專利名稱：奶牛產(chǎn)奶量相關(guān)基因牛ERα作為分子標記的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
發(fā)明屬于家畜分子標記制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種與奶牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)的基因f/Pc作為奶牛分子 標記的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
我國牛奶和牛肉的生產(chǎn)同發(fā)達國家相比差距較大，主要是因為我國奶牛品種和遺傳品質(zhì)比較差。應(yīng)用 分子標記的現(xiàn)代育種技術(shù)對于提高奶牛的產(chǎn)奶量和改善乳品質(zhì)是先進有效的方法。將靈敏度極高的一些 DNA分析手段應(yīng)用于奶牛育種中，其主要目的是在DNA分子水平上尋找與奶牛產(chǎn)奶性狀密切相關(guān)的遺傳標 記，用于奶牛的標記輔助選擇(Marker Assisted Selection, MAS)，實現(xiàn)早期選擇，加快育種速度。
乳腺發(fā)育主耍受類固醇和多肽類等激素的調(diào)控。雌激素是乳腺細胞進行有絲分裂的有效分裂原，對于 乳腺的正常發(fā)育是必需的(Jose Russo等，2002)。雌激素對靶細胞作用的分子基礎(chǔ)是靶細胞內(nèi)存在一種 能與其特異性結(jié)合的雌激素受體(Estrogen rec印tor，柳(St卿f等，1977)。
雌激素受體(M0是一類由配基激活的轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)大部分已知的雌激素效應(yīng)。屈屬于核受體超家 族的成員，是一種能與雌激素特異性結(jié)合的糖蛋白，具有特異性強、親和力高和結(jié)合容量低的特性，包括
(George et al.， 1996)和f/PA (Eva Enmark等，1997)。 ^S 分布于許多組織，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、 心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、泌尿生殖道、胃腸道、骨組織、腎臟、肺臟和子宮等。多數(shù)學(xué)者認為，雌激素對 乳腺的作用由SPff介導(dǎo)。從初情期開始，乳腺細胞快速生長發(fā)育，這主要由雌激素刺激導(dǎo)管增生和孕酮促 進腺泡發(fā)育引起的。Saji等(2000)用免疫組化法對大鼠乳腺中^ff"和M^的表達水平進行了研究，結(jié)果 發(fā)現(xiàn)初情期前乳腺中表達朋"的細胞約占40%,共同表達2種受體的細胞約占25%;妊娠期，多數(shù)細胞表達 0 》，少數(shù)細胞表達M"，共同表達2種受體的細胞極少；泌乳期，主要是共同表達2種受體的細胞；斷奶 后，表達^ a的細胞較少，共同表達2種受體的細胞極少。雖然現(xiàn)已明確雌激素能促進乳腺導(dǎo)管的發(fā)育， 但其受體在乳腺發(fā)育中的作用還不清楚。
王月影等(2007)對不同發(fā)育期大鼠乳腺組織中雌激素受體a的表達進行了研究'研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，妊 娠期和泌乳期大鼠乳腺中^Z^表達水平均低于處女期，且差異顯著(P<0. 05);整個妊娠過程中，以妊娠12d 最高；泌乳期隨著時間的延長，fifc的表達水平增加，但差異不顯著(P>0. 05)。提示^ c可能參與了乳腺
細胞的發(fā)育和凋亡。
迄今為止尚未見到有關(guān)牛^ c基因作為奶牛產(chǎn)奶性狀的分子標記。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的具體涉及一種與奶牛產(chǎn)奶性狀相關(guān)的基因^ "作為奶牛分子標記的應(yīng)用。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的
申請人通過制備獲得了一個奶牛產(chǎn)奶量相關(guān)基因f" o作為分子標記，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO: l所示，其中在序列表SEQ ID NO: 1的第114bp處有1個T114-A114的堿基突變，導(dǎo)致Z ral-RFLP多 態(tài)性。
其中用于擴增所述基因祝cz和檢測序列表SEQIDNO: 1的第114bp處T-A堿基突變的正、反向引物 對的DNA序列如下所示
正向引物5' CAGGGCTCTCTGGTTCTTTG 3% 反向引物5'GGAGAAGGAGCGTCTTTGTG3'。
本發(fā)明的具體步驟如下
(1) 從被檢牛血液樣本中提取牛血液總DNA;
(2) 根據(jù)報道的牛ERa基因序列(GenBank登錄號AY160683),利用生物學(xué)引物設(shè)計軟件Primer5. 0 和在線引物設(shè)訃Primer3.0,綜合考慮引物設(shè)計的各項原則，設(shè)計引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服 務(wù)有限公司合成。所述引物對的核苷酸序列如下
