專利名稱：變異鱗毛蕨的孢子繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蕨類植物的孢子繁殖方法，具體地說是涉及一種能快速繁殖變異鱗毛蕨 (D 70/7to7;y(L.) Ktunze)的孢子繁殖方法。
背景技術(shù)：
變異鱗毛蕨為中型草本植物，在我國熱帶及亞熱帶地區(qū)有廣泛分布，其林下土生，通常 高40 80cm，株形美觀，葉色暗綠，四季常青，不但可開發(fā)成為具有觀賞價值的觀葉植物， 而且其根莖有清熱止痛的藥效，可以入藥，因此這種蕨類植物具有良好的市場開發(fā)價值。但 是目前關(guān)于繁殖變異鱗毛蕨的研究極少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于開發(fā)出一種能快速繁殖變異鱗毛蕨的方法。
我們通過將消毒過的變異鱗毛蕨孢子在孢子萌發(fā)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)得到片狀原葉體，然 后將原葉體依次在增殖培養(yǎng)基、孢子體誘導(dǎo)培養(yǎng)基、孢子體繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，待長出
孢子葉后轉(zhuǎn)入孢子體生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待基部長出細(xì)根就可以出瓶移植，全過程只需半年 左右，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
本發(fā)明的變異鱗毛蕨的孢子繁殖方法，其特征包括以下的步驟
(1) 收集變異鱗毛蕨孢子，先在酒精中浸泡25 30s，然后再在升汞溶液中浸泡7 8min， 消毒后用無菌水漂洗；
(2) 將上述消毒過的變異鱗毛蕨孢子用無菌水配成懸浮液，加入孢子萌發(fā)培養(yǎng)基中，在 溫度23 25 °C，光照強(qiáng)度2000 2500 lx，光照時間11 13 h/d條件下培養(yǎng)，先萌發(fā)出綠色 絲狀體，再發(fā)育成片狀原葉體，所述的孢子萌發(fā)培養(yǎng)基是每升含6 8g瓊脂，18 22g蔗糖， 其余為MS或1/2MS， pH 5. 7 5. 8的培養(yǎng)基；
(3) 將上述片狀原葉體轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中，在溫度23 25"C，光照強(qiáng)度2000 2500 lx， 光照時間11 13h/d條件下，培養(yǎng)25 35d后，轉(zhuǎn)入孢子體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在溫度23 25T， 光照強(qiáng)度2000 2500 lx，光照時間11 13 h/d條件下，培養(yǎng)至原葉體出芽后轉(zhuǎn)入孢子體繼 代培養(yǎng)基，在溫度23 25X，光照強(qiáng)度2000 2500 lx，光照時間11 13 h/d條件下，培養(yǎng) 至形成幼孢子體，長出2 3片幼孢子葉；所述的增殖培養(yǎng)基每升中含有6-芐基嘌呤0. 15 0.25 mg，萘乙酸0. 15 0.25mg，瓊脂6 8g，蔗糖28 32g，其余為MS， pH 5.7 5.8;所 述的孢子體誘導(dǎo)培養(yǎng)基每升中含有激動素6-糠基氨基嘌呤或N6-呋喃甲基腺嘌呤0.4 0.6mg，萘乙酸O. 15 0. 25mg，瓊脂6 8g，蔗糖28 32g，其余為MS， pH 5.7 5.8;所述的孢子體繼代培養(yǎng)基每升中含有萘乙酸0.05 0. 15mg，瓊脂6 8g，蔗糖28 32g，其余為 MS， pH 5. 7 5. 8;
