專利名稱：一種血吸蟲感染性釘螺檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫DNA擴增檢測血吸蟲感染性釘螺的試劑盒 及檢測方法，屬于一寄生蟲病傳播媒介檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
釘螺是血吸蟲的唯一中間宿主，是血吸蟲病的唯一的傳播媒介。消滅血吸 蟲感染性釘螺可以阻斷血吸蟲病的傳播與流行。對血吸蟲感染性釘螺的分布進(jìn) 行調(diào)查，有選擇性地進(jìn)行化學(xué)滅螺是提高血吸蟲病傳播阻斷效果，最大限度地 保護(hù)生態(tài)平衡的一個重要手段。檢測血吸蟲感染性釘螺的方法有多種
肉眼觀察法
在自然光線下或人工燈光照射下，通過觀察釘螺的第4螺層以下的螺殼的 顏色與透光度的變化，以及釘螺肝組織與螺殼之間有無間隙來判斷釘螺是否感
染血吸蟲。這個方法雖然簡便易行，但誤差大，準(zhǔn)確性只有60%左右，漏檢率 高，不能鑒定血吸蟲感染早期的釘螺。 壓片鏡檢法
將釘螺外殼壓碎，使釘螺軟組織暴露出來，顯微鏡下通過觀察釘螺組織中 是否有血吸蟲母胞呦或尾呦來判斷釘螺是否感染了血吸蟲。該方法對血吸蟲感 染晚期，尤其是對體內(nèi)有發(fā)育成熟的血吸蟲尾蚴存在的感染性釘螺檢測的準(zhǔn)確 性很高，但對于處于血吸蟲感染早期階段釘螺仍不能檢出，檢測過程需要使用 顯微鏡，不便于血吸蟲病防治現(xiàn)場使用。
孵化法
將釘螺置于盛有清水的試管或其它玻璃容器中，室溫下(22-25°C)孵育2-3 小時，觀察釘螺體內(nèi)是否有血吸蟲尾呦孵出，以判斷是否是血吸蟲感染性釘螺。 該方法同樣操作簡便，對血吸蟲感染晚期的感染性釘螺檢測出率高，但同樣不 能檢出血吸蟲感染早期的釘螺。
循環(huán)抗原檢測法
先制備抗血吸蟲循環(huán)抗原的特異性單克隆抗體，再構(gòu)建檢測血吸蟲循環(huán)抗 原的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，以此方法來檢測血吸蟲感染性釘螺。該方法的 優(yōu)點是鑒定血吸蟲感染性釘螺有很高的敏感性與特異性，但操作煩瑣，技術(shù)、 設(shè)備要求高，不適合于血吸蟲病防治現(xiàn)場使用。
聚合酶鏈反應(yīng)法
設(shè)計血吸蟲基因特異性引物，通過對釘螺組織的DNA樣本進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增，觀察釘螺DNA樣本中是否存在血吸蟲特異性DNA片段存在。 該方法檢測血吸蟲感染性釘螺具有高度的敏感性與特異性，但是需要使用PCR 儀，DNA電泳儀等昂貴設(shè)備，耗時長，成本高，難于在血吸蟲病防治現(xiàn)場使用。 環(huán)介導(dǎo)等溫DNA擴增法
選擇血吸蟲基因中的特異性DNA片段，根據(jù)環(huán)介導(dǎo)同溫DNA擴增原理， 設(shè)計4對或6對特異性引物，在同一個溫度下對樣本中的血吸蟲特異性DNA片 段進(jìn)行擴增，通過肉眼觀察擴增產(chǎn)物顔色的變化來判斷樣本中是否存在血吸蟲 特異性DNA片段，具有高度的特異性和敏感性，檢測時間短，操作簡便，能檢 測血吸蟲感染早期的感染性釘螺，適合于血吸蟲病現(xiàn)場防治人員對血吸蟲感染 性釘螺進(jìn)行鑒定和用于大規(guī)模的分布調(diào)査。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種環(huán)介導(dǎo)等溫DNA擴增檢測血吸蟲感染性釘螺的試 劑盒及檢測方法，可以解決以往的血吸蟲感染性釘螺檢測方法敏感性不足、或 需要復(fù)雜儀器設(shè)備等缺點，可用于血吸蟲病流行區(qū)有螺地帶血吸蟲感染性釘螺 的鑒定與分布調(diào)査。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明選擇日本血吸蟲基因非長未端重復(fù)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 基因(AF412214, SEQIDNO.l)的第20 bp至231 bp之間的DNA片段(SEQ IDN0.6)作為環(huán)介導(dǎo)等溫DNA擴增的靶DNA片段，根據(jù)環(huán)介等溫DNA擴增 的原理設(shè)計一組環(huán)介導(dǎo)等溫DNA擴增檢測血吸蟲感染性釘螺的引物。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是構(gòu)建一種環(huán)介導(dǎo)等溫DNA擴 增檢測血吸蟲感染性釘螺的試劑盒，該試劑盒由一套引物混合物，10倍濃縮的 環(huán)介導(dǎo)等溫DNA擴增反應(yīng)緩沖液，DNA聚合酶，陽性對照樣本，陰性對照樣 本，顯色試劑和樣本DNA抽提試劑組成；
