專利名稱：DSN法直接獲得差異表達基因全長cDNA的改良消減雜交方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離差異基因的方法，尤其涉及到一種可以一次性獲取整個cDNA 的DSN法直接獲得差異表達基因全長cDNA的改良消減雜交方法。
背景技術(shù)：
目前，基因功能方面的研究是生命科學(xué)領(lǐng)域研究的重要課題，其核心內(nèi)容包括闡 明未知基因的功能和鑒定已知基因的新功能兩個層面，但無論如何，與獨特的生物學(xué)現(xiàn)象 相聯(lián)系，研究兩個或多個來源密切相關(guān)的生物系統(tǒng)之間基因表達的差異已成為揭示基因 功能的重要環(huán)節(jié)或有效途徑，隨著人類基因組計劃的順利實施和快速發(fā)展，不僅使人類 解讀了大量前所未有的自身遺傳信息，更重要的是其直接促進了一些革命性生物學(xué)技術(shù) 的誕生，這些技術(shù)的產(chǎn)生對生命科學(xué)研究的多方面都起到了推動作用；近年來，先后產(chǎn)生 了一系列研究基因差異表達的方法，如rnRNA差異顯示法(DDRT PCR)、代表性差異顯示 分析((representation difference analysis, cDNA-RNA)禾口差異蹄選((differential screening)等，雖然通過利用這些方法相繼克隆出一些新基因或者差異表達基因，但是 這些方法存在操作繁瑣，假陽性高以及上調(diào)表達難于分析等缺點，1996年Diatchenko等 提出了一種可以克服上述缺點的克隆基因新方法，即抑制消減雜交技術(shù)(suppression subtractive hybridization, SSH)；抑制消減雜交法(SSH)是抑制PCR與消減雜交技術(shù)相 結(jié)合的更簡單快速的分離差異基因的方法，以Clontech的PCR-Select cDNA Subtraction Kit為例將樣品(tester)和對照(driver)的mRNA分別反轉(zhuǎn)錄并合成為雙鏈cDNA后進行 酶消化，樣品(tester)分為兩組，分別加上不同的adapt0rl/2R，再將兩組樣品(tester)分 別與過量的對照(driver)雜交，兩份雜交結(jié)果混合，加入過量的對照再進行第二輪雜交， 補齊adaptor然后用PCR選擇性擴增，由于過量的對照封閉了在樣品中共同表達的基因，而 在樣品中特異表達的基因會被選擇性地擴增出來，這些擴增的片斷經(jīng)過克隆、測序后可以 進行拼接或者用RACE的方法從已知片斷釣全長cDNA，再做進一步的分析，但是這一系列的 操作并不簡單，且得到的結(jié)果是一些基因片斷，還需要進行下一步的拼接或RACE才能得到 完整的基因信息。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中抑制消減雜交法不能一次獲取整個cDNA的問題，本發(fā)明提 供了一種DSN法直接獲得差異表達基因全長cDNA的改良消減雜交方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的DSN法直接獲得差異表達基因全長cDNA的改良消減雜交方法，其基本原理是利 用特異降解雙鏈DNA的酶(DSN)來降解雜交過程中形成的雙鏈，從而獲得差異表達基因全 長cDNA ；本發(fā)明利用Cap-finder法來合成雙鏈cDNA，實驗組和對照組分別作為tester和 driver進行反轉(zhuǎn)錄，作為tester時用3 ‘ poly A尾和5 ‘ -GGG帽結(jié)構(gòu)分別在cDNA兩端
4加上序列相同的錨定引物，采用帶錨定序列的反轉(zhuǎn)錄引物，序列為5' -AAGCAGTGGTAACAA C GCA GA GTACT(30)N21N-3'，使cDNA 3'末端引入錨定序列，同時在反應(yīng)體系中加入根 據(jù)5 ‘帽結(jié)構(gòu)計的5 ‘錨定引物，序列為5 ‘ -AA GCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGG-3 ‘，使 cDNA 5'末端引入錨定序列，3'和5'的錨定序列是完全相同的，反轉(zhuǎn)錄酶為無RNA酶H活 性的superscript II，對照組(driver)用普通反轉(zhuǎn)錄方法反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA與實驗 組的cDNA進行雜交，雜交結(jié)束后加入DSN酶進行消化，消化后進行純化即獲得實驗組的差 異表達cDNA，這時利用錨定引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物連接T載體，然后進行轉(zhuǎn)化獲得陽 性克隆，接下來可進行斑點雜交步驟同傳統(tǒng)SSH。
