專利名稱：鑒定太平洋牡蠣種群的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的快速準(zhǔn)確鑒定牡蠣種群的方法。
背景技術(shù)：
牡蠣的貝殼可塑性強(qiáng)，貝殼外部形態(tài)差異極大，研究人員積極尋求其 它研究手段，以求解決牡蠣分類中存在的疑難問題。大部分學(xué)者認(rèn)為牡蠣 軟體部的結(jié)構(gòu)差異很小，可提供的分類證據(jù)少。絕大多數(shù)的牡蠣具有恒定 的染色體數(shù)目(2n=20)，并且核型的差異甚微，無法為區(qū)別牡蠣物種提供 證據(jù)(參見AhmedM . Cytogenetics of oysters. Cytologia， 1973， 28: 337-346.)。在借助生化手段方面，蛋白質(zhì)和同工酶電泳技術(shù)被用于研究 屬間的遺傳多樣性分析以及對分布區(qū)重疊的種群間的種類鑒定，但電泳分 析結(jié)果應(yīng)用于種類鑒別上的有效性，尚存在諸多爭議(參見Hedgecock D，0kazaki N B. Genetic diversity within and between population of American oyster(Crassostrea). Malacologia， 1984， 25: 535-549.)。此 外，地理分布常是牡蠣物種鑒定的主要依據(jù)之一，但有不少研究表明，一 些具有不同地理分布而被界定為不同種的牡蠣，很容易雜交，產(chǎn)生可存活 的并且具有繁育能力的后代(參見Gaffney P M， Allen S K Jr. Hybridization among Crassostrea species:a critical reviews. Aquaculture， 1993， 116: 1-13.)。因此，由于缺少有效的鑒定 種群的方法，在相當(dāng)長的一段時(shí)期內(nèi)，牡蠣的種名混亂，同物異名和異物 同名等現(xiàn)象十分嚴(yán)重。
此外異地引種養(yǎng)殖頻繁，打破了牡蠣種間的地理隔離，對我國的牡蠣 種質(zhì)資源造成了嚴(yán)重的影響，進(jìn)一步加劇了現(xiàn)有牡蠣形態(tài)分類的難度。分 類方面的混亂已嚴(yán)重影響到牡蠣的養(yǎng)殖和育種，給雜交育種工作的開展帶 來了諸多不便。微衛(wèi)星最早應(yīng)用之一是制作DNA指紋圖來逝行^體、.:品種'(系}.鑒定。
2006年，D. Lallias等人用微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)首次繪制出歐洲牡蠣的遺 傳圖譜(參見D. Lallias， A. R. Bea畫nt卞School of Ocean Sciences, College of Natural Sciences, University of Wales, Bangor, Menai Bridge, Gwynedd， 1X59 5AB， UK. A first-generation genetic linkage map of the European flat oyster Ostrea edulis (L ) based on AFLP and microsatellite markers [J]. Mol Ecol. 2006,15(13): 29-42.)
