專利名稱：一種左旋肉堿的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種左旋肉堿的制備方法，屬于生物工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自本世紀(jì)初，科學(xué)家從動(dòng)物肉類中攝取出左旋肉堿(L-carnitine)以來(lái)，它的營(yíng)養(yǎng)保健作用一直受到人們的關(guān)注。L-肉堿是二位學(xué)者Gulewjisch和Krimberg于1905年在肉類濃縮液中發(fā)現(xiàn)的，1927年L-肉堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)被證實(shí)。1952年Fracuke在肝的濃縮液中分離出L-肉堿并命名為維生素_B。 1958年Frize找出L_肉堿有脂肪氧化作用，肉堿能剌激脂肪氧化的速度。1986年"芝國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)院雜志"報(bào)導(dǎo)"必需營(yíng)養(yǎng)的專題討論會(huì)"中認(rèn)為L(zhǎng)-肉堿是L體必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。 左旋肉堿(L-carnitine)是一種類維生素的功能因子，化學(xué)名為L(zhǎng)-3-羥基-4-三甲銨丁酸，分子式C7H15N03，穩(wěn)定性好，能耐200°C以上的高溫，在PH3-6的溶液中可放置1年。它是動(dòng)物體內(nèi)與能量代謝有關(guān)的化合物，生化作用有①促進(jìn)脂肪酸P-氧化；②調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)?；嚷?；③網(wǎng)羅過(guò)量的或非理性的?；鶊F(tuán)；④影響氨基酸的代謝；⑤與尿素結(jié)合促進(jìn)體內(nèi)氨的排出，防止過(guò)量氨產(chǎn)生的毒性。另外，左旋肉堿對(duì)脂溶性維生素及Ca、 P的吸收也有作用；可間接參與糖元異生過(guò)程；防止高血氨；參與精子的成熟過(guò)程等。隨著現(xiàn)代科技的不斷發(fā)展，左旋肉堿逐漸應(yīng)用于食品、醫(yī)藥保健領(lǐng)域，并已被瑞士、法國(guó)、美國(guó)和世界衛(wèi)生組織法定為多用途營(yíng)養(yǎng)劑。 關(guān)于左旋肉堿的制備有很多種方法，人們一直在探討更好的工藝來(lái)生產(chǎn)左旋肉堿。最早期的左旋肉堿是從肉浸膏中分離出來(lái)的，典型的方法是Carter等1952年用450g牛肉浸膏提取到了0.6g純晶肉堿。第二種方法是始于賴氨酸和蛋氨酸的生物合成法。第三種方法是化學(xué)合成法，目前已知化學(xué)合成法有十幾條途徑，以環(huán)氧氯丙烷、氯乙酰乙酸乙酯、甘露糖醇等為原料，工藝路線均較長(zhǎng)。后來(lái)又發(fā)展到了消旋體拆分的方法，包括化學(xué)拆分、生物拆分和酶法拆分及右旋肉堿的再利用。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，微生物發(fā)酵法、從脫氫肉堿出發(fā)的肉堿衍生物轉(zhuǎn)變法和基因重組技術(shù)也在不斷的運(yùn)用到左旋肉堿的生產(chǎn)當(dāng)中。 酶轉(zhuǎn)化法也是一種生產(chǎn)左旋肉堿較為先進(jìn)的方法，它是利用純化的酶或菌體細(xì)胞將L-肉堿代謝的前體物質(zhì)(目前包括7- 丁基甜菜堿、巴豆甜菜堿、D肉堿或3-脫氫肉堿)轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-肉堿。酶轉(zhuǎn)化法具有環(huán)境友好、成本低、產(chǎn)品安全性高等特點(diǎn)，是很有吸引力的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種左旋肉堿的制備方法。 本發(fā)明所說(shuō)的左旋肉堿的制備方法，是用采自于的土壤樣品中的分離得到的假單胞桿菌，采用微波誘變的方法對(duì)其進(jìn)行篩選，得到高產(chǎn)酶菌株并進(jìn)行增值培養(yǎng)，再將菌株細(xì)胞微囊固定化，然后加入反應(yīng)底物巴豆甜菜堿，在超聲波輔助條件下進(jìn)行反應(yīng)。假單胞桿菌
