專利名稱：中藥dna檢測試劑盒及鑒定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及中藥檢測技術領域，更具體地說，是一種中藥DNA檢測試劑盒 及鑒定方法。
背景技術：
中藥材易混品種的監(jiān)督和檢驗是藥品檢驗部門每年重點工作內(nèi)容之一，目 前國內(nèi)外在中藥材檢測上普遍采用化學、紅外、紫外、液相色譜等分析方法， 上述方法對同科同屬不同種的易混藥材鑒別的專署性差，而且紅外、紫外、液 相色譜等方法又存在著對化學結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)特異性不強、操作繁瑣、費用高 等弊端，難以滿足對中藥易混品種的鑒定。由于現(xiàn)有分析方法的局限性，很難 對目前存在的中藥易混品種的真、偽作出準確判斷。本發(fā)明人從吉林市藥品檢 驗所近幾年的中藥同品種的質(zhì)量考察中發(fā)現(xiàn)，符合國家藥品標準的不一定是真 正療效好的藥品，而非正式企業(yè)生產(chǎn)的假藥，如按現(xiàn)有的分析方法檢驗，結(jié)論 的確符合規(guī)定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人遵循線粒體DNA (mtDNA)作為遺傳信息的載體，用于研究動植 物起源進化遺傳學理論，線粒體細胞色素b (cytb)基因DNA片段進化速度適 中，用于分析種內(nèi)、種間遺傳多樣性和生物的分類、系統(tǒng)發(fā)育。本發(fā)明的目的 是對三種易混中藥線粒體DNA的全部基因組進行篩選，提供一種能夠準確鑒別 易混中藥材的特異性，使用方便的中藥DNA檢測試劑盒，并提供其簡便、快速、 檢測結(jié)果可靠的鑒定方法。
本發(fā)明的目的是由以下技術方案來實現(xiàn)的。一種中藥DNA檢測試劑盒，其特征是，它包含
(a) 鑒定反應體系總體系為100iiL，其中含有緩沖液10 uL， 12.5mM dNTP4-10 uL， O.lmM鹿鞭引物、貝母引物和防己引物中的一種1. 5 -4. 0 u L, Taq DNA聚合酶2-10 n L，待檢樣本DNA 2-5 u L，余為雙蒸餾水；
(b) 陽性對照反應體系總體系為100pL，其中含有緩沖液10iiL， 12.5 mMdNTP4-10 u L， 0. lmM鹿鞭引物、貝母引物和防己引物中的一種1. 5-4. 0 HL， Taq DNA聚合酶2-10 u L，與鹿鞭引物、貝母引物和防己引物中的一種 相應的鹿鞭、貝母和防己DNA中的一種2-5 nL，余為雙蒸餾水；
(c) 陰性對照反應體系總體系為100uL，其中含有緩沖液10 uL，12.5 mM dNTP4-10 n L， O.lmM鹿鞭引物、貝母引物和防己引物中的一種1. 5 -4. 0 u L， Taq DNA聚合酶2-10 u L，牛鞭、假貝母和偽防己DNA中的一種2-5 u L， 余為雙蒸餾水。
中藥DNA鑒定方法，其特征是，它包含以下步驟
(l)設計鹿鞭、貝母、防己線粒體DNA三對特異寡核苷酸引物，含有鹿鞭、 貝母、防己DNA序列，如下鹿鞭引物、貝母引物、防己引物 鹿鞭引物
5， ATACATCCGATACAACAGC 3' 5， GAT嵐TGGGAGATAAGTG 3, 貝母引物
5， ATCATCCGATCAATAACAG 3， 5' AGGGAGMTAATAAAGTGAAA 3' 防己引物
