專利名稱：一種從纖細(xì)席藻中提取多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從纖細(xì)席藻中提取多糖的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景纖細(xì)席藻屬于藍(lán)藻門、藍(lán)藻綱、段殖體目、顫藻科、席藻屬。在干旱、半干 旱地區(qū)的自然藻結(jié)皮中常有纖細(xì)席藻分布。目前，對纖細(xì)席藻的利用一般只停留 在形成人工藻結(jié)皮來改良土壤和治理荒漠化，對纖細(xì)席藻的其他應(yīng)用開發(fā)幾乎還 是一片空白。纖細(xì)席藻用于形成人工藻結(jié)皮進行荒漠治理的一個重要原因是由于 其富含多糖，多糖含量一般都在其干重的36%以上。藻類多糖可以改變?nèi)芤毫鲃?學(xué)特征，增加溶液的粘度，形成穩(wěn)定凝膠，可以作為絮凝劑；多糖大分子的親水 性和疏水性，可以作為乳化劑或生物凝聚劑；其結(jié)合電荷的能力，可用于去除廢 水中的重金屬離子。因此，它們可以用于食品工業(yè)、制藥工業(yè)、化妝品工業(yè)、紡 織品工業(yè)和石油工業(yè)等。目前利用的多糖大多是從大型海藻中提取得到，它們的 多糖含量大多比纖細(xì)席藻的要低，另外，培養(yǎng)大型海藻的成本遠(yuǎn)比培養(yǎng)纖細(xì)席藻 的成本要高，從而提高了多糖的價格。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種從纖細(xì)席藻中提取多糖的方法，該方法易行、操 作方便、安全可靠，成本低，產(chǎn)品質(zhì)量好，且所用設(shè)備簡單適宜于工業(yè)化生產(chǎn)。 從纖細(xì)席藻中提取多糖的方法包括如下步驟-(1 )培養(yǎng)液的配制按每升水加入硝酸鈉0. 8 2. 5g、磷酸氫二鉀0. 02 0. 05g、 硫酸鎂0. 06 0. 09g、氯化鈣0. 02 0. 05g、檸檬酸0. 004 0. 008g、檸檬酸鐵 銨0. 004 0. 008g、乙二胺四乙酸二鈉鹽0. OO卜O. 003g、碳酸鈉0. 01 0. 04g， 微量元素溶液0. 5 2ml，其中微量元素溶液按每lOOnil蒸餾水中加入硼酸270 300mg、四水氯化錳170 200mg、七水硫酸鋅18 25mg、 二水鉬酸鈉15 30mg、 五水硫酸銅6 10mg，完全溶解后攪勻制得培養(yǎng)液；(2)纖細(xì)席藻的培養(yǎng)首先是一級培養(yǎng)，將纖細(xì)席藻種置于培養(yǎng)液中靜止培養(yǎng) 或通氣培養(yǎng)，調(diào)節(jié)氣流在1.5 3.5L.min—'，光強控制在65 85 y E. m—2. s—'，溫 度控制在22 35'C，當(dāng)培養(yǎng)5 10天后，轉(zhuǎn)入到二級培養(yǎng)；其次是二級培養(yǎng)，將一級培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物接入到新的培養(yǎng)液中，通氣培養(yǎng)，調(diào)節(jié)氣流在2.5 5L.min—',無菌處理，光強控制在75 95 u E. m—2. s—'，溫度控制在22 35°C ，當(dāng) 培養(yǎng)5 10天后，轉(zhuǎn)入到三級培養(yǎng)；第三是三級培養(yǎng)，將二級培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物 接入到新的培養(yǎng)液中，通氣培養(yǎng)，調(diào)節(jié)氣流在3 6L.min—',無菌處理，光強控 制在70 100u E.m—2.s—'，溫度控制在22 35t:，培養(yǎng)5 10天后，所得藻種為 繼續(xù)培養(yǎng)的接種種源；繼續(xù)培養(yǎng)首先是小循環(huán)培養(yǎng)池培養(yǎng)，采用三級培養(yǎng)后所得 的藻種，接入小循環(huán)培養(yǎng)池，按每升培養(yǎng)液0.2 0.5g濕重的比例接入，控制溫 度在22 35。