專利名稱：：利用銨離子調(diào)控林可霉素發(fā)酵過程及提高林可霉素產(chǎn)量的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種優(yōu)化的林可霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
：林可霉素(Lincomycin)屬林可胺類抗生素，林可鏈霉菌(5Yre;z^歷7ce51"/7C0^7e7^A，5".7i/cW/7e/L5i5)生產(chǎn)林可霉素的發(fā)酵過程非常復(fù)雜，其生物合成路線目前尚不清楚，僅有文獻(xiàn)報(bào)道過推測(cè)的途徑。目前，僅有在搖瓶規(guī)模上關(guān)于林可霉素發(fā)酵過程影響因素的研究，但由于混合和取樣等方面的限制，使得搖瓶發(fā)酵既不能充分發(fā)揮林可鏈霉菌的生產(chǎn)潛力，又不能及時(shí)反饋發(fā)酵過程的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)信息。而目前還沒有在較大規(guī)模的生物反應(yīng)器中對(duì)林可霉素發(fā)酵的影響因素進(jìn)行研究的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種優(yōu)化的林可霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種利用林可鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)林可霉素的方法，所述方法包括(1)調(diào)節(jié)初始發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為57土5mmol/L，在適宜條件下培養(yǎng)林可鏈霉菌；(2)當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為0.2-1.5mmol/L時(shí)，補(bǔ)加銨離子，之后控制發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度2-5mmol/L至發(fā)酵結(jié)束。在另一優(yōu)選例中，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為0.5-lmmol/L時(shí)，補(bǔ)加銨離子。在另一優(yōu)選例中，調(diào)節(jié)初始發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為57土3mraol/L;更優(yōu)選的是57土2誦ol/L;最優(yōu)選的是57±lmmol/L。在另一優(yōu)選例中，補(bǔ)加銨離子之后控制發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為3-4tnmol/L。在另一優(yōu)選例中，在步驟(2)中，通過補(bǔ)加硫酸氨來調(diào)節(jié)銨離子濃度。在另一優(yōu)選例中，調(diào)節(jié)初始發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為57±lmmol/L;優(yōu)選的是57±0.5mmol/L;在培養(yǎng)第20-24小時(shí)，當(dāng)氨基氮[NH2-N]《0.35g/L時(shí)，補(bǔ)加硫酸銨1.067g/L培養(yǎng)基；在培養(yǎng)第2440小時(shí)，當(dāng)氨基氮《0.55g/L時(shí)，補(bǔ)加硫酸銨0.8g/L培養(yǎng)基；在培養(yǎng)第40140小時(shí)，當(dāng)氨基氮《0.55g/L時(shí)，補(bǔ)加硫酸銨0.533g/Li肯養(yǎng)基；在培養(yǎng)第140小時(shí)放罐，當(dāng)氨基氮《0.55g/L時(shí)，補(bǔ)加硫酸銨0.267g/L培養(yǎng)基。在另一優(yōu)選例中，初始發(fā)酵培養(yǎng)基中硝酸銨為2±0.2g/L，硫酸銨3±0.2g/L。優(yōu)選的，初始發(fā)酵培養(yǎng)基中硝酸銨為2±0.lg/L，硫酸銨3±0.lg/L;更優(yōu)選的，初始發(fā)酵培養(yǎng)基中硝酸銨為2±0.05g/L，硫酸銨3±0.05g/L。在另一優(yōu)選例中，初始發(fā)酵培養(yǎng)基中含有以下成分淀粉6土lg/L，葡萄糖47士5g/L，黃豆餅粉28土3g/L，玉米漿12土lg/L，氯化鈉5土0.5g/L，硝酸鈉6±0.5g/L，磷酸二氫鉀0.3±0.03g/L，碳酸鈣8±0.8g/L，硝酸銨2±0.2g/Lg/L，硫酸銨3±0.2g/L。