5， AGACACATTCGTMCTC 3，5， CTCATTTMTAGGTATA 3， (2)人工合成鹿鞭、貝母、防己線粒體DNA三對特異寡核苷酸引物，采用 ABI3900高通量合成儀，固相亞磷酰胺三酯合成； (3 )建立中藥DNA檢測試劑盒
(a) 鑒定反應體系總體系為100uL，其中含有緩沖液10 uL， 12.5mM dNTP4-10 yL， O.lmM鹿鞭引物、貝母引物和防己引物中的一種1. 5-4. 0 u L， Taq DNA聚合酶2-10 u L，待檢樣本DNA 2-5 u L，余為雙蒸餾水；
(b) 陽性對照反應體系總體系為lOOyL，其中含有緩沖液10 yL，12.5 mMdNTP4-10 n L， 0. lmM鹿鞭引物、貝母引物和防己引物中的一種1. 5-4. 0 liL， Taq DNA聚合酶2-10 u L，與鹿鞭引物、貝母引物和防己引物中的一種 相應的鹿鞭、貝母和防己DNA中的一種2-5 nL，余為雙蒸餾水；
(c) 陰性對照反應體系總體系為100iiL,含有緩沖液10 ii L， 12.5mM dNTP4-10 nL， O.lmM鹿鞭引物、貝母引物和防己引物中的一種1. 5 -4. 0 y L， Taq DNA聚合酶2-10 w L，牛鞭、假貝母和偽防己DNA中的一種2-5 y L， 余為雙蒸餾水；
(4)設計反應程序
分別將中藥DNA檢測試劑盒的(a)鑒定反應體系、(b)陽性對照反應體系 和(c)陰性對照反應體系的總體系各100uL加入反應管中，置于PCR反應儀 中按下列程序進行
鹿鞭引物94。C預變性3-7 min， 94°C 30s，退火溫度57°C 30s， 72°C 1 min-30s， 35個循環(huán)，72。C延伸5-8min， 4°C;
貝母引物:94。C預變扭3-7 min， 94°C 1 min-30s，退火溫度58°C 30s， 72°C1 min-30s， 35個循環(huán)，72。C延伸5-8min， 4°C;防己引物94。C預變性3-7 min， 94°C 1 min-30s，退火溫度55°C 30s， 72°C 1 min-30s， 35個循環(huán)，72。C延伸5-8min， 4°C; (5)結(jié)果判定
反應產(chǎn)物使用1.5-1.8 %瓊脂糖凝膠，在DYY-III型水平電泳儀上電泳， 60-70mV電泳45min-lh，分子量100-1200 bp的DNA Marker作參照，凝膠成像 分析系統(tǒng)觀察得出結(jié)果。
本發(fā)明的中藥鑒定試劑盒能夠準確鑒別中藥材的特異性，使用方便；鑒 定方法具有簡便、快速、檢測結(jié)果可靠等優(yōu)點。


圖l為鹿鞭引物檢測結(jié)果圖。 圖2為貝母引物檢測結(jié)果圖。 圖3為防己引物檢測結(jié)果圖。
圖l中l(wèi)為陽性對照；2鹿鞭D(zhuǎn)NA與陽性對照出現(xiàn)相同結(jié)果為320bp; 3 為標準分子量；4為陰性結(jié)果。
圖2中5為陽性對照；6貝母DNA與陽性對照出現(xiàn)相同結(jié)果為280bp; 7為陰性結(jié)果；8為標準分子量。
圖3中9為陰性結(jié)果；IO陽性對照；11為防己DNA結(jié)果與陽性對照出現(xiàn)
相同結(jié)果為300bp; 12為標準分子量。
具體實施例方式
下面利用實施例對本發(fā)明作進一步說明。
中藥DNA鑒定方法，它包含以下步驟
(a)鑒定反應體系總體系為100uL，其中含有緩沖液10 uL, 12.5mM dNTP4-10 nL， 0, lmM鹿鞭引物、貝母引物和防己引物中的一種1. 5 -4. 0 yL， Taq DNA聚合酶2-10 u L，待檢樣本DNA 2-5 u L，余為雙蒸餾水；0. 1 mM 鹿鞭引物、貝母引物和防己引物根據(jù)鑒定種類選擇，鹿鞭、貝母和防己DNA亦 相應的根據(jù)鑒定種類選擇；