現(xiàn)中國養(yǎng)殖的主要經(jīng)濟(jì)牡蠣太平洋牡蠣，為了更好的準(zhǔn)確鑒定牡蠣種 群和順利地進(jìn)行遺傳育種工作，迫切需要一種省時(shí)準(zhǔn)確的方法，從而達(dá)到 保護(hù)牡蠣資源的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決牡蠣種質(zhì)鑒定和遺傳育種存在的不足問題，提供 一種鑒定太平洋牡蠣種群的新方法，應(yīng)用EST-SSRs分子標(biāo)記技術(shù)，從不同 種群牡蠣(褶牡蠣，近江牡蠣，太平洋牡蠣等)中分離出太平洋牡蠣群體， 方法簡單，分析準(zhǔn)確。
本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的采用的技術(shù)方案是鑒定太平洋牡蠣種群的新 方法，
1) 樣本采集分別采集褶牡蠣、太平洋牡蠣和近江牡蠣不同的種群樣 本個(gè)體；
2) 基因組提取提取上述樣本每種牡蠣群體的多個(gè)樣本的基因組；
3) 引物設(shè)計(jì)根據(jù)含有微衛(wèi)星的EST序列設(shè)計(jì)EST- SSRs引物；
4) PCR擴(kuò)增利用EST-SSRs引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的片段的PCR 產(chǎn)物；
5) EST- SSRs特異位點(diǎn)的鑒定對PCR產(chǎn)物先進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳， 得到具有清晰且穩(wěn)定條帶的PCR產(chǎn)物，再進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳， 進(jìn)行多態(tài)性位點(diǎn)檢測，鑒定出具有特異的EST微衛(wèi)星序列的等位基 因位點(diǎn)太平洋牡蠣種群。
所述樣本采集分別選取褶牡蠣、太平洋牡蠣、近江牡蠣各40以上個(gè)體，每個(gè)牡蠣取其閉殼肌0. 1克放入1. 5ml離'心管,中，—力ft六J9^乙醇后放入
-2(TC冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 所述基因組提取參照薩姆布魯克等經(jīng)典酚-仿抽提法從牡蠣肌肉中提 取牡蠣的全基因組DNA(參見薩姆布魯克J，弗里奇EF，蔓尼阿蒂斯T，著.分 子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].金冬雁，黎孟楓，侯云德，等譯.第2版.科學(xué)出版 社.1992， 63-481.)。
所述EST-SSRs引物設(shè)計(jì)從NCBI(http:〃鳳ncbi.nlm. nih.gov/) 的EST庫中搜索太平洋牡蠣的EST序列，然后用在線軟件SSRIT (http://ww.gramene.org/db/markers/ssrtool)找出含有微衛(wèi)星的EST 序列，根據(jù)這些含有微衛(wèi)星的EST序列利用在線引物設(shè)計(jì)軟件 Premier3. 0(http://frodo. wi. mit. Edu/cgibin/primer3/primer 3—ww.cgi)設(shè)計(jì)EST-SSRs引物，引物設(shè)計(jì)主要參數(shù)為引物長18-22bp ， 最適20bp;引物退火溫度55-65'C，上下引物之間退火溫度不超過5r; GC 含量40%-60%，最適50%; PCR預(yù)期產(chǎn)物長150-300bp。
所述EST-SSRs引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)適用于太平洋牡蠣的引物序列
F-------- 5， GCAGAGATGGTCTGGAAAGC 3，
r---------5， ctggctggagaagaacaagg 3,。
所述EST-SSRs的PCR擴(kuò)增以提取的全基因組DNA樣品分別為模板， 對EST-SSRs引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
所述EST-SSRs特異位點(diǎn)的鑒定首先經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，得到擴(kuò)增 條帶穩(wěn)定、條帶清晰的pcr產(chǎn)物；再進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，擴(kuò)增條帶穩(wěn) 定、條帶清晰且有多態(tài)性的EST-SSRs引物即是太平洋牡蠣群體。
