專利名稱：一種地衣芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物化工領(lǐng)域，具體的說，涉及一種地衣芽孢桿菌，及其應(yīng)用 該芽孢桿菌催化還原芳香族硝基化合物為相對應(yīng)的胺類化合物的方法。
背景技術(shù)：
由于我國境內(nèi)的地理環(huán)境、氣候條件千差萬別，微生物資源相當(dāng)?shù)呢S 富。人們通過在各種不同煒度、海拔以及氣候的地域?qū)ふ倚碌奈⑸锞N。 一般地，通過菌抹的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征以及生理生化特征等對微生物菌
種進(jìn)行分類鑒別，同時還常常采用檢測微生物菌種的16srDNA的序列來明 確該菌種的分類地位。
通過對在全國各地采集得來的微生物菌種進(jìn)行培養(yǎng),在得到的代謝產(chǎn)物 中尋找生物酶，來催化各種有機(jī)單元反應(yīng)，如酰胺酶可以催化腈類化合物 的水合反應(yīng)制備相應(yīng)的酰胺類和有機(jī)酸類化合物，如水解酶能夠催化酯類 化合物的水解反應(yīng)制備相應(yīng)有機(jī)酸類和醇類化合物，等等。目前，利用微 生物發(fā)酵培養(yǎng)得到的生物酶來催化合成各類化工產(chǎn)品，已成為生產(chǎn)大宗精 細(xì)化學(xué)產(chǎn)品的重要手段之一。
由芳香族硝基化合物制備芳香胺是一重要的有機(jī)合成單元，是制備芳胺 的重要途徑。產(chǎn)品芳胺廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、染料、助劑等領(lǐng)域，是重 要的有機(jī)合成中間體。傳統(tǒng)的以芳香族硝基化合物制備芳胺的技術(shù)主要有 在電解質(zhì)中用鐵粉還原、疏化堿還原、催化加氫還原、電化還原等。但是 這些方法都存在各自的不足，如鐵粉還原法的勞動強(qiáng)度大、污染嚴(yán)重；碌 化堿法收率低、廢水量大；催化加氫法成本高、安全性不高；電化還原法能 耗大、成本高。

發(fā)明內(nèi)容
本申請的發(fā)明人在我國江蘇省鹽城地區(qū)的土壤中采集并分離到一抹菌
才朱，編號為SPRI-60421,通過對其16SrDNA序列的測定和培養(yǎng)特征、生化 特征等分析，鑒定其為地衣芽孢桿菌(勘ci7/w //c/ e/ //^/7z /\y);進(jìn)一步 的研究發(fā)現(xiàn)，該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)物具有硝基還原能力，能夠?qū)⒎枷阕逑趸?化合物催化還原成相應(yīng)的芳香胺類化合物。
因此，本發(fā)明的首要目的就在提供一種地衣芽孢桿菌SPRI-60421及其 培養(yǎng)方法。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種SPRI-60421催化還原制備芳香胺類 化合物的應(yīng)用。
本發(fā)明的地衣芽孢桿菌(勘"7/"s //c力e/7/尸ara/") SPRI-60421，已 于2007年12月05日提交中國普通微生物保藏中心保藏，保藏號為CGMCC No. 2280。
經(jīng)測定，該菌4朱的16SrDNA序列如SEQ ID NO: 1所示。 本發(fā)明的地衣芽孢桿菌(勘"77w //c/^/ //^^") SPRI-60421經(jīng)發(fā) 酵培養(yǎng)后，用于催化還原制備芳香胺類化合物。
根據(jù)本發(fā)明，所述地衣芽孢桿菌(^c///^ //c力eT /尸or/b^ )SPRI-60421 的發(fā)酵培養(yǎng)條件如下在37。C下230rpm振蕩培養(yǎng)24小時；培養(yǎng)基的重量 體積百分比組成包括1%葡萄糖、0.5%酵母膏、0,5%肉膏、1%氯化鈉；PH 范圍可為6-8;培養(yǎng)溫度在24-45°C,通氣量以通氣比1: 0. 1到1比l之 間。