(b) 陽性對照反應體系總體系為100uL，其中含有緩沖液10 uL，12.5 mMdNTP4-10 u L， 0. lmM鹿鞭引物、貝母引物和防己引物中的一種1. 5 -4. 0 lxL， Taq DNA聚合酶2-10 u L，與鹿鞭引物、貝母引物和防己引物中的一種 相應的鹿鞭、貝母和防己DNA中的一種2-5 nL，余為雙蒸餾水；0. lmM鹿鞭 引物、貝母引物和防己引物根據(jù)鑒定種類選擇，鹿鞭、貝母和防己DNA亦相應 的根據(jù)鑒定種類選擇；
(c) 陰性對照反應體系總體系為100yL，其中含有緩沖液10 UL，12.5 mM dNTP4-10 u L, 0. lmM鹿鞭引物、貝母引物和防己引物中的一種1. 5 -4. 0 uL, TaqDNA聚合酶2-10 li L，牛鞭、假貝母和偽防己DNA中的一種2-5 n L， 余為雙蒸餾水。O.lmM鹿鞭引物、貝母引物和防己引物根據(jù)鑒定種類選擇，牛 鞭、假貝母和偽防己DNA亦相應的根據(jù)鑒定種類選擇。
中藥DNA鑒定方法，它包含以下步驟
(l)設計鹿鞭、貝母、防己線粒體DNA三對特異寡核苷酸引物，含有鹿鞭、 貝母、防己DNA序列，如下鹿鞭引物、貝母引物、防己引物 鹿鞭引物
5， ATACATCCGATACMCAGC 3， 5' GAT嵐TGGGAGATMGTG 3, 貝母引物
5， ATCATCCGATCAATMCAG 3， 5' AGGGAGMTMTMAGTGMA 3，防己引物
5， AGACACATTCGTMCTC 3， 5' CTCATTTMTAGGTATA 3'
(2)人工合成鹿鞭、貝母、防己線粒體DNA三對特異寡核苷酸引物，采用 ABI3900高通量合成儀，固相亞磷酰胺三酯合成；
(3 )建立中藥DNA檢測試劑盒
(a) 鑒定反應體系總體系為100yL，其中含有緩沖液10 u L， 12.5mM dNTP4-10 wL， O.lmM鹿鞭引物、貝母引物和防己引物中的一種1. 5 -4. 0 y L， Taq DNA聚合酶2-10 y L，待檢樣本DNA 2-5 、 L，余為雙蒸餾水；
(b) 陽性對照反應體系總體系為100ixL，其中含有緩沖液10 uL, 12.5 mMdNTP4-10 u L， 0. lmM鹿鞭引物、貝母引物和防己引物中的一種1. 5-4. 0 liL， Taq DNA聚合酶2-10 u L，與鹿鞭引物、貝母引物和防己引物中的一種 相應的鹿鞭、貝母和防己DNA中的一種2-5 nL，余為雙蒸餾水；
(c) 陰性對照反應體系總體系為100nL，其中含有緩沖液10 nL，12.5 mM dNTP4-10 u L， 0. lmM鹿鞭引物、貝母引物和防己引物中的一種1. 5 -4. 0 y L， Taq DNA聚合酶2-10 P L，牛鞭、假貝母和偽防己DNA中的一種2-5 u L， 余為雙蒸餾水；
(4)設計反應程序
分別將中藥DNA檢測試劑盒的(a)鑒定反應體系、(b)陽性對照反應體系 和(c)陰性對照反應體系的總體系各100uL力B入500iiL反應管中，置于PCR 反應儀中按下列程序進行
鹿鞭引物94。C預變性3-7 min， 94°C 30s，退火溫度57°C 30s， 72°C 1 min-30s， 35個循環(huán)，72。C延伸5-8min， 4°C;
10貝母引物94。C預變性3-7 min， 94°C 1 min-30s，退火溫度58°C 30s， 72°C1 min-30s， 35個循環(huán)，72。C延伸5-8min， 4°C;
