專利名稱：一種用aflp指紋技術(shù)鑒定青菜品種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及AFLP指紋技術(shù)鑒定青菜品種的方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的青菜品種鑒定方法主要是對(duì)植株形態(tài)進(jìn)行觀察，但由于大部分青菜品種苗期相似, 要到成株才開始表現(xiàn)品種的特性，所以從植株形態(tài)對(duì)青菜品種進(jìn)行鑒定往往需要幾個(gè)月的時(shí) 間。
AFLP技術(shù)是一項(xiàng)分子標(biāo)記技術(shù)，是基于PCR技術(shù)擴(kuò)增基因組DNA限制性片段，基因組
DNA先用限制性內(nèi)切酶切割，然后將雙鏈接頭連接到DNA片段的末端，接頭序列和相鄰的 限制性位點(diǎn)序列，作為引物結(jié)合位點(diǎn)。它結(jié)合了RFLP和PCR技術(shù)特點(diǎn)，具有RFLP技術(shù)的 可靠性和PCR技術(shù)的高效性。由于AFLP擴(kuò)增可使某一品種出現(xiàn)特定的DNA譜帶，而在另 一品種中可能無(wú)此譜帶產(chǎn)生，因此，這種通過(guò)引物誘導(dǎo)及DNA擴(kuò)增后得到的DNA多態(tài)性可 做為一種分子標(biāo)記。AFLP可在一次單個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)到大量的片段，它是一種新的而且有很 大功能的DNA指紋技術(shù)。近年來(lái)，隨著該技術(shù)的逐漸成熟，在品種鑒定及輔助育種上得到 了具體的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用AFLP指紋技術(shù)鑒定青菜品種的方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是 (1)基因池DNA的來(lái)源
從不同青菜品種的葉片提取DNA，混合成品種的基因池。提取及純化方法采用CTAB 法，其過(guò)程為取0.1g青菜葉片，液氮下研磨成粉末；加入750^x1 CTAB提取液后轉(zhuǎn)入 1.5ml離心管中；然后65"C水浴30min，其間震蕩混勻；分別用等體積的Tris-飽和酚、氯 仿、異戊醇混合溶液和等體積的氯仿、異戊醇混合溶液各提取一次，于常溫下在12000r/min 條件下離心2次，每次10min;取上清夜加入2倍的預(yù)冷的無(wú)水乙醇沉淀DNA，于4°C 條件下離心15min;離心轉(zhuǎn)速為12000r/min，離心后用70%乙醇清洗沉淀2 3次；加入 雙蒸水溶解DNA，經(jīng)DNA純度檢測(cè)證實(shí)純化度，存于一2(TC冰箱中備用。
(2) AFLP接頭和預(yù)擴(kuò)增、選擴(kuò)增引物序列設(shè)計(jì)
接頭的堿基序列 EcoR I接頭 5'〉CTCGTAGACTGCGTACC
CTGACGCATGGTTAA〈5'Mse I接頭 5'>GACGATGAGTCCTGAG
TACTCAGGACTCAT〈5'
預(yù)擴(kuò)增引物
EcoR I預(yù)擴(kuò)引物序列5'> GAC TGC GTA CCAATT CA< 3， Mse I 預(yù)擴(kuò)引物序列5'> GAT GAG TCC TGA GTA AC<3'
選擴(kuò)增引物
Mse I擴(kuò)增引物用FAM標(biāo)記 Pri證E GAC TGC GTA CCAATT CAA C/ Msel-3: GAT GAG TCC TGA GTAACA G
Primer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA G/ Msel-2: GAT GAG TCC TGA GTA ACA C
Primer E GAC TGC GTA CCAATT CAA G / MseI-6: GAT GAG TCC TGA GTA ACT C
Primer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA G/ Msel-8: GAT GAG TCC TGA GTA ACT T
P匿r E GAC TGC GTA CCAATT CAC A/ Msel曙5 GAT GAG TCC TGA GTA ACT A
