專利名稱：豬2型圓環(huán)病毒pcr快速檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及獸醫(yī)生物技術(shù)領(lǐng)域的診斷技術(shù)，具體是一種檢測豬2型圓環(huán)病毒的診斷方法 和專用試劑盒。
背景技術(shù)：
豬圓環(huán)病毒(Porcine Circovirus, PCV)是目前發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物病毒，病毒粒子直徑約 17nm，為共價(jià)閉合，環(huán)狀，單股DNA病毒，PCV具有兩種基因型PCV1禾tl PCV2。 PCV1 無致病性，但廣泛存在于豬體內(nèi)和豬源傳代細(xì)胞系，PCV2對豬有致病性，主要引起仔豬斷 奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)。 PMWS為一 種新的傳染病，1991年首次在加拿大發(fā)現(xiàn)，主要發(fā)生于5 12周齡斷奶仔豬，表現(xiàn)為進(jìn)行性 消瘦、呼吸困難、皮膚蒼白、腹瀉、黃疸。隨后，美國、英國、德國、法國、愛爾蘭、捷克、 西班牙、中國臺(tái)灣、荷蘭、瑞士、阿根廷、墨西哥、日本、丹麥、意大利、韓國、匈牙利、 泰國等相繼報(bào)道了該病，流行病學(xué)調(diào)査表明，該病在中國也廣泛流行，并造成相當(dāng)嚴(yán)重的經(jīng) 濟(jì)損失。PCV2除了引起PMWS夕卜，還可引起育肥豬皮炎與腎病綜合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome, PNDS)，并與懷孕母豬的繁殖障礙，新生仔豬的先天性震顫，新生仔 豬腹瀉和增生性壞死性肺炎關(guān)系密切。根據(jù)PMWS的流行病學(xué)、臨床癥狀和解剖病理變化可 對PCV2感染作出初步診斷，但確診仍需要以實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)檢測PCV2抗原。
目前，國內(nèi)外采用的PCV2檢測技術(shù)主要有病毒分離培養(yǎng)，間接免疫熒光(IFA)，免 疫酶單層試驗(yàn)(IMPA)，原位雜交(ISH)，酶聯(lián)免疫試驗(yàn)(ELISA)等，這些方法均存在操 作復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)條件要求高、特異性不強(qiáng)、耗時(shí)長、不適合大規(guī)模檢測等不足。因此，研制開 發(fā)適用于普通實(shí)驗(yàn)室的快捷、簡便的PCV2檢測試劑，實(shí)現(xiàn)PCV2的快速診斷，對疫病的預(yù) 防和控制有著重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)豬2型圓環(huán)病毒網(wǎng)上發(fā)表的序列，設(shè)計(jì)一對豬2型圓環(huán)病毒特異性擴(kuò)增引物， 結(jié)合先進(jìn)的病毒核酸提取技術(shù)和高效PCR商品試劑，經(jīng)實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化組合而成的一種成熟的 PCR快速檢測試劑盒。該試劑盒可對待檢組織進(jìn)行直接檢測，檢測過程簡單，抗污染性強(qiáng)。 從病料處理到獲得結(jié)果只需4小時(shí)，結(jié)果準(zhǔn)確且靈敏度高、特異性好，是目前豬2型圓環(huán)病 毒檢測非常好的一種替代方法。
本發(fā)明的主要技術(shù)方案有-
1. 引物設(shè)計(jì)根據(jù)豬2型圓環(huán)病毒網(wǎng)上發(fā)表的序列，設(shè)計(jì)一對豬2型圓環(huán)病毒特異性擴(kuò) 增引物，引物詳細(xì)為-
PrimerPh 5，一 CCGCGGGCTGGCTGAACTT—3， PrimerP2: 5，一 ACCCCCGCCACCGCTACC—3'