4所產(chǎn)生的高效水解酶將巴豆甜菜堿轉(zhuǎn)化為左旋肉堿。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下
(1)產(chǎn)酶菌株的培養(yǎng)、篩選 將采自于土壤中的含有假單胞桿菌的樣品自然風(fēng)干后，用研缽碾碎，按照梯度稀釋法和涂布平板法進(jìn)行分離操作。涂布好的平板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)出后，用254nm的紫外分析儀進(jìn)行觀察，挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的菌落接至新鮮固體平板，經(jīng)過(guò)單胞分離純化
幾代后轉(zhuǎn)移至試管斜面，置于4t:冰箱中保存?zhèn)溆谩?將試管斜面上的菌株用無(wú)菌水洗脫，按10%的接種量接至種子培養(yǎng)液中3(TC振搖(160r/min)培養(yǎng)24h。取稀釋至10mL的上述種子液分為2mL裝入小試管，用低溫?zé)岱稚⒎ㄏ⒉ǖ臒嵝?yīng)。采用微波爐對(duì)菌液進(jìn)行誘變處理。將微波誘變處理后的菌液稀釋后取0. 2mL涂布到平板培養(yǎng)基中，3(TC倒置培養(yǎng)1_3天至單菌落出現(xiàn)。挑取長(zhǎng)勢(shì)較好的單菌落反復(fù)進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩。 經(jīng)過(guò)發(fā)酵復(fù)篩，我們將得到的產(chǎn)酶量高的菌株轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基搖瓶中，35t:下，
轉(zhuǎn)速160r/rain培養(yǎng)24h，即得到細(xì)胞種子液。
(2)高產(chǎn)酶菌株細(xì)胞的固定化 在無(wú)菌水中加人種子培養(yǎng)液，取稀釋后的種子液與NaCS(纖維素硫酸鈉)混合，攪拌均勻，用于滴制膠囊。此溶液脫氣后，通過(guò)氣流微囊發(fā)生器滴人質(zhì)量濃度為6%P匿DAAC(聚二甲基二烯丙基氯化銨)溶液中。室溫下溫和攪拌，反應(yīng)培養(yǎng)的含細(xì)胞微膠囊。30min后，洗去表面殘余的PDMDAAC，即得待培養(yǎng)的固定化細(xì)胞。
(3)左旋肉堿的制備 固定化細(xì)胞培養(yǎng)將包菌后的膠囊，加入到含固定化細(xì)胞培養(yǎng)基中(pH7. 0)的搖瓶中，轉(zhuǎn)速150r/min搖床培養(yǎng)120h。 固定化細(xì)胞培養(yǎng)好后，在培養(yǎng)基中加入反應(yīng)底物巴豆甜菜堿，用超聲波輔助處理，反應(yīng)溫度為37t:，經(jīng)過(guò)24h后測(cè)定，底物的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了 80%。 本發(fā)明中用微波誘變處理法篩選高產(chǎn)酶菌株，彌補(bǔ)了用傳統(tǒng)方法篩選的不足，通過(guò)微波誘變方法，去除了產(chǎn)酶量低的菌株，得到了產(chǎn)酶量較高的菌株，再經(jīng)過(guò)增值培養(yǎng)，獲得了試驗(yàn)所需的高產(chǎn)酶菌株。然后用微囊法將菌體細(xì)胞包埋，目的在于提高菌體細(xì)胞所產(chǎn)酶的利用率。在酶解反應(yīng)階段又增加了超聲波輔助技術(shù)，超聲波在不破壞細(xì)胞的前提下，增加了細(xì)胞膜對(duì)反應(yīng)底物的通透性，使底物與酶能充分的結(jié)合，明顯的提高了底物的轉(zhuǎn)化率和酶的使用率。 左旋肉堿(L-Carnitine，又名左卡尼汀、肉毒堿、維生素BT)，是一種廣泛存在于機(jī)體組織的特殊氨基酸，它將長(zhǎng)鏈脂?；鶐司€粒體內(nèi)氧化釋放出能量，又可將線粒體內(nèi)的短鏈酰基運(yùn)送到膜外。