專利名稱：肝癌遺傳檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種檢測個(gè)體肝癌遺傳易感性的試劑盒， 通過同時(shí)檢測與肝癌密切相關(guān)的細(xì)胞色素P450 1A1基因(CYP1A1)、微粒體環(huán)氧化物酶基因(EPHX1)、谷 胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶M1基因(GSTM1)和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶T1基因(GSTT1)上的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型. 來評估個(gè)體肝癌遺傳易感性。
背景技術(shù)：
肝癌是由于肝臟受外界環(huán)境中的各種有害因素(主要是化學(xué)致癌物)和體內(nèi)某些致癌物的長期作用， 使肝細(xì)胞或膽管上皮細(xì)胞等發(fā)生過度增生，導(dǎo)致正常結(jié)構(gòu)遭受破壞而形成的一種惡、性腫瘤。肝癌是我國常 見的惡性腫瘤之一，是位居第二的癌癥"殺手"，常見于中年男性，高發(fā)年齡為40 49歲，男女發(fā)病之比 為6:1。肝癌的平均病程是兩年半，但其早期癥狀不明顯， 一般在出現(xiàn)癥狀后患者的生存時(shí)間僅為6個(gè)月。 因其惡性度高、病情進(jìn)展快，人稱"癌中之王"。
大量國內(nèi)外關(guān)聯(lián)研究表明，肝癌與遺傳因素關(guān)系密切，該疾病的遺傳易感性研究主要集中于I相代謝 酶和II相代謝的相關(guān)基因。
外來化合物在體內(nèi)的代謝包括I相代謝酶介導(dǎo)的活化過程和II相代謝酶介導(dǎo)的解毒過程。細(xì)胞色素 P450是研究較多的I相代謝酶，該酶系有100多種同工酶。許多化學(xué)物質(zhì)通過細(xì)胞色素P450酶的氧化作 用后，毒性不是減弱，反而增強(qiáng)，如苯并芘就是通過細(xì)胞色素P450酶的氧化代謝活化后才具有致癌活性 的。CYP1A1基因11e462Val是位于該基因第7號(hào)外顯子處的A/G多態(tài)位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于該酶的血紅素結(jié)合. 區(qū)。該多態(tài)位點(diǎn)具有三種基因型Ile/Ile、 Ile/Val和Val/Val，其中Ile/Val和Val/Val是肝癌的易感 基因型。研究表明，CYPlAl酶蛋白462位氨基酸由Ile變?yōu)閂al，增加了酶的活性，導(dǎo)致具有致癌能力的 環(huán)氧化物濃度增加，引起DNA的損傷及染色體畸變，導(dǎo)致肝癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。
環(huán)氧化物水解酶是體內(nèi)重要的II相代謝酶，在機(jī)體各種器官和組織中都可以表達(dá)，主要存在于細(xì)職內(nèi) 質(zhì)網(wǎng)和胞液中。該酶的主要功能是催化各種具有活性的外源性環(huán)氧化物以及I相代謝過程中所產(chǎn)生的各種 不穩(wěn)定的環(huán)氧化物水解，形成可溶性的物質(zhì)而排出體外。環(huán)氧化物由于帶有強(qiáng)極性的碳-氧鍵而高度活化， 易于和DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子共價(jià)結(jié)合，形成加合物而導(dǎo)致細(xì)胞毒性或遺傳物質(zhì)突變。EPHX1基因 Tyrll3His位點(diǎn)是該基因第3號(hào)外顯子處的一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，該多態(tài)位點(diǎn)的基因型有三種Tyr/Tyr、Tyr/His、 His/His，其中His/His被確定為風(fēng)險(xiǎn)基因型，與肝癌的發(fā)病有關(guān)。研究顯示，Hisll3His純合子編碼的 EPHX1酶的活性會(huì)降低40%，從而使環(huán)氧化物水解速率減慢，過多的環(huán)氧化物在體內(nèi)蓄積，后者可與DNA 鳥嘌呤的N7位點(diǎn)共價(jià)結(jié)合，引起DNA單鏈的斷裂。因此，風(fēng)險(xiǎn)基因型攜帶者由于對具有致癌作用的環(huán)氧 化物的代謝緩慢，而增加了肝癌的易感性。
GSTM1是體內(nèi)生物#轉(zhuǎn)化第11時(shí)相重要的轉(zhuǎn)移酶，它通過直接結(jié)合于化學(xué)致癌物或通過與谷胱甘肽結(jié)合 而發(fā)揮解毒功能。Null/Present是GSTM1常見的多態(tài)性，該多態(tài)有三種基因型，+/+、 +/_和-/-,分別代 表無等位基因缺失，缺失一個(gè)等位基因，缺失兩個(gè)等位基因(完全缺失型)，其中完全缺失型(Null)與 肝癌的發(fā)病相關(guān)。國內(nèi)外眾多研究表明，完全缺失型者的肝臟不能表達(dá)谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶M1，機(jī)體的解毒 功能降低，因此純合型缺失者在接觸大量致癌物時(shí)，不能使致癌物轉(zhuǎn)化為毒性低、水溶性強(qiáng)的代謝產(chǎn)物而 及時(shí)有效地排出體外。這些未排除體外的致癌物可與機(jī)體內(nèi)重要的腫瘤抑癌基因形成DNA加合物，易引起 腫瘤抑癌基因變異和功能喪失，從而增加了肝癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。
'、