其中Primer Pl/P2引物對在豬2型圓環(huán)病毒核酸中特異性擴(kuò)增出1154bp的產(chǎn)物。
2. 待檢病料的核酸提取采用DNA快速提取方法提取待檢組織樣品的DNA核酸。
3. PCR體系PCR反應(yīng)體系為25pL，包括10xPCR buffer (含Mg2+) 2.5/iL，濃度分 別為2.5mmol/L的dNTPs 2/iL， 5U//iLTaqDNA聚合酶0.5/iL， 20jUmol/LPrimer Pl/P2各l/iL， DNA提取溶液lOpL，用雙蒸水補(bǔ)足25/iL。
4PCR擴(kuò)增程序94。C預(yù)變性5min; 94。Clmin、 53。Clmin、 72。Clmin， 30個(gè)循環(huán)；最 后68'C延伸8min。 4'C保存。
5. 電泳檢測取8pLPCR產(chǎn)物，混合1/iL上樣緩沖液，1~1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析 PCR產(chǎn)物，以DNA分子量Marker為參考。
6. 結(jié)果判斷:在陰性對照無條帶、陽性對照有明顯1154bp條帶的前提下，樣品出現(xiàn)1154bp 大小條帶定為豬瘟病毒核酸陽性，否則判為陰性。
本試劑盒的組成及保存
緩沖液GA1.5mLx l管室溫儲(chǔ)存
緩沖液GB3mL x l管室溫儲(chǔ)存
去蛋白液GD6mL x 1管室溫儲(chǔ)存
漂洗液PW25mL x 1管室溫儲(chǔ)存
無水乙醇3mL x 1管室溫儲(chǔ)存
洗脫緩沖液TE2mL x1管室溫儲(chǔ)存
蛋白酶K0.3mL x 1管-20'C儲(chǔ)存，避免反復(fù)凍融。
吸附柱CB312個(gè)室溫儲(chǔ)存，避免反復(fù)凍融。
2mL收集管12個(gè)室溫儲(chǔ)存
滅菌離心管36個(gè)室溫儲(chǔ)存
PCR體系15jtiLx 12管-20'C儲(chǔ)存，避免反復(fù)凍融。
陽性對照lmL xi管-20。C儲(chǔ)存，避免反復(fù)凍融。
滅菌H20lmLxl管-20'C儲(chǔ)存
本試劑盒有效期6個(gè)月。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
1. 操作簡單，抗污染性強(qiáng)，耗時(shí)短。本方法采用了先進(jìn)的病毒核酸提取技術(shù)，操作簡單， 有較好的抗污染性，提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度；同時(shí)，采用的高效PCR商品試劑，提高了檢 測靈敏度。
2. 特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、敏感性高。本試劑盒僅對豬2型圓環(huán)病毒的核酸有擴(kuò)增產(chǎn)物， 對豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和偽狂犬病病毒和健康動(dòng)物組織的核酸無擴(kuò)增產(chǎn)物； 對豬2型圓環(huán)病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株和豬2型圓環(huán)病毒陽性病料的檢測結(jié)果重復(fù)性100%;對經(jīng)106 倍稀釋的臨床陽性病料的核酸提取液有穩(wěn)定準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。


圖1、引物Primer Pl、 PrimerP2的序列
圖2、本試劑盒檢測陽性產(chǎn)物測序后序列與標(biāo)準(zhǔn)毒株序列比對結(jié)果 圖3、本試劑盒對部分樣品的檢測結(jié)果圖
具體操作方式
1. 樣品制備
1.1組織樣品剪取待檢實(shí)質(zhì)組織(去筋膜的淋巴結(jié)、脾、腎)0.5g置研磨器中剪碎并研磨，
加入lmlPBS (pH7.2)研磨，將研磨好的待檢組織液，轉(zhuǎn)移至1.5ml滅菌離心管中，6000rpm 離心lmin，取上清lOO;itL至一新的1.5ml滅菌離心管中，加入IOO]UL緩沖液GA，混勻，然
后進(jìn)行核酸提取。 .