(4)將上述幼孢子體分株轉(zhuǎn)接到孢子體生根培養(yǎng)基上，在溫度23 25t，光照強(qiáng)度2000 2500 lx，光照時間11 13 h/d條件下，培養(yǎng)至幼孢子體基部長出褐色帶鱗片的細(xì)根時，可 出瓶移栽，煉苗后移栽至pH值為6.3 6.4的土壤基質(zhì)培養(yǎng)，所述的孢子體生根培養(yǎng)基每升 中含有萘乙酸0.25 0.35mg，活性碳4 6g，瓊脂6 8g，蔗糖28 32g，其余為1/2MS培養(yǎng) 基，pH 5. 7 5. 8。
歩驟(l)中采用的酒精和升汞是植物材料通用的消毒劑， 一般使用濃度酒精為體積分?jǐn)?shù) 75%，升滎為lg/L，最好消毒用無菌水漂洗5次。 歩驟(2)所述的光照的光源可以是日光燈。
步驟(3)所述的片狀原葉體在轉(zhuǎn)入孢子體誘導(dǎo)培養(yǎng)基后35 45d形成出芽的原葉體，所述 的原葉體在轉(zhuǎn)入孢子體繼代培養(yǎng)基15 25d形成幼孢子體，長出2 3片幼孢子葉，所述的增 殖培養(yǎng)基，孢子體誘導(dǎo)培養(yǎng)基和孢子體繼代培養(yǎng)基的光照的光源可以是日光燈。
步驟(4)所述的光照的光源可以是日光燈，所述的煉苗時間為3 4d，所述的土壤基質(zhì) 可以由花卉土，菜園泥和素沙按體積比2:1:1混合得到，也可以由塘泥、碎木、腐殖土和細(xì) 沙等混合得到。
歩驟(2)、 (3)中所述的MS為國際通用的培養(yǎng)基，其成分和配制方法參看文獻(xiàn)(譚文澄、 戴策剛主編.觀賞植物組織培養(yǎng)技術(shù).北京中國林業(yè)出版社1991.);步驟(2)、 (4)中所述 的1/2 MS是將MS中的大量元素濃度減半，而其他成分濃度不變而形成的培養(yǎng)基。
本發(fā)明投入少，設(shè)備簡單，并有效地縮短了變異鱗毛蕨孢子的繁殖周期，從孢子萌發(fā)到 幼孢子體形成僅需110d左右，獲得大量種苗，幼孢子苗成活率可達(dá)90%，使變異鱗毛蕨成為 優(yōu)良的觀葉植物并發(fā)揮其藥用價值。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一歩說明，但本發(fā)明不限于以下實(shí)施例。 實(shí)施例1:
剪取成熟的孢子葉，將孢子從葉緣小心的刮下，將收集的孢子(約O. lg)用濾紙包好， 在超凈工作臺上用lOmL體積分?jǐn)?shù)75%的酒精浸泡25s，再放入10mL lg/L的升汞溶液中消 毒7min，無菌水漂洗5次，洗凈升汞，最后放在無菌的培養(yǎng)皿中待用。
將MS培養(yǎng)基、6g瓊脂和18g蔗糖制成pH 5. 7 5. 8的MS孢子萌發(fā)培養(yǎng)基1L,并將制成 的培養(yǎng)基分裝到150mL或200mL培養(yǎng)瓶中，每瓶約加入培養(yǎng)基約15mL，室溫冷卻后待用。
將無菌孢子用3mL無菌水配成懸浮液，用無菌的移液管取0. 2mL滴加入準(zhǔn)備好的培養(yǎng)瓶 中，輕微搖動培養(yǎng)瓶，使孢子均勻分布在孢子萌發(fā)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)溫度為23 25'C，光照強(qiáng)度2000 2500 lx，光源為日光燈，光照時間11 13 h/d。在25 30d時孢子萌發(fā)培養(yǎng)基顯 綠，孢子大量萌發(fā)出綠色絲狀體。
將6-芐基嘌呤0. 15mg，萘乙酸0. 15mg，瓊脂6g，蔗糖28g和MS配制成pH 5. 7 5. 8 的增殖培養(yǎng)基1L;將激動素6-糠基氨基嘌呤0.4mg，萘乙酸O. 15mg，瓊脂6g，蔗糖28g和 MS配成pH5. 7 5.8孢子體誘導(dǎo)培養(yǎng)基1L;將萘乙酸0.05mg，瓊脂6g，蔗糖28g和MS配成 pH 5. 7 5. 8的孢子體繼代培養(yǎng)基1L。將制成的三種培養(yǎng)基分別加注到150mL或200mL培養(yǎng) 瓶中，每瓶約加入培養(yǎng)基約15mL，室溫冷卻后待用。