所述的一套引物混合物是由一對外引物和一對內(nèi)引物組成，其名稱和序列 如下
外引物1: SEQIDNO.2, 外引物2: SEQIDN0.3， 內(nèi)引物1: SEQIDN0.4， 內(nèi)引物2: SEQIDNO.5,
所述的一對外引物與一對內(nèi)引物之間的摩爾數(shù)比例為1:6 9; 所述的DNA聚合酶為具有鏈置換作用的Bst DNA聚合酶，活性單位為 8U/|aL;
所述10倍濃縮的環(huán)介導(dǎo)等溫DNA擴增反應(yīng)緩沖液組成是200mmol三羥 甲基氨基甲烷、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、60-120mmol/L硫酸鎂、 體積百分"/。曲拉通-X100、 4 10mol/L甜菜堿和16mmol/L的dNTP;所述陽性對照樣本為含本發(fā)明試劑盒檢測的日本血吸蟲靶DNA片段的重組 質(zhì)粒；
所述的陰性對照樣本為滅菌去離子水；
所述的顯色試劑為10倍濃縮的熒光試劑SYBR Green I溶液； 所述的樣本DNA抽提試劑包括含50mmol/L三羥甲基氨基甲垸、體積百 分0.5。/。Tween-20、 pH8.0的樣本裂解液；10mg/mL蛋白酶K;用O.lmol/L的三 羥甲基氨基甲烷溶液平衡到pH8.0的苯酚；氯仿；8mol/L醋酸胺；無水乙醇； 70%乙醇；滅菌去離子水。
一套引物混合物為一對外引物與一對內(nèi)引物，外引物與內(nèi)引物之間的摩爾
數(shù)比例為1:8;
所述的一套引物混合物的組成是外引物l、 2|amol;外引物2、 2)imiol;內(nèi) 引物l、 16|amol;內(nèi)引物2、 16pmo1。
10倍濃縮的環(huán)介導(dǎo)等溫DNA擴增反應(yīng)緩沖液組成，其中硫酸鎂的優(yōu)選濃度 為80mmo1,甜菜堿的優(yōu)選濃度為8mo1。
試劑盒中陽性對照樣本為日本血吸蟲基因組DNA的PCR擴增產(chǎn)物與TA克 隆質(zhì)粒pGEM-T連結(jié)構(gòu)建的重組質(zhì)粒，其中含血吸蟲的SEQ IDN0.6基因序列；
制備的方法以所述外引物對日本血吸蟲基因組DNA進(jìn)行PCR擴增，擴 增產(chǎn)物與TA克隆質(zhì)粒pGEM-T連結(jié)構(gòu)建的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，抽 提質(zhì)粒DNA，經(jīng)DNA測序確定含耙DNA片段；紫外分光光度計測定質(zhì)粒DNA 的濃度后再用TE緩沖液稀釋到10ng/pL，即為陽性對照樣本；
TE緩沖液為pH值8.0、含200mmol/L三羥甲基氨基甲烷和lmmol/L四氨 基二乙酸。
基于環(huán)介導(dǎo)等溫DNA擴增LAMP的血吸蟲感染性釘螺的檢測方法，通過 使用一套特異性引物，利用LAMP技術(shù)擴增血吸蟲特定DNA片段區(qū)域，觀察 判斷釘螺是否感染了血吸蟲；
所用的一套特異性引物序列是SEQ IDN0.2 SEQ IDNO.5;
利用LAMP技術(shù)擴增血吸蟲特異性DNA片段區(qū)域，該特定區(qū)域是日本血 吸蟲基因非長未端重復(fù)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因AF412214的第20 bp至231 bp之間長 度為212bp的DNA片段；