本發(fā)明利用特異降解雙鏈DNA的酶(DSN)來降解雜交過程中形成的雙鏈，可以直 接獲得全長cDNA，使整個操作過程有了很大的簡化，獲得功能基因的速度大大加快；雜交 后未雜交上的實驗組單鏈cDNA可直接作為模板被擴增，所以差異基因被擴增的幾率大大提尚。


圖1為本發(fā)明的流程圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細說明參照附圖1，DSN法直接獲得差異表達基因全長cDNA的改良消減雜交方法，其步驟 主要由cDNA的合成和差減雜交兩部分組成，其具體實施步驟如下LcDNA 的合成1. 1 實驗組(tester) cDNA —鏈合成首先用3 ‘ poly A尾和5 ‘ -GGG帽結(jié)構(gòu)分別在cDNA兩端加上序列相 同的錨定引物，采用帶錨定序列的反轉(zhuǎn)錄引物，序列為5 ‘ -AAGCAGTGGTAACAA C GCA GA GTACT(30)N21N-3 ‘，使cDNA 3 ‘ 末端引入錨定序列，序列為5 ‘ -AA GCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGG-3‘ JicDNA 5'末端引入錨定序列。1)取一個0. 5ml的無菌離心管，依次加入以下試劑mRNA(2y g/μ 1)1 μ 13，端引物(10 μ Μ)1μ 15，端引物(10 μ Μ)1μ 1Deionized Η202μ 1Total Volume5 μ 12)充分混勻，輕微離心。3) 65-75 °C溫育 2_4min，冰浴 2min 左右。4)輕微離心，使之沉底。5)再加入以下試劑5X First-Strand Buffer2 μ 1DTT (20mM)1 μ 1dNTP MixdOmM of each dNTP)1 μ 1
SuperScript II1 u 16)用移液器吸打混勻，在離心機上輕甩一下。7)滴一滴礦物油覆蓋液面，在42°C水浴鍋中反應(yīng)1. 5hr。8)反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，放置冰上終止反應(yīng)，-20°C冰箱中保存cDNA第一鏈或立即進行 第二鏈的合成。1. 2cDNA 二鏈合成1)加入下列試劑48. 4u 1DEPC H2016 ill5 X Second-Strand Buffer1.6 illdNTP Mix(lOmM)4yl20XSecond-Strand enzyme cocktail彈指混勻，短暫離心。2)放到已預(yù)冷(16°C )的PCR儀上，反應(yīng)2hr。3)加入 2 ill T4 DNA Polymerase (6U)，彈指混勻，短暫離心。4)放到已預(yù)冷(16°C )的PCR儀上，反應(yīng)30min左右。5)力口入 4ii 1 20XEDTA/Glycogen Mix 終止反應(yīng)。
1.3 對照組(driver) cDNA 一鏈合成1)在0. 2-ml PCR管中加入以下試劑x u 1 mRNA (2 u g)1 ]i 1 cDNA synthesis primer加DEPC水補充體積到5 ill，彈指混勻，短暫離心。2)PCR 儀上 70-75°C反應(yīng) l_3min，冰浴 2min 左右，3000rpm 離心 30sec。3)上述0. 2-ml PCR管中加入下列試劑2 ill 5 X First-Strand Buffer1 u 1 dNTP Mix(lOmM)1 u 1 DEPC H201u 1 AMV Reverse Transcriptase(20U/u 1)彈指混勻，短暫離心。4) PCR儀上40-45°C反應(yīng)1. 5hr，冰浴4_6min，立即進行二鏈cDNA合成反應(yīng)。1. 4 對照組(driver) cDNA 二鏈合成1)加入下列試劑48. 4u 1 DEPC H2016u 15X Second-Strand Buffer1.6 illdNTP Mix(lOmM)4yl20XSecond-Strand enzyme cocktail彈指混勻，短暫離心。2)放到已預(yù)冷(16°C )的PCR儀上，反應(yīng)2hr。3)加入 2 ill T4 DNA Polymerase (6U)，彈指混勻，短暫離心。4)放到已預(yù)冷(16°C )的PCR儀上，反應(yīng)30min。