正向引物5' CAGGGCTCTCTGGTTCTTTG 3'， 反向引物5' GGAGMGGAGCGTCTTTGTG 3'。
(3) PCR反應(yīng)擴增程序為94 。C變性3 min, 35次循環(huán)(94 °C 1 min， 60 °C 1 min， 72 。C 1 min)， 72 'C延伸10 min，得到PCR擴增產(chǎn)物。
(4) 用2. 5°/。瓊脂糖凝膠電泳對步驟(3)的擴增產(chǎn)物進行檢測，所述電泳條件為屯壓100 V，時間為20min, 染色，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察條帶。
(5) PCR產(chǎn)物回收測序，發(fā)現(xiàn)在114位存在突變位點。
(5) 取16 uL PCK擴增產(chǎn)物，加入5 Z ra I限制性內(nèi)切酶和2 y L IOX酶切緩沖液，加水至20 u L, 37 。C,反應(yīng)5 h。
(6) 反應(yīng)完成后，在10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳條件為穩(wěn)壓100 V，電泳時間為4 h，銀染，根據(jù)擴 增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果。
使用PCR擴增得到含有T114-A114 (等位基因突變)SNP位點的ERa基因259bp的片段。由于擴增
引物中引入了一個堿基的錯配，產(chǎn)生了一個酶切位點，導(dǎo)致5rs I -RFLP多態(tài)性。
根據(jù)擴增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果若出現(xiàn)259bp —條帶，判定該基因型為M型；若出現(xiàn)172bp和87bp兩 條帶，判定該基因型為BB型；同時出現(xiàn)259bp、 172bp和87bp三條帶，判定該基因型為GT型。


序列表SEQ ID NO: 1是本發(fā)明作為分子標記用的ER a基因的核苷酸序列 圖l:是本發(fā)明的技術(shù)流程圖。
圖2:用奶牛血樣DNA擴增^ff"基因259bp的片段，瓊脂糖檢測電泳圖。瓊脂糖凝膠濃度為2. 5%。圖中 編號說明如下1， 2， 3， 4， 5泳道分別為5個樣本的PCR擴增產(chǎn)物(25恥p); M泳道DNA分子量標記(100 一600bp)。圖3: 基因259bp測序結(jié)果圖。
圖4: 基因PCR產(chǎn)物經(jīng)Z^3l酶切，基因分型電泳圖。聚丙烯酰胺膠濃度為10%。圖中編號說明如下
泳道l、 2、 8、 9、 10、 ll為AB基因型；泳道3、 4、 5、 6、 7為BB基因型。M泳道DNA分子量標記(100 —600bp)。
具體實施例方式
實施例1 (制備實施例)
1、 奶牛血樣的采集及處理
取奶牛血樣約10niL,加入O. 5 mol/L的EDTA500 u L (使終濃度為25 mmol/L)抗凝，4'C離心(8000 rpm) 10 min,棄上層清，分離白細胞，加入蒸餾水，搖勻，使紅細胞破裂，離心10 min，棄上層清液。重復(fù)兩 次后，在沉淀中加入1XSET 1 raL和lW。十二垸基硫酸鈉(使終濃度為0.5%)，再緩慢加入蛋白酶K (終濃 度為50 100 yg/mL)，置于55 'C水浴鍋消化8 10 h， 4 。C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 2、 從奶牛血樣中提取總NDA
(1) 取消化后的試樣，加入等體積的平衡酚(PH 8.0)，緩慢顛倒離心管10 min， 4 'C, 8000 rpm離 心10 min。
(2) 小心吸取含有DNA的上清液，移至另一離心管中，重復(fù)步驟(1)的操作。
(3) 吸取的上清液中加入等體積的平衡酚/氯仿/異戊醇(體積比為25: 24: 1)，緩慢顛倒離心管10rain, 4 。C， 8000 rpm，離心10 min。
(4) 吸取上清液后加入等體積的氯仿/異戊醇(體積比為24: 1),緩慢顛倒離心管10min， 4 °C 8000 rpm離心10 min。
(5) 吸取上清液，加入1/10體積3 raol/L NaAC及2倍體積的無水乙醇，迅速轉(zhuǎn)動離心管，可見白色的 絮狀物，艮陽NA， -20 。C放置30 min。
(6) 取出冷凍后的樣品，于10000 rpm轉(zhuǎn)速離心5 8 min，去掉上層乙醇，加入70%的乙醇1 raL洗滌 沉淀，80000 rpm離心5 8 min。
(7) 加入70%的乙醇重復(fù)洗滌一次，80000 rpm離心5 8 min。
(8) 棄去乙醇，在室溫下?lián)]發(fā)殘留乙醇，加入適量的TE溶解DNA，存放于-20 'C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 3、 引物設(shè)計
根據(jù)牛^7ftf基因序列(GenBank登錄號NC_007307)，利用生物學(xué)引物常用設(shè)計軟件Premier 5,設(shè) 計引物，由上海生丁.生物工程技術(shù)有限公司合成。 該引物對的核苷酸序列如下 正向5' CAGGGCTCTCTGGTTCTTTG 3', 反向5' GGAGMGGAGCGTCTTTGTG 3'。