優(yōu)選的，初始發(fā)酵培養(yǎng)基中含有淀粉6±0.5g/L，葡萄糖47±2.5g/L，黃豆餅粉28±1.5g/L，玉米漿12±0.5g/L，氯化鈉5±0.25g/L，硝酸鈉6±0.25g/L，磷酸二氫鉀0.3±0.015g/L，碳酸鈣8±0.4g/L,硝酸銨2±0.lg/Lg/L，硫酸銨3±0.lg/L。在另一優(yōu)選例中，在發(fā)酵過程中還補(bǔ)加葡萄糖和玉米漿。優(yōu)選的，在采用初始的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)后，當(dāng)測(cè)定出還原糖含量在5g/L培養(yǎng)基以下時(shí)開始補(bǔ)糖，20-40小時(shí)，按20±2g/L-h補(bǔ)加葡萄糖；40-140小時(shí)，按10土lg/L'h補(bǔ)加葡萄糖;140-結(jié)束，按5土0.5g/L'h補(bǔ)加葡萄糖。優(yōu)選的，在發(fā)酵起始后80-168小時(shí)補(bǔ)玉米漿，補(bǔ)加速率為0.2g/Lh。在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括步驟(3)從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離林可霉素。在另一優(yōu)選例中，發(fā)酵培養(yǎng)基中每分鐘空氣的通氣量是1.4±0.3L/L;優(yōu)選1.4±0.2L/L;更優(yōu)選1.4±0,1L/L。在另一優(yōu)選例中，發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度是30±2°C;優(yōu)選30士rC;更優(yōu)選30士0.5°C。在另一優(yōu)選例中，培養(yǎng)的時(shí)間是150-200小時(shí)。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。圖1顯示了不同培養(yǎng)方式下林可鏈霉菌發(fā)酵液中銨離子的含量變化。圖2顯示了不同培養(yǎng)方式下第1次補(bǔ)糖前發(fā)酵液總糖含量的變化。圖3顯示了不同培養(yǎng)方式下林可鏈霉菌菌濃(DCW)與生物效價(jià)變化圖。圖4顯示了不同培養(yǎng)方式下前50h發(fā)酵液的在線攝氧率(0UR)變化圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究和試驗(yàn)，首次在較大規(guī)模水平上研究了林可鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)林可霉素的影響因素，總結(jié)出了一種優(yōu)化的林可霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法。利用本發(fā)明的方法可使得林可鏈霉菌生長(zhǎng)良好，林可霉素的產(chǎn)量大大提高，生物效價(jià)達(dá)到7000U/ml以上。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，銨離子(NH4+)作為一種微生物易利用的氮源，在林可鏈霉菌的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)林可霉素過程中是影響產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。并且，在發(fā)酵的不同時(shí)間段銨離子的添加方法和加入量是影響發(fā)酵過程至關(guān)重要的因素。也即并非在整個(gè)過程中始終控制相同的銨離子濃度才能獲得良好的效果。因此，本發(fā)明提供一種利用林可鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)林可霉素的方法，所述方法包括(1)調(diào)節(jié)初始發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為57±5mmol/L，在適宜的條件下培養(yǎng)林可鏈霉菌；(2)當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為O.2-1.5mmol/L時(shí)，補(bǔ)加銨離子，之后控制發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度2-5mmol/L至發(fā)酵結(jié)束。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，林可鏈霉菌氨同化銨離子主要經(jīng)丙氨酸脫氫酶(ADH)途徑和谷氨酰胺合成酶(GS)/谷氨酸合酶途徑，在發(fā)酵開始的一段時(shí)間(約14h)，ADH保持較高的酶活力，而GS的酶活力較小，主要依靠ADH對(duì)銨離子進(jìn)行同化，此期間，菌濃(DCW)迅速增加，林可霉素的合成受抑制，在隨后的發(fā)酵過程中，應(yīng)將銨離子限制在較低濃度狀態(tài)，此時(shí)ADH的酶活力受抑制，而GS的酶活力較高，利于林可霉素的合成。