專利名稱：：一種快速檢測轉(zhuǎn)基因玉米品系bt176的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測方法，具體說是一種快速檢測轉(zhuǎn)基因玉米品系BT176的方法，通過肉眼觀察反應(yīng)管濁度或觀察加入1000xSYBRGreen后顏色變化或觀察瓊脂糖凝膠電泳來判斷樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因玉米品系BT176成分。
背景技術(shù)：
：自1993年第一個(gè)轉(zhuǎn)基因作物轉(zhuǎn)基因晚熟西紅柿正式投放美國市場以來，轉(zhuǎn)基因作物已由1996年的190萬ho^增加到2007年的1.44億hm2，市場產(chǎn)值從最初1995年的0.75億美元增加到2007年的70億美元，12年間增加約93倍。目前已有23個(gè)國家種植轉(zhuǎn)基因作物，其中轉(zhuǎn)基因大豆占全球種植面積的51%,玉米占31%,棉花占13%,油菜占5%。Bt-176玉米是先正達(dá)公司開發(fā)的抗蟲且耐草銨膦除草劑的轉(zhuǎn)基因玉米品種。美國農(nóng)業(yè)部(USDA)1994年受理該>5^司的申請，并于1995年批準(zhǔn)在美國國內(nèi)無限制種植。隨后，日本(1996)、加拿大(1996)、阿根廷及歐盟各成員國(1997)也先后準(zhǔn)許無限制種植，Bt-176玉米的種植面積不斷擴(kuò)大。同時(shí)，美國(1995)、加拿大(1995)、日本(1996)及英國、丹麥、荷蘭、瑞士和阿根廷等國分別批準(zhǔn)Bt-176玉米作為食物或詞料來源并可上市銷售。轉(zhuǎn)基因作物發(fā)展迅速，世界很多組織對其安全性產(chǎn)生擔(dān)憂。其安全性主要集中在轉(zhuǎn)基因作物釋放的環(huán)境安全性和由轉(zhuǎn)基因作物生產(chǎn)出的食品的安全性上。包括對人和動物健康的風(fēng)險(xiǎn)、對生態(tài)環(huán)境與農(nóng)業(yè)的風(fēng)險(xiǎn)、對非目標(biāo)生物的風(fēng)險(xiǎn)。針對第一種風(fēng)險(xiǎn)，1993年，聯(lián)合國經(jīng)濟(jì)發(fā)展與合作組織(0EC0)提出了食品安全性評估的"實(shí)質(zhì)等同性"原則。如果轉(zhuǎn)基因作物生產(chǎn)的產(chǎn)品與傳統(tǒng)產(chǎn)品具有實(shí)質(zhì)等同性，則可以認(rèn)為是安全的。最早提出對轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行標(biāo)識管理的是歐盟，1998年，歐盟在世界上簽署第一個(gè)法案，要求對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)簽說明；1999年，要求出口到歐盟的非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品不得含有1%的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品污染；2002年，歐盟將標(biāo)識的最低限量降低到O.9%。日本、澳大利亞、新西蘭對轉(zhuǎn)基因成分的最低含量做了不同規(guī)定，域值從1-5%不等。我國于2001年5月9日公布并實(shí)施《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》，于2002年1月5日公布了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)、標(biāo)識和進(jìn)口安全管理三個(gè)配套管理辦法，確定了第一批實(shí)施標(biāo)識管理的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物目錄，并于2002年3月20日起正式實(shí)施。為了能夠?qū)D(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品做出綜合評價(jià)，除了需要各國政府和國際機(jī)構(gòu)制定科學(xué)的安全評價(jià)體系以及嚴(yán)格的管理法規(guī)外，建立有效的方法體系對轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行檢測也很重要，這是對轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行安全性評價(jià)和實(shí)施監(jiān)管的基礎(chǔ)，也是農(nóng)產(chǎn)品國際貿(mào)易健康發(fā)展的重要保障。