5)力口入 4 μ 1 20XEDTA/Glycogen Mix 終止反應(yīng)。1. 5cDNA 純化1)上述二鏈產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至1. 5ml離心管中，加入250 μ 1 Binding buffer，混勻。2)將上一步所得溶液加入到吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，IOOOOg離心 lmin，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中。3)向吸附柱中加入500 μ 1洗脫緩沖液，IOOOOg離心lmin，倒掉廢液，離心Imin以 徹底去除洗脫液，將吸附柱轉(zhuǎn)入新的收集管中。4)向吸附柱中加入10μ1預(yù)熱至50-55°C的DEPC H2O,室溫放置2min，IOOOOg離 心 1. 5min。5)再加入 10 μ 1 預(yù)熱至 50-550C 的 DEPC H2O,室溫放置 2min，IOOOOg 離心 1. 5min。1.6準(zhǔn)備用于差減雜交的雙鏈cDNA1)取出700-1400ng純化的cDNA到一個新的1. 5ml離心管中，將剩下的_20°C保存。2)加入0. 1倍體積3mol/L的NaAc (pH4. 8)，2. 5倍體積的100%的乙醇，輕輕混勻。3) 14000rpm,室溫，離心 15 分鐘。4)小心吸取上清。5)輕輕加入100 μ 1 98%的乙醇。6) 14000rpm,室溫，離心 5 分鐘。7)小心棄掉上清。8)重復(fù) 5-7 步 1 次。9)將cDNA沉淀室溫下干燥15分鐘。10)將得到的 cDNA 稀釋成 100_150ng/y 1。11)取1 μ 1瓊脂糖凝膠電泳檢測。12)將cDNA放到冰上，準(zhǔn)備下一步實驗。2.差減雜交2. 1 雜交1)對于每個樣品，在1. 5ml的離心管中加入以下成分實驗組ds cDNA 2 μ 1對照組ds cDNA 10 μ 14Χ Hybridization buffer 4 μ 1Total volume 16 μ 12)混勻，短暫離心。3)將每個樣品分成4等份，分別加到4個PCR管中，具體做法如表1。4)每個PCR管中加入兩滴礦物油，室溫，HOOOrpm離心2分鐘。5) 98 °C 溫浴 2 分鐘。6)68°C溫浴5個小時，然后，盡量快地進行下一步實驗。Table 2—1 Setting up DSN treatment 表 12. 2DSN 處理1)準(zhǔn)備1/2倍(1 μ 1 DSN保存液和1 μ 1 DSN反應(yīng)液混勻)、1/4倍稀釋的DSN(3 μ 1 DSN保存液和1 μ 1 DSN反應(yīng)液混勻)，冰上放置。2) 68 0C DSN 預(yù)熱 DSN master buffer 3)在每個PCR管中加入5μ 1預(yù)熱的DSN master buffer，混勻，短暫離心收集，快 速地放回68 °C。4) 68 °C 保溫 10 分鐘。5)根據(jù)表中所示，分別加入各個組份。68°C保溫25分鐘。6)每管加入10 μ 1終止液(stop solution)，混勻，短暫離心。7) 68 °C 保溫 5 分鐘。8)將PCR管放到冰上。9)加入20 μ 1滅菌水，混勻。2. 3對DSN處理的樣品進行PCR擴增1)對于每個樣品，在滅菌的PCR管中加入以下組份cDNA (DSN 處理后)1 μ 1ddH20 40. 5 μ 1IOXAdvantage 2PCR Buffer 5μ 150 XdNTP Mix(10mM of each dNTP) 1 μ 1Evrogen PCR primer Ml 1. 5 μ 150XAdvantage 2 Polymerse Mix 1 μ 1Total volume 50 μ 12)混勻，短暫離心。3)按照下面的PCR程序進行PCR擴增95 "C 7 #66°C20 秒72°C4 分鐘4)將所有的樣品全部進行12個PCR循環(huán)。5)取5 μ 1樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
