專利名稱：一種用巢式pcr鑒定肝素豬、牛、羊來源的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種定性檢測(cè)肝素來源成分的準(zhǔn)確檢測(cè)方法，具體地說是利用分子生 物學(xué)技術(shù)對(duì)肝素粗成品中成分來源的高效定性檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
肝素是一種由動(dòng)物結(jié)締組織的肥大細(xì)胞產(chǎn)生的粘多糖，是一種天然抗凝血物質(zhì)， 它在抗凝血，促進(jìn)脂蛋白酶釋放和補(bǔ)體溶細(xì)胞體系等方面具有活性，被廣泛用于治療血栓塞、 暴發(fā)性流腦、敗血癥、腎炎、急性心肌梗塞、動(dòng)脈硬化等疾病，還具有澄清血漿脂質(zhì)，降低 膽固醇等作用。
由于肝素至今尚無法化學(xué)合成，只能從動(dòng)物屠宰后的下腳料中提取，主要從豬、牛、羊 的肺臟、腸粘膜等動(dòng)物臟器等組織中提取得到。市場(chǎng)需求量極大，我國(guó)是世界上肝素鈉主要 出口國(guó)家之一，占世界市場(chǎng)55%以上的份額，但由于"瘋牛病"的泛濫，統(tǒng)計(jì)表明在負(fù)作用 方面豬源肝素明顯小于其它來源的肝素，所以歐美各國(guó)在肝素進(jìn)口方面明確要求以豬副產(chǎn)品 為原料提取的產(chǎn)品，同時(shí)加大了對(duì)中國(guó)出口肝素產(chǎn)品的質(zhì)量、來源等方面的質(zhì)量要求和抽檢 力度。目前國(guó)內(nèi)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)較為混亂，出現(xiàn)了一些技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)不一致，法規(guī)滯后，與國(guó)際慣例 不接軌，而且大部分廠家還沒有形成一套可信、方便的自檢體系以便做到心中有數(shù)，盡量減 少不必要的損失。本發(fā)明是基于上述情況的一種便于推廣的運(yùn)用巢式PCR技術(shù)對(duì)肝素來源的 定性檢測(cè)方法。
自20世紀(jì)60年代，線粒體DNA (mtDNA)得到證實(shí)以來，目前很多種動(dòng)物的mtDNA的 全序列已經(jīng)全部測(cè)定。mtDNA為細(xì)胞核外遺傳物質(zhì)，以母系單性遺傳、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、在世代遺 傳中不發(fā)生重組、進(jìn)化速度快為特點(diǎn)。mtDNA在種間、種內(nèi)群體間和群體內(nèi)具有廣泛的多肽 性，線粒體DNA因其種屬特異性強(qiáng)，在分子進(jìn)化中有許多獨(dú)特的優(yōu)越性，是研究動(dòng)物種間進(jìn)
化、進(jìn)行種屬鑒定、特異的遺傳標(biāo)記，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用在分子分類學(xué)等領(lǐng)域。
Polymerase Chain Reaction (PCR)由1985年的cetus公司的Karry Mu出s首創(chuàng)。以DNA 為模板，在4種核苷酸存在條件下，借DNA聚合酶形成酶促反應(yīng)，PCR最主要的組分是引物。 加熱使雙鏈DNA變成單鏈，denaturation變性。當(dāng)溫度驟然降低，引物特異與單鏈結(jié)合， 同時(shí)4種核苷酸在DNA聚合酶促下，5-3聚合，使DNA鏈不斷延伸。
發(fā)明人根據(jù)mtDNA的基本特性，設(shè)計(jì)出特異的引物，利用分子分類學(xué)方法找到豬、牛、 羊三種動(dòng)物mtDNA上的種屬特異性片段，從而可以定性檢測(cè)肝素樣品的來源
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一組可以專門用于PCR鑒定檢測(cè)肝素粗制樣品的來源組成(豬、 牛、羊)的引物，并建立了基于上述引物的穩(wěn)定定性鑒別的PCR反應(yīng)體系。根據(jù)Genbank公 布的豬、牛、羊線粒體DNA序列，經(jīng)同源性比對(duì)后，利用Primer 5. 0與Oligo 6軟件輔助設(shè) 計(jì)引物。具體如下
1、用于鑒定的特異性引物 (1)豬成分?jǐn)U增引物名稱及序列
第一輪擴(kuò)增片段長(zhǎng)度385 bp
Por—mt F 5， 一aaacatgaaacattggagtagtcc-3， Po「mt R 5' - aggattagtattataaataaggctcc-3'
第二輪擴(kuò)增片段長(zhǎng)度80 bp
P2-5: 5' -TCACACGATTCTTCGCCTTTCA-3' P2—3: 5' —GTGCAGGAATAGGAGATGTACGG 3'