孢子萌發(fā)后,原葉體在孢子萌發(fā)培養(yǎng)基上均生長良好，約30d后發(fā)育成片狀結(jié)構(gòu)，將片 狀原葉體轉(zhuǎn)接到原葉體增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為23 25'C，光照強(qiáng)度2000 2500 lx，光 源為日光燈，光照時間11 13h/d。 30d后，原葉體增殖培養(yǎng)基中的原葉體增殖明顯，不僅加 寬伸長顯著，而且原葉體中間及頂端處明顯加厚，此時，將原葉體轉(zhuǎn)接入孢子體誘導(dǎo)培養(yǎng)基 中，培養(yǎng)溫度為23 25°C，光照強(qiáng)度2000 2500 lx，光源為日光燈，光照時間11 13 h/d， 原葉體頂端不斷加厚，約40d后，原液體頂端誘導(dǎo)出芽，l片原葉體頂端通常有3 4個芽。 將已出芽的原葉體轉(zhuǎn)入孢子體繼代培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為23 25°C，光照強(qiáng)度 2000 2500 lx,光源為日光燈，光照時間11 13h/d，原葉體不再增殖加厚，原葉體上的芽 不斷生長，約20d后，芽陸續(xù)長出幼孢子葉，大量幼孢子體形成。從孢子萌發(fā)到幼孢子體形 成僅需110d左右。
將萘乙酸0.25mg，活性碳4g，瓊脂6g，庶糖28g, 1/2MS培養(yǎng)基制成pH 5. 7 5. 8的孢 子體生根培養(yǎng)基1L，將制成的培養(yǎng)基分裝到150mL或200mL培養(yǎng)瓶中，每瓶約加入培養(yǎng)基約 15ml，室溫冷卻后待用。
待幼孢子體長出2 3片幼孢子葉時，將其分株轉(zhuǎn)接到孢子體生根培養(yǎng)基上，每瓶培養(yǎng) 基接種約10株幼孢子體，培養(yǎng)溫度為23 25'C，光照強(qiáng)度2000 2500 lx，光源為日光燈， 光照時間11 13 h/d。經(jīng)過30d的生長，幼孢子體葉片逐漸長大，幼孢子體基部開始長出纖 細(xì)的根，根多而密。待幼孢子體長出3 4片幼孢子葉，基部長出較多褐色帶鱗片的細(xì)根時， 可出瓶移栽。將培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)室內(nèi)移植溫室內(nèi)，置于自然光下敞瓶煉苗3d。移栽時，將幼孢 子體從瓶中取出，小心洗凈根部附著的培養(yǎng)基，移栽至高溫滅菌的混合土壤基質(zhì)(土壤基質(zhì) 由花卉土，菜園泥和素沙按體積比2:1:1混合得到)，移栽后，注意噴霧保濕。25 35d后， 幼孢子苗成活率達(dá)90%。
實(shí)施例2:
剪取成熟的孢子葉，將孢子從葉緣小心的刮下，將收集的孢子(約O. lg)用濾紙包好， 在超凈工作臺上用10mL體積分?jǐn)?shù)75。/。的酒精浸泡30s，再放入10mL lg/L的升汞溶液中消毒 8min，無菌水漂洗5次，洗凈升汞，最后放在無菌的培養(yǎng)皿中待用。將1/2MS和8g瓊脂和22g蔗糖制成pH 5. 7 5. 8的1/2MS孢子萌發(fā)培養(yǎng)基1L，將制成 的培養(yǎng)基分裝到150mL或200mL培養(yǎng)瓶中，每瓶約加入培養(yǎng)基15mL，室溫冷卻后待用。
將無菌孢子用3mL無菌水配成懸浮液，用無菌的移液管取0. 2mL滴加入準(zhǔn)備好的孢子萌 發(fā)培養(yǎng)瓶中，輕微搖動培養(yǎng)瓶，使孢子均勻分布在培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為23 25'C，光照強(qiáng) 度2000 2500 lx，光源為日光燈，光照時間11 13 h/d。在25 30d時孢子萌發(fā)培養(yǎng)基顯 綠，孢子大量萌發(fā)出綠色絲狀體。