2. 4PCR產(chǎn)物純化1)在PCR反應(yīng)液中，加入5倍體積的Buffer PBI，混勻。2)將QIAquick柱置于2ml收集管中。3) IOOOOg離心lmin，棄濾液，將QIAquick柱置回2ml收集管中。4)加入 0.75ml PE buffer，將 QIAquick 柱置于 2ml 收集管中。5) IOOOOg離心lmin，將QIAquick柱置于一新的1.5ml離心管中。6)加入 50ml EB buffer, IOOOOg 離心 lmin。2. 5用Chroma SPIN-400將cDNA按分子大小分級分離1)取16支1. 5ml管，按順序標(biāo)號排列。2)準(zhǔn)備 Chroma SPIN-400 柱A從冰箱中取出Chroma SPIN-400管，室溫預(yù)熱至少lhr，將柱子顛倒幾次，使填料
完全懸浮。B將柱子的氣泡趕走，用Iml的槍輕輕吸打懸浮填充物，注意避免產(chǎn)生氣泡，打開 柱子底部塞帽，使柱中溶劑自然下滴。C將柱子固定。D讓柱中貯藏的緩沖液按壓力作用流出，直到露出填充物的表面，填充物的頂部應(yīng) 在柱子管壁的1. Oml刻度處(若太少應(yīng)補充)。E液流的速度應(yīng)在每40 60s 1滴，液滴的體積應(yīng)是每滴40 μ 1，如果流速太慢 (即每滴超過100s)并且液滴的體積太小(如小于25 μ 1)，需要重新裝柱。3)當(dāng)貯藏緩沖液流完，沿著柱子內(nèi)壁小心加入700 μ 1 column buffer到柱頂部， 并使其流出。4)當(dāng)緩沖液停止流出(15 20min)后，小心、平緩地上樣(100 μ 1酶切并加有染 料的cDNA)到填充物頂部中心，填充物不平的表面不會影響氣候的分部過程。5)在下面步驟操作前讓樣品完全進入填充物，不應(yīng)有液體在表面。6)輕輕加入 100 μ 1 column buffer 洗柱。7)讓buffer流出，直到在樹脂中沒有剩余。8)將準(zhǔn)備好的收集管放到柱下并使1號管對準(zhǔn)柱的下口。9)加入600μ1 column buffer，立即開始用準(zhǔn)備的16支管收集，每管一滴，蓋好
管蓋，收完16管后蓋上柱子的上蓋。10)用1. 1 %的瓊脂糖檢測各管(每管3 μ 1)，150V，IOmin,在紫外燈下辨別每管 cDNA帶峰，收集含有cDNA的最先三管。11)在含有cDNA的3 4分部混合樣管(125 μ 1)中加NaAc (3Μ, ρΗ4· 8) 12. 5 μ 1glycogen(20mg/ml) 1. 3μ 195% 乙醇(_20°C) 347 μ 112)輕輕地前后搖勻。13)將管放置_20°C過夜。14)室溫離心14000rpm，20min。16)小心吸出上清液，不要攪動沉淀。0156]17)短暫離心，使殘余的液體集中到管底。
0157]18)小心吸出所有的液體，沉淀空氣中干燥lOmin。
0158]19)用7 ill去離子水溶解沉淀，并輕輕混勻。
0159]2. 6處理后dscDNA與T載體連接
0160]如下所述配制連接反應(yīng)體系
0161]1)取干凈的0. 5m離心管，依次加入個各組分。
0162]各取80ng 二次PCR純化擴增產(chǎn)物，按如下體系配制反應(yīng)
0163]2X Ligation Buffer5u 1
0164]T Vector (50ng/u 1)1 u 1
0165]PCR product (80ng)Xu 1
0166]T4D NA Ligase1 u 1
0167]7jCup to 10 u 12)4°C 或 16°C 連接過夜。2. 7 轉(zhuǎn)化a.取200 ill感受態(tài)宿主菌(DH-5 a )至滅菌的5ml離心管中，放置冰水浴融化。b.加入上述1 P 1連接液，輕輕混勻后置于冰上45min。c. 42°C水浴熱休克90s，迅速放入冰上2min。d.加入2ml LB培養(yǎng)基(不含抗生素)，37°C搖床，轉(zhuǎn)速彡150rpm，復(fù)蘇45min。e. 3000rpm 離心 lOmin 收菌，用 250 ii 1 LB 重懸。f.取200 ill菌液涂布于15cm培養(yǎng)皿上(ApLlPTG/x-gal LB固體培養(yǎng)基)，37°C 過夜。2. 8PCR鑒定差減文庫的克隆插入片斷大小a.每個文庫隨機挑取384個白斑克隆。b. 250rpm，37°C搖菌過夜。c.各取1 ill菌液作為擴增模板。d.如下表2加入PCR試劑，混勻振蕩混勻，短暫離心。e.PCR儀進行反應(yīng)，按以下循環(huán)條件94°C 5min 72 V 7min 表22. 9斑點雜交2.9. 1點膜及膜處理a.根據(jù)表3中的方陣點膜，每個點各取0.6μ1 PCR產(chǎn)物(插入片斷鑒定PCR產(chǎn) 物)。 表3b.變性 5min (變性液0. 5M NaOH, 1. 5M NaCl)。c.中和兩次，每次 IOmin (中和液:1M Tris-HCl (ρΗ7· 4)，1. 