(2) 牛成分?jǐn)U增引物名稱及序列
第一輪擴(kuò)增片段長(zhǎng)度295 bp
Bov-mt F 5， -ttttaagttagagattgagagcc-3 ， Bov-mt R 5， -aatagtaggcttgggaatagtac-3，
第二輪擴(kuò)增片段長(zhǎng)度128 bp
B2-5: 5' -ACAATCCAGAACTGACACCAACA-3' B2-3: 5' - CGATAAGGGTTACGAGAGGGAGA-3'
(3) 羊成分?jǐn)U增引物名稱及序列 第一輪擴(kuò)增片段長(zhǎng)度319 bp
Y肌g—mt F 5， 一atttgcctctttcattacccc-3， Yang-mt R 5， -tcctgctcataagggatagcc-3'
第二輪擴(kuò)增片段長(zhǎng)度112 bp
S2-5: 5' TTATTTCCCACATCAAGCCGACTA3' S2-3: 5'TCTGTCCTTTGGTGTTATGAATGC-3'
2、構(gòu)建的反應(yīng)體系如下
第一輪PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件-
總反應(yīng)體系為25ul，其中含DNA模板(100 ng/ul) 1 ul， dNTPs(10 mM) 0.2 ul， 10 XPCR緩沖液2.5 ul,外部正反向引物(20 uM)各l ul， Taq DNA聚合酶(5U/ul) 0.2 ul， 無菌超純水補(bǔ)足至25 ul。擴(kuò)增反應(yīng)條件為95°C 3min, 95°C 40 s， 56°C 40 s, 72°C 40 s，
共30個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸10 min。
第二輪PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 取第一輪反應(yīng)產(chǎn)物稀釋100倍作為第二輪擴(kuò)增的模板。
總反應(yīng)體系為25 ul,其中含DNA模板1 ul， dNTPs(10mM) 0.2 ul， 10XPCR緩沖 液2.5 ul,內(nèi)部正反向引物(20 uM)各1 ul， Taq DNA聚合酶(5U/ul) 0.2 ul，無菌超 純水補(bǔ)足至25 ul。擴(kuò)增反應(yīng)條件為95°C 3 min， 95°C 20 s， 56°C 20 s， 72°C 20 s，共 30個(gè)循環(huán)，最后72"延伸10 min。


圖l、為本發(fā)明豬牛羊引物的種特異性分析結(jié)果電泳圖A為豬引物，B為牛引 物，c為羊引物；1， 2, 3泳道分別為豬、牛和羊DNA模板，4為空白對(duì)照。豬、牛、羊引物 擴(kuò)增片段長(zhǎng)分別為377bp、 271bp和295bp。陰性對(duì)照無擴(kuò)增說明PCR體系無污染。豬牛羊引 物對(duì)豬牛羊成分的特異性擴(kuò)增表明本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物可用以檢測(cè)DNA樣品中是否含有豬牛 或羊來源的DNA成分。
圖2、為本發(fā)明外部引物檢測(cè)靈敏度分析結(jié)果電泳圖A為豬引物，B為牛引物，C為羊 引物。泳道l一6分別代表在200ng無關(guān)DNA中添加相應(yīng)豬牛羊總DNA 100ng, 10ng， lng, 0. lng, 0. Olng， Ong作為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
圖3、為本發(fā)明第二輪Nest-PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖A、 B、 C分別為豬牛羊二次nest-PCR 結(jié)果，泳道l, 2， 3， 4, 5， 6為梯度稀釋的DNA模板(加在200ng無關(guān)DNA中)，濃度分 別為lng， 0. lng， 10pg， lpg, 0. lpg, 0. Olpg;泳道7為PCR陰性對(duì)照，以無菌純水為模板。
圖4、為本發(fā)明巢式PCR檢測(cè)肝素原料中豬牛羊成分的結(jié)果電泳圖I:外部引物PCR擴(kuò) 增結(jié)果，II: Nest-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。A為豬引物，B為牛引物，C為羊引物。泳道l:豬牛羊陽 性模板；2:陰性對(duì)照；3 — 6: 4個(gè)肝素原料內(nèi)提取的DNA。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明的目的是為了公布一種基于分子分類學(xué)基礎(chǔ)上的豬、牛、羊來源肝 素的定性的檢測(cè)方法。發(fā)明人公布了一種可以用來PCR辨別肝素來源的特異性引物和反應(yīng)體 系。下面就具體實(shí)施例來說明引物的特異性、檢測(cè)的靈敏度和肝素粗品檢驗(yàn)來說明本發(fā)明的 具體運(yùn)用。