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測要求方法要快速、準(zhǔn)確、靈敏，并且還得考慮適應(yīng)大樣品量、目標(biāo)基因種類眾多等特點(diǎn)。因此，目前轉(zhuǎn)基因作物的檢測主要是檢測樣品是否含有外源蛋白質(zhì)(基因表達(dá)產(chǎn)物)和是否含有外源基因(DNA)。轉(zhuǎn)基因作物中外源蛋白可以利用基于免疫學(xué)原理的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、試紙條檢測、Western雜交等方法檢測，主要從待測樣品中按照一定的程序抽提含有目的蛋白的基質(zhì)，利用抗體與目的蛋白(抗原)特異結(jié)合的特性，通過偶聯(lián)抗體與抗原抗體復(fù)合物的作用產(chǎn)生可檢測的信號。轉(zhuǎn)基因作物的核酸檢測方法主要有兩種核酸分子雜交技術(shù)(Sourthernblot)，PCR檢測技術(shù)。其中的PCR檢測方法是最主要、最準(zhǔn)確地檢測轉(zhuǎn)基因作物的方法，包括定性PCR方法、復(fù)合PCR方法、巢式PCR方法、竟?fàn)幮远縋CR方法、熒光定量PCR方法等等。目前，國內(nèi)外推廣使用的是定性PCR和實(shí)時(shí)定量PCR檢測方法PCR技術(shù)的基本原理類似于DM的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。通過聚合酶的作用，在體外快速特異地?cái)U(kuò)增目的片段，使微量、特定目的DNA片段在幾小時(shí)內(nèi)迅速擴(kuò)增到百萬倍。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色后很容易觀察，因而具有快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于公開一種快速檢測轉(zhuǎn)基因玉米品系BT176的方法及根據(jù)外源基因序列設(shè)計(jì)一套引物對其進(jìn)行擴(kuò)增，通過肉眼觀察濁度或觀察加入SYBRGreen后顏色的變化或觀察瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果判斷擴(kuò)增情況。本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明基于轉(zhuǎn)基因玉米BT176的基因序列信息，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行環(huán)狀等溫?cái)U(kuò)增從而提供檢測轉(zhuǎn)基因玉米BT176的方法。用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米BT176的特異性引物，其特征在于包括外引物正向序列CGGGAACTGGCATGACGT，外引物反向序列GAGGGAGAGAGAGGGAGC;內(nèi)引物正向序列TCTCGGTGACGGGCAGGACTTTTGGTTTCTGGCAGCTGGACTT，反向序列TCTCCTCCATTGATGCACGCCTTTTGGAAGGGAGAAACGGTCGG，環(huán)引物TCAATGGCCTTGAAGCCTTG。本發(fā)明采用上述一套引物進(jìn)行快速檢測轉(zhuǎn)基因玉米品系BT176的方法，其特征在于包括如下步驟(1)釆用權(quán)利要求1所述的5條特異引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，加入模板DNA，在63-651C進(jìn)行45-60min,并且在801C持續(xù)2min，使擴(kuò)增達(dá)到10'-10"個(gè)拷貝；其中的擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為25pL，各種成分分別為10xBuffer2.5pL，4MBSA6.25nL,0.2MMgS040.25jliL，引物混合溶液lyL，lOpMdNTPs3.5yL，8000U/LBstDNA聚合酶大片段l-2juL，模板DNA1-5pL，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25mL;其中的引物序列表l如下:_引物名稱堿基數(shù)_序列(5'to3')_F3-Btl7618CGGGAACTGGCATGACGTB3-Btl7618GAGGGAGAGAGAGGGAGCFIP-Btl7643