若基礎(chǔ)培養(yǎng)基中銨離子含量過高或發(fā)酵過程中銨離子補(bǔ)入速率太大，則會(huì)抑制蛋白水解酶及淀粉水解酶的活性，并抑制GS的活性。發(fā)酵前期，在發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度降低到0.2-1.5mmol/L并補(bǔ)加銨離子后，林可霉素效價(jià)可較快升高，原因在于補(bǔ)銨離子前菌體將銨離子消耗至較低濃度，解除了高濃度的銨離子對(duì)GS的抑制作用，而GS是菌體合成抗生素時(shí)參與細(xì)胞成分如細(xì)胞壁、蛋白質(zhì)、酶和輔酶的維持代謝的關(guān)鍵酶，它的酶活力大小與林可霉素的產(chǎn)量呈正相關(guān)；補(bǔ)加銨離子之后，將發(fā)酵液中的銨離子濃度控制在25mmol/L范圍內(nèi)，可使GS的酶活力穩(wěn)定在較高水平；而如果補(bǔ)入銨離子量過多，GS的活性則將被高濃度的銨離子抑制。同時(shí)，銨離子被同化后發(fā)酵液中將生成氫離子(H+)，使pH降低，在低pH值條件下，糖代謝酶的活性可能會(huì)受到抑制，因而需要控制銨離子的加入量。當(dāng)加入銨離子過少時(shí)，由于銨離子濃度太低，GS對(duì)銨離子同化生成谷氨酰胺的速率較小，而谷氨酰胺是細(xì)胞壁、蛋白質(zhì)和酶等合成的首選供體，從而導(dǎo)致林可鏈霉菌生產(chǎn)遲緩及林可霉素的產(chǎn)量降低。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為0.5-lmmol/L時(shí)，補(bǔ)加銨離子。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，補(bǔ)加銨離子之后控制發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為3-4mmol/L。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，調(diào)節(jié)初始發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為57±3mmol/L;更優(yōu)選的是57±2mmol/L;最優(yōu)選的是57±lmmol/L。本發(fā)明的方法中，可以選擇合適的無機(jī)氮源作為銨離子的供體。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的銨離子來源于硫酸銨和硝酸氨。優(yōu)選的，初始發(fā)酵培養(yǎng)基中硝酸銨為2±0.2g/L，硫酸銨3土0.2g/L;更優(yōu)選的，初始發(fā)酵培養(yǎng)基中硝酸銨為2±0.lg/L,硫酸銨3±0.lg/L;進(jìn)一步優(yōu)選的，初始發(fā)酵培養(yǎng)基中硝酸銨為2士0.05g/L，硫酸銨3±0.05g/L。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在后續(xù)的培養(yǎng)過程中，不補(bǔ)加硝酸氨而僅通過補(bǔ)加硫酸氨來調(diào)節(jié)銨離子濃度。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述方法是調(diào)節(jié)初始發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為57±lmmol/L(優(yōu)選的是57±0.5誦ol/L);在培養(yǎng)第20-24小時(shí)，當(dāng)[跳-N]《0.35g/L時(shí)，硫酸銨補(bǔ)加量為1.067g/L;在培養(yǎng)第2440小時(shí)，當(dāng)NH2-N]《0.55g/L時(shí)，硫酸銨補(bǔ)加量為0.8g/L;在培養(yǎng)第40140小時(shí)，當(dāng)[NH廠N]《0.55g/L時(shí)，硫酸銨補(bǔ)加量0.533g/L;在培養(yǎng)第140小時(shí)放罐，當(dāng)[NH2-N]《0.55g/L時(shí)，硫酸銨補(bǔ)加量O.267g/L。在發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，還可包括步驟從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離林可霉素。從培養(yǎng)產(chǎn)物中分離或純化林可霉素可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)。例如可采用硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose離子交換、UltrogelAcA34凝膠過濾三步法純化；或采用Ni-IDA親和層析一步法純化。