5Μ NaCl)。d.洗滌 5min (洗滌液2 X SSC)。e.風(fēng)干后80°C烘烤2小時后備用。2. 9. 2探針標(biāo)記及純化(具體可參考Strip-EZ DNA Kit說明書)a.取探針5μ1(50ι^)+引物5μ1 (二輪差減PCR產(chǎn)物用RsaI酶切后純化即為探 針)。b. 95°C 100°C 水浴 5min。c.彈勻，spin，室溫放置。d. Milli-Q-H20 16 μ 1, dCTP, dGTP, dTTP # 4μ 1, Reaction Buffer5 μ 1, Enyzme2μ 1。 e.加入 32P α -dATP 5 μ 1 然后混勻。f.放入電熱恒溫水浴鍋內(nèi)37 °C，1小時。g.將探針取出后快速離心，然后加入2μ l(500mmol)EDTA(以終止反應(yīng))。
h.取探針1 μ 1稀釋至100 μ 1。i.取一純化柱(G-50)套上 1. 5ml 離心管 3000rpm, Imin0j.取出純化柱換一離心管，打開純化柱將探針移入純化柱內(nèi)2500rpm，2min。
k.棄柱取純化好探針1 μ 1稀釋至100 μ 1。1.各取1 μ 1點于濾紙表面，然后經(jīng)探測器探測后計算摻入率和放射強度。2. 9. 3預(yù)雜交和雜交(具體可參考Ultrahyb說明書)a.膜在預(yù)雜交液中68°C預(yù)雜交2至3hr。b.將探針 100°C水浴 5min，迅速冰浴 3min，spin。c.將探針加入到5ml雜交液中，混勻。d.從雜交爐中取出雜交管打開瓶蓋移出預(yù)雜交液，立即加入雜交液蓋緊瓶蓋放入 雜交爐內(nèi)雜交過夜(14hr)。2. 9. 4 洗膜a.打開雜交爐取出雜交管，打開雜交管移出雜交液迅速用洗液1沖洗一遍。b.洗液 2 于 25°C洗 15min，洗 2 次。c.取出尼龍膜測試信號強度，若本底較高(大于20COimtS)必須再次清洗。d.洗液3于45V洗15min，洗2次，測試本底。e.若本底無明顯變化，洗液3于50°C洗15min，洗2次。f.取出雜交膜測試放射強度本底，將膜放入保鮮袋內(nèi)封口后壓片過夜。g.掃描圖像，信號定量并分析實驗結(jié)果。
權(quán)利要求
DSN法直接獲得差異表達基因全長cDNA的改良消減雜交方法，其特征在于整個步驟總體分為cDNA的合成和差減雜交兩個部分，具體步驟如下1)反轉(zhuǎn)錄合成實驗組(tester)cDNA一鏈和二鏈，mRNA為模板，用3′poly A尾和5′-GGG帽結(jié)構(gòu)分別在cDNA兩端加上序列相同的錨定引物，采用帶錨定序列的反轉(zhuǎn)錄引物，序列為5′-AAGCAGTGGTAACAA C GCA GA GTACT(30)N21N-3′，使cDNA 3′末端引入錨定序列，同時在反應(yīng)體系中加入根據(jù)5′帽結(jié)構(gòu)計的5′錨定引物，序列為5′-AA GCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGG-3′，使cDNA 5′末端引入錨定序列，3′和5′的錨定序列是完全相同的，采用無RNA酶H活性的SuperScript II反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成實驗組(tester)cDNA鏈，同時對照組(driver)cDNA一鏈和二鏈用普通反轉(zhuǎn)錄方法反轉(zhuǎn)錄；2)進行cDNA純化獲得用于雜交的雙鏈cDNA；3)雜交將步驟(1)中反轉(zhuǎn)錄后的對照組cDNA與實驗組的cDNA進行雜交；4)DSN處理準(zhǔn)備1/2倍、1/4倍稀釋的DSN，冰上放置，68℃預(yù)熱DSN master buffer，在每個PCR管中加入5μl預(yù)熱的DSN master buffer，混勻，短暫離心收集，快速地放回68℃，68℃保溫10分鐘，每管加入10μl終止液(stop solution)，混勻，短暫離心，68℃保溫5分鐘，將PCR管放到冰上，加入20μl滅菌水，混勻；5)PCR擴增及PCR產(chǎn)物純化把DSN處理后的樣品進行PCR擴增，用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，再對PCR產(chǎn)物進行普通方法純化并分級分離后獲得實驗組的差異表達cDNA；6)cDNA與T載體連接；7)轉(zhuǎn)化與PCR鑒定差減文庫的克隆插入片斷大小將上一步驟中cDNA與T載體連接過的cDNA轉(zhuǎn)化獲得陽性克?。?)