C，利用自然光進行光照，控制光照強度在120 180y E.nf2. s-'， 攪動培養(yǎng)基；其次是大循環(huán)培養(yǎng)池培養(yǎng)，將小循環(huán)培養(yǎng)池中培養(yǎng)4 7天的纖細(xì) 席藻轉(zhuǎn)接到大循環(huán)培養(yǎng)池中，小循環(huán)培養(yǎng)池與大循環(huán)培養(yǎng)池中培養(yǎng)液的體積比為 1:20 25，將大循環(huán)培養(yǎng)池中控制溫度在22 35°C，利用自然光進行光照，控 制光照強度在120 180u E.m—2.5_'培養(yǎng)10 20天后的纖細(xì)席藻篩選收得纖細(xì) 席藻藻漿；上述纖細(xì)席藻接種時，按每升培養(yǎng)液O. 1 0.5g濕重的比例接入。(3) 纖細(xì)席藻粉的制備將纖細(xì)席藻藻漿離心獲得纖細(xì)席藻藻泥，然后將纖 細(xì)席藻藻漿經(jīng)濃縮、脫水、干燥、粉碎后得到纖細(xì)席藻粉；(4) 纖細(xì)席藻多糖的抽提向纖細(xì)席藻粉中加入7 10倍重量的蒸餾水，攪 勻，然后在70 90。C下，攪拌抽提3 5小時，在3000 6000rpm條件下離心10 15min，收集上清液，向上清液中加入等體積的氯仿 正丁醇4 7: 1 v/v溶液， 振蕩20 30min， 3000 6000rpm離心10 15min，收集上層溶液，加入3 5倍 體積的預(yù)先冷凍到0 4。C的無水乙醇，搖勻，靜置10 20min，析出的白色絮狀 沉淀物即為纖細(xì)席藻多糖，3000 6000rpm離心5 10min收集多糖；(5) 純化、收獲與干燥首先是純化，將上述所得多糖溶于4 6倍蒸餾水中， 用10 15倍0 4'C冷的無水乙醇洗滌；其次是收獲，將上述溶液在離心機中 8000 10000rpm離心5 10min，收集多糖沉淀物；第三是干燥，將收集到的多 糖沉淀物在一6(h^ — ll(TC下冷凍干燥，得多糖產(chǎn)品。本發(fā)明具有以下優(yōu)點和卓著的效果方法易行、經(jīng)濟快捷、操作方便、安全可靠、產(chǎn)量高、產(chǎn)品質(zhì)量好，且設(shè)備簡單適用于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。
具體實施方式
本發(fā)明通過以下步驟從纖細(xì)席藻中提取多糖A、 培養(yǎng)液的配制按每升水加入硝酸鈉1.5g、磷酸氫二鉀0.04g、硫酸鎂0.075g、氯化鈣 0.036g、檸檬酸0.006g、檸檬酸鐵銨0.006g、乙二胺四乙酸二鈉鹽0. OOlg、碳 酸鈉0.02g，微量元素溶液lml，其中微量元素溶液按每100ml蒸餾水中加入硼 酸286mg、四水氯化錳181mg、七水硫酸鋅22. 2mg、 二水鉬酸鈉25. 2mg、五水 硫酸銅7.9mg，完全溶解后攪勻。B、 纖細(xì)席藻的培養(yǎng)(1) 一級培養(yǎng)將纖細(xì)席藻種接入裝有培養(yǎng)液的三角瓶(150 200ml)中， 靜止培養(yǎng)或通氣培養(yǎng)，通氣培養(yǎng)時，調(diào)節(jié)氣流大小在2.5L.min—、氣流經(jīng)過棉花 球進行無菌處理，光強控制在70u E.m-2.s-'，溫度控制在3(TC。當(dāng)培養(yǎng)7 10 天后，轉(zhuǎn)入到二級培養(yǎng)。(2) 二級培養(yǎng):將一級培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物接入到裝有培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶(500 1000ml)中，通氣培養(yǎng)，調(diào)節(jié)氣流大小在3L.min—'，無菌處理，光強控制在 80p E.m—2.s—'，溫度控制在3(TC。當(dāng)培養(yǎng)7 10天后，轉(zhuǎn)入到三級培養(yǎng)。(3) 三級培養(yǎng)將二級培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物接入到裝有培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶 (5000 20000ml)中，通氣培養(yǎng)，調(diào)節(jié)氣流大小在5L.min—1,無菌處理，光強控制在90u E.m—2.s—'，溫度控制在3(TC。