防己引物94。C預變性3-7 min， 94°C 1 min-30s，退火溫度55°C 30s， 72°C 1 min-30s， 35個循環(huán)，72。C延伸5-8min， 4°C; (5)結(jié)果判定
反應產(chǎn)物使用1.5-1.8 %瓊脂糖凝膠，在DYY-III型水平電泳儀上電泳， 60-70mV電泳45min-lh，分子量100-1200 bp的DNA Marker作參照，凝膠成像 分析系統(tǒng)觀察得出結(jié)果。
本發(fā)明所用的固相亞磷酰胺三酯由上海生物工程公司合成，市場有售； 緩沖液含有500 mM KCl， 100 mM Tris-HC1 (PH8. 4), 15 mM MgCl2，市場有售； 12. 5 mM dNTP為12. 5 mM脫氧核苷三磷酸，市場有售；Taq DNA聚合酶，市場 有售；1.5-1.8%瓊脂糖凝膠，市場有售；DYY-III型水平電泳儀由北京市六一 儀器廠制造的市售儀器；分子量100-1200 bp的DNA Marker為標準分子量， 市場有售；凝膠成像分析系統(tǒng)，市場有售。
參照圖1，鹿鞭D(zhuǎn)NA與陽性對照出現(xiàn)相同結(jié)果為320bp。
參照圖2，貝母DNA與陽性對照出現(xiàn)相同結(jié)果為280bp。 參照圖3，防己DNA結(jié)果與陽性對照出現(xiàn)相同結(jié)果為300bp。
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權(quán)利要求
1. 一種中藥DNA檢測試劑盒，其特征是，它包含(a)鑒定反應體系總體系為100μL，其中含有緩沖液10μL，12.5mMdNTP4-10μL，0.1mM鹿鞭引物、貝母引物和防己引物中的一種1.5-4.0μL，Taq DNA聚合酶2-10μL，與鹿鞭引物、貝母引物和防己引物中的一種相應的鹿鞭、貝母和防己DNA中的一種2-5μL，余為雙蒸餾水；(b)陽性對照反應體系總體系為100μL，其中含有緩沖液10μL，12.5mM dNTP 4-10μL，0.1mM鹿鞭引物、貝母引物和防己引物中的一種1.5-4.0μL，Taq DNA聚合酶2-10μL，與鹿鞭引物、貝母引物和防己引物中的一種相應的鹿鞭、貝母和防己DNA中的一種2-5μL，余為雙蒸餾水；(c)陰性對照反應體系總體系為100μL，其中含有緩沖液10μL，12.5mM dNTP4-10μL，0.1mM鹿鞭引物、貝母引物和防己引物中的一種1.5-4.0μL，Taq DNA聚合酶2-10μL，牛鞭、假貝母和偽防己DNA中的一種2-5μL，余為雙蒸餾水。
2. —種中藥DNA鑒史方法，其持征是，'t包舍以下步腺(1)設計鹿鞭、貝母、防己線粒體DNA三對特異寡核苷酸引物，含有鹿鞭、 貝母、防己DNA序列，如下鹿鞭引物、貝母引物、防己引物 鹿鞭引物5' ATACATCCGATACAACAGC 3' 5' GATAAATGGGAGATAAGTG 3'貝母引物5' ATCATCCGATCAATAACAG 3' 5, AGGGAGAATAATAAAGTGAAA 3'防己引物5' AGACACATTCGTAACTC 3' 5' CTCATTTAATAGGTATA 3'(2)人工合成鹿鞭、貝母、防己線粒體DNA三對特異寡核苷酸引物，采用 ABI3900高通量合成儀，固相亞磷酰胺三酯合成； (3 )建立中藥DNA檢測試劑盒(a) 鑒定反應體系總體系為100iiL，其中含有緩沖液10 yL， 12.5raM dNTP4-10 ix L， 0. lmM鹿鞭引物、貝母引物和防己引物中的一種1. 