為檢測本發(fā)明鑒定方法的精確度，對牡蠣群體特異性微衛(wèi)星位點(diǎn)的等 位基因純合體的基因型的序列測定，進(jìn)行驗(yàn)證對這個(gè)特異位點(diǎn)的純合體 的基因序列進(jìn)行其擴(kuò)增產(chǎn)物純化；將純化后的標(biāo)記克隆到載體上，然后測 定其dna堿基序列加以驗(yàn)證。
本發(fā)明是以太平洋牡蠣的EST序列設(shè)計(jì)弓I物的序列。太平洋牡蠣群體 在位點(diǎn)S5PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠凝膠電泳上有兩個(gè)等位基因，表現(xiàn)出此位點(diǎn)的多態(tài)性(見圖3);而其他牡蠣群體頃茌聚丙:烯酰胺凝膠凝
膠電泳上只有一條帶，即一個(gè)等位基因存在，沒有的多態(tài)性(見圖4)。 即位點(diǎn)S5在太平洋牡蠣群體中有多態(tài)性，而在褶牡蠣和近江牡蠣等群體中 沒有。依據(jù)聚丙烯酰胺凝膠凝膠電泳圖譜上的多態(tài)性，從而達(dá)到從牡蠣群體中分 離太平洋牡蠣群體的目的。該方法省時(shí)有效且可靠性強(qiáng)，可以作為經(jīng)濟(jì)牡 蠣遺傳種質(zhì)鑒定、系統(tǒng)進(jìn)化分析、選育和雜交育種工作提供了依據(jù)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明利用了 EST-SSRs分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于不同種 群牡蠣進(jìn)行了遺傳分析，引物設(shè)計(jì)合理，二步電泳檢測，達(dá)到鑒定太平洋 牡蠣種群的目的，方法簡單，省時(shí)且分析準(zhǔn)確。本發(fā)明利用EST-SSRs分子 標(biāo)記技術(shù)研究太平洋牡蠣的遺傳結(jié)構(gòu)使其區(qū)別于近江牡蠣、褶牡蠣的遺傳 信息，從分子水平揭示太平洋牡蠣與其他幾種群之間的遺傳變異，找到了 區(qū)分群體遺傳結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的重復(fù)性好的EST-SSRs的標(biāo)記位點(diǎn)，為牡蠣的種質(zhì) 資源保護(hù)提供有力的科學(xué)依據(jù)。


圖1顯示的是牡蠣基因組瓊脂糖凝膠電泳圖
圖2顯示的是太平洋牡蠣養(yǎng)殖群體在位點(diǎn)S5PCR擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖3顯示的是太平洋牡蠣養(yǎng)殖群體在位點(diǎn)S5的EST-SSRs聚丙烯酰胺凝 膠電泳。
圖4褶牡蠣、近江牡蠣等群體的在位點(diǎn)S5 EST-SSRs聚丙烯酰胺凝膠 電泳圖。
圖5太平洋牡蠣位點(diǎn)S5的微衛(wèi)星測序圖(純合體)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明用進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但本發(fā)明并不局 限于具體實(shí)施例 實(shí)施例1
鑒定太平洋牡蠣種群的新方法，按下述工藝過程進(jìn)行鑒定。1、 樣本采集
褶牡蠣自然群體40個(gè)樣本采自于大連開發(fā)區(qū)海域；太平洋牡蠣養(yǎng)殖群 體40個(gè)樣本購自天津王頂?shù)趟a(chǎn)品市場；近江牡蠣40個(gè)樣本購自海南省 ?？谏礁啧r活水產(chǎn)品批發(fā)市場。每個(gè)牡蠣取其閉殼肌放入1. 5ml離心管中， 加入95%乙醇后放入-201:冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 2、 基因組的提取
按照酚-仿抽提法提取三個(gè)牡蠣群體120個(gè)個(gè)體的總DNA，經(jīng)0. 8%的瓊 脂糖電泳檢測，大多數(shù)的DNA都比較完整，樣品的片段大小在23kb左右， 基本不含其它雜質(zhì)及RNA，可以用來進(jìn)行PCR的擴(kuò)增。如圖1顯示的是部分 DNA檢測的結(jié)果。
3、 EST-SSRs引物設(shè)計(jì)