用于配制發(fā)酵培養(yǎng)基的其它原料(如碳源、磷源、有機(jī)氮源、無機(jī)鹽、微量元素)及其使用量均可根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)用于發(fā)酵生產(chǎn)林可霉素的原料及使用量而定。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，初始發(fā)酵培養(yǎng)基中含有以下成分淀粉6±lg/L，葡萄糖47±5g/L，黃豆餅粉28±3g/L，玉米漿12±lg/L，氯化鈉5±0.5g/L，硝酸鈉6±0.5g/L，磷酸二氫鉀O.3±0.03g/L，碳酸鈣8±0.8g/L，硝酸銨2士0.2g/Lg/L，硫酸銨3土0.2g/L;在發(fā)酵過程中，當(dāng)測(cè)定出還原糖含量在5g/L培養(yǎng)基以下時(shí)開始補(bǔ)糖，20-40小時(shí)，按20士2g/L'h補(bǔ)加葡萄糖；40-140小時(shí)，按10土lg/L'h補(bǔ)加葡萄糖;140-結(jié)束，按5±0.5g/L'h補(bǔ)加葡萄糖；在發(fā)酵起始后80-168小時(shí)補(bǔ)玉米漿，補(bǔ)加速率為0.2g/Lh。培養(yǎng)林可鏈霉菌的其它條件，如溫度、濕度、通氣量等，可采用本領(lǐng)域已知的條件。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，發(fā)酵培養(yǎng)基中空氣的通氣量是1.4土0.3L/L培養(yǎng)基；優(yōu)選1.4±0.2L/L;更優(yōu)選1.4±0.1L/L。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度是30土2。C;優(yōu)選30±1。C;更優(yōu)選30土0.5°C。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，培養(yǎng)的時(shí)間是150-200小時(shí)。在本發(fā)明的實(shí)施例中，本發(fā)明人采用50L全自動(dòng)控制發(fā)酵罐，以林可鏈霉菌L-427為生產(chǎn)菌發(fā)酵生產(chǎn)林可霉素。在50L發(fā)酵罐中采用4種硫酸銨補(bǔ)料工藝發(fā)酵制備林可霉素。將林可霉素的發(fā)酵生產(chǎn)過程分為初期(024h)、前期(2440h)、中期(40140h)和后期(140h放罐)，通過多參數(shù)的采集與分析，從而找出了銨離子對(duì)林可霉素生物合成過程產(chǎn)生重要影響的規(guī)律。與采用小規(guī)模培養(yǎng)(如搖瓶培養(yǎng))方法來分析培養(yǎng)基各因素對(duì)發(fā)酵的影響相比，本發(fā)明更加準(zhǔn)確，更能夠反映現(xiàn)實(shí)發(fā)酵生產(chǎn)中的規(guī)律。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(1)首次在較大規(guī)模水平上研究了林可鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)林可霉素的影響因素，總結(jié)出了一種優(yōu)化的林可霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法，利用該方法可使得林可鏈霉菌生長(zhǎng)良好，林可霉素的產(chǎn)量大大提高，生物效價(jià)達(dá)到7000U/ml以上，而現(xiàn)有技術(shù)中目前可達(dá)到的較好的生物效價(jià)僅為約3000U/ml。(2)本發(fā)明人揭示了不同時(shí)間段上添加銨離子的較佳方式，可操作性強(qiáng)，有利于指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。儀器與材料1.儀器與試劑FUS-50L多參數(shù)全自動(dòng)控制發(fā)酵罐(上海國(guó)強(qiáng)生化工程裝備有限公司)。林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)。2.菌種與培養(yǎng)基林可f連毒菌(5Yrepz^/zyces^Vco7/7e/7W^)L—427禾口藤黃八疊球菌(5krci"a7〃t朋，CMCC(B)28001)均購(gòu)自江西國(guó)藥有限責(zé)任公司。種子培養(yǎng)基(g/L):淀粉18.7，葡萄糖24.3，黃豆餅粉22.3，硝酸銨1.33，硫酸銨2，玉米漿26，碳酸鈣7，氯化鈉0.7，磷酸二氫鉀0.045，硝酸鈉0.85。