才艮據(jù)本發(fā)明，所述地衣芽孢桿菌(//cAe"http://ar/w/s)SPRI-60421 不僅能應(yīng)用于高效地催化單硝基芳香化合物，同時還可以應(yīng)用于高效地還 原二硝基芳香化合物為相應(yīng)的一胺或二胺產(chǎn)品。其催化反應(yīng)可以用下述反 應(yīng)通式表示根據(jù)本發(fā)明，所述地衣芽孢桿菌(勘c///^ //c/ e/ //o/7Z7Ay)SPR 1-60421 培養(yǎng)結(jié)束后將發(fā)酵液和菌體分離，所獲得菌體沉淀加入到含有芳香族硝基 化合物的轉(zhuǎn)化液中，使芳香族硝基化合物轉(zhuǎn)化為芳香胺類化合物。
根據(jù)本發(fā)明，轉(zhuǎn)化結(jié)束后，去除菌體細(xì)胞，轉(zhuǎn)化液用有機(jī)溶劑萃取后， 用層析、精餾等常規(guī)分離手段將未完全轉(zhuǎn)化的芳香族硝基化合物和產(chǎn)物芳 香胺分離。
具體實施例方式
下面通過具體實施例，進(jìn)一步說明本發(fā)明。
本發(fā)明的地衣芽孢桿菌(勘"7/〃i1 //c力e/7/7^/7Z7/" SPRI-60421，已 于2007年12月05日提交中國普通微生物保藏中心保藏，保藏號為CGMCC No. 2280。
以下實施例所涉及的原材料皆可通過市售得到，且涉及到的濃度均為 重量體積比濃度。
本發(fā)明的地衣芽孢桿菌(&"7/ws //c力e/2i7br歷/s) SPRI-60421的形 態(tài)特征、培養(yǎng)特征及16srDNA的序列和菌種分類結(jié)果如下 1、 形態(tài)特征和培養(yǎng)特征
菌抹在生長過程中產(chǎn)生芽孢。該菌菌體桿狀，培養(yǎng)36h左右后產(chǎn)生芽 孢，芽孢中生。營養(yǎng)瓊脂平板上，初期菌落呈光滑狀，后期呈列液狀，邊 緣毛發(fā)褶皺。根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》以及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》 方法進(jìn)行耐鹽性、耐熱性、甲基紅等生化試驗，其培養(yǎng)特征如表l:
表l、培養(yǎng)特征
培養(yǎng)基氣生菌絲基內(nèi)菌絲可溶性色素
革蘭氏染色+葡萄糖產(chǎn)酸陽性
芽孢著生方式中生水解明膠陽性
V. P測定+水解淀粉陽性
2%Nacl+曱基紅試驗+
5飾C1+3(TC生長十
7%Nacl+5(TC生長+
檸檬酸鹽利用可利用6(TC生長+
62、本發(fā)明所述的菌4朱SPRI-60421的16srDNA序列如SEQ ID NO: l所示。
16SrDNA序列分析用溶菌酶法從新鮮菌體提取基因組DNA，采用通用 引物進(jìn)行16SrDNA擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng);險測、純化后直接用Taq Deoxy Terminator Cyele Sequencing Kit測序,電泳及數(shù)Applied Biosystems DNA Sequencer (model 377)自動進(jìn)行。
根據(jù)形態(tài)和培養(yǎng)特征以及16srDM序列分析，判斷該菌抹屬于地衣芽 孑包才亍菌("a c / 7 / 〃i" / / c力e/ //V /7i7/ s)。
本發(fā)發(fā)明所述的地衣芽孢桿菌SPRI-60421的培養(yǎng)方法，可以是常規(guī)的 細(xì)菌培養(yǎng)方法。為了有利于工業(yè)性的培養(yǎng)，宜將上述生產(chǎn)菌進(jìn)行深層液體 通氣培養(yǎng)。
對培養(yǎng)基中的營養(yǎng)源并無特殊的規(guī)定，可使培養(yǎng)基中含有常用于細(xì)菌 培養(yǎng)的碳源、氮源及其他營養(yǎng)源。其中碳源可為淀粉、糊精、葡萄糖、甘 油、蔗糖、甘露醇等，氮源可為肉胨、黃豆餅粉、花生粉、酵母、肉膏、 米糠、玉米漿、麥皮、銨鹽、尿素、硝酸鹽以及其他有機(jī)或無機(jī)含氮化合 物。其他營養(yǎng)源可適當(dāng)添加一些無機(jī)鹽類，例如食鹽、磷酸鹽及鉀、4丐、 錳、鐵等金屬鹽。必要時可添加一些動、植、礦物油等作為消泡劑。