(3) AFLP反應(yīng)條件
A、酶切和連接限制性酶切及連接(20ul反應(yīng)體系)，在0.5ml離心管中加入對(duì)照模板DNA 4|J (50ngVl)， Adapter(il (Mse I接頭50 pmoles/fiL, EcoR I接頭5 pmoes/|JL)， EcoRI /Mse I 2^1 (4u/pl每種)，10xReaction buffer 2.5pl, 10mM ATP 2.5^1， T4 Ligase lpl Gu/^il), AFLP-Water 7pl ，混勻離心數(shù)秒，37。C保溫5h ，8。C保溫4h， 4°C 10h;
B、 預(yù)擴(kuò)增在0.2ml離心管中按下列方式加入(25ul反應(yīng)體系)模板DNA2pl，預(yù)擴(kuò)引物 1(il(50ng/)xl每種)，dNTPs lpl(幽M)， 10xPCR buffer 2.5nl， Taq DNA polymease 0.5^1 (2u/pl)， 水18^1,離心數(shù)秒，按下列參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增循環(huán)30輪變性94'C2mm，(變性94°C 30s, 復(fù)性56°C 30s，延伸72°C 80s.)延伸72°C 5min;
C、 選擇性擴(kuò)增將預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物l: 20稀釋,作為選擴(kuò)模板。選擇性擴(kuò)增休系在0.2ml
離心管中，按下列方式加入體積(25pl體系)預(yù)擴(kuò)增稀釋樣品2^1， 10xPCR buffer 2.5^1， dNTPS 0.5nl(10mM)， EcoRI引物(5ng/|il)， Mse I引物1^1 (30—1)， Taq酶0.5^1 (2u/pl)， H20 17.5^il，以上混勻，離心數(shù)秒，按下列參數(shù)PCR循環(huán)1輪擴(kuò)增參數(shù)94°C 30s， 65。C 30s， 72'C80s，以后每輪循環(huán)溫度遞減0.7"C，擴(kuò)增12輪，接著按下列參數(shù)擴(kuò)增23輪94°C 30s， 55。C 30s， 72°C 80s;
D、 擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺電泳預(yù)電泳20-30min，點(diǎn)樣，電泳2.5h(電壓1200V),電泳大 約1小時(shí)，小片段會(huì)先跑到膠的底部,測(cè)序儀激光管開始收集條帶，膠圖由測(cè)序儀軟件自動(dòng)生成。
(4) AFLP圖譜分析及標(biāo)準(zhǔn)的DNA指紋圖譜的構(gòu)建
A、 GENESCAN軟件分析用GENESCAN3.1軟件打開膠圖，對(duì)膠圖進(jìn)行數(shù)據(jù)提取，安 裝膠圖的MATRIX,選擇合適的內(nèi)標(biāo)即SIZE STANDARD,分析得到結(jié)果；
B、 通過(guò)Binthere軟件提取樣品的各片段大小的結(jié)果，打開Binthere軟件，導(dǎo)入數(shù)據(jù)，選 擇相應(yīng)的熒光標(biāo)記的顏色并選擇合適的內(nèi)標(biāo)即SIZI STANDARD,點(diǎn)擊分析，導(dǎo)出結(jié)果并將 結(jié)果保存為XLS格式；
C、 EXCEL轉(zhuǎn)換將表內(nèi)的數(shù)值不為O轉(zhuǎn)換為1，數(shù)值為0的不轉(zhuǎn)換，從而生成由"O"和"l"
組成的原始矩陣；
D、 EXCEL轉(zhuǎn)換生成的0， l矩陣圖，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)的青菜DNA指紋圖譜； (5)青菜品種的鑒定
將待測(cè)青菜樣本的指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜相比較，以鑒定待測(cè)樣本的品種真實(shí)性。 以上述AFLP擴(kuò)增的結(jié)果為依據(jù)，構(gòu)建青菜不同品種的標(biāo)準(zhǔn)DNA指紋圖譜。 本發(fā)明與背景技術(shù)相比，構(gòu)建了一個(gè)客觀、科學(xué)、準(zhǔn)確的青菜品種鑒定技術(shù)體系，特別 是以標(biāo)準(zhǔn)樣品的0， 1矩陣圖構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)的青菜DNA指紋圖譜，克服以往用電泳圖直接比較可 能產(chǎn)生的誤差。該發(fā)明為保護(hù)青菜育種產(chǎn)權(quán)、新品種登錄、鑒定品種的真實(shí)性和純度提供技 術(shù)保障。