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):淀粉6，葡萄糖47，黃豆餅粉28，玉米漿12,氯化鈉5，硝酸鈉6，磷酸二氫鉀0.3,碳酸鈣8，硝酸銨2，硫酸銨(F1罐7，F(xiàn)2、F3、F4罐均為3)，配料體積24L。在發(fā)酵過程中需要補(bǔ)加的原料為葡萄糖、硫酸銨和玉米槳。在采用初始的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)后，當(dāng)測(cè)定出還原糖含量在5g/L以下時(shí)開始補(bǔ)糖，20-40小時(shí)，按20g/L'h補(bǔ)加葡萄糖;40-140小時(shí)，按10g/L'h補(bǔ)加葡萄糖;140-結(jié)束，按5g/Ivh補(bǔ)加葡萄糖。在發(fā)酵起始后80-168小時(shí)補(bǔ)玉米漿，補(bǔ)加速率為O.2g/L'h。實(shí)施例150L發(fā)酵罐培養(yǎng)接種量20%;每分鐘通入單位體積(L)發(fā)酵液的空氣體積(VVM)為1.4L;攪拌轉(zhuǎn)速300550r/min;培養(yǎng)溫度30°C;罐壓0.05MPa;起始培養(yǎng)液體積30L;培養(yǎng)周期184h。測(cè)定方法細(xì)胞干重(DCW):吸取發(fā)酵液10ml，稱濕重，布氏漏斗抽濾，濕固形物水洗3次后80。C恒溫烘12h,稱重，計(jì)算DCW(g/L)。林可霉素效價(jià)中國(guó)藥典(2005版)二部管碟法。NH/含量利用苯酚-次氯酸鹽反應(yīng)測(cè)定銨離子[參見徐晨東等，利用苯酚-次氯酸鹽反應(yīng)測(cè)定銨離子方法的探討[J];無錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)食品與生物技術(shù)，1998，17(1):34-38]。氨基氮(NH2-N)含量甲醛氧化法[參見北京大學(xué)生物系生化教研室；生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M];北京高等教育出版社；1986:92-96]?？偺?TS)和還原糖(RS)含量斐林氏法[參見北京大學(xué)生物系生化教研室；生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M];北京高等教育出版社；1986:92-96]。實(shí)施例2NH4+對(duì)氮源代謝的動(dòng)態(tài)影響本發(fā)明人確定了四種典型的補(bǔ)硫酸銨方案(表1)，以考察NH/對(duì)發(fā)酵過程的影響。為考察基礎(chǔ)培養(yǎng)基中NH/含量較高時(shí)發(fā)酵過程的變化，將F1罐基礎(chǔ)培養(yǎng)基中硫酸銨的含量設(shè)為7g/L(相當(dāng)于103.139mmol/L);為考察發(fā)酵初期和前期補(bǔ)入硫酸銨的速率較高時(shí)發(fā)酵過程的動(dòng)態(tài)變化，設(shè)計(jì)了F3罐補(bǔ)料工藝；為考察發(fā)酵初期和前期補(bǔ)入硫酸銨的速率較低時(shí)發(fā)酵過程的動(dòng)態(tài)變化，設(shè)計(jì)了F4罐補(bǔ)料工藝。其中[NH2-N]起每隔2小時(shí)時(shí)間檢測(cè)一次。表l硫酸銨的補(bǔ)料工藝方案<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>NH4+對(duì)氮源代謝的動(dòng)態(tài)影響發(fā)酵過程中，每一罐中NH/含量變化曲線分別如圖l所示。對(duì)Fl罐，0h時(shí)NH/和氨基氮含量分別為103.139mmol/L、0.19mg/ml，全程未補(bǔ)加硫酸銨，NH/和氨基氮含量分別在25mmol/L和110mg/100ml以上，全程消耗硫酸銨5.318g/L(40h后的消耗量約0.669g/L)，未消耗的硫酸銨為0.283g/L。對(duì)F2罐，20h時(shí)NH/和氨基氮含量分別降為0.823mmol/L、30.8mg/100ml，隨后第一次補(bǔ)入硫酸銨；24184h，最低麗4+濃度(每次補(bǔ)硫酸銨之前的測(cè)定值)約為3.04.O畫ol/L，全程消耗硫酸銨14.936g/L(40h后的消耗量約10.134g/L)。對(duì)F3罐，16h時(shí)NH/和氨基氮含量分別為3.676mmol/L、50.7mg/100ml，隨后第一次補(bǔ)入硫酸銨；40h后未補(bǔ)加硫酸銨，但全程的NH/濃度均在19.5mmol/L以上，氨基氮含量在94mg/100ml以上；全程消耗硫酸銨9.403g/L(40h后的消耗量約0.447g/L)，未消耗的硫酸銨為1.541g/L。對(duì)F4罐，16h時(shí)NH4+和氨基氮含量分別為3.836mmol/L、51.8mg/100ml，隨后第一次補(bǔ)入硫酸銨，最低NH/濃度在40h時(shí)降為0.543mmol/L;40h以后，最低NH/濃度基本在1.502.50mmol/L的范圍內(nèi)；全程消耗硫酸銨10.116g/L(40h后的消耗量約6.108g/L)。