專利名稱：：一種防治煙草赤星病的球孢鏈霉菌菌劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物農(nóng)藥，更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種防治煙草赤星病的菌劑及其制備方法。'
背景技術(shù)：
：煙草是我國(guó)重要的葉用經(jīng)濟(jì)作物，是病害危害最嚴(yán)重的作物之一，從播種到收獲，整個(gè)過(guò)程都可受到病原物的侵染。煙草赤星病(TobaccoBrownSpotDisease)是煙葉成熟后期重要的葉部病害，在各煙區(qū)普遍發(fā)生，是我國(guó)煙草的主要病害。近年來(lái)，我國(guó)的湖南、安徽、貴州、云南、陜西、遼寧、浙江、廣東、福建、黑龍江、吉林等省的赤星病也有所發(fā)展，成為為害最大的一種葉斑病，一般年份發(fā)病率為20%30%，嚴(yán)重的發(fā)病率達(dá)90%、減少產(chǎn)值達(dá)50%以上，對(duì)產(chǎn)量、.質(zhì)量影響較大。煙草赤星病是一種典型的氣傳病害，目前國(guó)內(nèi)在防治時(shí)主要以保健栽培等農(nóng)業(yè)措施和大劑量的化學(xué)農(nóng)藥等防治措施，缺乏可供區(qū)域栽培的抗性品種；多年使用菌核凈進(jìn)行防治，導(dǎo)致用藥成本在逐年攀升，防治效果在逐步減弱，一些病原真菌已;^i:抗藥性，防治難度也隨之加大。由于化學(xué)藥劑極易形成藥害，施藥時(shí)也易受雨水的沖刷而失效，而且缺乏高效低毒化學(xué)防治藥劑，連續(xù)用藥易造成農(nóng)藥殘留，對(duì)環(huán)境造成的惡劣影響，污染水源，造成人畜中毒、死亡，同時(shí)也使病原菌產(chǎn)生抗藥性，致使其使用受到一定限制。另一方面，煙草赤星病是煙草成熟期病害，由于對(duì)煙草安全性的要求越來(lái)越高，對(duì)煙草栽培本身來(lái)說(shuō)，就提出了更高的要求，特別是對(duì)于煙草赤星病這種成熟期病害的防治不大適宜采用有殘留的化學(xué)藥劑。這是本領(lǐng)域一個(gè)急待解決的技術(shù)難題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種有效、無(wú)毒、安全、無(wú)殘留、使用簡(jiǎn)便的防^煙草赤星病的菌劑。同時(shí)，本發(fā)明還提供一種所述菌劑的制備方法。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)。A.本發(fā)明提供了一種防治煙草赤星病的菌劑，該菌劑采用的放線菌是分類命名為球孢鏈霉菌(5^e/tom;;c"g/o6&/on)AM6,保藏編號(hào)為CGMCCNo.1701。本發(fā)明的生產(chǎn)菌株球孢鏈霉菌(S加/to附y(tǒng)cesg/oZ^pon)AM6，分離自云南蒙自典型的煙草赤星病病斑上，室內(nèi)離體葉片懸滴法測(cè)定發(fā)現(xiàn)100倍帶菌培養(yǎng)液對(duì)赤星病的防效均達(dá)100%,平皿測(cè)定發(fā)現(xiàn)AM6100倍帶菌培養(yǎng)液對(duì)強(qiáng)致病力病菌的抑制作用為100%,其滅菌濾液的抑制效果為81.8%，其抑菌機(jī)理主要是產(chǎn)生拮抗物質(zhì)，顯微鏡觀察表明AM6能使病菌孢子和菌絲畸變，細(xì)胞壁破裂，原生質(zhì)泄露。該菌株具有以下特征①在高氏一號(hào)瓊脂和天門(mén)冬素瓊脂上28r培養(yǎng)710天后，菌株AM6基內(nèi)菌絲無(wú)橫隔，不斷裂，無(wú)孢囊；氣生菌絲分枝較多；孢子絲直或彎曲，偶叢生；孢子球形或卵圓形，表面光滑。在8種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的結(jié)果見(jiàn)表1。表l.菌株AM6在8種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征培養(yǎng)基基內(nèi)菌絲氣生菌絲可溶色素②全細(xì)胞水解液含有LL-二氨基庚二酸(LL-DAP，LL-Diaminopimelicacid),甘氨酸，糖無(wú)特征性(糖型C);含有磷脂酰乙醇胺(PE)，磷酸類脂為II型。③具有以下生理生化特性氨酸酶陰性，可在纖維素上生長(zhǎng)，產(chǎn)生類黑色素，不產(chǎn)生H2S,液化明膠，胨化牛奶，不凝固牛奶，水解淀粉，還原硝酸鹽，利用L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-木糖、半乳糖，不利用甘露糖、棉籽糖、肌醇。葡萄糖天門(mén)冬素瓊月！