圖1是引物Primer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA C/ Msel-3: GAT GAG TCC TGA GTA ACAG擴(kuò)增的10個(gè)青菜品種AFLP電泳圖譜
圖2是引物Primer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA C/ Msel-3: GAT GAG TCC TGA GTA
ACAG擴(kuò)增的10個(gè)青菜品種AFLP的0， 1矩陣指紋圖譜
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一歩說(shuō)明 實(shí)施例1
(1)基因池DNA的來(lái)源
分別從抗熱605、矮抗青、特矮青、黑油冬兒、早油冬兒、遲油冬兒、蘇州青、矮萁蘇州 青、黑葉五月慢、五月慢10個(gè)不同青菜品種的葉片提取DNA，混合成品種的基因池。提取 及純化方法采用CTAB法，其過(guò)程為取O.lg青菜葉片，液氮下研磨成粉末；加入750W CTAB 提取液后轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中；然后65'C水浴30min，其間震蕩混勻；分別用等體積的Tris-飽和酚、氯仿、異戊醇混合溶液和等體積的氯仿、異戊醇混合溶液各提取一次，于常溫下在 12000r/min條件下離心2次，每次10min;取上清夜加入2倍的預(yù)冷的無(wú)水乙醇沉淀DNA， 于4。C條件下離心15min;離心轉(zhuǎn)速為12000r/min，離心后用70%乙醇清洗沉淀2 3次；加入雙蒸水溶解DNA，經(jīng)DNA純度檢測(cè)證實(shí)純化度，存于一2(TC冰箱中備用。 (2) AFLP接頭和預(yù)擴(kuò)增、選擴(kuò)增引物序列設(shè)計(jì)
接頭的堿基序列-EcoR I接頭 5'〉CTCGTAGACTGCGTACC
CTGACGCATGGTTAA〈5'
Mse I接頭 5'〉GACGATGAGTCCTGAG
TACTCAGGACTCAT〈5'
預(yù)擴(kuò)增引物
EcoR I預(yù)擴(kuò)引物序列5 ，> GAC TGC GTA CCA ATT CA< 3 ， Msel 預(yù)擴(kuò)引物序列5，>GATGAGTCCTGAGTAAC<3，
選擴(kuò)增引物
Mse I擴(kuò)增引物用FAM標(biāo)記
Primer E GAC TGC GTA CCA ATT C AA C/ Msel-3: GAT GAG TCC TGA GTA ACA G (3) AFLP反應(yīng)條件
A、 酶切和連接限制性酶切及連接(20ul反應(yīng)體系)，在0.5ml離心管中加入對(duì)照模板DNA 4|il (50ng/|il)， Adapter 1^1 (Mse I接頭50 pmoles/(xL, EcoR I接頭5 pmoles/pL)， EcoRI /Mse I 2^1 (4u/(xl每種)，10xReaction buffer 2.5pl， 10mM ATP 2.5pl， T4 Ligase (3u/pl)， AFLP-Water7pl ,混勻離心數(shù)秒，37。C保溫5h ，8'C保溫4h， 4°C 10h;
B、 預(yù)擴(kuò)增在0.2ml離心管中按下列方式加入(25ul反應(yīng)體系)模板DNA2ial，預(yù)擴(kuò)引物 ljil(50ng/pl每種)，dNTPs lpl(10mM)， 10xPCR buffer 2.5^1， Taq DNA poly畫se 0.5^K2u/(il)， 水18pl，離心數(shù)秒，按下列參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增循環(huán)30輪變性94。C2min，(變性94°C 30s， 復(fù)性56°C 30s，延伸72°C 80s.)延伸72。C 5min;