與F2罐相比，F(xiàn)l和F3罐NH/含量很高，而消耗硫酸銨的總量卻比F2罐少，說明高濃度的NH4+可抑制林可鏈霉菌對(duì)NH/的利用；F3罐40h后未補(bǔ)加硫酸銨，但消耗硫酸銨的量極少，進(jìn)一步說明發(fā)酵前期產(chǎn)生的NH/阻遏效應(yīng)很難解除，會(huì)降低后續(xù)發(fā)酵過程中菌體消耗氮源的能力。另外，40h前F2罐硫酸銨的消耗量比F4罐的僅多0.794g/L，但40h后F2罐的消耗量比F4罐的多4.026g/L，前者的干重也較后者平均多2g/L左右(圖4)，NH/的這種調(diào)節(jié)作用類似信號(hào)的放大作用，此處簡(jiǎn)稱"NH4+放大效應(yīng)"。綜上，第一次補(bǔ)硫酸銨以前，待發(fā)酵液中的順4+消耗至很低濃度(<1.0mmol/L，如F2罐)后，林可鏈霉菌對(duì)NH/的消耗速率和消耗量增大，說明低濃度的NH/促進(jìn)了催化銨同化的酶的大量合成；發(fā)酵初期和前期補(bǔ)入硫酸銨的平均速率過大或偏小(本工藝以F2罐的為最佳)時(shí)均會(huì)導(dǎo)致后續(xù)發(fā)酵過程的"NH/放大效應(yīng)"。實(shí)施例3冊(cè)4+對(duì)糖代謝的動(dòng)態(tài)影響根據(jù)測(cè)定，0h時(shí)，4罐培養(yǎng)液的總糖含量分別為6.3、6.52、6.32和6.78g/100ml。16h前F2、F3和F4罐的總糖消耗速率變化基本相當(dāng)，16h后按表l補(bǔ)加硫酸銨F3和F4罐均在16h開始第一次補(bǔ)硫酸銨，前者補(bǔ)硫酸銨的速率較后者的大，導(dǎo)致前者的總糖消耗速率比后者的大；F2罐在20h才開始補(bǔ)入硫酸銨，1620h，其NH/濃度比F3和F4罐的低，總糖消耗速率也較低(圖2)，說明NH4+濃度與葡萄糖降解酶的酶活力正相關(guān)。對(duì)F1罐，總糖消耗速率最慢，在44h時(shí)總糖含量降至16.7g/L，由于起始培養(yǎng)基中含47g/L的葡萄糖，僅含6g/L的淀粉，說明過高濃度的NH4+會(huì)抑制葡萄糖降解酶的酶活力。因此，在一定濃度范圍內(nèi)，增大NH/的供給速率可提高葡萄糖降解酶的活性；當(dāng)NH/的濃度過高時(shí)(如F1罐，〉25mmol/L)，葡萄糖降解酶的酶活力會(huì)受到抑制。補(bǔ)葡萄糖后的影響整個(gè)發(fā)酵過程中Fl罐的最低NH/濃度為25.3mmol/L，葡萄糖的降解速率均很低，說明NH/濃度持續(xù)在25mmol/L以上時(shí)會(huì)抑制葡萄糖降解酶的酶活力。對(duì)F2罐，24h時(shí)第一次補(bǔ)入葡萄糖，2428h平均耗糖速率為2.0g/(h'L)[或0.0499g'(h'g干重)—']，24h補(bǔ)加硫酸銨后NH/的最高瞬時(shí)濃度為12.5mmol/L，此后，平均耗糖速率逐漸降低，但降幅較小。對(duì)F3罐，19h時(shí)第一次補(bǔ)入葡萄糖，1925h，平均耗糖速率為2.15g/(h'L)[或0.05g'(h'g干重)—J，較F2罐的高，而在19h和22h兩次補(bǔ)硫酸銨后NH/的最高瞬時(shí)濃度分別為19.lmmol/L禾P19.9mmol/L，說明NH/的最高瞬時(shí)濃度約為19.0mmol/L時(shí)葡萄糖降解酶的酶活力較最高瞬時(shí)濃度為12.5mmol/L時(shí)的高；2528h平均耗糖速率為1.644g/0rL)，較第一時(shí)段下降0.467g/0vL)[F2罐第二時(shí)段相對(duì)第一時(shí)段下降0.222g/0vL)]，說明F3罐由于補(bǔ)入硫酸銨速率過快而抑制了葡萄糖降解酶在此時(shí)段的酶活力，即當(dāng)NH/濃度達(dá)到20.927mmol/L(2528h的最高瞬時(shí)濃度)時(shí)葡萄糖降解酶的活性會(huì)受到抑制；31h后，平均耗糖速率下降很快，進(jìn)一步說明過高濃度的NH/會(huì)對(duì)葡萄糖降解酶產(chǎn)生明顯的抑制作用。鑒于此，可取19.0腿ol/L作為NH4+抑制葡萄糖降解酶的濃度臨界點(diǎn)。因此，發(fā)酵初期(從第l次補(bǔ)硫酸銨開始)和前期抑制葡萄糖降解酶活性的NH/濃度臨界點(diǎn)為19.0圓ol/L，即臨界值以下，NH/濃度與葡萄糖降解酶的活力呈正相關(guān)。實(shí)施例4對(duì)次級(jí)代謝的動(dòng)態(tài)影響林可鏈霉菌進(jìn)行旺盛的次級(jí)代謝主要需具備兩方面的條件具有較高的生物量積累及合適的環(huán)境條件；林可霉素合成酶的量很大且活性很高。由圖3可見，40h后，F(xiàn)l罐的菌濃(DCW)最低，F(xiàn)2罐的DCW最高最穩(wěn)定，維持在43.5g/L左右；F4罐的DCW維持在41.4g/L左右；而F3罐的DCW呈下降趨勢(shì)。