GSTT1是體內(nèi)重要的II相代謝酶，它通過直接結(jié)合于化學(xué)致癌物或通過與谷胱甘肽結(jié)合而發(fā)揮解毒功 能。Null/Present是GSTT1常見的多態(tài)性，該多態(tài)有三種基因型，+/+、 +/_和-/-,分別代表無等位基因 缺失，缺失一個(gè)等位基因，缺失兩個(gè)等位基因(完全缺失型)，其中完全缺失型(-/-)與肝癌的發(fā)病相關(guān)， 是肝癌的風(fēng)險(xiǎn)基因型。GSTT1基因的缺失多態(tài)，使該基因功能喪失，機(jī)體的解毒功能降低，使得致癌物不 能轉(zhuǎn)化為毒性低、水溶性強(qiáng)的代謝產(chǎn)物而及時(shí)有效地排出體外，致癌物質(zhì)在體內(nèi)積累，濃度增加。積累的 致癌物可與機(jī)體內(nèi)重要的腫瘤抑癌基因形成DNA加合物，易引起腫瘤抑癌基因變異和功能喪失，從而增加 了肝癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
基于細(xì)胞色素P450 1A1基因(CYP1A1)、微粒體環(huán)氧化物酶基因(EPHX1)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶Ml基 因(GSTM1)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶T1基因(GSTT1)上的4個(gè)SNP位點(diǎn)多態(tài)性可用來評估個(gè)體肝癌遺傳易感 性的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種檢測個(gè)體肝癌遺傳易感性的試劑盒。
該試劑盒包括
檢測CYP1A1基因上11e462Val SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對； 檢測EPHX1基因上Tyrll3His SNP多態(tài)性基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對； 檢測GSTM1基因上SNP多態(tài)性基因型的電泳檢測引物對； 檢測GSTT1基因上SNP多態(tài)性基因型的電泳檢測引物對；
PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCL溶液、PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水等)； 熒光定量PCK反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCh溶液、反應(yīng)緩沖液、去離子水等)。 . 本試劑盒中所述的引物對是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成設(shè)計(jì)的，并可用常^的合成技術(shù)進(jìn)行合成。 本試劑盒中所述的特異性熒光探針對是能夠輕易完成設(shè)計(jì)的，特異性熒光探針對可用常規(guī)的探針合成 技術(shù)進(jìn)行合成。
本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括-
1. 熒光定量PCR反應(yīng)套裝 . 10 X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液2pl， 25mM dNTP混合液0.2|al，
25rnM MgC12溶液1. 2^1， 5units/Vl Taq DNA聚合酶0. 05pl， 20MM特異性引物對每條引物各0.225^1， IO幽特異性熒光探針對每條探針各0.25^1， 去離子水10.65^1。
2. 電泳檢測套裝
10X PCR反應(yīng)緩沖液2.5jxl， 25mM dNTP混合液0. 2pl， 25mM MgCh溶液1. 5ji1， 5units/nl Taq DNA聚合酶0. 125fil， 20pM電泳檢測引物對每條引物各0.25pl， 去離子水18. 675^1， 本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20°C 。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī) 條件，或按照廠商所建議的條件。
實(shí)施例l.檢測試劑盒的使用 步驟l: DNA模板的抽取
用硅膠吸附法抽提口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA。 步驟2:電泳檢測分型
使用檢測試劑盒中的電泳檢測套裝，反應(yīng)的體系為總體積25nl，包含濃度為12.5ng/pl的DNA模板 lpl、 IOXPCR反應(yīng)緩沖液2.5^il, 25mMdNTP混合液0.2pl， 25mMMgC12溶液1.5^1, 5units/pl Taq DNA 聚合酶0.125^1， 20nM電泳檢測引物對每條引物各0.25)x1,去離子水18.675^1。
在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為94°C、 12分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的94°C、 30秒，6(TC、 30秒，72°C、 30秒，然后進(jìn)行72。C、 IO分鐘。
然后利用電泳技術(shù)，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶數(shù)量。
步驟3:熒光定量PCR反應(yīng)
使用檢測試劑盒中的熒光定量PCR套裝，分別進(jìn)行2次獨(dú)立的熒光定量PCR反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)的體系為 總體積10nl，包含濃度為20ng/pl的DNA模板2^1、 lpl 10 X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、0. lpl 25mM dNTP 混合液、0.6nl 25mM MgCl2溶液、0.025^1 (5units/nl) Taq DNA聚合酶、20pM的有義引物和反義引物 各0. 225nl 、 10nM的帶VIC熒光探針和帶FAM熒光探針各0. 25^1 ，去離子水5. 325pl 。