對溫度、PH、時間等培養(yǎng)條件并無嚴(yán)^^各的限制，以適于生產(chǎn)菌的生產(chǎn) 為準(zhǔn)，并以選擇產(chǎn)硝基還原酶最高的條件為好。例如，培養(yǎng)基的PH范圍可 為6-8，以接近中性為好；培養(yǎng)溫度在24-45。C，通氣量以通氣比1: 0.1 到1比l之間(通氣比指每分鐘通過培養(yǎng)液的空氣體積與培養(yǎng)液體積之 比)。這些培養(yǎng)基的組份、PH、培養(yǎng)溫度、通氣條件等均應(yīng)根據(jù)實際情況進(jìn) 行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以獲得最好的效果。
將上述發(fā)酵培養(yǎng)好的微生物培養(yǎng)液與菌體分離，可采用大于1000rpm 的離心分離方法，或過濾分離方法得到菌體。
本發(fā)明所述的地衣芽孢桿菌SPRI-60421的一種應(yīng)用，可用于的生物催 化還原反應(yīng)?？稍谒嗷蛩?有機(jī)兩相系統(tǒng)中進(jìn)行。水相轉(zhuǎn)化條件為底 物濃度小于等于0. 2g/L,在任意一種PH6. 5-9. 5的中性到偏堿性的緩沖液 中。有機(jī)相為N， N-二曱基曱酰胺、二氯甲烷、N-曱基吡咯烷酮、二曱基亞 砜或其他對細(xì)胞毒性較小的有機(jī)溶劑。水-有機(jī)相兩相系統(tǒng)為上述水相和有機(jī)相的混合物。轉(zhuǎn)化溫度范圍在20-40°C， 50-300rpm搖瓶振蕩通氣或攪 拌通氣或管道通氣供氧，反應(yīng)時間l-48小時。轉(zhuǎn)化結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液與菌 體通過離心或過濾分開，即可獲得含有芳香胺的轉(zhuǎn)化液。
上述轉(zhuǎn)化液中需要加入濃度大于0. Qiy。的碳源物質(zhì)，以維持菌體基礎(chǔ)代 謝活力。碳源可以是葡萄糖、蔗糖、果糖等其他任何糖質(zhì)。
本發(fā)明所述的生物催化還原反應(yīng)結(jié)束后，可在上述轉(zhuǎn)化液中加入二氯 曱烷、三氯曱烷、四氯曱烷、乙酸乙酯、N-曱基吡咯烷酮等有機(jī)溶劑，振 蕩、萃取，所需產(chǎn)物和未轉(zhuǎn)化完全的底物進(jìn)入有機(jī)相中。靜止或離心分層 后，將有機(jī)相經(jīng)減壓濃縮除去有機(jī)溶劑，即可得到芳香胺的粗產(chǎn)品。該產(chǎn) 品經(jīng)層析、精餾等手段即可得到芳香胺純品。
實施例l、地衣芽孢桿菌SPRI-60421的發(fā)酵培養(yǎng)
將200mL的LB培養(yǎng)基(生化技術(shù)手冊——常用培養(yǎng)基)放入500mL三 角瓶中，12rc高壓蒸汽滅菌，冷卻到室溫后接入本發(fā)明所述的地衣芽孢桿 菌(勘"7k //c力e"/'/婦/、)SPRI-60421 CGMCC No. 2280，在37。C和230rpm 振蕩下培養(yǎng)24小時后，離心分離菌體。
實施例2、地衣芽孢桿菌SPRI-60421的發(fā)酵培養(yǎng)
將200ml含有1%葡萄糖、0. 5%酵母膏、0. 5%肉膏、1%氯化鈉的培養(yǎng)基 放入500ml三角瓶中，12rC高壓蒸汽滅菌，冷卻到室溫后接入本發(fā)明所述 的地衣芽孢桿菌(勘"7to //c力認(rèn).尸,/力SPRI-60421 CGMCC No. 2280, 在37"C和230rpn^展蕩下培養(yǎng)24小時后，離心分離菌體。
實施例3、間二硝基苯的生物催化還原反應(yīng)
取實施例1所得的100mL菌液的菌體加入到含有0. 03%間二硝基苯和 0. 5%葡萄糖的50mL磷酸緩沖液(PH8. 0)的250mL三角瓶中，20°C、 300rpm 振蕩通氣，進(jìn)行間二硝基苯的靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)(注靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)