Fl、F2、F3和F4罐發(fā)酵液在24h時(shí)的生物效價(jià)分別為0、376、145和259u/ml，在40h時(shí)分別為286、1223、598和834u/ral，F(xiàn)2罐起步效價(jià)最高，2440h其生物效價(jià)的漲幅也最大，說明F2罐在發(fā)酵初期林可霉素合成途徑中的一些關(guān)鍵調(diào)控酶(統(tǒng)稱林可霉素合成酶)可能被大量誘導(dǎo)或激活，并且一經(jīng)合成后就不受NH4+抑制或所受抑制作用很?。?6h前，F(xiàn)2與F4罐各項(xiàng)參數(shù)變化很接近，16h時(shí)F4罐以很小的速率補(bǔ)入硫酸銨，而F2罐是在NH/消耗至1.Ommol/L以下(20h)才補(bǔ)入硫酸銨，1620h，F(xiàn)2罐的NH/濃度變化范圍為3.00.8mmol/L，F(xiàn)l罐的為3.12.5mmol/L，這說明NH/濃度在2.5mmol/L以下有利于林可霉素合成酶的大量合成。F2罐全程的補(bǔ)硫酸銨速率比F4罐的大，前160h，每24h林可霉素效價(jià)的漲幅均在1000u/ml以上，但F4罐在前88h林可霉素效價(jià)漲幅僅在600u/ml左右，以后每24h的漲幅約為800u/ml左右，進(jìn)一步說明發(fā)酵初期林可霉素合成酶一經(jīng)合成后即不受NH/濃度的影響。Fl和F3罐的起步效價(jià)低說明高濃度的NH/會(huì)抑制林可霉素合成酶的合成；二者的DCW逐漸降低，顯微鏡下可觀察到菌絲提前斷裂及自溶，說明高濃度的NH/抑制了糖代謝酶及氮源代謝酶的活性，使得林可鏈霉菌的初級(jí)代謝強(qiáng)度變得很弱，次級(jí)代謝水平低。因此，第一次補(bǔ)硫酸銨以前，待NH/消耗至很低的濃度(〈1.0mmol/L)，有利于林可霉素合成酶的大量合成，該酶合成后可能不受NH/濃度(〈19.0mmol/L)的影響；限制硫酸銨的補(bǔ)入速率，使發(fā)酵液保持穩(wěn)定的NH/濃度壓力(最低濃度范圍為3.04.Ommol/L)，可使林可鏈霉菌的維持代謝和次級(jí)代謝保持較高水平。實(shí)施例5前50h的攝氧率(OUR)曲線與菌絲形態(tài)變化分析菌體的OUR受多種因素的影響，如罐壓、空氣流量、轉(zhuǎn)速、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度和環(huán)境條件等，OUR的變化與菌絲形態(tài)的變化也有密切的關(guān)聯(lián)性。Fl、F2、F3和F4罐的在線0UR曲線如圖4所示。與其它3罐相比，F(xiàn)1罐的0UR水平最低；對(duì)F2、F3和F4罐，前16h三者的OUR曲線變化趨勢(shì)基本一致，16h后則有了差異F2罐的0UR曲線較平穩(wěn)，24h后雖然呈下降趨勢(shì)，但與其它罐相比，基本保持在最高水平(發(fā)酵旺盛期40140h)2030mmol/(L'h)內(nèi)(50h后數(shù)據(jù)未列出);F3罐的OUR在25h前較高，此后緩慢下降，31h后降幅明顯增大；F4罐的0UR也較穩(wěn)定，但比F2罐的低。就菌絲特征而言，F(xiàn)2、F3和F4罐的菌絲在16h時(shí)均開始出現(xiàn)原生質(zhì)收縮現(xiàn)象，1620h，對(duì)F2罐，該現(xiàn)象逐漸消失，發(fā)酵液密度增大，菌絲長(zhǎng)而舒展；對(duì)F3罐，該現(xiàn)象很快消失，但發(fā)酵液密度減小，菌絲出現(xiàn)膨脹現(xiàn)象；對(duì)F4罐，該現(xiàn)象一直存在。發(fā)酵前期和后續(xù)發(fā)酵過程中，F(xiàn)2罐的菌絲形態(tài)穩(wěn)定；而F3罐在31h以后斷裂的菌絲段明顯增多；40h前F4罐的菌絲逐漸變得較細(xì)而短，40h以后，菌絲隨著硫酸銨補(bǔ)料量的增加逐漸變得較長(zhǎng)較粗，0UR與F2罐靠近；Fl罐從20h開始即有許多斷裂的菌絲段。因此，NH/供給速率過高可導(dǎo)致菌絲膨脹；第一次補(bǔ)硫酸銨以前，待林可鏈霉菌將NH/消耗至很低濃度(〈1.0mmol/L)，可使遲效碳、氮源得到充分利用(原生質(zhì)收縮現(xiàn)象逐漸消失)；在林可霉素生產(chǎn)旺盛期(40140h)應(yīng)全面調(diào)控，使OUR保持在2030mmol/(L'h)的范圍內(nèi)。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。權(quán)利要求1.一種利用林可鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)林可霉素的方法，其特征在于，所述方法包括(1)調(diào)節(jié)初始發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為57±5mmol/L，在適宜條件下培養(yǎng)林可鏈霉菌；(2)當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為0.2-1.5mmol/L時(shí)，補(bǔ)加銨離子，之后控制發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度2-5mmol/L至發(fā)酵結(jié)束。