(1)、釘螺樣本DNA的提取將釘螺外殼壓破，剪取約3mn^的釘螺肝組 織，置于一個無菌的玻璃勻漿器中，加入0.5mL樣本裂解液，手工勻漿，破碎 組織；將勻漿液轉(zhuǎn)移到一無菌的1.5mL塑料離心管中，加入蛋白酶K溶液10pL， 混勻，55。C水浴保溫1小時；10， OOOrpm離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移到一新的 1.5mL塑料離心管中；加入2倍體積苯酚，顛倒混勻200次，再以10， 000rpm 離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一的1.5mL塑料離心管中；加入2倍體積氯仿顛倒混勻200次，再以10， OOOrpm離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一的1.5mL 塑料離心管中；加入O.l體積8mmol/L醋酸胺，混勻，加入2倍體積無水乙醇， 混勻，以10， 000rpm離心10min，去掉上清液，沉淀物用70%乙醇洗滌2次； 在室溫下千燥沉淀物，再加入20pL無菌去離子水溶解沉淀的DNA;
(2) 、環(huán)介導(dǎo)等溫DNA擴增取3個0.2mLPCR用薄壁管，分別標(biāo)記為陽 性對照管，檢測管，陰性對照管；各管中加入如下成分10倍LAMP緩沖液2.5i^iL， 2mmoldNTP8iaL，引物混合物2.5pL;陽性對照管加入陽性對照樣本DNA 1|liL;
檢測管中加入待檢樣本DNA l!LlL;陰性對照管中加入去離子水l(LlL;最后各管
中加入去離子水lOpL;混勻，IO(TC水浴煮沸5min,立即至冰上冷卻，加入lpL 8U的BstDNA聚合酶，混勻，短暫離心后置60'C水浴箱保溫60min;然后轉(zhuǎn) 移到80。C水浴保溫5min;
(3) 、結(jié)果判斷選用如下兩種觀察方法之一，觀察判斷釘螺是否感染了 血吸蟲；
方法l):將含l嗎/ml溴化乙啶的2。/。瓊脂糖凝膠放入電泳槽中，加入pH8.0、 含0.04mol/L三羥甲基氨基甲烷和lmmol/L四胺基二乙酸的電泳緩沖液，使凝 膠浸于液面下3-5mm，取5pL擴增產(chǎn)物與2pL的含0.25%溴酚蘭、質(zhì)量濃度40% 蔗糖水溶液的凝膠載樣緩沖液混合，加入凝膠孔中，以l-5V/cm的電壓進(jìn)行電 泳，使樣本向陰極移動，當(dāng)溴酚藍(lán)移到凝膠的三分之二處時停止電泳，將凝膠 放在紫外燈上，觀察擴增產(chǎn)物中有無梯形DNA條帶出現(xiàn)，有梯形DNA條帶出 現(xiàn)，樣本為陽性；無梯形DNA條帶出現(xiàn)，樣本為陰性；
方法2):在反應(yīng)管中加入2pL 10倍濃縮的熒光試劑SYBRGreen I，混勻， 在自然光下觀察反應(yīng)物是否出現(xiàn)綠色熒光，有綠色熒光出現(xiàn)，樣本為陽性；無 綠色熒光出現(xiàn)，樣本為陰性。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明構(gòu)建了用于檢測感染性釘螺體內(nèi)血吸蟲基因的 LAMP方法，達(dá)到區(qū)別血吸蟲感染性釘螺和非常感染性釘螺之目的。該方法與 常規(guī)的血吸蟲感染性釘螺檢測方法相比，具有操作簡便快速、敏感特異、不需 要特殊的設(shè)備等特點，適合于血吸蟲病現(xiàn)場防治人員使用。


圖l: M、 50bpDNA低分子標(biāo)志物，1、 LAMP擴增產(chǎn)物，2、陰性對照。 圖2: 1、 LAMP擴增產(chǎn)物，2、陰性對照。
圖3: M、 100bp DNA低分子標(biāo)志物，1 10、 DNA模板量分別為10ng， lng， 100pg， 10pg， lpg， 100fg， 10fg, lfg， 0.1 fg,陰性對照。
圖4: 1 10、 DNA模板量分別為10ng， lng， 100pg， 10pg， lpg， 100fg， 10fg， lfg， 0.1 fg，陰性對照。
圖5: M、 100bpDNA低分子標(biāo)志物；1、日本血吸蟲基因組DNA; 2、華支睪吸蟲基因組DNA; 3、惡性瘧原蟲基因組DNA; 4、大腸桿菌基因組DNA。 圖6: 1、日本血吸蟲基因組DNA; 2、華支睪吸蟲基因組DNA; 3、惡件 瘧原蟲基因組DNA; 4、大腸桿菌基因組DNA; 5、無離子水對照。
具體實施例方式
實施例l:靈敏性研究
1) 標(biāo)準(zhǔn)靶DNA分子模板的制備
取純化的陽性對照樣本DNA，用TE緩沖液進(jìn)行稀釋10ng， lng， 100pg， 10pg， lpg， 100fg， 10fg， lfg， O.lfg。
2) 、環(huán)介導(dǎo)等溫DNA擴增與結(jié)果判斷