1.2陽性對照取100/iL陽性對照和IOOmL緩沖液GA進(jìn)行核酸提取。
1.3陰性對照取IOO]UL滅菌水和100piL緩沖液GA進(jìn)行核酸提取。
2. 操作步驟
2.1在200/xL處理好的樣品中，加入20juL蛋白酶K溶液(20mg/mL)，混勻，在56'C水浴中 放置15 30min，至溶液澄清。
2.2加入220/iL緩沖液GB，充分顛倒混勻，70。C水浴放置10min， 10000rpm離心30s。
2.3加入220/xL無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，10000rpm離心30s。
2.4將所有溶液轉(zhuǎn)移至一個(gè)吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管內(nèi))，12000rpm離心30s，倒掉 廢液，吸附柱CB3放回收集管中。
2.5向吸附柱CB3中加入500]LiL去蛋白液GD， 12000rpm離心30s，倒掉廢液，吸附柱CB3
放回收集管中。
2.6向吸附柱CB3中加入700/iL漂洗液PW， 12000rpm離心30s，倒掉廢液，吸附柱CB3放
回收集管中。
2.7向吸附柱CB3中加入500/iL漂洗液PW， 12000rpm離心30s，倒掉廢液。 2.8將吸附柱CB3放回收集管中，12000 rpm離心2min。
2.9將吸附柱移入新的滅菌離心管內(nèi)，在膜中央懸空滴加50~200ML經(jīng)65 70'C水浴預(yù)熱的洗
脫緩沖液TE，室溫靜置5 10min， 12000rpm離心2min，獲得樣品總DNA。
2.10取10/tL樣品DNA，加入至PCR體系中，混勻，6000rpm離心30s。
2.11置于PCR儀中，進(jìn)行如下程序94。C預(yù)變性5min; 94°Clmin、 53°Clmin、 72。Clmin，
30個(gè)循環(huán)；最后72'C延伸8min。 4"C保存。
2.12取8/xLPCR產(chǎn)物，混合l/iL上樣緩沖液，1~1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，以 DNA分子量Marker為參考。
2.13在陰性對照無產(chǎn)物、陽性對照有明顯1154bp條帶的前提下，樣品出現(xiàn)1154bp大小條帶 定為PCV-2核酸陽性，否則判為陰性。
權(quán)利要求
1.一對豬2型圓環(huán)病毒特異性檢測引物Primer P1/P2，其序列為Primer P15’-CCGCGGGCTGGCTGAACTT-3’Primer P25’-ACCCCCGCCACCGCTACC-3’其中Primer P1/P2引物對在豬2型圓環(huán)病毒核酸中特異性擴(kuò)增出1154bp的產(chǎn)物。
2. 利用權(quán)利要求1所述引物組成的豬2型圓環(huán)病毒快速檢測試劑盒，其特征為采用DNA快速提取方法提取待檢組織樣品的DNA，按如下PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序， 用Primer Pl/P2引物對進(jìn)行豬2型圓環(huán)病毒的RT-PCR擴(kuò)增檢測。PCR體系PCR反應(yīng)體系為25/xL，包括10xPCRbuffer (含Mg2+) 2.5mL，濃度分別為 2.5匪ol/L的dNTPs 2/iL， 5U//iL TaqDNA聚合酶0.5/xL， 20/miol/L Primer Pl/P2各1/aL, DNA提取溶液10ML,用雙蒸水補(bǔ)足25/iL。PCR擴(kuò)增程序94。C預(yù)變性5min; 94°Clmin、 53。Clmin、 72。Clmin， 30個(gè)循環(huán)；最后 68'C延伸8min。 4'C保存。電泳檢測取8/iLPCR產(chǎn)物，混合l/iL上樣緩沖液，1 1.5y。的瓊脂糖凝膠電泳分析PCR 產(chǎn)物，以DNA分子量Marker為參考。結(jié)果判斷在陰性對照無條帶、陽性對照有明顯1154bp條帶的前提下，樣品出現(xiàn)1154bp 大小條帶定為豬2型圓環(huán)病毒核酸陽性，否則判為陰性。
全文摘要
本發(fā)明根據(jù)豬2型圓環(huán)病毒網(wǎng)上發(fā)表的序列，設(shè)計(jì)一對豬2型圓環(huán)病毒特異性擴(kuò)增引物，結(jié)合先進(jìn)的病毒核酸提取技術(shù)和高效PCR商品試劑，經(jīng)實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化組合而成的一種成熟的PCR快速檢測試劑盒。該試劑盒可對待檢組織進(jìn)行直接檢測，檢測過程簡單，抗污染性強(qiáng)。從病料處理到獲得結(jié)果只需4小時(shí)，結(jié)果準(zhǔn)確且靈敏度高、特異性好，是目前豬2型圓環(huán)病毒檢測非常好的一種替代方法。
文檔編號C12N15/11GK101343671SQ20081003214
公開日2009年1月14日 申請日期2008年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月25日
發(fā)明者何世成, 劉道新, 李曉成, 范仲鑫, 談志祥, 邱伯根, 邱立新, 杰 陳, 魯杏華 申請人:湖南省獸醫(yī)總站