從NCBI (http:〃ww. ncbi. nlm. nih. gov/)的EST庫中搜索太平洋牡蠣 的 EST 序列， 然后用在線軟件 SSRIT (http:〃www. gramene. org/db/markers/ssrtool)找出含有微衛(wèi)星的EST 序列，根據(jù)這些含有微衛(wèi)星的EST序列利用在線引物設(shè)計(jì)軟件 Premier3. 0(http:/7frodo. wl. mit. Edu/cgibin/primer3/primer 3—www. cgi)設(shè)計(jì)EST-SSRs引物，共設(shè)計(jì)了 50對引物，引物設(shè)計(jì)主要參數(shù) 為引物長18-22bp ，最適20bp;引物退火溫度55-65X:，上下引物之間退 火溫度不超過5°C; GC含量40%-60%，最適50%; PCR預(yù)期產(chǎn)物長150-300bp。 由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。適用于太平洋牡蠣的引物序列
F-------- 5， GCAGAGATGGTCTGGAAAGC 3，
R---------5， CTGGCTGGAGAAGAACAAGG 3，。
4、 EST-SSRs的PCR擴(kuò)增
DNA片段的定性檢測可以用瓊脂糖凝膠電泳檢測。首先對上述EST-SSRs 引物進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增。
5、 EST-SSRs的特異位點(diǎn)的鑒定
瓊脂糖凝膠電泳分辨率較低，PCR擴(kuò)增DNA片段產(chǎn)物的長度相差在15 bp 以下時(shí)則難以區(qū)分，只能作初步判斷，不可檢測差異很小往往是幾個(gè)堿基的微衛(wèi)星多態(tài)性。所以，本發(fā)明先采用瓊脂糖凝膠C泳'^JI;,.fi^采超聚丙烯
酰胺凝膠電泳檢測，分析微衛(wèi)星多態(tài)性。
(一) 瓊脂糖凝膠電泳
PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段在范圍內(nèi)表現(xiàn)為單一條 帶，如圖2所示。
(二) 聚丙烯酰胺凝膠電泳
(1) 玻璃板的清洗用試管刷沾上洗滌劑把玻璃板擦洗干凈后，用清 水沖洗干凈，放入烘箱備用。
(2) 凝膠的灌制玻璃板清洗干凈并且烘干后，用膠條將兩塊板子底 部封住，然后用夾子固定好。將配制好的膠液(30%丙烯酰胺溶液10ml， 5 倍TBE6ml，雙蒸水14ml， 10%過硫酸胺溶液200 u 1， TEMED15 ti 1)沿著梳 子插槽邊緣緩慢地倒入玻璃板的空隙中(不能產(chǎn)生氣泡)，然后立即插入梳 子。如果出現(xiàn)氣泡，可以輕輕敲玻璃板，使氣泡溢出。 一般聚合30min便 可聚合完全。如室溫較低時(shí)，聚合時(shí)間適當(dāng)延長。
(3) 上樣與凝膠電泳劃開玻璃板下端膠帶，固定在電泳槽上，電泳 槽上端加滿1倍TBE。用注射器沖洗加樣孔(輕柔)。
(4) 140V電壓，預(yù)電泳15分鐘，同時(shí)準(zhǔn)備點(diǎn)樣。
(5) 擴(kuò)增產(chǎn)物與上樣緩沖液按體積比l: 5混勻后，用移液槍加入點(diǎn)樣 孔內(nèi)。點(diǎn)樣后，不可挪動電泳槽或取下玻璃板。1倍TBE， 130V恒壓電泳6個(gè) 小時(shí)。
(三)、銀染方法來觀察結(jié)果 銀染按照許紹斌的方法并略作改進(jìn),具體步驟如下
(1) 凝膠的固定電泳結(jié)束后，關(guān)閉電泳儀,拿出玻璃板并用小刀小心撬 開，移走上層玻璃板，輕輕用小刀把膠剝開一角，放入加有固定液的瓷盤中 (固定液10%乙醇溶液，每板用量為200ml)在搖床上緩緩搖動10min。
(2) 洗膠:倒掉瓷盤中的固定液，用雙蒸水洗3次，共計(jì)lmin;
(3) 凝膠的染色:倒掉瓷盤中的水,加入染色液(O. P/。AgN03溶液，每板 200ml),在搖床上緩緩搖動染色15min;(4)洗膠:倒掉瓷盤中的染色液，用雙蒸水洗3!f，共ifl、ctifi;
(5) 顯色加入顯色液(2g NaOH， 0. lg Na2C03，加雙蒸水到250ml，在 加入800ul甲醛)，振蕩顯色， 一般5-15min內(nèi)，帶型顯現(xiàn)。
(6) 終止待帶型清晰時(shí)，將膠用清水沖洗干凈，以防止污染儀器，然 后放置在掃描儀上掃描。(在膠上鋪一層吸水紙以防止掃描儀蓋子與聚丙 烯酰胺凝膠之間的氣泡影響掃描效果。)