取一0.2mLPCR用薄壁管10個，按順序編號，分別加入如下成分10倍 LAMP緩沖液2.5|iL; dNTP (2mM) 8(iL; 10倍引物混合物2.5pL; 1 9管加入 不同濃度的DNA樣本lpL，第10號管為陰性對照加入lpL去離子水；各管再 加入去離子水10juL?；靹颍琁O(TC水浴煮沸5 min，立即至冰上，加入lpL (8U) BstDNA聚合酶，混勻，短暫離心后置60'C水浴箱保溫60min;然后轉(zhuǎn)移到80°C 水浴保溫5min。將擴增產(chǎn)物取5)aL與2pL的含0.25%溴酚蘭、質(zhì)量濃度40%蔗 糖水溶液的凝膠載樣緩沖液混合，加入凝膠孔中。以l-5V/cm的電壓進(jìn)行電泳， 電泳結(jié)束將凝膠放在紫外燈上進(jìn)行觀察，1 8管均有梯形DNA條帶山現(xiàn)，熒光 強度逐漸減弱，第9、 IO管沒有條帶出現(xiàn)為陰性。如附圖3所示。
在反應(yīng)管中加入2iuL 10倍濃縮的熒光試劑SYBR Green I，混勻，在自然光 下觀察1 8管均有出現(xiàn)綠色熒光，第9、 IO管沒有發(fā)生顔色改變。附圖4。
說明該方法的敏感性為lfg/^LDNA。
實施例2:特異性研究
分別取血吸蟲基因組DNA、肝吸蟲基因組DNA，瘧原蟲基因組DNA，大 腸桿菌基因組DNA，用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行擴增，同時以滅菌去離子水做陰性對 照。只有血吸蟲基因組出現(xiàn)陽性反應(yīng)，其余樣本均為陰性反應(yīng)。附圖5， 6。
實施例3:現(xiàn)場釘螺樣本檢測
在血吸蟲病流行區(qū)現(xiàn)場收集釘螺1000只。提取基因組DNA。用本發(fā)明的試 劑盒進(jìn)行檢測，同時以常規(guī)PCR方法檢測進(jìn)行對照。結(jié)果，IOOO只釘螺用本發(fā) 明的環(huán)介導(dǎo)同溫DNA擴增試劑盒檢測有56只釘螺為陽性，陽性率為5.6%，而 用PCR方法檢測，有52個釘螺為陽性，陽性率為5.2%,顯示環(huán)介導(dǎo)等溫DNA 擴增方法的敏感性比常規(guī)PCR方法的靈敏性高，操作更加簡單。
9序 列 表
<210〉 SEQIDNO: 1 <211> 4120 <212> DNA
<213〉 曰本血卩及蟲(5b/7/^stosom" y(2pow/cwm)
<400> 1
atcccgctcc cattcgcttg cggggacccc agctgaacag aaatgg犯cg tgcctatgct ttatgacctt tgcccaagta ggctcaacga tctcgcaagc atcaacccaa
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acttcaccttgg咖cggctcagttcactcttcgtgtttc120
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gattagttag
taatggtctt ttcagtcata
￡L￡LCCtCt￡lCt
2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4120
<210〉 SEQIDNO.2: <211〉 19 <212> DNA
<400> 2
tgctgcatct ctgaaacgc 19<210〉 SEQ ID NO.3: <211> 18 <212> DNA
<400> 3
gcgcacaatc gactgtct 18
<210> SEQ ID NO.4: <211> 42 <212> DNA
<400〉 4
gagtgaactg agccggttcc ttatccaagc acagtcattc gc 42
<210〉 SEQ ID NO.5: <211> 39 <212> DNA
<400> 5
cgctaccact cgaggccttg cagtcgagga gagcctgtt 39
<210> SEQ ID NO.6: <211> 212 <212> DNA
<400> 6
tgctgcatct ctgaaacgcg tatacaggat ccaagcacag tcattcgctt gacttcacct 60
tgtgaaaata aggaaccggc tcagttcact cttcgtgttt ccggggaccc caccgctacc 120