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為0.5-l,ol/L時(shí)，補(bǔ)加銨離子。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，調(diào)節(jié)初始發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為57±3mmol/L。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，補(bǔ)加銨離子之后控制發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為3-4mmol/L。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的銨離子來源于硫酸銨和硝酸氨。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，調(diào)節(jié)初始發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為57士lmmol/L;在培養(yǎng)第20-24小時(shí)，當(dāng)氨基氮[NH2-N]《0.35g/L時(shí)，補(bǔ)加硫酸銨1.067g/L;在培養(yǎng)第2440小時(shí)，當(dāng)氨基氮《0.55g/L時(shí)，補(bǔ)加硫酸銨0.8g/L;在培養(yǎng)第40140小時(shí)，當(dāng)氨基氮《0.55g/L時(shí)，補(bǔ)加硫酸銨0.533g/L;在培養(yǎng)第140小時(shí)放罐，當(dāng)氨基氮《0.55g/L時(shí)，補(bǔ)加硫酸銨0.267g/L。7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，初始發(fā)酵培養(yǎng)基中硝酸銨為2±0.2g/L，硫酸銨3±0.2g/L。8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，初始發(fā)酵培養(yǎng)基中含有以下成分淀粉6士lg/L，葡萄糖47士5g/L，黃豆餅粉28土3g/L,玉米漿12士lg/L，氯化鈉5±0.5g/L，硝酸鈉6士0.5g/L，磷酸二氫鉀0.3±0.03g/L，碳酸鈣8±0.8g/L，硝酸銨2土0.2g/Lg/L，硫酸銨3±0.2g/L。9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基中每分鐘空氣的通氣量是:1.4±0.3L/L。10.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度是30土2。C。全文摘要本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，公開了一種優(yōu)化的林可霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法，所述方法包括調(diào)節(jié)初始發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為57±5mmol/L，培養(yǎng)林可鏈霉菌；當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度為0.2-1.5mmol/L時(shí)，補(bǔ)加銨離子，之后控制發(fā)酵培養(yǎng)基中銨離子濃度2-5mmol/L至發(fā)酵結(jié)束。本發(fā)明人首次在較大規(guī)模水平上研究了林可鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)林可霉素的影響因素，總結(jié)出了優(yōu)化的林可霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法，利用該方法可使得林可霉素的產(chǎn)量大大提高。文檔編號(hào)C12P17/16GK101220385SQ20081003295公開日2008年7月16日申請(qǐng)日期2008年1月23日優(yōu)先權(quán)日2008年1月23日發(fā)明者炬儲(chǔ),夏建業(yè),莊英萍,張嗣良,嘯李,杭海峰,王永紅,郭美錦申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)