TCTCGGTGACGGGCAGGACTTTTGGTTTCTGGCAGCTGGACTTBIP-Btl7644TCTCCTCCATTGATGCACGCCTTTTGGAAGGGAGAAACGGTCGGLB-BU7620TCAATGGCCTTGAAGCCTTG(2)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，取體系液3-25jaL，采用不同方法判斷擴(kuò)增與否，包括直接向擴(kuò)增管中加入嵌入劑SYBRGreen,通過顏色變化觀察有無擴(kuò)增反應(yīng)；或評估擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂的白色沉淀物的量來觀察有無擴(kuò)增反應(yīng)；或通過觀察瓊脂糖凝膠電泳條帶判斷擴(kuò)增結(jié)果。例如可以通過肉眼觀察反應(yīng)管濁度判斷結(jié)果，無色透明為陰性，白色混濁為陽性；或通過加入1-2jaLlOOOxSYBRGreen判斷結(jié)果，橙色為陰性，綠色為陽性；或通過瓊脂糖凝膠電泳判斷結(jié)果，無條帶為陰性，有彌散及梯度條帶為陽性。本發(fā)明所述的引物混合溶液指的是將合成的引物干粉分別配制濃度為100yM的母液，然后取外引物F3、B3各8juL，內(nèi)引物FIP、BIP各1juL,環(huán)引物2pL，充分混合，制得引物混合溶液。本發(fā)明所述判斷擴(kuò)增方法中通過加入1-2pL1000xSYBRGreen判斷結(jié)果。本發(fā)明所述的模板DNA指的是樣品采用CTAB法提取純化得到的DNA。為了能更加清楚的說明本發(fā)明的測定方法，下面對本發(fā)明的試驗(yàn)方法做以詳細(xì)的iJL明。1、原理本方法應(yīng)用新型的核酸擴(kuò)增方法，其原理是采用5條特異引物及一種具有鏈置換活性的DM聚合酶，加入模板DNA,在63-65t:進(jìn)行45-60min,并且在80X:持續(xù)2min而終止，短時(shí)間擴(kuò)增效率可達(dá)到1(T-10"個(gè)拷貝。具有高特異性、高效性、快速、筒便、易檢測等特點(diǎn)。2、引物設(shè)計(jì)該引物設(shè)計(jì)較復(fù)雜。需要4-6條引物，分別是正向內(nèi)引物FIP、正向外引物F3、反向內(nèi)引物BIP、反向外引物B3、正向環(huán)引物L(fēng)F、反向環(huán)引物L(fēng)B。內(nèi)引物長度通常超過40個(gè)堿基，外引物短些，為25個(gè)堿基左右。除了引物的長度、堿基組成外，還要考慮引物與靶序列的結(jié)構(gòu)因素，使引物能夠更好的與模版目的基因序列結(jié)合并形成環(huán)狀擴(kuò)增結(jié)構(gòu)。本研究依據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米品系BT176外源基因與內(nèi)源基因結(jié)合處序列設(shè)計(jì)了5條引物。引物由大連寶生物公司合成。表l引物序列表如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3、反應(yīng)條件反應(yīng)試劑需要鏈置換型DNA聚合酶、dNTPs、引物、BSA、MgS(^和反應(yīng)緩沖液。反應(yīng)在恒溫條件下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間依據(jù)引物的效率和模板DNA質(zhì)量變化，一般為lh或更少。加入模板DNA,在63-651C進(jìn)行45-60min，并且在80X:持續(xù)2min而終止。這項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)就是不需要熱循環(huán)。由于擴(kuò)增是在恒溫條件下進(jìn)行的，因此僅需要恒溫水浴鍋或金屬加熱塊維持反應(yīng)溫度，不需要PCR儀等昂貴的儀器。材料與方法(1)試劑BioUbs(NEWENGLAND)生產(chǎn)的BstDNA聚合酶大片段和lO倍Buffer溶液；BT176品系特異性引物;BSA溶液；MgSO,溶液；dNTPs;(2)擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為25pL，其各種成分及終濃度分別為10xBuffer2.5nL,4MBSA6.25yL，0.2MMgS040.25|uL，引物混合液lpL，10pMdNTPs3.5pL，8000U/LBstDNA聚合酶大片段l-2iaL，模板DNAl-5)LiL，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25yL。