4、 PCR擴增反應(yīng)
PCR反應(yīng)總體積為25 u L (見表l)。擴增程序是94 'C變性3 min， 35次循環(huán)(94 'C 1 min， 60 °C 1 min, 72 'C 1 min)， 72 。C延伸10 min。表l 本發(fā)明的PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系體積(n L)
10X buffer2.5
祝c正向引物1
祝c反向引物1
Tag酶(2U/P 1)0.5
d證(10 nM each)0.5
模板DNA1.5
ddHO 218
Total25
取2 PL PCR產(chǎn)物，2.5%瓊脂糖凝膠電泳(100 V，電泳20 min)，溴化乙錠染色后，在凝膠成像系統(tǒng) 觀察條帶，PCR擴增產(chǎn)物片段大小應(yīng)為259bp。 5、 PCR產(chǎn)物回收及測序
PCK擴增產(chǎn)物經(jīng)1. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示均為特異的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物回收純化后測序， 測序結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物的長度為259bp。電泳圖譜見圖2
測序結(jié)果表明在這兩個片段的114bp處有l(wèi)個堿基突變(即T114-A114)，測序峰參見圖3。
6、 酶切反應(yīng)
取16uL PCR擴增產(chǎn)物，加入5 Z ral限制內(nèi)切酶和2uL IOX酶切緩沖液，該緩沖液購自寶生物工程 (大連)有限公司，加水至20"L， 37。C反應(yīng)5h。
7、 酶切產(chǎn)物檢測
10%聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠電泳(技術(shù)參數(shù)穩(wěn)壓IOO V,電泳4 h)，銀染。具體染色方法如下
(1) 電泳完畢，取下玻璃板，小心地將凝膠從玻璃板上剝離下來，放入雙蒸水中漂洗一次，然后浸入10% 乙醇溶液固定5 10 min。
(2) 用1%硝酸脫色3 8 min，然后雙蒸水迅速漂洗一次。
(3) 0.2%硝酸銀晃動閉光染膠15 25 min;染色結(jié)束后用雙蒸水快速沖洗凝膠兩次(每次10s),洗去凝 膠表面殘留的硝酸銀溶液。
(4〕在染膠盒中倒入含3呢Na2C03和微量甲醛的顯色液，立即快速地晃動膠盒，避免析出的黑色銀顆粒在凝 膠表面沉積。顯色液顏色變暗時立即更換新鮮的顯色液。 (5)注意觀察顯色情況，目的條帶顯現(xiàn)淸晰后立刻將凝膠轉(zhuǎn)入3%的乙酸溶液，浸泡IO min停顯。 8、基因型鑒定
CVM基肉型鑒定結(jié)果如圖3所示，在ERa基因的PCR-RFLP酶切產(chǎn)物電泳圖譜中，若只出現(xiàn)259bp—條帶， 判定基因型為AA型；若出現(xiàn)172bp和87bp兩條帶，判定基因型為BB型；同時出現(xiàn)259bp、 172bp和87bp三條 帶，判定基因型為AB型。
6實施例2 (應(yīng)用實施例)
對祝a基因多態(tài)位點不同基因型與奶牛產(chǎn)奶量性狀進行了關(guān)聯(lián)分析的檢測應(yīng)用。牛for基因Dral 酶切多態(tài)位點關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表1和表2。由表1和表2中可以得出2種基因型間對奶牛產(chǎn)奶量的影響有 達到顯著差異(P<0. 05)。 BB型的產(chǎn)奶量比AB的型的要高，BB型優(yōu)勢個體。同時BB型的個體數(shù)也比AB 型的多，這也有可能是B等位基因有優(yōu)良效果對選擇育種影響的結(jié)果。
_^_利用最小二乘法分析各變因?qū)Ξa(chǎn)奶量的影響_
變因 自由度 平方和 均方 F P值
41. 74** <. 0001 5. 49" <■ 0001
1.88 0.1126
4. 24* 0. 0402
注，表示P〈0. 05，差異顯著；"表示P〈0. 01,差異極顯著
表2 牛&g基因"ra I酶切多態(tài)性與產(chǎn)奶量的統(tǒng)計分析_
^~ 觀察數(shù) "~產(chǎn)奶量
AB 78 5942. 18 ±1162.55'
BB 190 6213.77 ±1305.99'
注具有相同字母表示差異不顯箸(P>0. 05),字母不同表示差異顯著(P<0. 05)。
由表1和表2中可以得出三種基因型間對奶牛產(chǎn)奶量的影響沒有達到顯著差異(P〉0.05)， BB基因型
個體的產(chǎn)奶量最高，而AB基因型的個體最低。
表3牛五r"基因"ra I酶切多態(tài)性與乳脂率和乳蛋白率的統(tǒng)計分析
記錄數(shù)基因型
AA ABBB
乳脂率1323. 616±0.453a3. 920±0. 239a
乳蛋白率1322. 847±0. 443°3. 024±0. 241a
注具有相同字母表示差異不顯著(P>0. O5)，字母不同表示差異顯著(P<0. 01).