C、 選擇性擴(kuò)增將預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物l: 20稀釋,作為選擴(kuò)模板。選擇性擴(kuò)增體系在0.2ml
離心管中，按下列方式加入體積(25pl體系)預(yù)擴(kuò)增稀釋樣品2^1， 10xPCR buffer 2.5^， dNTPS 0.5(xl(10mM)， EcoRI引物l^il (5—1), Msel引物l^il (30ng/Vl)， Taq酶0.5^1 (2u/nl)， H20 17.5|al，以上混勻，離心數(shù)秒，按下列參數(shù)PCR循環(huán)1輪擴(kuò)增參數(shù)94°C 30s， 65°C 30s， 72'C80s，以后每輪循環(huán)溫度遞減0,7'C，擴(kuò)增12輪，接著按下列參數(shù)擴(kuò)增23輪94°C 30s， 55°C 30s， 72°C 80s;
D、 擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺電泳預(yù)電泳20-30min，點(diǎn)樣，電泳2.5h(電壓1200V),電泳大約1小時(shí)，小片段會(huì)先跑到膠的底部,測(cè)序儀激光管開始收集條帶，膠圖由測(cè)序儀軟件自動(dòng)生 成。
(4) AFLP圖譜分析及標(biāo)準(zhǔn)的DNA指紋圖譜的構(gòu)建
A、 GENESCAN軟件分析用GENESCAN3.1軟件打開膠圖，對(duì)膠圖進(jìn)行數(shù)據(jù)提取，安 裝膠圖的MATRIX,選擇合適的內(nèi)標(biāo)即SIZE STANDARD,分析得到結(jié)果；
B、 通過(guò)Binthere軟件提取樣品的各片段大小的結(jié)果，打開Binthere軟件，導(dǎo)入數(shù)據(jù)，選 擇相應(yīng)的熒光標(biāo)記的顏色并選擇合適的內(nèi)標(biāo)即SIZI STANDARD,點(diǎn)擊分析，導(dǎo)出結(jié)果并將 結(jié)果保存為XLS格式；
C、 EXCEL轉(zhuǎn)換將表內(nèi)的數(shù)值不為0轉(zhuǎn)換為1，數(shù)值為0的不轉(zhuǎn)換，從而生成由"0"和"1" 組成的原始矩陣；
D、 EXCEL轉(zhuǎn)換生成的0， l矩陣圖，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)的青菜DNA指紋圖譜； (5)青菜品種的鑒定
將待測(cè)青菜樣本的指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜相比較，以鑒定待測(cè)樣本的品種真實(shí)性。
實(shí)施例2
(1) 基因池DNA的來(lái)源
分別從抗熱605、矮抗青、特矮青、黑油冬兒、早油冬兒、遲油冬兒、蘇州青、矮萁蘇州 靑、黑葉五月慢、五月慢10個(gè)不同青菜品種的葉片提取DNA，混合成品種的基因池。提取 及純化方法采用CTAB法，其過(guò)程為取O.lg青菜葉片，液氮下研磨成粉末；加入75(^1 CTAB 提取液后轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中；然后65'C水浴30min，其間震蕩混勻；分別用等體積的Tris-飽和酚、氯仿、異戊醇混合溶液和等休積的氯仿、異戊醇混合溶液各提取一次，于常溫下在 12000r/min條件下離心2次，每次10min;取上清夜加入2倍的預(yù)冷的無(wú)水乙醇沉淀DNA， 于4。C條件下離心15min;離心轉(zhuǎn)速為12000r/min，離心后用70%乙醇清洗沉淀2 3次；加 入雙蒸水溶解DNA，經(jīng)DNA純度檢測(cè)證實(shí)純化度，存于一2(TC冰箱中備用。
(2) AFLP接頭和預(yù)擴(kuò)增、選擴(kuò)增引物序列設(shè)計(jì)
接頭的堿基序列 EcoR I接頭 5'>CTCGTAGACTGCGTACC
CTGACGCATGGTTAA<5'
Msel接頭 5'>GACGATGAGTCCTGAG
TACTCAGGACTCAT<5'
預(yù)擴(kuò)增引物
EcoR I預(yù)擴(kuò)引物序列5 ，> GAC TGC GTA CCA ATT CA< 3' Mse I 預(yù)擴(kuò)引物序列5 ，> GAT GAG TCC TGA GTA AC<3 ，選擴(kuò)增引物