斑點雜交采用步驟同傳統(tǒng)SSH，對最終獲得的序列進行測定和分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DSN法直接獲得差異表達基因全長cDNA的改良消減雜交方 法，其特征在于第一個步驟中所述的反轉(zhuǎn)錄合成實驗組(tester) cDNA—鏈，是在0. 5ml 的無菌離心管中加入以下反應(yīng)體系1 mRNA(2ug/u l),lu 1 3’端引物(10 y M)， lu 1 5，端引物(10 iiM)，2 ill Deionized H20, 5 u 1 Total Volume，充分混勻，輕微離心， 65-75 V溫育2-4min，冰浴2min左右，輕微離心，使之沉底，再加入以下反應(yīng)體系2 yl 5X First-Strand Buffer, 1 u 1DTT, 1 u 1 dNTP Mix, 1 yl 反轉(zhuǎn)錄酶 SuperScript II 或 其它等效反轉(zhuǎn)錄酶，用移液器吸打混勻，在離心機上輕甩一下，滴一滴礦物油覆蓋液面，在 42°C水浴鍋中反應(yīng)1.5hr，反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，放置冰上終止反應(yīng)，置于-20°C冰箱中備用；所 述的實驗組(tester) cDNA 二鏈合成，是在一鏈中加入以下反應(yīng)體系48. 4 ill DEPC H20， 16 ill 5 X Second-Strand Buffer, 1. 6 u 1 dNTP Mix,4u 1 20 X Second-Strandenzyme cocktail，彈指混勻，短暫離心，放到已預(yù)冷(16°C)的PCR儀上，反應(yīng)2hr，加入2 ill T4 DNA Polymerase (6U)，彈指混勻，短暫離心，放到已預(yù)冷(16°C )的PCR儀上，反應(yīng)30min左右，加 入 4iil 20XEDTA/Glycogen Mix 終止反應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DSN法直接獲得差異表達基因全長cDNA的改良消減雜交方 法，其特征在于步驟(2)中所述的cDNA純化，其步驟為上述cDNA 二鏈產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至1. 5ml 離心管中，加入250iilBinding buffer，混勻；將所得溶液加入到吸附柱中(吸附柱放入收 集管中)，10000g離心lmin，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中；向吸附柱中加入500 yl洗脫緩沖液，IOOOOg離心lmin，倒掉廢液，離心Imin以徹底去除洗脫液，將吸附柱轉(zhuǎn)入新的 收集管中；向吸附柱中加入10 μ 1預(yù)熱至50-55°C的DEPC H2O,室溫放置2min，IOOOOg離心`1.5min ；再加入 10 μ 1 預(yù)熱至 50-55°C 的 DEPC H2O,室溫放置 2min, IOOOOg 離心 1. 5min ；步 驟(2)中所述的用于雜交的雙鏈cDNA，其制備步驟如下取出700-1400ng純化的cDNA到 一個新的1. 5ml離心管中，將剩下的_20°C保存；加入0. 1倍體積3mol/L的NaAc (pH4. 8)，`2.5倍體積的100%的乙醇，輕輕混勻；14000rpm，室溫，離心15分鐘；小心吸取上清；輕輕 加入100 μ 1 98%的乙醇；14000rpm，室溫，離心5分鐘；小心棄掉上清；重復(fù)上三步1次；將 cDNA沉淀室溫下干燥15分鐘；將得到的cDNA稀釋成100-150ng/ μ 1 ；取1 μ 1瓊脂糖凝膠 電泳檢測；將cDNA放到冰上備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DSN法直接獲得差異表達基因全長cDNA的改良消減雜交方 法，其特征在于步驟(3)中所述的雜交，是在1.5ml的離心管中加入以下成分2μ1實驗 組 ds cDNA, 10μ 1 對照組 dscDNA，4y 1 4X Hybridization buffer, 16 μ 1 Total volume, 混勻，短暫離心，將每個樣品分成4等份，每個PCR管中加入兩滴礦物油，室溫，HOOOrpm離 心2分鐘，98 °C溫浴2分鐘，68 °C溫浴5個小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DSN法直接獲得差異表達基因全長cDNA的改良消減雜交方 法，其特征在于步驟⑷中所述的1/2倍稀釋的DSN為混勻的Ιμ DSN保存液和Ιμ DSN反應(yīng)液，所述的1/4倍稀釋的DSN為混勻的3 μ 1 DSN保存液和Iyl DSN反應(yīng)液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DSN法直接獲得差異表達基因全長cDNA的改良消減雜交方 法，其特征在于步驟(5)中所述的PCR擴增，是在滅菌的PCR管中加入以下組份1μ 1 DSN 處理后 cDNA，40. 