8定義是指將發(fā)酵液離心分離后得到的菌體沉淀加入到含有芳香族硝基化合 物的轉(zhuǎn)化液中進(jìn)行的催化還原反應(yīng)，下同。)，24小時后，停止轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
反應(yīng)過程中采用TLC薄層進(jìn)行跟蹤分析。
離心除去菌體，上清液用lOmL二氯曱烷萃取兩次。減壓濃縮有機(jī)相得 到淡黃色間二苯胺和間硝基苯胺以及間二硝基苯的混合物。再經(jīng)過層析、 精餾等常規(guī)分離手段得到各單組分，經(jīng)常規(guī)液相色譜分析，各組分含量均 大于98%。
實施例4、鄰硝基曱苯的生物催化還原反應(yīng)
取實施例2所得的100mL菌液的菌體加入到含有0. 04%鄰硝基曱苯和 0. 5%葡萄糖的50mL磷酸緩沖液(PH8. 0)的250mL三角瓶中，25°C、 250rpm 振蕩通氣，進(jìn)行鄰硝基甲苯的靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)，1小時后，停止轉(zhuǎn)化反應(yīng)。 反應(yīng)過程中采用HPLC或TLC薄層進(jìn)行跟蹤分析。
離心除去菌體，上清液用lOmL二氯曱烷萃取兩次。減壓濃縮有機(jī)相得 到含量約為90%左右的鄰甲基苯胺粗品。再經(jīng)過層析、精餾等常規(guī)分離手段 得到鄰甲基苯胺純品，經(jīng)常規(guī)液相色譜分析，含量大于98%。
實施例5、對硝基苯甲酰胺的生物催化還原反應(yīng)
NH2
取實施例2所得的lOOmL菌液的菌體加入到含有0. 06%對硝基苯曱酰胺 和0. 5°/。蔗糖的50mL磷酸緩沖液(PH8. 0)的250mL三角瓶中，30°C、 200rpm 振蕩通氣，進(jìn)行對硝基苯曱酰胺的靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)，6小時后，停止轉(zhuǎn)化 反應(yīng)。反應(yīng)過程中采用TLC薄層進(jìn)行跟蹤分析。
離心除去菌體，上清液用lOmL二氯曱烷萃取兩次。減壓濃縮有機(jī)相得 到含量約為90%左右的對曱酰胺苯胺粗品。再經(jīng)過層析、精餾等常規(guī)分離手 段得到對曱酰胺苯胺純品，經(jīng)常規(guī)液相色譜分析，含量大于98%。實施例6、 6-氯-2-辨基曱苯的生物催化還原反應(yīng)
取實施例2所得的100mL菌液的菌體加入到含有0. 04%6-氯-2-硝基甲 笨和0. 5%果糖的50mL磷酸緩沖液(PH8. O)的250mL三角瓶中，35°C 、 150rpm 振蕩通氣，進(jìn)行6-氯-2-硝基曱苯的靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)，12小時后，停止 轉(zhuǎn)化反應(yīng)。反應(yīng)過程中采用TLC薄層進(jìn)行跟蹤分析。
離心除去菌體，上清液用lOmL二氯曱烷萃取兩次。減壓濃縮有機(jī)相得 到含量約為90°/。左右的2-曱基-3-氯苯胺粗品。再經(jīng)過層析、精餾等常規(guī)分 離手賴:得到2-甲基-3-氯苯胺純品，經(jīng)常規(guī)液相色譜分析，含量大于98 % 。
實施例7、 4-氯-2, 5-二甲氧基硝基苯的生物催化還原反應(yīng)
OMe OMe
取實施例2所得的100mL菌液的菌體加入到含有0. 04%4-氯-2， 5-二曱 氧基硝基苯和0. 5%葡萄糖的50mL磷酸緩沖液(PH8. 0)的250mL三角瓶中, 4(TC攪拌敞口通氣，進(jìn)行4-氯-2， 5-二曱氧基硝基苯的靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)， 20小時后，停止轉(zhuǎn)化反應(yīng)。反應(yīng)過程中采用TLC薄層進(jìn)行跟蹤分析。
離心除去菌體，上清液用lOmL二氯曱烷萃取兩次。減壓濃縮有機(jī)相得 到含量約為90%左右的4-氯-2,5-二曱氧基苯胺粗品。再經(jīng)過層析、精餾等 常規(guī)分離手段得到4-氯-2,5-二曱氧基苯胺純品，經(jīng)常規(guī)液相色譜分析，含 量大于98%。