酵母精麥芽精瓊脂高氏合成一號(hào)瓊脂蔗糖硝酸鹽瓊脂無(wú)機(jī)鹽淀粉瓊脂淀粉銨鹽瓊脂土豆浸出瓊脂燕麥粉瓊脂無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)無(wú)黃黃灰灰淺淺白灰綠黃黃米色秸黃黃米米微褐褐棕色色褐黃褐色淺淺無(wú)無(wú)淺微棕褐B.本發(fā)明提供了球孢鏈霉菌(Sfre/tow;;cesg/o6&;oms)AM6生物制劑的制備方法，該法采用以下步驟l.試管種培養(yǎng)試管斜面培養(yǎng)基配方為新鮮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂17-20g，蒸餾水1000ml，pH自然。將球孢鏈霉菌(Sfr印tomycesg/o&s;on^)AM6劃線接種到試管斜面培養(yǎng)基上，在28。C士1。C恒溫培養(yǎng)45天，獲得試管種。2.液體發(fā)酵培養(yǎng)液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為黃豆粉10.0g,蔗糖20.0g，磷酸氫二鉀2g、硫酸亞鐵0.02g、碳酸錦0.5g、硫酸鎂0.05g、自來(lái)水1000ml、pH自然。將每支試管斜面加無(wú)菌水5-10ml，用接種環(huán)刮下分生孢子，搖勾，形成孢子懸液，以0.2%的體積比接入裝培養(yǎng)液量為40%60%(裝培養(yǎng)液的容積與容器的容積比)的三角瓶中，于28。C士rC恒溫150~200轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)78天，涂片，鏡檢，產(chǎn)生大量孢子，平板計(jì)數(shù)測(cè)定含孢量，當(dāng)每毫升含孢量達(dá)100億以上時(shí)，停止發(fā)酵，室溫靜置12小時(shí)。3.制劑化球孢鏈霉菌(&w/tom_yc"g/o6Z^orus)AM6的菌劑為液體發(fā)酵制劑，制備方法如下發(fā)酵靜置后的菌液加入0.5%羧甲基纖維素鈉、0.2%的苯甲酸納、5%的菌核凈，50轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速漸漸加速攪拌至250轉(zhuǎn)/分鐘時(shí)，恒速連續(xù)攪拌15分鐘，膠體磨破碎，過(guò)200目流體篩，裝入塑料旋蓋瓶中。該液體發(fā)酵制劑保質(zhì)期1年，施用時(shí)需要充分搖勻。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果1.本發(fā)明利用生物防治技術(shù)，研制成功了一種高效、無(wú)毒、安全、無(wú)殘留、使用簡(jiǎn)便的防治煙草赤星病的菌劑。這對(duì)減輕病害危害、減少化學(xué)農(nóng)藥的使用量、減少環(huán)境污染、降低農(nóng)藥殘留都具有良好效果；2.本發(fā)明對(duì)克服病原真菌的抗藥性，提高煙葉品質(zhì)，增強(qiáng)煙草農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性，保障煙草產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和廣闊的應(yīng)用前景，將會(huì)在未來(lái)的進(jìn)出口貿(mào)易竟?fàn)幹姓加杏欣牡匚弧１２厣锊牧系恼f(shuō)明本發(fā)明所釆用菌株，已于2006年4月24曰在位于中囯北京中關(guān)村的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏，分類命名為球孢鏈霉菌(Sfreptow;^"g/06&;70ms)AM6,保藏編號(hào)為CGMCCNo.1701。具體實(shí)施例方式通過(guò)下面給出的具體實(shí)施例和應(yīng)用實(shí)施例，可以進(jìn)一步清楚地了解本發(fā)明。但它們不是對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。實(shí)施例l一一液體發(fā)酵菌劑制備方法1(1)菌種制備將球孢鏈霉菌(S伊e/tow;;cesg/o6/j/7oms)AM6菌株劃線接種到試管斜面培養(yǎng)基(新鮮馬鈴薯200g,葡萄糖20g，瓊脂17-20g，蒸餾水1000ml，pH自然。)上，在28。C恒溫培養(yǎng)45天，獲得試管種。(2)液體發(fā)酵培養(yǎng)將每支試管斜面加無(wú)菌水10ml，用接種環(huán)刮下分生孢子，搖勻，形成孢子懸液，以0.2%的體積比接入裝有3001111培養(yǎng)液(黃豆粉10.0g,蔗糖20.0g，磷酸氫二鉀2g、硫酸亞鐵0.02g、碳酸鈣0.5g、硫酸鎂0.05g、自來(lái)水1000ml、pH自然。)的500ml三角瓶中，于28。C恒溫150~200轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)7~8天，涂片，鏡檢，產(chǎn)生大量孢子，平板計(jì)數(shù)測(cè)定含孢量，當(dāng)每毫升含孢量達(dá)100億以上時(shí)，停止發(fā)酵，室溫靜置12小時(shí)。