在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為5(TC、 2分鐘，95°C、 IO分鐘，進(jìn)行60個(gè)循環(huán)的95°C、 30秒， 60°C、 l分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。
步驟4:基因型分析
根據(jù)試劑盒使用說明書標(biāo)示的基因分型圖示對SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析。
熟悉電泳檢測技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識(shí)電泳圖上DNA條帶的位置和數(shù)量來確定所檢測的 SNP位點(diǎn)的基因型。
熟悉熒光定量PCR技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識(shí)熒光定量PCR儀上顯示的最終樣品熒光量，根 據(jù)不同序列探針VIC和FAM熒光信號(hào)的強(qiáng)弱即可確定所檢測的SNP位點(diǎn)的基因型。
實(shí)施例2.應(yīng)用檢測試劑盒進(jìn)行個(gè)體肝癌遺傳易感性檢測的服務(wù) 步驟l: DNA提取
由醫(yī)院檢驗(yàn)科醫(yī)師指導(dǎo)被檢者使用口腔采樣拭進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞取樣，采用硅膠吸附法進(jìn)行口腔上皮 細(xì)胞的DNA抽提。
步驟2:基因分型檢測
使用本發(fā)明提供的試劑盒，對被檢測者基因組DNA的GSTM1基因和GSTT1基因上的SNP位點(diǎn)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和電泳檢測，對CYPIAI基因上11e462Val SNP位點(diǎn)、EPHXl基因上Tyrll3His SNP位點(diǎn)進(jìn)行熒光定量 PCK檢測，確定這4個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型。
步驟3:個(gè)體肝癌遺傳易感性的分析
通過對被檢測者SNP基因型的分析，出具個(gè)體肝癌遺傳易感性的分析報(bào)告單。報(bào)告中詳細(xì)說明了被檢 測者肝癌遺傳風(fēng)險(xiǎn)的高低，并由醫(yī)師向被檢者詳細(xì)說明和解讀個(gè)體肝癌遺傳易感性分析報(bào)告單。
權(quán)利要求
1.一種檢測個(gè)體肝癌遺傳易感性的試劑盒，其特征在于包括同時(shí)檢測細(xì)胞色素P450 1A1基因(CYP1A1)上Ile462Val SNP位點(diǎn)、微粒體環(huán)氧化物酶基因(EPHX1)上Tyr113His SNP位點(diǎn)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶M1基因(GSTM1)上SNP位點(diǎn)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶T1基因(GSTT1)上SNP位點(diǎn)的特異性引物對及特異性熒光探針對、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PGR反應(yīng)緩沖液、去離子水。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括1) 熒光定量PCR反應(yīng)套裝10X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液2W，25raMdNTP混合液0. , 25mM MgC12 溶液1. 2W， 5units/W Taq DNA聚合酶0.00514， 20MM特異性引物對每條引物各0.225W, 10MM特異 性熒光探針對每條探針各0. 25W，去離子水10. 65W。2) PCR反應(yīng)套裝:IOXPCR反應(yīng)緩沖液2. 5W, 25mMdNTP混合液0. 2W, 25raM MgC12溶液1.5W, 5units/W Taq DNA聚合酶0. 20HM特異性引物對每條引物各0.25W，去離子水18.675W。本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-2(TC 。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測肝癌遺傳風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒。該試劑盒包括檢測細(xì)胞色素P450 1A1基因(CYP1A1)、微粒體環(huán)氧化物酶基因(EPHX1)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶M1基因(GSTM1)和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶T1基因(GSTT1)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物對及特異性熒光探針對、熒光定量PCR常規(guī)組件、PCR反應(yīng)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過同時(shí)檢測與肝癌遺傳風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)的基因上的多態(tài)性位點(diǎn)基因型來評估個(gè)體肝癌遺傳風(fēng)險(xiǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101608217SQ200810039259
公開日2009年12月23日 申請日期2008年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月20日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司