將6-芐基嘌呤0. 25mg，萘乙酸0. 25mg,瓊脂8g，蔗糖32g和MS配成pH 5. 7 5. 8的 增殖培養(yǎng)基1L;將激動素N6-呋喃甲基腺嘌呤0.6mg，萘乙酸0.25mg，瓊脂8g，蔗糖32g和 MS配成pH5.7 5.8孢子體誘導(dǎo)培養(yǎng)基1L;將萘乙酸O. 15mg，瓊脂8g，蔗糖32g和MS配成 PH 5. 7 5. 8的孢子體繼代培養(yǎng)基1L。將制成的三種培養(yǎng)基分別分裝到150mL或200mL培養(yǎng) 瓶中，每瓶約加入培養(yǎng)基約15mL，室溫冷卻后待用。
孢子萌發(fā)后，原葉體在1/2MS孢子萌發(fā)培養(yǎng)基上均生長良好，約30d后發(fā)育成片狀結(jié)構(gòu)， 將片狀原葉體轉(zhuǎn)接到原葉體增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為23 25'C,光照強(qiáng)度2000 2500 lx， 光源為日光燈，光照時間11 13 h/d。約30d后原葉體增殖培養(yǎng)基中的原葉體增殖明顯，不 僅加寬伸長顯著，而且原葉體中間及頂端處明顯加厚，此時，將原葉體轉(zhuǎn)接入孢子體誘導(dǎo)培 養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為23 25°C ，光照強(qiáng)度2000 2500 lx，光源為日光燈，光照時間11 13h/d， 原葉體頂端不斷加厚，約40d后原液體頂端誘導(dǎo)出芽，l片原葉體頂端通常有3 4個芽。將 已出芽的原葉體轉(zhuǎn)入孢子體繼代培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為23 25'C，光照強(qiáng)度2000 2500 lx，光源為日光燈，光照時間11 13 h/d，原葉體不再增殖加厚，原葉體上的芽不斷 生長，約20d后芽陸續(xù)長出幼孢子葉，大量幼孢子體形成。從孢子萌發(fā)到幼孢子體形成僅需 110d左右。
將萘乙酸0.35mg，活性碳6g，瓊脂8g，蔗糖32g， 1/2MS培養(yǎng)基制成pH 5. 7 5. 8的孢 子體生根培養(yǎng)基1L，將制成的培養(yǎng)基加注到150mL或200mL培養(yǎng)瓶中，每瓶約加入培養(yǎng)基 15mL，室溫冷卻后待用。
待幼孢子體長出2 3片幼孢子葉時，將其分株轉(zhuǎn)接到孢子體生根培養(yǎng)基上，每瓶培養(yǎng) 基接種約10株幼孢子體，培養(yǎng)溫度為23 25'C，光照強(qiáng)度2000 2500 lx，光源為日光燈， 光照時間11 13h/d。經(jīng)過約30d的生長，幼孢子體葉片逐漸長大，幼孢子體基部開始長出 纖細(xì)的根，根多而密。待幼孢子體長出3 4片幼孢子葉，基部長出較多褐色帶鱗片的細(xì)根時， 可出瓶移栽。將培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)室內(nèi)移植溫室內(nèi)，置于自然光下敞瓶煉苗4d。移栽時，將幼孢 子體從瓶中取出，小心洗凈根部附著的培養(yǎng)基，移栽至高溫滅菌的混合土壤基質(zhì)，移栽后， 注意噴霧保濕。約25 35d后，幼孢子苗成活率達(dá)90%。
權(quán)利要求
1.一種變異鱗毛蕨的孢子繁殖方法，其特征包括以下的步驟(1)收集變異鱗毛蕨(Dryopteris varia(L.)Ktunze)孢子，先在酒精中浸泡25～30s，然后再在升汞溶液中浸泡7～8min，消毒后用無菌水漂洗；(2)將上述消毒過的變異鱗毛蕨孢子用無菌水配成懸浮液，加入孢子萌發(fā)培養(yǎng)基中，在溫度23～25℃，光照強(qiáng)度2000～2500lx，光照時間11～13h/d條件下培養(yǎng)，先萌發(fā)出綠色絲狀體，再發(fā)育成片狀原葉體，所述的孢子萌發(fā)培養(yǎng)基是每升含6～8g瓊脂，18～22g蔗糖，其余為MS或1/2MS，pH 