經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測的有清晰且穩(wěn)定條帶的PCR產(chǎn)物，再進(jìn)行聚 丙烯酰胺凝膠電泳檢測，最后此弓I物在太平洋牡蠣群體表現(xiàn)出特異性條帶 清晰并且有多態(tài)性。
太平洋牡蠣群體在位點(diǎn)S5PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在聚丙烯酰胺凝膠凝膠電泳上
有兩個(gè)等位基因，表現(xiàn)出此位點(diǎn)的多態(tài)性(見圖3);而其他牡蠣群體中 在聚丙烯酰胺凝膠凝膠電泳上只有一條帶，即一個(gè)等位基因存在，沒有的 多態(tài)性(見圖4)。位點(diǎn)S5在太平洋牡蠣群體中有多態(tài)性，而在褶牡蠣和 近江牡蠣等群體中沒有。 實(shí)施例2:
牡蠣群體特異性微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因純合體的基因型的序列測定， 為了進(jìn)一步說明上述特殊位點(diǎn)，本發(fā)明對這特異性位點(diǎn)的純合體基因型進(jìn) 行了克隆，具體過程如下
經(jīng)過PCR擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物100ml經(jīng)過純化后進(jìn)行連接反應(yīng)，提前制 備LB液體培養(yǎng)基和LB固體培養(yǎng)基，連接反應(yīng)進(jìn)行完畢后，連接液在無菌 操作臺上進(jìn)行涂板，然后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后在4度冰箱里進(jìn)行 顯色反應(yīng)，然后挑取白色的大小適中的單個(gè)菌落在液體培養(yǎng)基中搖菌，搖 菌過程也是在培養(yǎng)箱中進(jìn)行。最后以菌液為模板進(jìn)行PCR檢測，在瓊脂糖 凝膠電泳上檢測PCR產(chǎn)物，如果膠上有目標(biāo)片段，證明克隆成功，然后將 菌液送至大連寶生物工程有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果見圖5。從測序的峰 圖5可以看出，這些位點(diǎn)是的微衛(wèi)星，如位點(diǎn)S5在太平洋牡蠣的純合體中 分別含有7個(gè)微衛(wèi)星。
通過以上說明本發(fā)明提供了一種很好的鑒別太平洋牡蠣種群的方法，在三個(gè)牡蠣群體的研究中，基因座位S5，在;t乎洋:牡蠣群體.中^",^個(gè)等位
基因表現(xiàn)多態(tài)，而在褶牡蠣自然群體和近江牡蠣養(yǎng)殖群體中沒有擴(kuò)增出特 異條帶。這個(gè)位點(diǎn)可以作為區(qū)分種群的特異性標(biāo)記。
權(quán)利要求
1、鑒定太平洋牡蠣種群的新方法，其特征是1)樣本采集分別采集褶牡蠣、太平洋牡蠣和近江牡蠣不同的種群樣本個(gè)體；2)基因組提取提取上述樣本每種牡蠣群體的多個(gè)樣本的基因組；3)引物設(shè)計(jì)根據(jù)含有微衛(wèi)星的EST序列設(shè)計(jì)EST-SSRs引物；4)PCR擴(kuò)增利用EST-SSRs引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的片段的PCR產(chǎn)物；5)EST-SSRs特異位點(diǎn)的鑒定對PCR產(chǎn)物先進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，得到具有清晰且穩(wěn)定條帶的PCR產(chǎn)物，再進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，進(jìn)行多態(tài)性位點(diǎn)檢測，鑒定出具有特異的EST微衛(wèi)星序列的等位基因位點(diǎn)太平洋牡蠣種群。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定太平洋牡蠣種群的新方法，其特征是 樣本采集分別選取褶牡蠣、太平洋牡蠣、近江牡蠣，每個(gè)牡蠣取其閉殼 肌放入1. 5ml離心管中，加入95。/。乙醇后放入-2(TC冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的鑒定太平洋牡蠣種群的新方法，其特征是 基因組提取采用經(jīng)典酚-仿抽提法從牡蠣肌肉中提取牡蠣的全基因組DNA。