當(dāng)培養(yǎng)7 10天后，便可作為繼續(xù)培 養(yǎng)的接種種源。(4) 繼續(xù)培養(yǎng)① 小循環(huán)培養(yǎng)池(1 2m3)培養(yǎng)采用三級培養(yǎng)后所得的藻種，接入小循環(huán) 培養(yǎng)池。采用玻璃溫棚控制溫度在30°C，利用自然光進行光照，采用遮蔭網(wǎng)控 制光照強度在120 180u E.m—2.s—'，葉輪或潛水泵攪動培養(yǎng)基。② 大循環(huán)培養(yǎng)池(40 60m3)培養(yǎng)將小循環(huán)培養(yǎng)池中培養(yǎng)4 7天的纖細(xì) 席藻轉(zhuǎn)接到大循環(huán)培養(yǎng)池中，小循環(huán)培養(yǎng)池與大循環(huán)培養(yǎng)池中培養(yǎng)液的體積比為 1:20 25。其他培養(yǎng)條件與小循環(huán)培養(yǎng)池的培養(yǎng)條件相同。上述纖細(xì)席藻接種時，按每升培養(yǎng)液0.1 0.5g濕重的比例接入。C、 纖細(xì)席藻粉的制備將大循環(huán)培養(yǎng)池中培養(yǎng)15 20天后的纖細(xì)席藻用泵抽到過濾裝置——振動 斜面篩上，經(jīng)過振動斜面篩后，收得纖細(xì)席藻藻漿，然后將藻漿經(jīng)過離心機離心 獲得纖細(xì)席藻藻泥。將纖細(xì)席藻藻泥經(jīng)濃縮、脫水、干燥、粉碎后得到纖細(xì)席 藻粉。D、 纖細(xì)席藻多糖的抽提向纖細(xì)席藻粉中加入7~10倍重量的蒸餾水，充分?jǐn)噭?。然后?(TC下， 利用攪拌器不停地攪拌抽提3 5小時。在離心機中，3000 6000rpm離心10 15min，收集上清液。向上清液中加入等體積的氯仿 正丁醇(5:1， v/v)溶液， 振蕩20 30min， 3000 6000rpm離心10 15min。下層為氯仿、正丁醇溶液， 中層為主要包含蛋白質(zhì)的懸浮液，上層即為主要包含多糖的粗多糖溶液。收集粗 多糖溶液，加入3 5倍體積的預(yù)先冷凍到0 4t:的無水乙醇，搖勻，靜置10 20min,析出的白色絮狀沉淀物即為纖細(xì)席藻多糖。3000 6000rpm離心5 10min收集多糖。E、 純化、收獲與干燥純化將上述所得多糖溶于4 6倍蒸餾水(w/v)中，用10 15倍(w/v) O'C冷的無水乙醇洗滌；收獲將上述溶液在離心機中8000 10000rpm離心5 10min，收集沉淀物； 干燥將收集到的多糖沉淀物在-IOO'C下冷凍干燥，得多糖產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1、一種從纖細(xì)席藻中提取多糖的方法，其特征在于包括如下步驟(1)培養(yǎng)液的配制按每升水加入硝酸鈉0.8～2.5g、磷酸氫二鉀0.02～0.05g、硫酸鎂0.06～0.09g、氯化鈣0.02～0.05g、檸檬酸0.004～0.008g、檸檬酸鐵銨0.004～0.008g、乙二胺四乙酸二鈉鹽0.001～0.003g、碳酸鈉0.01～0.04g，微量元素溶液0.5～2ml配制成培養(yǎng)液，其中微量元素溶液為按每100ml蒸餾水中加入硼酸270～300mg、四水氯化錳170～200mg、七水硫酸鋅18～25mg、二水鉬酸鈉15～30mg、五水硫酸銅6～10mg，完全溶解后攪勻即制得培養(yǎng)液；(2)纖細(xì)席藻的培養(yǎng)首先是一級培養(yǎng)，將纖細(xì)席藻種置于培養(yǎng)液中靜止培養(yǎng)或通氣培養(yǎng)，調(diào)節(jié)氣流在1.5～3.5L.min-1，光強控制在65～85μE.m-2.s-1，溫度控制在22～35℃，培養(yǎng)5～10天后轉(zhuǎn)入到二級培養(yǎng)；其次是二級培養(yǎng)，將一級培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物接入到新的培養(yǎng)液中通氣培養(yǎng)，調(diào)節(jié)氣流在2.5～5L.min-1，無菌處理，光強控制在75～95μE.m-2.s-1，溫度控制在22～35℃，培養(yǎng)5