實(shí)施例l、引物特異性、靈敏度的鑒定
1、 DNA的提取分別將新鮮豬肉、牛肉、羊肉研磨粉碎，DNA提取試劑盒(上海市農(nóng)業(yè) 科學(xué)院和上海出入境檢驗(yàn)檢疫局聯(lián)合研制)提取總DNA。核酸蛋白分析儀測(cè)量所提取DNA 樣品的OD260/OD280的值不小于1.5，并進(jìn)行電泳檢測(cè)后，根據(jù)測(cè)得的濃度將DNA樣品 濃度稀釋到100ng/u1, -20'C保存。進(jìn)行引物擴(kuò)增靈敏度分析時(shí)將DNA IO倍梯度稀釋(102 —1(Tng/ul),再以稀釋的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
2、 擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定所有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用296瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，加入終濃度為O. 5ug/ml 的溴化乙錠。電泳緩沖液為O. 5xTBE,以DL2000DNAMarker作為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。電泳條 件為10V/cm電壓，電泳lh后在凝膠成像系統(tǒng)中拍照分析。
3、 引物特異性的鑒定以豬牛羊DNA (100 ng)為模板，分別用上述設(shè)計(jì)的豬牛羊特異 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果豬引物只有豬成分DNA反應(yīng)管有擴(kuò)增，牛羊DNA均無擴(kuò)增；同 樣，牛引物只能擴(kuò)增牛成分，羊引物只能擴(kuò)增羊成分，結(jié)果見圖l。
4、 巢式PCR第一輪擴(kuò)增引物靈敏度分析分別在200ng不相關(guān)DNA中加入100ng到100pg 梯度稀釋的豬牛羊DNA作為模板，用上述相應(yīng)的豬牛羊引物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均有特異性擴(kuò) 增，結(jié)果見圖2。
5、 巢式PCR第二輪擴(kuò)增引物靈敏度分析將第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋100倍，再分別取lul 作為模板，用相應(yīng)的內(nèi)部引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，結(jié)果，DNA模板量為l(Tiig時(shí)仍能有較強(qiáng)的 擴(kuò)增?？瞻讓?duì)照無擴(kuò)增，表明PCR體系未受污染。結(jié)果見圖3.
實(shí)施例2、肝素樣品來源的鑒定
分別將送檢4份肝素原料樣品(分別編號(hào)為3井、4#、 5井和6井)、新鮮豬肉、牛肉、羊肉研 磨粉碎，DNA提取試劑盒(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院和上海出入境檢驗(yàn)檢疫局聯(lián)合研制)提取總 DNA。根據(jù)測(cè)得的濃度將DNA樣品濃度稀釋到100 ng/ul， -20'C保存。按照上述發(fā)明設(shè)計(jì)的 引物和PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定送檢肝素樣品的來源。
將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用296瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)鑒定可知在第一輪擴(kuò)增后可以判斷5#和6#肝素 樣品為豬來源，而進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增后可以斷定4份肝素樣品均為豬來源樣品，但3#樣品中 混有牛成分。結(jié)果見圖4。
權(quán)利要求
1、巢式PCR鑒定肝素豬、牛、羊來源的快速檢測(cè)方法，其特征在于用DNA 提取試劑盒提取總DNA，進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增種特異性DNA序列基因，最 后電泳鑒定肝素來源。