調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)外?；鵆oA/CoA的比率等，因此它是脂肪代謝的必須輔助因子。自左旋肉堿1905年被發(fā)現(xiàn)，一個(gè)世紀(jì)以來(lái)人們不斷探索拓展它的新用途，近年來(lái)左旋肉堿在我國(guó)臨床、保健食品等方面得到了廣泛的應(yīng)用。首先，在慢性腎衰腹膜血透方面的應(yīng)用。現(xiàn)今左旋肉堿作為藥品應(yīng)用于臨床上最多的當(dāng)屬在血液透析方面的應(yīng)用，在給予尿毒癥血液透析患者促紅細(xì)胞素(EPO)常規(guī)治療的同時(shí)加用左旋肉堿，可使患者Hb及Hct顯著升高。同時(shí)，大量動(dòng)物和人體實(shí)驗(yàn)都證實(shí)，補(bǔ)充左旋肉堿對(duì)治療心血管疾病大有益處。它能改善心肌的能量代謝，又能降低充血性心力衰竭患者的病死率，改善心力衰竭的自然病程。補(bǔ)充左旋肉堿，可使缺血缺氧心肌從無(wú)氧酵解方式回到脂肪酸氧化方式，從而使 心肌細(xì)胞的能量代謝得以恢復(fù)，減少了無(wú)氧酵解產(chǎn)生的有害物質(zhì)在心肌細(xì)胞內(nèi)的堆積，起 到了預(yù)防和減輕心肌損傷、提高患者心耐量，減少心絞痛發(fā)作頻率等作用。另外，左旋肉堿 可以促進(jìn)病人脂肪代謝，增加脂肪組織特別是腹部脂肪組織的利用，減輕中心型肥胖。降低 病人血清甘油三酯水平，有助于防止動(dòng)脈粥樣硬化。左旋旋肉堿還能迅速分解脂肪，釋放能 量，恢復(fù)體力，現(xiàn)已經(jīng)成為減肥產(chǎn)品中的一種不可少的原料。 總之，經(jīng)證實(shí)，左旋肉堿是一種公認(rèn)的安全、無(wú)毒的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，其在脂肪代謝方 面的生理功能可以使之廣泛應(yīng)用于臨床疾病的治療、減肥食品、嬰幼兒母乳化奶粉、運(yùn)動(dòng)員 功能性飲料、中老年?duì)I養(yǎng)補(bǔ)充劑以及添加于飼料中喂養(yǎng)豬、牛、羊、雞、魚。隨著醫(yī)療科學(xué)技 術(shù)水平的不斷進(jìn)步，人民生活水平的提高，左旋肉堿新的用途還將得到更大的拓展。
權(quán)利要求
一種左旋肉堿的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)產(chǎn)酶菌株的培養(yǎng)、篩選將采自于土壤中的含有假單胞桿菌的樣品自然風(fēng)干后，用研缽碾碎，按照梯度稀釋法和涂布平板法進(jìn)行分離操作。涂布好的平板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)出后，用254nm的紫外分析儀進(jìn)行觀察，挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的菌落接至新鮮固體平板，經(jīng)過(guò)單胞分離純化幾代后轉(zhuǎn)移至試管斜面，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。將試管斜面上的菌株用無(wú)菌水洗脫，按10％的接種量接至種子培養(yǎng)液中30℃振搖(160r/min)培養(yǎng)24h。取稀釋至10mL的上述種子液分為2mL裝入小試管，用低溫?zé)岱稚⒎ㄏ⒉ǖ臒嵝?yīng)。采用微波爐對(duì)菌液進(jìn)行誘變處理。將微波誘變處理后的菌液稀釋后取0.2mL涂布到平板培養(yǎng)基中，30℃倒置培養(yǎng)1-3天至單菌落出現(xiàn)。挑取長(zhǎng)勢(shì)較好的單菌落反復(fù)進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩。經(jīng)過(guò)發(fā)酵復(fù)篩，我們將得到的產(chǎn)酶量高的菌株轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基搖瓶中，35℃下，轉(zhuǎn)速160r/rain培養(yǎng)24h，即得到細(xì)胞種子液。