實施例8、對硝基苯曱酰胺的兩相生物催化還原反應(yīng)
取實施例2所得的lOOmL菌液的菌體加入到含有0. 5%對硝基苯曱酰胺
10和0. 5°/。蔗糖的50mL磷酸緩沖液(PH8. 0 )的250mL三角瓶中，然后在前述 的轉(zhuǎn)化液中加入二甲基亞砜(DMS0)，每100ml轉(zhuǎn)化液加入10ml 二曱基亞 砜，3(TC管道通氣，進(jìn)行對硝基苯曱酰胺的靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)，30小時后， 停止轉(zhuǎn)化反應(yīng)。反應(yīng)過程中采用TLC薄層進(jìn)行跟蹤分析。
離心除去菌體，上清液用10mL二氯甲烷萃取兩次。減壓濃縮有機(jī)相得 到含量約為90%左右的對曱酰胺苯胺粗品。再經(jīng)過層析、精餾等常規(guī)分離手 段得到對甲酰胺苯胺純品，經(jīng)常規(guī)液相色譜分析，含量大于98%。
實施例9、間二賄基苯的兩相生物催化還原反應(yīng) O,N. H。N
取實施例2所得的lOOmL菌液的菌體加入到含有0. 5%間二硝基苯和 0. 5%果糖的50mL磷酸緩沖液(PH8. 0 )的250mL三角瓶中，然后在前述的 轉(zhuǎn)化液中加入二氯甲烷，每100ml轉(zhuǎn)化液加入10mlN， N-二曱基甲酰胺，20 。C攪拌敞口通氣，進(jìn)行間二硝基苯的靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)，36小時后，停止 轉(zhuǎn)化反應(yīng)。反應(yīng)過程中采用TLC薄層進(jìn)行跟蹤分析。
離心除去菌體，上清液用lOmL二氯甲烷萃取兩次。減壓濃縮有機(jī)相得 到含量約為90%左右的間二苯胺粗品。再經(jīng)過層析、精餾等常規(guī)分離手段得 到間二苯胺純品，經(jīng)常規(guī)液相色譜分析，含量大于98%。
實施例IO、鄰硝基曱苯的兩相生物催化還原反應(yīng)
取實施例2所得的100mL菌液的菌體加入到含有0. 5%鄰硝基曱苯和 0. 5%葡萄糖的50mL磷酸緩沖液(PH8. 0)的250mL三角瓶中，然后在前述 的轉(zhuǎn)化液中加入N-甲基吡咯烷酮，每100ml轉(zhuǎn)化液加入10ml N-曱基吡咯 烷酮，4(TC管道通氣，進(jìn)行鄰硝基甲苯的靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)，48小時后， 停止轉(zhuǎn)化反應(yīng)。反應(yīng)過程中采用TLC薄層進(jìn)行跟蹤分析。
離心除去菌體，上清液用lOmL二氯曱烷萃取兩次。減壓濃縮有機(jī)相得到含量約為9oy。左右的鄰甲基苯胺粗品。再經(jīng)過層析、精餾等常規(guī)分離手段
得到鄰曱基苯胺純品，含量大于98 % 。
綜上所述，本發(fā)明是以一種地衣芽孢桿菌SPRI-60421來進(jìn)行催化還原 芳香族硝基化合物的生物催化過程，與傳統(tǒng)的鐵粉還原、硫化堿還原、催 化加氫還原、電化還原等技術(shù)相比，具有催化條件溫和、環(huán)境相容性好、 催化專一選擇性好等特點，為由芳香族硝基化合物制備芳香胺提供了 一種 新的途徑。序列表
<110>上海市農(nóng)藥研究所南京師范大學(xué) 〈120〉 一種地衣芽孢桿菌及其應(yīng)用 〈130〉 P5081086 <歸 1
〈170〉 Patentln version 3. 3
<210> <211> <212> 〈213>
〈220〉 〈221> 〈222〉
1
1425 DNA
Bacillus licheniformis
16srDNA (l).. (1425)
〈400〉 1
cggcggctgg ctccaaaagg ttacctcacc gacttcgggt gttacaaact ctcgtggtgt 60
gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc ggcatgctga tccgcgatta 120