5 -4. 0 u L， TaqDNA聚合酶2-10 ix L，與鹿鞭引物、貝母引物和防己引物中的一種相應的 鹿鞭、貝母和防己DNA中的一種2-5 UL，余為雙蒸餾水；(b) 陽性對照反應體系總體系為100uL，其中含有緩沖液10 yL, 12.5 mM dNTP 4-10 y L， 0.1 mM鹿鞭引物、貝母引物和防己引物中的一種1. 5 -4.0 yL， Taq DNA聚合酶2-10 y L，與鹿鞭引物、貝母引物和防己引物中的一種相 應的鹿鞭、貝母和防己DNA中的一種2-5 yL，余為雙蒸餾水；(c) 陰性對照反應體系總體系為100uL，其中含有緩沖液10 yL， 12.5 mMdNTP4-10 u L， O.lmM鹿鞭引物、貝母引物和防己引物中的一種1. 5-4. 0 u L， Taq DNA聚合酶2-10 u L，牛鞭、假貝母和偽防己DNA中的一種2-5 p L， 余為雙蒸餾水；(4)設計反應程序分別將中藥DNA檢測試劑盒的(a)鑒定反應體系、(b)陽性對照反應體系 和(c)陰性對照反應體系的總體系各IOOPL加入反應管中，置于PCR反應儀 中按下列程序進行鹿鞭引物94。C預變性3-7 min， 94°C 30s，退火溫度57°C 30s， 72°C 1 min-30s， 35個循環(huán)，72。C延伸5-8min， 4°C;貝母引物94。C預變性3-7 min， 94。C 1 min-30s，退火溫度58 °C 30s， 72°C1 min-30s， 35個循環(huán)，72。C延伸5-8min, 4'C;防己引物94。C預變性3-7 min， 94。C 1 min-30s，退火溫度55°C 30s， 72。C 1 min-30s， 35個循環(huán)，72。C延伸5-8min, 4°C; (5)結(jié)果判定反應產(chǎn)物使用1.5-1.8 %瓊脂糖凝膠，在DYY-III型水平電泳儀上電泳， 60-70mV電泳45min-lh，分子量100-1200 bp的DNA Marker作參照，凝膠成像 分析系統(tǒng)觀察得出結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明涉及中藥檢測技術領域，是一種中藥DNA檢測試劑盒，它包含鑒定反應體系、陽性對照反應體系和陰性對照反應體系，鑒定反應體系與陽性對照反應體系均含有緩沖液，12.5mM dNTP，0.1mM鹿鞭引物、貝母引物和防己引物中的一種，Taq DNA聚合酶，鹿鞭、貝母和防己DNA中的一種，以及待檢樣本DNA，雙蒸餾水；陰性對照反應體系含有緩沖液，12.5mM dNTP，0.1mM鹿鞭引物、貝母引物和防己引物中的一種，Taq DNA聚合酶，牛鞭、假貝母和偽防己DNA中的一種，雙蒸餾水。中藥DNA鑒定方法是設計鹿鞭、貝母、防己線粒體DNA三對特異寡核苷酸引物、人工合成、確定反應程序和結(jié)果判定等步驟，中藥鑒定試劑盒能夠準確鑒別中藥材的特異性；鑒定方法具有簡便、快速、檢測結(jié)果可靠等優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/68GK101434989SQ20081005164
公開日2009年5月20日 申請日期2008年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月15日
發(fā)明者孫紅霞, 張麗華, 李明成, 王冰梅 申請人:北華大學