5.7～5.8的培養(yǎng)基；(3)將上述片狀原葉體轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中，在溫度23～25℃，光照強(qiáng)度2000～2500lx，光照時間11～13h/d條件下，培養(yǎng)25～35d后，轉(zhuǎn)入孢子體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在溫度23～25℃，光照強(qiáng)度2000～2500lx，光照時間11～13h/d條件下，培養(yǎng)至原葉體出芽后轉(zhuǎn)入孢子體繼代培養(yǎng)基，在溫度23～25℃，光照強(qiáng)度2000～2500lx，光照時間11～13h/d條件下，培養(yǎng)至形成幼孢子體，長出2～3片幼孢子葉；所述的增殖培養(yǎng)基每升中含有6-芐基嘌呤0.15～0.25mg，萘乙酸0.15～0.25mg，瓊脂6～8g，蔗糖28～32g，其余為MS，pH 5.7～5.8；所述的孢子體誘導(dǎo)培養(yǎng)基每升中含有激動素6-糠基氨基嘌呤或N6-呋喃甲基腺嘌呤0.4～0.6mg，萘乙酸0.15～0.25mg，瓊脂6～8g，蔗糖28～32g，其余為MS，pH 5.7～5.8；所述的孢子體繼代培養(yǎng)基每升中含有萘乙酸0.05～0.15mg，瓊脂6～8g，蔗糖28～32g，其余為MS，pH 5.7～5.8；(4)將上述幼孢子體分株轉(zhuǎn)接到孢子體生根培養(yǎng)基上，在溫度23～25℃，光照強(qiáng)度2000～2500lx，光照時間11～13h/d條件下，培養(yǎng)至幼孢子體基部長出褐色帶鱗片的細(xì)根時，可出瓶移栽，煉苗后移栽至pH值為6.3～6.4的土壤基質(zhì)培養(yǎng)，所述的孢子體生根培養(yǎng)基每升中含有萘乙酸0.25～0.35mg，活性碳4～6g，瓊脂6～8g，蔗糖28～32g，其余為1/2MS培養(yǎng)基，pH 5.7～5.8。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種變異鱗毛蕨的孢子繁殖方法，其特征是步驟(l)中所述的 酒精為體積分?jǐn)?shù)75%，升汞為lg/L，消毒后用無菌水漂洗5次，步驟(4)所述的煉苗時間為3 4天，所述的土壤基質(zhì)是由花卉土，菜園泥和素沙按體積比2:1:1混合得到或由塘泥、碎木、 腐殖土和細(xì)沙混合得到。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種能快速繁殖變異鱗毛蕨(Dryopteris varia(L.)Ktunze)的孢子繁殖方法，其特征是將消毒過的變異鱗毛蕨孢子在孢子萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)至發(fā)育成片狀原葉體，然后將原葉體依次在增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)約30天，孢子體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)約40天，孢子體繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)約20天，待形成幼孢子體，長出2～3片幼孢子葉后轉(zhuǎn)入孢子體生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)約30天，待基部長出褐色帶鱗片的細(xì)根就出瓶移植，煉苗后移栽至土壤基質(zhì)培養(yǎng)。本發(fā)明投入少，設(shè)備簡單，從孢子萌發(fā)到幼孢子體形成僅需110d左右，短的時間內(nèi)獲得大量變異鱗毛蕨種苗，幼孢子苗成活率可達(dá)90％，使變異鱗毛蕨能成為優(yōu)良的觀葉植物并發(fā)揮其藥用價值。
文檔編號C12N5/04GK101297635SQ200810029109
公開日2008年11月5日 申請日期2008年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日
發(fā)明者唐源江, 歐陽嬋娟, 王瑞江, 董仕勇 申請人:中國科學(xué)院華南植物園