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定太平洋牡蠣種群的新方法，其特征是 EST-SSRs引物設(shè)計(jì)從NCBI (http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov/)的EST庫 中搜索太平洋牡蠣的EST序列，然后用在線軟件SSRIT(http:〃www. gramene. org/db/markers/ssrtool)找出含有微衛(wèi)星的EST 序列，根據(jù)這些含有微衛(wèi)星的EST序列利用在線引物設(shè)計(jì)軟件 Premier3. 0(http://frodo. wi. mit. Edu/cgibin/primer3/primer 3—www.cgi)設(shè)計(jì)EST-SSRs引物，引物設(shè)計(jì)主要參數(shù)為引物長18-22bp ， 最適20bp;引物退火溫度55-65。C，上下引物之間退火溫度不超過5。C; GC 含量40°/。-60%，最適50%; PCR預(yù)期產(chǎn)物長150-300bp。
5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定太平洋牡蠣種群酌新.方*^ 其特征是-EST-SSRs引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)適用于太平洋牡蠣的引物序列F--------5， GCAGAGATGGTCTGGAAAGC 3，r---------5， ctggctggagaagaacaagg 3，。
6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定太平洋牡蠣種群的新方法，其特征是: EST-SSRs的PCR擴(kuò)增以提取的全基因組DNA樣品分別為模板，對EST-SSRs 引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。
7、根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的鑒定太平洋牡蠣種群的新方法，其特 征是EST-SSRs特異位點(diǎn)的鑒定首先經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳，得到擴(kuò)增條 帶穩(wěn)定、條帶清晰的PCR產(chǎn)物；再進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，擴(kuò)增條帶穩(wěn)定、 條帶清晰且有多態(tài)性的EST-SSRs引物即是太平洋牡蠣群體。
全文摘要
本發(fā)明涉及鑒定牡蠣種群的方法。鑒定太平洋牡蠣種群的新方法，樣本采集分別采集褶牡蠣、太平洋牡蠣和近江牡蠣不同的種群樣本個(gè)體；基因組提取提取上述樣本每種牡蠣群體的多個(gè)樣本的基因組；引物設(shè)計(jì)根據(jù)含有微衛(wèi)星的EST序列設(shè)計(jì)EST-SSRs引物；PCR擴(kuò)增利用EST-SSRs引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的片段的PCR產(chǎn)物；EST-SSRs特異位點(diǎn)的鑒定對PCR產(chǎn)物先進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，得到具有清晰且穩(wěn)定條帶的PCR產(chǎn)物，再進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，進(jìn)行多態(tài)性位點(diǎn)檢測，鑒定出具有特異的EST微衛(wèi)星序列的等位基因位點(diǎn)太平洋牡蠣種群。本發(fā)明利用了EST-SSRs分子標(biāo)記技術(shù)，引物設(shè)計(jì)合理，二步電泳檢測，達(dá)到鑒定太平洋牡蠣種群的目的，方法簡單，省時(shí)且分析準(zhǔn)確。
文檔編號C12Q1/68GK101613741SQ20091001311
公開日2009年12月30日 申請日期2009年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月11日
發(fā)明者仇雪梅, 劉少貞, 麗 徐, 柳曉瑜, 王秀利 申請人:大連水產(chǎn)學(xué)院