Mse I擴(kuò)增引物用FAM標(biāo)記 Primer E GAC TGC GTA CCAATT CAA G/ MseI-2: GAT GAG TCC TGA GTAACA C (3) AFLP反應(yīng)條件
A、 酶切和連接限制性酶切及連接(20ul反應(yīng)體系)，在0.5ml離心管中加入對(duì)照模板DNA 4^1 (50ng/nl)， Adapter lpl (Mse I接頭50 pmoles/(aL, EcoR I接頭5 pmoles/VL)， EcoRI/Mse I 2pl (4u4d每種)，10xReaction buffer 2.5^1， 10mM ATP 2.5(xl， T4 Ligase l^il (3u/|_il)， AFLP-Water7pl ，混勻離心數(shù)秒，37。C保溫5h ，8'C保溫4h， 4°C 10h;
B、 預(yù)擴(kuò)增在0.2ml離心管中按下列方式加入(25ul反應(yīng)體系)模板DNA2pl，預(yù)擴(kuò)引物 l|xK50ng/Vl每種)，dNTPs lnl(10niM)， 10xpCR buffer 2.5^1' Taq DNApolymease 0.5^1 (2一)， 水18^1,離心數(shù)秒，按下列參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增循環(huán)30輪變性94°C 2min，(變性94°C 30s， 復(fù)性56"C 30s，延伸72°C 80s.)延伸72°C 5min;
C、 選擇性擴(kuò)增將預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物l: 20稀釋，作為選擴(kuò)模板。選擇性擴(kuò)增體系在0.2ml
離心管中，按下列方式加入體積(25^U休系)預(yù)擴(kuò)增稀釋樣品2nl， 10xPCR buffer 2.5W， dNTPS 0.5nl(10mM)， EcoRI引物lpl (5ng/|il)， Mse I引物l)J (30ng/|il)， Taq酶0.5^1 (2岸)， H20 17.5^1，以上混勻，離心數(shù)秒，按下列參數(shù)PCR循環(huán)1輪擴(kuò)增參數(shù)94°C 30s, 65'C 30s， 72°C 80s，以后每輪循環(huán)溫度遞減0.7°C，擴(kuò)增12輪，接著按下列參數(shù)擴(kuò)增23輪94°C 30s， 55°C 30s， 72°C 80s;
D、 擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺電泳預(yù)電泳20-30min，點(diǎn)樣，電泳2.5h(電壓1200V),電泳大
約1小時(shí)，小片段會(huì)先跑到膠的底部,測(cè)序儀激光管開始收集條帶，膠圖由測(cè)序儀軟件自動(dòng)生 成。
(4) AFLP圖譜分析及標(biāo)準(zhǔn)的DNA指紋圖譜的構(gòu)建
A、 GENESCAN軟件分析用GENESCAN3.1軟件打開膠圖，對(duì)膠圖進(jìn)行數(shù)據(jù)提取，安 裝膠圖的MATRIX,選擇合適的內(nèi)標(biāo)即SIZE STANDARD,分析得到結(jié)果；
B、 通過(guò)Binthere軟件提取樣品的各片段大小的結(jié)果，打丌Binthere軟件，導(dǎo)入數(shù)據(jù)，選 擇相應(yīng)的熒光標(biāo)記的顏色并選擇合適的內(nèi)標(biāo)即SIZI STANDARD,點(diǎn)擊分析，導(dǎo)出結(jié)果并將 結(jié)果保存為XLS格式；
C、 EXCEL轉(zhuǎn)換將表內(nèi)的數(shù)值不為O轉(zhuǎn)換為1,數(shù)值為0的不轉(zhuǎn)換，從而生成由"O"和"l" 組成的原始矩陣
D、 EXCEL轉(zhuǎn)換生成的0， l矩陣圖，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)的青菜DNA指紋圖譜； (5)青菜品種的鑒定將待測(cè)青菜樣本的指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜相比較，以鑒定待測(cè)樣本的品種真實(shí)性。
實(shí)施例3
(1) 基因池DNA的來(lái)源