5μ 1 ddH20，5yl IOXAdvantage 2 PCR Buffer, 1 μ 1 50XdNTP Mix, 1.5 μ IEvrogen PCR primer Ml,1 μ 1 50 XAdvantage 2 Polymerse Mix,50 μ 1 Total volume,混勻，短暫離心，擴增參數(shù):95°C 7秒，66°C 20秒，72°C 4分鐘，進行12個PCR循環(huán)， 取5 μ 1樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DSN法直接獲得差異表達基因全長cDNA的改良消減雜 交方法，其特征在于步驟(6)中所述的cDNA與T載體連接，是在干凈的0. 5m離心管中 依次加入以下體系配制反應(yīng)5μ 12XLigation Buffer, 1 μ 1 T Vector (50ng/μ 1), PCR product (80ng)，1 μ 1 Τ4 DNA Ligase，1 μ 1-10 μ 1 水，4°C或 16°C連接過夜。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DSN法直接獲得差異表達基因全長cDNA的改良消減雜交方 法，其特征在于步驟(7)所述的轉(zhuǎn)化，其步驟為取200 μ 1感受態(tài)宿主菌(DH-5ci)至滅 菌的5ml離心管中，放置冰水浴融化；加入上述1 μ 1連接液，輕輕混勻后置于冰上45min ； 42°C水浴熱休克90s，迅速放入冰上2min ；加入2ml LB培養(yǎng)基(不含抗生素)，37°C搖床，轉(zhuǎn) 速;^ 150rpm，復(fù)蘇45min ；3000rpm離心IOmin收菌，用250 μ 1 LB重懸；取200 μ 1菌液涂 布于15cm培養(yǎng)皿(Af-IPTG/x-galLB固體培養(yǎng)基)，37°C過夜；步驟(7)所述的PCR鑒定差 減文庫的克隆插入片斷大小，其步驟為隨機挑取384個白斑克??；250rpm，37°C搖菌過夜； 各取1μ 1菌液作為擴增模板；加入以下反應(yīng)體系19. 75μ 1水，2. 5μ 1 10XPCR reaction buffer, 0. 5 μ 1 dNTP Mix (IOmM)，1 μ 1 Evrogen PCR primer M1,0. 25 μ 1 rTaq, U^iMM 混勻，短暫離心；循環(huán)反應(yīng)參數(shù)94°C 5min，94°C 30s, 66°C 30s, 72°C 30s,72°C 7min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種DSN法直接獲得差異表達基因全長cDNA的改良消減雜交方法，屬于基因工程領(lǐng)域，其主要方法是利用Cap-finder法來合成雙鏈cDNA，實驗組和對照組分別進行反轉(zhuǎn)錄，實驗組用3′poly A尾和5′-GGG帽結(jié)構(gòu)分別在cDNA兩端加上序列相同的錨定引物，對照組用普通反轉(zhuǎn)錄方法反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA與實驗組的cDNA進行雜交，雜交結(jié)束后加入DSN酶進行消化，再進行純化即獲得實驗組的差異表達cDNA，利用錨定引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物分級分離后收集大片段連接T載體，進行轉(zhuǎn)化獲得陽性克隆，然后進行斑點雜交，本發(fā)明能夠一次獲取全長差異cDNA。
文檔編號C12P19/34GK101870994SQ20091004969
公開日2010年10月27日 申請日期2009年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月21日
發(fā)明者徐小東, 王樹偉 申請人:上海歐易生物科技有限公司