ctagcgattc cagcttcacg cagtcgagtt gcagactgcg atccgaactg agaacagatt 180
tgtgggattg gcttagcctc gcggcttcgc tgccctttgt tctgcccatt gtagcacgtg 240
tgtagcccag gtcataaggg gcatgatgat ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg 300
tcaccggcag tcaccttaga gtgcccaact gaatgctggc aactaagatc aagggttgcg 360
ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacaacc atgcaccacc 420
tgtcactctg cccccgaagg ggaagcccta tctctagggt tgtcagagga tgtcaagacc 480
tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc 540
ccgtcaattc ctttgagttt cagtcttgcg accgtactcc ccaggcggag tgcttaatgc 600
gtttgctgca gcactaaagg gcggaaaccc tctaacactt agcactcatc gtttacggcg 660tggactacca gggtatctaa tcctgttcgc tccccacgct ttcgcgcctc agcgtcagtt 了20
acagaccaga gagtcgcctt cgccactggt gttcctccac atctctacgc atttcaccgc 780
tacacgtgga attccactct cctcttctgc actcaagttc cccagtttcc aatgaccctc 840
cccggttgag ccgggggctt tcacatcaga cttaagaaac cgcctgcgcg cgctttacgc 900
ccaataattc cggacaacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta 960
gccgtggctt tctggttagg taccgtcaag gtgccgccct attcgaacgg tacttgttct 1020
tccctaacaa cagagtttta cgatccgaaa accttcatca ctcacgcggc gttgctccgt 1080
cagactttcg tccattgcgg aagattccct actgctgcct cccgtaggag tctgggccgt 1140
gtctcagtcc cagtgtggcc gatcaccctc tcaggtcggc tacgcatcgt cgccttggtg 1200
agccgttacc tcaccaacta gct犯tgcgc cgcgggtcca tctgtaagtg gtagctaaaa 1260
gccacctttt atgattgaac catgcggttc aatcaagcat ccggtattag ccccggtttc 1320
ccggagttat cccagtctta caggcaggtt acccacgtgt tactcacccg tccgccgctg 1380
acctaaggga gcaagctccc gtcggtccgc tcgacttgca tgtat 142權(quán)利要求
1、一種地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)SPRI-60421，其特征在于，該菌株的保藏號為CGMCC No.2280。
2、 如權(quán)利要求1所述的地衣芽孢桿菌SPRI-60421 ，其特征在于，該菌 抹具有SEQ ID NO: 1所示的16SrDNA序列。
3、 如權(quán)利要求1所述的地衣芽孢桿菌SPRI-60421，其特征在于，該菌 抹的發(fā)酵培養(yǎng)條件為在37。C下230rpm振蕩培養(yǎng)24小時；培養(yǎng)基的重量 體積百分比組成包括1°/。葡萄糖、0. 5%酵母膏、0. 5%肉膏、1%氯化鈉；PH6-8; 培養(yǎng)溫度在24-45°C,通氣量為通氣比(1 : 0. 1 ) ~ (1:1)之間。
