能降低豬飼料成本，減少飼料浪費(fèi)。Choct等人(1992)報道，在肉雞的小麥飼料中，燕麥木聚糖與表觀代謝能，氮沉積、飼料轉(zhuǎn)化率和增重下降相關(guān)，在這些小麥日糧中添加木聚糖酶，表觀代謝能、增重、飼料轉(zhuǎn)化率、蛋白質(zhì)沉積率及糞便都得到了改善。近年來隨著無氯漂白的大力提倡及廣泛應(yīng)用，木聚糖酶也被引入紙漿無氯漂白流程，PedersenJ研究了木聚糖酶的加入對闊葉木(樺木)硫酸鹽漿漂白達(dá)到同樣白度可比原漂白階段減少10%的臭氧用量。我國也廣泛開展了這方面的研究工作，木聚糖酶預(yù)處理用于桉木、松木、蔗渣硫酸鹽漿及麥草漿漂白流程中取得良好效果，陳嘉川等研究發(fā)現(xiàn)木聚糖酶可明顯改善麥草漿的濾水性、脆性、物理強(qiáng)度和白度，減少總有效氯用量。在樺木木聚糖(適用于造紙)。燕麥木聚糖(飼料酶角度考慮)方面，復(fù)合酶水平為1500IU/Kg，木聚糖酶降解程度達(dá)到23.09%，與未加酶處理差異顯著P<0.05。參考文件200810101057.5(應(yīng)用的實際例子)。在詳細(xì)說明的較佳實施例之后，熟悉該項技術(shù)人士可清楚地了解，在不脫離上述申請專利范圍與精神下可進(jìn)行各種變化與修改，凡依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍。且本發(fā)明亦不受限于說明書中所舉實例的實施方式。9權(quán)利要求一種提高半纖維素木聚糖降解率的酶組合物，其特征在于它是由木聚糖酶XynA1或XynA2與木糖苷酶XynB1組成；其中XynA1或XynA2∶XynB1的重量份數(shù)比是1000∶1-2.5。2.權(quán)利要求1所述的酶組合物，其中的兩種木聚糖酶和一種木糖苷酶于嗜熱脫氮芽孢桿菌NG80-2中分離得到。3.權(quán)利要求1所述的酶組合物，其中兩種木聚糖酶和一種木糖苷酶協(xié)同作用的底物包括燕麥木聚糖、樺樹木聚糖、山毛櫸木聚糖中的至少一種。4.權(quán)利要求1所述的酶組合物，其中XynAl或XynA2的濃度為0.001mg/ml，木糖苷酶XynBl的濃度為0.000001mg/ml。5.權(quán)利要求1所述的酶組合物，其中兩種木聚糖酶和一種木糖苷酶協(xié)同作用的反應(yīng)溫度為60-65t:，協(xié)同反應(yīng)pH為5.6-7.6。6.權(quán)利要求5所述的酶組合物，其中XynAl與XynBl協(xié)同反應(yīng)的pH為5.6，XynA2與XynBl協(xié)同反應(yīng)的pH為7.6。7.權(quán)利要求1所述的酶組合物，其特征在于XynAl或XynA2:XynBl的重量份數(shù)比是IOOO:1;木聚糖酶XynAl、XynA2濃度為O.OOlmg/ml;木糖苷酶XynBl的終濃度為0.00000lmg/ml。全文摘要本發(fā)明涉及一種提高半纖維素木聚糖降解率的酶組合物，它是由木聚糖酶XynA1或XynA2與木糖苷酶XynB1組成；其重量份數(shù)比是1000∶1。本發(fā)明公開的兩種木聚糖酶分別與一種木糖苷酶協(xié)同作用于不同木聚糖底物的反應(yīng)體系，反應(yīng)溫度均為60-65℃，XynA1或XynA2與XynB1協(xié)同作用的pH分別為5.6和7.6，兩種酶協(xié)同作用可大大促進(jìn)半纖維素木聚糖的降解率，從而使工農(nóng)業(yè)廢棄物中的木聚糖得到合理的轉(zhuǎn)化，對造紙、能源、醫(yī)藥行業(yè)具有巨大的工業(yè)應(yīng)用價值。文檔編號C12N9/42GK101696401SQ200910071169公開日2010年4月21日申請日期2009年11月5日優(yōu)先權(quán)日2009年11月5日發(fā)明者馮露,李曉敏,王磊申請人:南開大學(xué);