(3)擴(kuò)增反應(yīng)過程:在63-65"C進(jìn)行45-60min，并且在80iC持續(xù)2min，41C，保存；(4)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，取體系液3-25|iL用不同的檢測方法判斷擴(kuò)增與否。4、擴(kuò)增結(jié)果觀察有三種觀察方法，適合不同情況下進(jìn)行1)使用2%瓊脂糖凝膠，加入EB染色劑，100V電泳50min,在紫外燈下觀察。反應(yīng)會產(chǎn)生各種片斷長度的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的擴(kuò)增產(chǎn)物，因此在電泳圖鐠中顯示為從點(diǎn)樣孔處開始的彌散和條帶現(xiàn)象。由于EB是致癌劑，因此該方法應(yīng)用不是很廣范。結(jié)果見圖l。2)由于反應(yīng)形成大量雙鏈DNA產(chǎn)物，可以直接向擴(kuò)增管中加入嵌入劑SYBRGreen，紫外燈下或肉眼觀察，無擴(kuò)增反應(yīng)的管子呈橙色，有擴(kuò)增反應(yīng)的管子將變?yōu)榫G色。結(jié)果見圖2。3)檢測還可以通過評估擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂的白色沉淀物的量來進(jìn)行。在反應(yīng)中，在核酸大量合成時(shí)，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg"結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物一焦磷酸鎂沉淀。它有極高的特異性，可以用肉眼觀察或法度儀檢測反應(yīng)管中的沉淀濁度就能夠判斷擴(kuò)增與否。本發(fā)明用于轉(zhuǎn)基因玉米品系BT176檢測的擴(kuò)增方法，具有許多迄今為止的擴(kuò)增方法無法比擬的優(yōu)點(diǎn)1)操作簡便不需要復(fù)雜的儀器，不需要特殊試劑，只需一恒定溫度就能反應(yīng)，不需要預(yù)先進(jìn)行雙鏈DNA的變性。2)高特異性該技術(shù)由5條引物擴(kuò)增靶序列的6個(gè)區(qū)段，因此具有高度特異性。3)快速高效本發(fā)明的檢測方法快速、準(zhǔn)確、靈敏，整個(gè)擴(kuò)增不到lh即可完成，產(chǎn)量可達(dá)到1(T-1(T個(gè)拷貝；4)靈敏度高擴(kuò)增模板可僅為10拷貝甚至更少。5)鑒定簡便可以用肉眼直接觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的混濁度或者通過SYBRGreen顏色變化判斷擴(kuò)增與否。圖l為擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析圖譜。自左向右依次為陽性對照、陽性樣品、Marker、陰性樣品、陰性對照。圖2為擴(kuò)增產(chǎn)物加入SYBRGreen結(jié)果圖。從左邊依次為陽性對照、陽性樣品、陰性樣品、陰性對照。圖3為擴(kuò)增產(chǎn)物加入SYBRGreen結(jié)果圖。由左向右，陽性對照、待測樣品l、待測樣品2、陰性對照。圖4為擴(kuò)增產(chǎn)物加入SYBRGreen結(jié)果圖。由左向右陽性對照l、陽性對照2、待測樣品l、待測樣品2、陰性對照、空白對照。圖5為擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析圖譜。由左向右Marker,空白對照，陰性對照，待測樣品l、待測樣品2、陽性對照。圖6為實(shí)施例4本發(fā)明方法擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析，紫外燈下觀察結(jié)果，其中M，DL2000DMMarker;1，5%;2,1%;3，0.5%;4，0.1%;5，0.05%;6，0.01%;7，0.005%;8,0.001%;9，陰性對照。圖7為實(shí)施例4常規(guī)定性PCR方法擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析，紫外燈下觀察結(jié)果其中M,DL2000DNAMarker;1，5%;2，1%;3，0.5%;4，0.1%;5，0.05%;6，0.01%;7，陰性對照。為了能更加清楚的說明本發(fā)明的方法，下面對本發(fā)明的試驗(yàn)方法做以詳細(xì)的說明，在此需加以說明的是(1)本發(fā)明所述的引物序列見表l。