actcgaggcc ttgctggtgt aggtatagca ctaagtttaa aagctgaaca ggctctcctc 180
gactggattc caatagacag tcgattgtgc gc 21權(quán)利要求
1、一種血吸蟲感染性釘螺檢測試劑盒，其特征是該試劑盒由一套引物混合物，10倍濃縮的環(huán)介導(dǎo)等溫DNA擴增反應(yīng)緩沖液，DNA聚合酶，陽性對照樣本，陰性對照樣本，顯色試劑和樣本DNA抽提試劑組成；所述的一套引物混合物是由一對外引物和一對內(nèi)引物組成，其名稱和序列如下外引物1SEQ ID NO.2，外引物2SEQ ID NO.3，內(nèi)引物1SEQ ID NO.4，內(nèi)引物2SEQ ID NO.5，所述的一對外引物與一對內(nèi)引物之間的摩爾數(shù)比例為1:6～9；所述的DNA聚合酶為具有鏈置換作用的Bst DNA聚合酶，活性單位為8U/μL；所述10倍濃縮的環(huán)介導(dǎo)等溫DNA擴增反應(yīng)緩沖液組成是200mmol三羥甲基氨基甲烷、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、60-120mmol/L硫酸鎂、體積百分1％曲拉通-X100、4～10mol/L甜菜堿和16mmol/L的dNTP；所述陽性對照樣本為含本發(fā)明試劑盒檢測的日本血吸蟲靶DNA片段的重組質(zhì)粒；所述的陰性對照樣本為滅菌去離子水；所述的顯色試劑為10倍濃縮的熒光試劑SYBR Green I溶液；所述的樣本DNA抽提試劑包括含50mmol/L三羥甲基氨基甲烷、體積百分0.5％Tween-20、pH8.0的樣本裂解液；10mg/mL蛋白酶K；用0.1mol/L的三羥甲基氨基甲烷溶液平衡到pH8.0的苯酚；氯仿；8mol/L醋酸胺；無水乙醇；70％乙醇；滅菌去離子水。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是一套引物混合物為一對外引物 與一對內(nèi)引物，外引物與內(nèi)引物之間的摩爾數(shù)比例為1:8;所述的一套引物混合物的組成是外引物K 2pmol;外引物2、 2pmol;內(nèi) 引物l、 16,ol;內(nèi)引物2、 16|amol。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是10倍濃縮的環(huán)介導(dǎo)等溫DNA 擴增反應(yīng)緩沖液組成，其中硫酸鎂的優(yōu)選濃度為80mmo1,甜菜堿的優(yōu)選濃度為 8mo1。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是試劑盒中陽性對照樣本為曰本 血吸蟲基因組DNA的PCR擴增產(chǎn)物與TA克隆質(zhì)粒pGEM-T連結(jié)構(gòu)建的重組質(zhì)粒，其中含血吸蟲的SEQIDNO,6基因序列；制備的方法以所述外引物對日本血吸蟲基因組DNA進(jìn)行PCR擴增，擴 增產(chǎn)物與TA克隆質(zhì)粒pGEM-T連結(jié)構(gòu)建的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5oc，抽 提質(zhì)粒DNA，經(jīng)DNA測序確定含靶DNA片段；紫外分光光度計測定質(zhì)粒DNA 的濃度后再用TE緩沖液稀釋到10ng/pL，即為陽性對照樣本；TE緩沖液為pH值8.0、含200mmol/L三羥甲基氨基甲烷和lmmol/L四氨 基二乙酸。
5、一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫DNA擴增LAMP的血吸蟲感染性釘螺的檢測方法， 其特征是通過使用一套特異性引物，利用LAMP技術(shù)擴增血吸蟲特定DNA片 段區(qū)域，觀察判斷釘螺是否感染了血吸蟲；所用的一套特異性引物序列是SEQ ID N0.2 SEQ ID NO.5;利用LAMP技術(shù)擴增血吸蟲特異性DNA片段區(qū)域，該特定區(qū)域是日本血 吸蟲基因非長未端重復(fù)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因AF412214的第20 bp至231 bp之間長 度為212bp的DNA片段；(1) 、釘螺樣本DNA的提取將釘螺外殼壓破，剪取約3mmS的釘螺肝組 織，置于一個無菌的玻璃勻漿器中，加入0.5mL樣本裂解液，手工勻漿，破碎 組織；將勻漿液轉(zhuǎn)移到一無菌的1.5mL塑料離心管中，加入蛋白酶K溶液10pL， 混勻，55。