2、 根據(jù)權(quán)利要求書l所述方法，其特征為根據(jù)Genbank公布的豬、牛、羊線 粒體DNA序列，經(jīng)同源性比對(duì)后，利用Primer5.0與Oligo 6軟件輔助設(shè) 計(jì)引物。具體如下(1)豬成分?jǐn)U增引物名稱及序列第一輪擴(kuò)增片段長(zhǎng)度385 bpPl-5 5' -AAACATGAAACATTGGAGTAGTCC-3' Pl-3 5' - AGGATTAGTATTATAAATAAGGCTCC-3' 第二輪擴(kuò)增片段長(zhǎng)度80 bpP2-5: 5， TCACACGATTCTTCGCCTTTCA-3， P2-3: 5' -GTGCAGGAATAGGAGATGTACGG-3，(2 )牛成分?jǐn)U增引物名稱及序列第一輪擴(kuò)增片段長(zhǎng)度295 bpBov-mt F 5， TTTTAAGTTAGAGATTGAGAGCC-3， Bov-mt R 5， -AATAGTAGGCTTGGGAATAGTAC-3'第二輪擴(kuò)增片段長(zhǎng)度128 bp B2-5: 5' ACAATCCAGAACTGACACCAACA-3' B2-3: 5' - CGATAAGGGTTACGAGAGGGAGA-3' (3)羊成分?jǐn)U增引物名稱及序列第一輪擴(kuò)增片段長(zhǎng)度319 bp Yang-mt F 5' -ATTTGCCTCTTTCATTACCCC-3' Yang-mt R 5' -TCCTGCTCATAAGGGATAGCC-3' 第二輪擴(kuò)增片段長(zhǎng)度112 bp S2-5: 5' -TTATTTCCCACATCAAGCCGACTA-3' S2-3: 5' - TCTGTCCTTTGGTGTTATGAATGC-3'
3、 一種穩(wěn)定的巢式PCR反應(yīng)體系，其特征是根據(jù)權(quán)利要求2所述的引物，利用 本反應(yīng)體系可以特異地鑒定肝素豬、牛、羊的成分來源。具體如下第一輪PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件總反應(yīng)體系為25ul，其中含DNA模板(100ng/ul) 1 ul， dNTPs(10mM) 0.2 ul, 10XPCR緩沖液2.5 ul,外部正反向引物(20 uM)各l ul, Taq DNA聚 合酶(5U/ul) 0.2ul，無菌超純水補(bǔ)足至25 ul。擴(kuò)增反應(yīng)條件為95'C 3 min， 95'C 40 s， 56'C 40 s， 72°C 40 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸10 min。 第二輪PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件取第一輪反應(yīng)產(chǎn)物稀釋100倍作為第二輪擴(kuò)增的模板。 總反應(yīng)體系為25ul，其中含DNA模板lul， dNTPs(10mM) 0. 2 ul， 10XPCR 緩沖液2.5 ul,內(nèi)部正反向引物(20 uM)各l ul, Taq DNA聚合酶(5U/ul) 0.2 ul,無菌超純水補(bǔ)足至25 ul。擴(kuò)增反應(yīng)條件為95°C 3 min， 95。C 20 s， 56。C 20 s， 72。C 20 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸10 min。
4、 一種檢測(cè)肝素的豬、牛、羊成分來源的PCR方法，其特征在于它含有本發(fā) 明的特異性引物和PCR反應(yīng)體系。
5、 一種檢測(cè)產(chǎn)品中豬、牛、羊成分來源的方法，其特征在于該檢測(cè)方法是基于 權(quán)利要求書2和/或權(quán)利要求書3的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可以鑒定肝素粗成品成分來源的檢測(cè)方法。引物及其反應(yīng)體系。特征是根據(jù)Genbank公布的豬、牛、羊線粒體DNA序列，經(jīng)同源性比對(duì)后，利用Primer 5.0與Oligo 6軟件輔助設(shè)計(jì)得到引物，并建立了具體的穩(wěn)定的巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)體系。經(jīng)過具體實(shí)例驗(yàn)證，經(jīng)巢式PCR反應(yīng)，本發(fā)明可以用來鑒定肝素粗品成分的豬、牛、羊來源，其基因含量靈敏度達(dá)到0.01pg，可以廣泛的運(yùn)用到肝素粗成品檢驗(yàn)中。本發(fā)明還可用于其它產(chǎn)品中豬、牛、羊的成分鑒定。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101363058SQ200810123709
公開日2009年2月11日 申請(qǐng)日期2008年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月30日
發(fā)明者侯亞義, 王慶苓, 趙光鋒, 趙樹立, 黃亞紅 申請(qǐng)人:南京大學(xué)