(3)制劑化本發(fā)明生防菌株球孢鏈霉菌(Sfrepto/^cMg/o6z'57on^)AM6的菌劑為液體發(fā)酵制劑，制備方法如下發(fā)酵靜置后的菌液加入0.5%羧甲基纖維素鈉、0.2%的苯甲酸納、5%的菌核凈，50轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速漸漸加速攪拌至250轉(zhuǎn)/分鐘時(shí)，恒速連續(xù)攪拌15分鐘，膠體磨破碎，過(guò)200目流體篩，裝入250ml塑料旋蓋瓶中。即得本發(fā)明的液體菌劑。實(shí)施例2一一液體發(fā)酵制劑制備方法2(1)菌種制備同實(shí)施例1。(2)液體發(fā)酵培養(yǎng)分為搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)和發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)除培養(yǎng)發(fā)酵時(shí)間縮短至45天外，其余同上例中的液體發(fā)酵培養(yǎng)，觀察菌絲較豐、菌絲上新生大量孢子，平板計(jì)數(shù)測(cè)定含孢量，當(dāng)每亳升含孢量達(dá)60億以上，獲得發(fā)酵罐母種。再以此為母種按0.2%的體積比接入裝有培養(yǎng)液(黃豆粉10.0g,蔗糖20.0g,磷酸氫二鉀2g、硫酸亞鐵0.02g、碳酸鈣0.5g、硫酸鎂0.05g、自來(lái)水1000ml、pH自然。)的發(fā)酵罐中，于28。C恒溫150-200轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速培養(yǎng)6~7天，平板計(jì)數(shù)測(cè)定含孢量，當(dāng)每亳升含孢量達(dá)100億以上時(shí)，停止發(fā)酵，室溫靜置12小時(shí)。(3)制劑化同實(shí)施例1。應(yīng)用實(shí)施例1一一菌劑的同田對(duì)比試驗(yàn)1.1材料與方法試驗(yàn)田塊及管理選取地勢(shì)較平整、肥力較一致，往年赤星病高發(fā)區(qū)田塊。栽培的品種為當(dāng)?shù)刂髟云贩N，株行距1.0-1.1x0.55-0.60米。除在煙苗移栽成活后，不施用葉面殺真菌劑以外，無(wú)特珠要求。其它按當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)措施進(jìn)行栽培管理。處理設(shè)置本發(fā)明菌劑(200倍)、多抗霉素(600倍)、菌核凈(斯佩斯牌，40%可濕性粉劑500倍)、赤斑特(500倍)，l個(gè)清水空白對(duì)照，共5個(gè)處理，每處理面積0.5畝。施藥方法各藥劑在煙草赤星病發(fā)病初期(或大田生產(chǎn)發(fā)現(xiàn)輕微癥狀出現(xiàn)時(shí))即開(kāi)始噴藥，用工農(nóng)16型背負(fù)式噴霧器，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)濃度要求兌水混合均勻，在煙株葉正反面均勻噴霧，隔710天噴1次，共施2次。觀察與記錄分別調(diào)查各處理的赤星病病情，在第l次噴霧用藥前l(fā)天或當(dāng)天進(jìn)行調(diào)查，最后一次用藥后的第7天調(diào)查1次。調(diào)查按(YC/T39-1996)煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。調(diào)查取樣時(shí)，按五點(diǎn)取樣，即每個(gè)小區(qū)五點(diǎn)定株取樣10株作定點(diǎn)調(diào)查，以葉片為單位，分別分級(jí)調(diào)查記載指定葉位葉片的發(fā)病情況。計(jì)算病情指數(shù)和防效。1.2結(jié)果與分析不同藥劑的同田對(duì)比試驗(yàn)表明，供試的4種藥劑對(duì)煙草赤星病的防治效果有較大的差異。施藥2次后，以菌核凈和本發(fā)明菌劑對(duì)赤星病的防治效果較好，分別為74.6%和73.6%,以多抗霉素的防效較差，為66.2%。從供試2種生物制劑對(duì)赤星病防效的比較表明，本發(fā)明菌劑具有較好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景見(jiàn)表2。表2.菌劑的的同田對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>采用多點(diǎn)小規(guī)模推廣方式進(jìn)行，在紅塔區(qū)、蒙自縣、賓川縣、彌勒縣等4地的烤煙種植區(qū)生產(chǎn)推廣部門(mén)為依托，采用多抗霉素、本發(fā)明菌劑統(tǒng)一部署了200畝的試驗(yàn)示范，并以菌核凈作對(duì)照，以同片面積約0.5畝的田塊作空白對(duì)照。