(2)樣品DNA模板的提取方法常規(guī)CTAB法提取(見附件)實(shí)施例1(1)試劑BioLabs(NEWENGLAND)生產(chǎn)的BstDNA聚合酶大片段和10倍Buffer溶液；BT176特異性引物混合液;4MBSA溶液；0.2MMgS04溶液;DNA模板包括陽性對照、待測樣品l、待測樣品2、陰性對照。(2)擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為25pL,其各種成分分別為10xBuffer2.5pL,4mBSA6.25pL，0.2MMgS040.25yL,引物混合液lluL，10juMdNTPs3.5yL，8000U/LBstDNA聚合酶大片段lpL,DNA模板luL,用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25)LiL，混合均勻后離心；(3)擴(kuò)增反應(yīng)程序在63"C進(jìn)行60min，并且在80。C保溫2min，41c，保存；(4)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，取體系液15pL，向擴(kuò)增管中加入嵌入劑lmL1000xSYBRGreen，振蕩混勻，肉眼觀察結(jié)果。無擴(kuò)增反應(yīng)的管子呈橙黃色，有擴(kuò)增反應(yīng)的管子將變?yōu)榫G色。結(jié)果見圖3。由左向右，陽性對照、待測樣品l、待測樣品2、陰性對照。有結(jié)果可知，待測樣品l含有轉(zhuǎn)基因玉米BT176成份，待測樣品2不含有轉(zhuǎn)基因玉米BT176成份。實(shí)施例2(1)試劑BioLabs(NEWENGLAND)生產(chǎn)的BstDNA聚合酶大片段和10倍Buffer溶液；BT176特異性引物混合液；4MBSA溶液；0.2MMgS04溶液；DNA模板包括陽性對照1、陽性對照2、待測樣品l、待測樣品2、陰性對照。(2)擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為25uL,其各種成分分別為10xBuffer2.5pL，4MBSA6.25jaL,0.2MMgSO復(fù)25pL，引物混合液lpL,lOyMdNTPs3.5pL,8000U/LBstDNA聚合酶大片段2nL，模板DNA2yL,用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25jjL,混合均勻后離心；(3)擴(kuò)增反應(yīng)程序在65iC進(jìn)行45min，并且在80t:保溫2min，4*C，保存；(4)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，取體系液15uL，直接向擴(kuò)增管中加入嵌入劑2yL1000xSYBRGreen，振蕩混勻，肉眼觀察結(jié)果。無擴(kuò)增反應(yīng)的管子呈橙黃色，有擴(kuò)增反應(yīng)的管子將變?yōu)榫G色。結(jié)果見圖4。由左向右陽性對照l、陽性對照2、待測樣品l、待測樣品2、陰性對照、空白對照。有結(jié)果可知，待測樣品1和待測樣品2都含有轉(zhuǎn)基因玉米BT176成份。實(shí)施例3(1)試劑BioLabs(NEWENGLAND)生產(chǎn)的BstDNA聚合酶大片段和lO倍Buffer溶液;BT176特異性引物混合液；4MBSA溶液;0.2MMgS04溶液；DNA模板包括陰性對照，待測樣品l、待測樣品2、陽性對照。(2)擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為25)LiL，其各種成分分別為10xBuffer2.5pL,4MBSA6.25pL,0.2MMgS040.25yL，混合引物lILiL，10nMdNTPs3.5uL，8000U/LBstDNA聚合酶大片段2pL，模板DNA5mL，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25jiL，混合均勻后離心；(3)擴(kuò)增反應(yīng)程序在63X:進(jìn)行60min,并且在80X:保溫2min，41C,保存；(4)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，取體系液5nL，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析，紫外燈下觀察結(jié)果。無擴(kuò)增反應(yīng)的管子無明顯條帶，有擴(kuò)增反應(yīng)的管子出現(xiàn)階梯狀條帶。結(jié)果見圖5。由左向右Marker,空白對照，陰性對照，待測樣品l、待測樣品2、陽性對照。有結(jié)果可知，待測樣品l不含有轉(zhuǎn)基因玉米BT176成份，待測樣品2含有轉(zhuǎn)基因玉米BT176成份。