分別從抗熱605、矮抗青、特矮青、黑油冬兒、早油冬兒、遲油冬兒、蘇州青、矮萁蘇州 青、黑葉五月慢、五月慢IO個(gè)不同青菜品種的葉片提取DNA，混合成品種的基因池。提取 及純化方法采用CTAB法，其過(guò)程為取O.lg青菜葉片，液氮下研磨成粉末；加入75(^1 CTAB 提取液后轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中；然后65'C水浴30min，其間震蕩混勻；分別用等體積的Tris-飽和酚、氯仿、異戊醇混合溶液和等體積的氯仿、異戊醇混合溶液各提取一次，于常溫下在 12000r/min條件下離心2次，每次10min;取上清夜加入2倍的預(yù)冷的無(wú)水乙醇沉淀DNA, 于4'C條件下離心15min;離心轉(zhuǎn)速為12000r/min,離心后用70%乙醇清洗沉淀2 3次；加 入雙蒸水溶解DNA,經(jīng)DNA純度檢測(cè)證實(shí)純化度，存于一20'C冰箱中備用。
(2) AFLP接頭和預(yù)擴(kuò)增、選擴(kuò)增引物序列設(shè)計(jì)
接頭的堿基序列 EcoR I接頭 5'>CTCGTAGACTGCGTACC
CTGACGCATGGTTAA<5'
Mse I接頭 5'〉GACGATGAGTCCTGAG
TACTCAGGACTCAT<5'
預(yù)擴(kuò)增引物
EcoRI預(yù)擴(kuò)引物序列5'>GACTGC GTACCAATTCA〈3' Mse I 預(yù)擴(kuò)引物序列5，> GAT GAG TCC TGA GTA AC<3' 選擴(kuò)增引物
Mse I擴(kuò)增引物用FAM標(biāo)記 Primer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA G / Msel-6: GAT GAG TCC TGA GTA ACT C
(3) AFLP反應(yīng)條件
A、 酶切和連接限制性酶切及連接(20ul反應(yīng)體系)，在0.5ml離心管中加入對(duì)照模板DNA 4)il (50ng/(al)， Adapter l(J (Mse I接頭50 pmoles/jxL, EcoR I接頭5 pmoles/,uL)， EcoRI /Mse I 2^1 (4uVl每種)，10xReaction buffer 2.5^1， 10mM ATP 2.5^1， T4 Ligase l^il (3u/pl)， AFLP-Water 7|il ，混勻離心數(shù)秒，37。C保溫5h ,8。C保溫4h， 4°C 10h;
B、 預(yù)擴(kuò)增在0.2ml離心管中按下列方式加入(25ul反應(yīng)體系)模板DNA2)11，預(yù)擴(kuò)引物 lnl(50ng/|al每種)，dNTPs l|J(10mM)' lOPCR buffer 2.5^d， Taq DNApolymeasc 0.5|il(2u/nl)， 水18pl,離心數(shù)秒，按下列參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增循環(huán)30輪變性94'C2min，(變性94°C 30s， 復(fù)性56°C 30s，延伸72。C 80s.)延伸72'C 5min;C、 選擇性擴(kuò)增將預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物l: 20稀釋,作為選擴(kuò)模板。選擇性擴(kuò)增懷糸在0.2ml
離心管中，按下列方式加入體積(25^d體系)預(yù)擴(kuò)增稀釋樣品2^1， IOxPCR buffer 2.5^1, dNTPS O，(lOmM)， EcoRT引物(5ng/W)， Mse I引物lpl (30ng/fil), Taq酶0.5|al (2u/pl)， H20 17.5^1，以上混勻，離心數(shù)秒，按下列參數(shù)PCR循環(huán)1輪擴(kuò)增參數(shù)94°C 30s， 65°C 30s， 72°C 80s,以后每輪循環(huán)溫度遞減0.7°C ,擴(kuò)增12輪，接著按下列參數(shù)擴(kuò)增23輪94°C 30s， 55°C 30s， 72°C 80s;
D、 擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺電泳預(yù)電泳20-30min，點(diǎn)樣，電泳2.5h(電壓1200V)，電泳大 約1小時(shí)，小片段會(huì)先跑到膠的底部,測(cè)序儀激光管開始收集條帶，膠圖由測(cè)序儀軟件自動(dòng)生成。