有表3可知Er a不同的基因型對乳脂率和乳蛋白率的影響不顯著平(P〉0. 05),但是BB型的乳脂率和 乳蛋白率都要比AB型的要高。
參考文獻
1.王月影，范光麗，楊國宇等.不同發(fā)育期大鼠乳腺組織中雌激素受體A的表達.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué) 報(自然科學(xué)版).2007， 35 (3) : 53-56
場
年、季節(jié) 胎次 基因型
53849167. 7453849167. 74
合計
12 4 1
367 385
84975634.70
9722537. 18
5466863. 33
473476934. 2 627491137. 1
7081302. 89
2430634. 29
5466863. 33
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<221〉 gene <222〉 (1).. (259) 〈223〉 <220>
<221> primer—bind <222> (251). . (259) <223〉 <，>
<221> primer—bind <222〉 (1)..(19) <223> <220〉
<221〉 mutation <222〉 (114).. (114) <223〉 ■> 1
cagggctctc tgg"ctUg tgtctgaggc tcagtagttg agatcagtga gatcaaagtt 60 gcttttccat aac朋gccca acgctcatcfi朋ggcatctg tgtttgacat tagaaaatgc 120 tagccaagat gtcaggtggc tggtggaagc attcacaggt tctggtgttt tta卿ttgg 180 3C3Bctgt3t atttcEic卿3鄉(xiāng)tggtsc幼ggcatccs tttgc胡gtc ttg肪33cac 240 acaaagacgc tccttctcc 259
權(quán)利要求
1、奶牛產(chǎn)奶量相關(guān)基因ERα作為分子標記的應(yīng)用，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，其中在序列表SEQ ID NO1的第114bp處有1個T114-A114的堿基突變，導(dǎo)致Dra I-RFLP多態(tài)性。
2、 一種作為分子標記應(yīng)用的與奶牛產(chǎn)奶量相關(guān)的ERa基因片段，它的核苷酸序列如序列 表SEQ ID NO: 1所示，其中檢測序列表SEQ ID NO: 1的第114bp處T-A堿基突變的正、 反向引物對的DNA序列如下所示正向引物5， CAGGGCTCTCTGGTTCTTTG 3，， 反向引物5 ， GGAGAAGGAGCGTCTTTGTG 3'。
全文摘要
本發(fā)明屬于家畜分子標記制備技術(shù)領(lǐng)域。具體公開了一種奶牛產(chǎn)奶量相關(guān)基因ER α片段作為分子標記的應(yīng)用。所述基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，其中在序列表SEQ ID NO1的第114bp處有1個T114-A114的堿基突變，導(dǎo)致Dra I-RFLP多態(tài)性。同時公開了擴增所述基因和檢測序列表SEQ ID NO1的第114bp處T-A堿基突變的正、反向引物對的DNA序列。本發(fā)明為奶牛分子標記輔助選擇提供了一種新標記。
文檔編號C12Q1/68GK101525663SQ20091006166
公開日2009年9月9日 申請日期2009年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月20日
發(fā)明者勇 余, 姜勛平, 張淑君, 彭開華, 戴紅安, 楊利國, 俊 梅, 胡修忠, 陶利文, 霍立軍 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)