實(shí)施例4對比實(shí)驗(yàn)?zāi)壳稗D(zhuǎn)基因玉米BT176的測定方法與本發(fā)明測定方法的對比(1)本方法試劑BioLabs(NEWENGLAND)生產(chǎn)的BstDNA聚合酶大片段和10倍Buffer溶液；BT176特異性引物混合液；4MBSA溶液；0.2MMgS04溶液；DNA模板包括含有轉(zhuǎn)基因玉米BT176成份5y。、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%、0.001%的樣品。(2)本方法擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為25pL，其各種成分分別為10xBuffer2.5pL，4MBSA6.25pL，0.2MMgS040.25nL，混合引物1mL，10pMdNTPs3.5|iL,8000U/LBstDNA聚合酶大片段2yL,模板DNA5)LiL，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25iuL，混合均勻后離心；(3)本方法擴(kuò)增反應(yīng)程序在63C進(jìn)行60min，并且在80X:保溫2min,4X:，保存；(4)本方法擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，取體系液3yL,經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析，紫外燈下觀察結(jié)果。無擴(kuò)增反應(yīng)的管子無明顯條帶，有擴(kuò)增反應(yīng)的管子出現(xiàn)階梯狀條帶。結(jié)果見圖6:M，DL2000DMMarker;1，5%;2，1%;3，0.5%;4,0.1%;5，0.05%;6,0.01%;7，0.005%;8，0.001%;9,陰性對照。(5)PCR反應(yīng)引物采用本方法反應(yīng)中一對外引物F3和B3。PCR反應(yīng)為25yL體系，10XPCRbuffer(Promega)2.5iiL，10mMdNTPs(Promega)0.5uL,上游和下游引物(10mM)各0.5uL，Taq酶(5U/uL，Promega)0.5uL,DNA模板lyL，滅菌去離子水19.5uL。反應(yīng)程序?yàn)?5'C預(yù)變性5min，95。C變性30s，58。C退火30s，72。C延伸30s,72。C延伸7min。PCR產(chǎn)物取IOuL于2。/。瓊脂糖凝膠電泳，100V電壓下40min，通過凝膠成4象分析4義，見察結(jié)果圖7:M,DL2000DNAMarker;1，5%;2，1%;3,0.5%;4，0.1%;5，0.05%;6，0.01%;7，陰性對照。由兩種方法比較可以看出，本發(fā)明的方法靈敏度明顯高于PCR方法的敏感度，能檢測出BT176含量更低的樣品。附件常規(guī)CTAB法提取轉(zhuǎn)基因玉米BT176DNA的方法(1)取轉(zhuǎn)基因玉米BT176約100mg，放入研缽中，加入少量液氮迅速磨碎。液氮反復(fù)加入3~4次，磨碎成粉末為止。(2)加入1.5mL預(yù)熱至65。C的CTAB提取緩沖液，充分混合、懸浮試樣(依試樣不同，可適當(dāng)增加緩沖液的用量)，65'C保育30min，期間不停顛倒混勻；(3)約12000g離心10min。轉(zhuǎn)移上清至一新離心管，加入l倍體積的酚氯仿異戊醇(25:24:1)，充分混合。約12000g離心15min。轉(zhuǎn)移上清至一新離心管中；(4)加入1倍體積的氯仿:異戊醇(24:1)，充分混合。約12000g離心15min。轉(zhuǎn)移上清至一新離心管中；(5)加入2倍體積CTAB沉淀緩沖液，室溫靜置保育60min;12000g離心15min，棄上清；加入350jiL氯化鈉溶液溶解沉淀；12000g離心10min，轉(zhuǎn)移上清至一新離心管。(6)加入0.6倍體積異丙醇，倒置離心管輕柔混合，室溫放置20min。12000g離心15min。棄上清。加入500jiL70%乙醇溶液，并顛倒離心管數(shù)次。12000g離心10min。棄上清。(7)干燥DNA沉淀，加100nL水或TE緩沖液溶解DNA。