～10天后，轉(zhuǎn)入到三級培養(yǎng)；第三是三級培養(yǎng)，將二級培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物接入到新的培養(yǎng)液中，通氣培養(yǎng)，調(diào)節(jié)氣流在3～6L.min-1，無菌處理，光強控制在70～100μE.m-2.s-1，溫度控制在22～35℃，培養(yǎng)5～10天后，所得藻種為繼續(xù)培養(yǎng)的接種種源；繼續(xù)培養(yǎng)首先是小循環(huán)培養(yǎng)池培養(yǎng)，采用三級培養(yǎng)后所得的藻種，接入小循環(huán)培養(yǎng)池，控制溫度在22～35℃，利用自然光進行光照，控制光照強度在120～180μE.m-2.s-1，攪動培養(yǎng)基；其次是大循環(huán)培養(yǎng)池培養(yǎng)，將小循環(huán)培養(yǎng)池中培養(yǎng)4～7天的纖細(xì)席藻轉(zhuǎn)接到大循環(huán)培養(yǎng)池中培養(yǎng)，將大循環(huán)培養(yǎng)池中控制溫度在22～35℃，利用自然光進行光照，控制光照強度在120～180μE.m-2.s-1培養(yǎng)10～20天后的纖細(xì)席藻篩選收得纖細(xì)席藻藻漿；(3)纖細(xì)席藻粉的制備將纖細(xì)席藻藻漿離心獲得纖細(xì)席藻藻泥，然后纖細(xì)席藻藻泥經(jīng)濃縮、脫水、干燥、粉碎后得到纖細(xì)席藻粉；(4)纖細(xì)席藻多糖的抽提向纖細(xì)席藻粉中加入7～10倍重量的蒸餾水，攪勻，然后在70～90℃下，攪拌抽提3～5小時，在3000～6000rpm條件下離心10～15min，收集上清液，向上清液中加入等體積的氯仿正丁醇溶液，振蕩20～30min，3000～6000rpm離心10～15min，收集上層溶液，加入3～5倍體積的預(yù)先冷凍到0～4℃的無水乙醇，搖勻，靜置10～20min，析出的白色絮狀沉淀物即為纖細(xì)席藻多糖，3000～6000rpm離心5～10min收集多糖；(5)純化、收獲與干燥首先是純化，將上述所得多糖溶于4～6倍蒸餾水中，用10～15倍0～4℃冷的無水乙醇洗滌；其次是收獲，將純化后的溶液以8000～10000rpm離心5～10min，收集多糖沉淀物；第三是干燥，將收集到的多糖沉淀物在-60～-110℃下冷凍干燥，得多糖產(chǎn)品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從纖細(xì)席藻中提取多糖的方法，其特征在于小循環(huán)培 養(yǎng)池與大循環(huán)培養(yǎng)池中培養(yǎng)液的體積比為1:20 25。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從纖細(xì)席藻中提取多糖的方法，其特征在于所用氯仿 正丁醇溶液中氯仿與正丁醇體積比為4 7: 1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從纖細(xì)席藻中提取多糖的方法，首先將硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈣、檸檬酸、檸檬酸鐵銨、乙二胺四乙酸二鈉鹽、碳酸鈉，微量元素溶液按比例配制成培養(yǎng)液；然后將纖細(xì)席藻置于培養(yǎng)液中培養(yǎng)并制取纖細(xì)席藻粉，最后從纖細(xì)席藻多糖粉中提取多糖并將所得多糖純化、收獲與干燥。本發(fā)明方法易行、操作方便、安全可靠、產(chǎn)量高、產(chǎn)品質(zhì)量好、且所用設(shè)備簡單適用于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C12N1/12GK101235096SQ200810046770
公開日2008年8月6日 申請日期2008年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月25日
發(fā)明者劉永定, 沈銀武, 王焰新, 胡春香, 謝作明, 黃澤波 申請人:中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)