4、 如權(quán)利要求1-3任一項所述的地衣芽孢桿菌SPRI-60421的應(yīng)用， 其特征在于，用于將芳香族硝基化合物催化還原制備芳香族胺類化合物。
5、 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述催化還原是將所述地 衣芽孢桿菌SPRI-60421發(fā)酵后所獲得的菌體沉淀加入到含有芳香族硝基化 合物的轉(zhuǎn)化液中，使芳香族硝基化合物轉(zhuǎn)化為芳香胺類化合物。
6、 如權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的催化還原反應(yīng) 在水相或水-有機(jī)兩相系統(tǒng)中進(jìn)行。
7、 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的水相系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)化 條件為底物濃度小于等于0. 2g/L,在任意一種PH6. 5-9. 5的中性到偏堿 性的緩沖液中進(jìn)行。
8、 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的水-有機(jī)兩相系統(tǒng) 為水相和N, N-二曱基曱酰胺、二甲基亞砜、N-甲基吡咯烷酮、二氯曱烷或 其他對細(xì)胞毒性較小的有機(jī)溶劑的混合物。
9、 如權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的催化反應(yīng)條件 為轉(zhuǎn)化溫度在20-40。C, 50-300rpm搖瓶振蕩通氣，或攪拌通氣或管道通 氣供氧，反應(yīng)時間1-48小時。
10、 如權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的催化還原反 應(yīng)的轉(zhuǎn)化液中加入濃度大于0. 01%的碳源物質(zhì)，碳源是葡萄糖、蔗糖或果糖。
11、 如權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于，用于將單硝基芳香 化合物催化還原為相應(yīng)的 一胺產(chǎn)品。
12、如權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于，用于將二硝基芳香化合物催化還原為相應(yīng)的 一胺或二胺產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種地衣芽孢桿菌，及其利用該芽孢桿菌催化還原芳香族硝基化合物為相對應(yīng)的胺類化合物的方法。本發(fā)明所涉及的微生物為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)SPRI-60421(保藏登記號CGMCCNo.2280)。將具有硝基還原能力的微生物菌株接種到培養(yǎng)液中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后將發(fā)酵液和菌體分離，所獲得菌體沉淀加入到含有芳香族硝基化合物的轉(zhuǎn)化液中，使芳香族硝基化合物轉(zhuǎn)化為芳香胺類化合物。轉(zhuǎn)化結(jié)束后，去除菌體細(xì)胞，轉(zhuǎn)化液用有機(jī)溶劑萃取后，用層析、精餾等常規(guī)分離手段將未完全轉(zhuǎn)化的芳香族硝基化合物和產(chǎn)物芳香胺分離。
文檔編號C12P13/00GK101555460SQ200910045110
公開日2009年10月14日 申請日期2009年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月9日
發(fā)明者徐文平, 曠文豐, 薛章榮, 生 袁, 磊 郭, 陶黎明, 軍 雒 申請人:上海市農(nóng)藥研究所;南京師范大學(xué)