序列表<110>天津巿農(nóng)業(yè)科學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室<120>—種快速檢測轉(zhuǎn)基因玉米品系BT176的方法及所用引物<160>5<210>1<211>18bp<212>DNA<213>人工序列<400>1cgggaactggcatgacgt18<210>2<211>18bp<212>DNA<213>人工序列<400>2gagggagagagagggagc18<210>3<211>43bp<212>DNA<213>人工序列<憎>3tctcggtgacgggcaggacttttgg"tctggcagctggactt43<210>4<211>44bp<212>DNA<213>人工序列<400>4tctcctccattgatgcacgccttttggaagggagaaacggtcgg44<210>5<211>20bp<212>腿<213>人工序列<400>5tcaatggccttgaagccttg20權(quán)利要求1、一種用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米BT176的特異性引物，其特征在于包括外引物正向序列CGGGAACTGGCATGACGT，反向序列GAGGGAGAGAGAGGGAGC；內(nèi)引物正向序列TCTCGGTGACGGGCAGGACTTTTGGTTTCTGGCAGCTGGACTT，反向序列TCTCCTCCATTGATGCACGCCTTTTGGAAGGGAGAAACGGTCGG，環(huán)引物TCAATGGCCTTGAAGCCTTG。2、一種采用權(quán)利要求1所述特異性引物快速檢測轉(zhuǎn)基因玉米BT176的方法，其特征在于(1)采用權(quán)利要求1所述的5條特異引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，加入模板DNA,在63-65t:進(jìn)行45-60min,并且在80匸持續(xù)2min，使擴(kuò)增達(dá)到10'-10"個(gè)拷貝；其中擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為25)aL，各種成分分別為10xBuffer2.5HL,4MBSA6.25jiL，0.2MMgS040.25jiL，引物混合溶液lpL，lOpMdNTPs3.5juL，8000U/LBstDNA聚合酶大片段1-2pL，模板DNA1-5nL，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25pL;混合均勻后離心；(2)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，取體系液3-25)aL，采用不同方法判斷擴(kuò)增與否，包括直接向擴(kuò)增管中加入嵌入染色劑SYBRGreen，通過顏色變化觀察有無擴(kuò)增反應(yīng)；或評估擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂的白色沉淀物來觀察有無擴(kuò)增反應(yīng)；或通過觀察瓊脂糖凝膠電泳條帶判斷擴(kuò)增結(jié)果。3、如權(quán)利要求2所迷的檢測方法，其中所述的引物混合溶液指的是將合成引物干粉分別配制濃度為100pM的母液，然后取外引物F3、B3各8jiL,內(nèi)引物FIP、BIP各lpL，環(huán)引物2pL，充分混合，制得引物混合溶液。4、如權(quán)利要求2所迷的檢測方法，其中通過加入1-2pL1000xSYBRGreen判斷結(jié)果。5、如權(quán)利要求2所述的檢測方法，其中的模板DNA指的樣品采用CTAB法提取純化得到的DNA，體積為1-5pL。全文摘要本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)基因玉米BT176的快速檢測方法及所用引物。其原理是采用5條特異引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在64℃左右對樣品模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，短時(shí)間擴(kuò)增效率可達(dá)到10⁹-10¹⁰個(gè)拷貝。其鑒定采用肉眼直接觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的混濁度或者通過加入SYBRGreen顏色變化判斷擴(kuò)增與否。本發(fā)明的檢測方法具有高特異性、高效性、快速、簡便、易檢測等特點(diǎn)，為轉(zhuǎn)基因作物的檢測開辟了廣闊的前景。文檔編號C12Q1/68GK101302565SQ200810053700公開日2008年11月12日申請日期2008年6月30日優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日發(fā)明者蘭青闊,珠朱,永王,奕程,新趙申請人:天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室