(4) AFLP圖譜分析及標(biāo)準(zhǔn)的DNA指紋圖譜的構(gòu)建
A、 GENESCAN軟件分析用GENESCAN3.1軟件打開膠圖，對(duì)膠圖進(jìn)行數(shù)據(jù)提取，安 裝膠圖的MATRIX,選擇合適的內(nèi)標(biāo)即SIZE STANDARD,分析得到結(jié)果
B、 通過(guò)Binthere軟件提取樣品的各片段大小的結(jié)果，打開Binthere軟件，導(dǎo)入數(shù)據(jù)，選 擇相應(yīng)的熒光標(biāo)記的顏色并選擇合適的內(nèi)標(biāo)即SIZl STANDARD,點(diǎn)擊分析，導(dǎo)出結(jié)果并將 結(jié)果保存為XLS格式；
C、 EXCEL轉(zhuǎn)換將表內(nèi)的數(shù)值不為O轉(zhuǎn)換為1，數(shù)值為0的不轉(zhuǎn)換，從而生成由"O"和'T' 組成的原始矩陣；
D、 EXCEL轉(zhuǎn)換生成的O， l矩陣圖，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)的青菜DNA指紋圖譜； (5)青菜品種的鑒定
將待測(cè)青菜樣本的指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜相比較，以鑒定待測(cè)樣本的品種真實(shí)性。
權(quán)利要求
1、用AFLP指紋技術(shù)鑒定青菜品種的方法，其特征在于其步驟如下(1)基因池DNA的來(lái)源從不同青菜品種的葉片提取DNA，混合成品種的基因池。(2)AFLP接頭和預(yù)擴(kuò)增、選擴(kuò)增引物序列接頭的堿基序列EcoR I接頭5′＞CTCGTAGACTGCGTACC CTGACGCATGGTTAA＜5′Mse I接頭 5′＞GACGATGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCAT＜5′預(yù)擴(kuò)增引物EcoR I預(yù)擴(kuò)引物序列5’＞GAC TGC GTA CCA ATT CA＜3’Mse I 預(yù)擴(kuò)引物序列5’＞GAT GAG TCC TGA GTA AC＜3’選擴(kuò)增引物Mse I擴(kuò)增引物用FAM標(biāo)記Primer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA C/MseI-3GAT GAG TCC TGA GTA ACA GPrimer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA G/MseI-2GAT GAG TCC TGA GTA ACA CPrimer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA G/MseI-6GAT GAG TCC TGA GTA ACT CPrimer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA G/MseI-8GAT GAG TCC TGA GTA ACT TPrimer E GAC TGC GTA CCA ATT CAC A/MseI-5GAT GAG TCC TGA GTA ACT A(3)AFLP反應(yīng)條件A、酶切和連接限制性酶切及連接(20ul反應(yīng)體系)，在0.5ml離心管中加入對(duì)照模板DNA4μl(50ng/μl)，Adapter 1μl(Mse I接頭50pmoles/μL，EcoR I接頭5pmoles/μL)，EcoRI/MseI 2μl(4u/μl每種)，10×Reaction buffer 2.5μl，10mM ATP 2.5μl，T4 Ligase 1μl(3u/μl)，AFLP-Water 7μl，混勻離心數(shù)秒，37℃保溫5h，8℃保溫4h，4℃10h；B、預(yù)擴(kuò)增在0.2ml離心管中按下列方式加入(25ul反應(yīng)體系)模板DNA 2μl，預(yù)擴(kuò)引物1μl(50ng/μl每種)，dNTPs 1μl(10mM)，10×PCR buffer 2.5μl，Taq DNA polymease 0.5μl(2u/μl)，水18μl，離心數(shù)秒，按下列參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增循環(huán)30輪變性94℃2min，(變性94℃30s，復(fù)性56℃30s，延伸72℃80s)延伸72℃5min；C、選擇性擴(kuò)增將預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物1∶20稀釋，作為選擴(kuò)模板。