C水浴保溫1小時；10， 000rpm離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移到一新的 1.5mL塑料離心管中；加入2倍體積苯酚，顛倒混勻200次，再以10， 000rpm 離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一的1.5mL塑料離心管中；加入2倍體積氯仿 顛倒混勻200次，再以10， 000rpm離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移到另一的1.5mL 塑料離心管中；加入O.l體積8mmol/L醋酸胺，混勻，加入2倍體積無水乙醇， 混勻，以10， 000rpm離心10min，去掉上清液，沉淀物用70%乙醇洗滌2次； 在室溫下干燥沉淀物，再加入20pL無菌去離子水溶解沉淀的DNA;(2) 、環(huán)介導(dǎo)等溫DNA擴增取3個0.2mLPCR用薄壁管，分別標(biāo)記為陽 性對照管，檢測管，陰性對照管；各管中加入如下成分10倍LAMP緩沖液2.5^iL， 2mmoldNTP8pL，引物混合物2.5jxL;陽性對照管加入陽性對照樣本DNA lpL; 檢測管中加入待檢樣本DNA lpL;陰性對照管中加入去離子水lpL;最后各管 中加入去離子水10|_iL;混勻，IO(TC水浴煮沸5 min,立即至冰上冷卻，加入l|dL 8U的Bst DNA聚合酶，混勻，短暫離心后置6(TC水浴箱保溫60min;然后轉(zhuǎn) 移到8(TC水浴保溫5min;(3) 、結(jié)果判斷選用如下兩種觀察方法之一，觀察判斷釘螺是否感染了 血吸蟲；方法l):將含l嗎/ml溴化乙啶的2。/o瓊脂糖凝膠放入電泳槽中，加入pH8.0、 含0.04mol/L三羥甲基氨基甲烷和lmmol/L四胺基二乙酸的電泳緩沖液，使凝膠浸于液面下3-5mm，取5fiL擴增產(chǎn)物與2fiL的含0.25%溴酚蘭、質(zhì)量濃度40% 蔗糖水溶液的凝膠載樣緩沖液混合，加入凝膠孔中，以l-5V/cm的電壓進(jìn)行電 泳，使樣本向陰極移動，當(dāng)溴酚藍(lán)移到凝膠的三分之二處時停止電泳，將凝膠 放在紫外燈上，觀察擴增產(chǎn)物中有無梯形DNA條帶出現(xiàn)，有梯形DNA條帶出 現(xiàn)，樣本為陽性；無梯形DNA條帶出現(xiàn)，樣本為陰性；方法2):在反應(yīng)管中加入2pL 10倍濃縮的熒光試劑SYBR Green I，混勻， 在自然光下觀察反應(yīng)物是否出現(xiàn)綠色熒光，有綠色熒光出現(xiàn)，樣本為陽性；無 綠色熒光出現(xiàn)，樣本為陰性。
全文摘要
一種血吸蟲感染性釘螺檢測試劑盒及其檢測方法，屬于寄生蟲病傳播媒介檢測領(lǐng)域。本發(fā)明提供一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫DNA擴增技術(shù)(LAMP)檢測血吸蟲感染性釘螺的試劑盒和檢測方法，該試劑盒是根據(jù)LAMP技術(shù)原理，設(shè)計擴增日本血吸蟲非長未端重復(fù)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子基因(AF412214)的第20bp至231bp之間的DNA片段的6對特異性引物，構(gòu)建用于檢測感染性釘螺體內(nèi)血吸蟲基因的LAMP方法，達(dá)到區(qū)別血吸蟲感染性釘螺和非常感染性釘螺之目的。該方法與常規(guī)的血吸蟲感染性釘螺檢測方法相比，具有操作簡便快速、敏感特異、不需要特殊的設(shè)備等特點，適合于血吸蟲病現(xiàn)場防治人員使用。
文檔編號C12Q1/68GK101457258SQ20081024271
公開日2009年6月17日 申請日期2008年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月26日
發(fā)明者余傳信, 殷旭仁, 琪 高 申請人:江蘇省血吸蟲病防治研究所