結(jié)果表明，在病害發(fā)生不嚴(yán)重的前提下，多抗霉素、鏈霉菌制劑與對(duì)照藥劑菌核凈差異不顯著，見(jiàn)表3。在認(rèn)真做好測(cè)報(bào)的條件下，病情不嚴(yán)重時(shí)，本發(fā)明的菌劑可大面積推廣使用。表3防治煙草赤星病試驗(yàn)示范效果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>權(quán)利要求1.一種防治煙草赤星病的菌劑，其特征在于該菌劑的生產(chǎn)菌株為球孢鏈霉菌(Streptomycesglobisporus)AM6，保藏號(hào)為CGMCCNo.1701。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的菌劑，所述菌株的液體和固體培養(yǎng)基配方如下①試管斜面培養(yǎng)基配方為新鮮馬鈴薯200g,葡萄糖20g，瓊脂17-20g，蒸餾水1000ml，pH自然；②液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為黃豆粉10.0g，蔗糖20.0g，磷酸氫二鉀2g、硫酸亞鐵0.02g、碳酸轉(zhuǎn)0.5g、硫酸鎂0.05g、自來(lái)水1000ml、pH自然。3.—種防治煙草赤星病的菌劑的制備方法，其特征在于釆用以下步驟(1)試管種培養(yǎng)試管.斜面培養(yǎng)基配方為新鮮馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂17-20g,蒸餾水1000ml，pH自然；將球孢鏈霉菌(5^/7tow^^g/oZ^/)AM6劃線接種到試管斜面培養(yǎng)基上，在28°C±rC恒溫培養(yǎng)45天，獲得試管種;-'(2)液體發(fā)酵培養(yǎng)液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為黃豆粉10.0g,蔗糖20.0g,磷酸氫二鉀2g、硫酸亞鐵0.02g、碳酸鈣0.5g、硫酸鎂0.05g、自來(lái)水1000ml、pH自然；將每支試管斜面加無(wú)菌水5-10ml，用接種環(huán)刮下分生孢子，搖勾，形成孢子懸液，以0.2%的體積比接入裝培養(yǎng)液量為40%~60%(裝培養(yǎng)液的容積與容器的容積比)的三角瓶中，于28。C土1。C恒溫150~200轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)78天，涂片，鏡檢，產(chǎn)生大量孢子，平板計(jì)數(shù)測(cè)定含孢量，當(dāng)每毫升含孢量達(dá)IOO億以上時(shí)，停止發(fā)酵，室溫靜置12小時(shí)；(3)制劑化球孢鏈霉菌(S^e/tow，yceyg/oZ^/on^)AM6的菌劑為液體發(fā)酵制劑，制備方法如下發(fā)酵靜置后的菌液加入0.5%羧甲基纖維素鈉、0.2%的苯甲酸納、5%的菌核凈，50轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速漸漸加速攪拌至250轉(zhuǎn)/分鐘時(shí)，恒速連續(xù)攪拌15分鐘，膠體磨破碎，過(guò)200目流體篩，裝入塑料旋蓋瓶中；即制得所需的防治煙草赤星病的菌劑。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種防治煙草赤星病病害的生物制劑。該生物制劑的生產(chǎn)菌株分類命名為球孢鏈霉菌(Streptomycesglobisporus)AM6，保藏號(hào)為CGMCCNo.1701。所述菌株的液體和固體培養(yǎng)基配方如下①試管斜面培養(yǎng)基配方為新鮮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂17-20g，蒸餾水1000ml，pH自然；②液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為黃豆粉10.0g，蔗糖20.0g，磷酸氫二鉀2g、硫酸亞鐵0.02g、碳酸鈣0.5g、硫酸鎂0.05g、自來(lái)水1000ml、pH自然。本發(fā)明經(jīng)菌株的試管培養(yǎng)，搖床發(fā)酵培養(yǎng)，制備為生物制劑。試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的生物制劑對(duì)煙草赤星病具有良好的防治效果。文檔編號(hào)C12R1/465GK101422170SQ20081023350公開(kāi)日2009年5月6日申請(qǐng)日期2008年10月28日優(yōu)先權(quán)日2008年10月28日發(fā)明者宋春滿,方敦煌,鄧云龍,鄧建華申請(qǐng)人:云南省煙草科學(xué)研究所