選擇性擴(kuò)增體系在0.2ml離心管中，按下列方式加入體積(25μl體系)預(yù)擴(kuò)增稀釋樣品2μl，10×PCR buffer 2.5μl，dNTPS0.5μl(10mM)，EcoRI引物1μl(5ng/μl)，Mse I引物1μl(30ng/μl)，Taq酶0.5μl(2u/μl)，H2O 17.5μl，以上混勻，離心數(shù)秒，按下列參數(shù)PCR循環(huán)1輪擴(kuò)增參數(shù)94℃30s，65℃30s，72℃80s，以后每輪循環(huán)溫度遞減0.7℃，擴(kuò)增12輪，接著按下列參數(shù)擴(kuò)增23輪94℃30s，55℃30s，72℃80s；(4)AFLP圖譜分析及標(biāo)準(zhǔn)的DNA指紋圖譜的構(gòu)建A、電泳大約1小時(shí)，測(cè)序儀激光管開始收集條帶，膠圖由測(cè)序儀軟件自動(dòng)生成。B、GENESCAN軟件分析用GENESCAN軟件打開膠圖，對(duì)膠圖進(jìn)行數(shù)據(jù)提取，安裝膠圖的MATRIX，選擇合適的內(nèi)標(biāo)即SIZE STANDARD并設(shè)置軟件合適的分析參數(shù)，分析得到結(jié)果；C、通過(guò)Binthere軟件提取樣品的各片段大小的結(jié)果，打開Binthere軟件，導(dǎo)入數(shù)據(jù)，選擇相應(yīng)的熒光標(biāo)記的顏色并選擇合適的內(nèi)標(biāo)即SIZI STANDARD，點(diǎn)擊分析，導(dǎo)出結(jié)果并將結(jié)果保存為XLS格式；D、EXCEL轉(zhuǎn)換將表內(nèi)的數(shù)值不為0轉(zhuǎn)換為1，數(shù)值為0的不轉(zhuǎn)換，從而生成由“0”和“1”組成的原始矩陣；E、EXCEL轉(zhuǎn)換生成的0，1矩陣圖，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)的青菜DNA指紋圖譜；(5)青菜品種的鑒定將待測(cè)青菜樣本的指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜相比較，以鑒定待測(cè)樣本的品種真實(shí)性。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用AFLP指紋技術(shù)鑒定青菜品種的方法。在AFLP指紋技術(shù)的基礎(chǔ)上，以特定不同青菜品種的基因池為模版，以限制性內(nèi)切酶EcoR I和Mse I酶解，然后酶切片段跟含有與其共同粘性末端的人工接頭連接，連接后的粘性末端順序和接頭順序就作為以后PCR反應(yīng)的引物結(jié)合位點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)引物，并以特定引物對(duì)青菜不同品種的預(yù)擴(kuò)增、選擇性擴(kuò)增共兩次擴(kuò)增為依據(jù)，構(gòu)建青菜品種的標(biāo)準(zhǔn)DNA指紋圖譜，將待定的青菜品種樣本與標(biāo)準(zhǔn)圖譜相比較，以鑒定待測(cè)樣品的品種真實(shí)性。本發(fā)明為保護(hù)青菜育種產(chǎn)權(quán)、新品種登錄、鑒定品種的真實(shí)性和純度提供技術(shù)保障。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101633950SQ20081010889
公開日2010年1月27日 申請(qǐng)日期2008年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月30日
發(fā)明者李紅斌, 宏 王, 王世恒 申請(qǐng)人:杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院