(2)高產(chǎn)酶菌株細(xì)胞的固定化在無(wú)菌水中加人種子培養(yǎng)液，取稀釋后的種子液與NaCS(纖維素硫酸鈉)混合，攪拌均勻，用于滴制膠囊。此溶液脫氣后，通過(guò)氣流微囊發(fā)生器滴人質(zhì)量濃度為6％PDMDAAC(聚二甲基二烯丙基氯化銨)溶液中。室溫下溫和攪拌，反應(yīng)培養(yǎng)的含細(xì)胞微膠囊。30min后，洗去表面殘余的PDMDAAC，即得待培養(yǎng)的固定化細(xì)胞。(3)左旋肉堿的制備固定化細(xì)胞培養(yǎng)將包菌后的膠囊，加入到含固定化細(xì)胞培養(yǎng)基中(pH7.0)的搖瓶中，轉(zhuǎn)速150r/min搖床培養(yǎng)120h。固定化細(xì)胞培養(yǎng)好后，在培養(yǎng)基中加入反應(yīng)底物巴豆甜菜堿，用超聲波輔助處理，反應(yīng)溫度為37℃，經(jīng)過(guò)24h后測(cè)定，底物的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了80％。
2. 根據(jù)權(quán)利要求(1)中所述的涂布好的平板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其特征在于培養(yǎng)溫度 為26。C -28。C，培養(yǎng)時(shí)間為36h-48h。
3. 根據(jù)權(quán)利要求(1)中所述的采用微波爐對(duì)菌液進(jìn)行誘變處理，其特征在于微波的使 用頻率為2450Hz，輸出功率為800W，處理時(shí)間為140s-160s。
4. 根據(jù)權(quán)利1中所述的幾種培養(yǎng)基，其特征在于培養(yǎng)基的組成成分如下斜面(平 板)培養(yǎng)基瓊脂1. 5%，蛋白胨0. 5%，牛肉膏3%， MnS04. H200. 05%，酵母粉0. 3%， NaCl 2眉，KC1 0. 01%， CaCl2. H20 0. 15% ， Fe2 (P04) 30 . 001 % ， MgCl2. 6H20 0. 55% ， MgS04. 7H20 0.69%。蒸餾水配制，調(diào)pH7. 3-7.4，滅菌。種子培養(yǎng)基玉米漿3. 0% ;氯化鈉0. 3% ;葡萄糖1. 5%。蒸餾水配制，調(diào)pH7. 3-7. 4， 滅菌。發(fā)酵培養(yǎng)基玉米漿2.5%，氯化鈉0.3%，葡萄糖2.0%，硫酸氨0. 1%，硫酸鎂 0. 05% ，氯化鈷0. 01 % ，調(diào)pH7. 3-7. 4，滅菌。固定化細(xì)胞培養(yǎng)基2%富馬酸，1%酵母浸膏，1%蛋白胨，0.3%巴豆甜菜堿鹽，其余為 蒸餾水，調(diào)pH7.0，滅菌。
5. 根據(jù)權(quán)利(2)中所說(shuō)的取稀釋后的種子液與NaCS(纖維素硫酸鈉)混合，其特征在 于稀釋后的種子液是指加無(wú)菌水將原種子液稀釋為原濃度的1/5，NaCS(纖維素硫酸鈉)所加的量為稀釋后種子液的4% (m/v)。
6.根據(jù)權(quán)利(3)所說(shuō)的用超聲波輔助處理，其特征在于所說(shuō)的超聲波的使用頻率為 20kHz ，功率為10W。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種左旋肉堿的制備方法。是用采自于的土壤樣品中的分離得到的一種假單胞桿菌，采用微波誘變的方法對(duì)其進(jìn)行篩選得到高產(chǎn)酶菌株，再進(jìn)行增值培養(yǎng)，然后將菌株細(xì)胞微囊固定化后加入反應(yīng)底物巴豆甜菜堿，在超聲波輔助條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)得到左旋肉堿。反應(yīng)底物在24h后的轉(zhuǎn)化率就達(dá)到了80％，明顯的提高了底物的轉(zhuǎn)化率。
文檔編號(hào)C12R1/38GK101712969SQ20081012154
公開日2010年5月26日 申請(qǐng)日期2008年10月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月7日
發(fā)明者吳菁, 陳群 申請(qǐng)人:湖州來(lái)色生物基因工程有限公司;吳菁