專利名稱：用于檢測(cè)和/或分選靶標(biāo)的方法和系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開內(nèi)容涉及在樣品如生物樣品中檢測(cè)一種或多種耙標(biāo)，尤其是生 物標(biāo)志物。更具體地，其涉及用于檢測(cè)和/或分選耙標(biāo)的方法和系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
靶標(biāo)(尤其是生物標(biāo)志物)的高靈敏度檢測(cè)是生物分子分析領(lǐng)域中的 一個(gè)挑戰(zhàn)，尤其是在企圖檢測(cè)多種耙標(biāo)時(shí)。無(wú)論是用于病理學(xué)檢查還U 礎(chǔ)生物學(xué)研究，都有若干方法"fi4用于檢測(cè)多種類別的生物材料和生物分 子。
在實(shí)驗(yàn)室中普遍用于檢測(cè)單個(gè)生物耙標(biāo)的一些技術(shù)包括凝膠電泳、聚 丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、 western印跡、熒光原位雜交(FISH)、熒光活 化細(xì)胞分選(FACS)、聚合Sl^式反應(yīng)(PCR)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)。 這些方法提供了在生物樣品如組織中檢測(cè)一種或多種生物標(biāo)志物的能力， 并且也適用于診斷目的。
然而，目前對(duì)組織的全局性基因組及蛋白質(zhì)組學(xué)分析正在影響我們?cè)诜肿铀缴蠈?duì)許多人類癌癥的理解。整合了基因表達(dá)和蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)二者 的研究尤其具有信息性。這類多參數(shù)數(shù)據(jù)集已開始揭示定義癌癥發(fā)生和發(fā)
展的混亂的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)(Lin, B.; White, J. T.; Lu, W.; Xie， T.; Utleg, A. G; Yan, X.; Yi， E. C; Shannon, P.; Khretbukova， I.; Lange, P. H.; Goodlett, D. R.; Zhou, D.; Vasicek, T. J.; Hood, L. 2005, 65, 3081-3091. Kwong，
K. Y.; Bloom, G C; Yang, I.; Boulware, D.; Coppola, D.; Haseman， J.; Chen, E.; McGrath， A.; Makusky, A. J.; Taylor, J.; Steiner， S.; Zhou， J.; Yeatman， T. J.; Quackenbush, / Ge"0附1cs 2005， 86， 142-158. Huber, M.; Bahr, L; Kratzchmar, J. R.; Becker, A.; Muller， E.-C; Donner, P.; Pohlenz, H.畫D.; Schneider, M. R.; Sommer， A. Molec. Cell. Proteomics 2004, 3， 43-55. Tian， Stepaniants, S. B.; Mao, M.; Weng， L.; Feetham， M. C; Doyle， M. J.; Yi, E. C; Dai, H.; Thorsson, V.; Eng, J.; Goodlett, D.; Berger, J. P.; Gunter， B.; Linseley, P. S.; Stoughton, R. B.; Aebersold, R.; Collins, S. J.; Hanlon， W. A.; Hood, L. E. Molec. Cell. Proteomics 2004， 3, 960-969. Chen, G; Gharib，. T. G; Huang, C-C; Taylor, J.M. G; Misek, D. E.; Kardia， S. L. R.; Giordano, T. J.; lannettoni, M. D.; Orringer， M. B.; Hanash， S. M.; Beer, D. G Molec. Cell. Proteomics 2002,1, 304-313)。對(duì)復(fù)雜疾病如癌癥的這種新情 況以及有前途的新癌癥藥物的出現(xiàn)(Prados, M.; Chang, S.; Burton， E.; Kapadia， A.; Rabbitt， J.; Page, M.; Federoff， A.; Kelly, S.; Fyfe, G Proc. Am. Soc. Clin. Oncology 2003， 22， 99. Rich, J. N.; Reardon, D. A.; Peery, T.; Dowell， J. M.; Quinn， J. A.; Penne, K. L.; Wikstrand， C J.; van Duyn, L. B.; Dancey, J. E.; McLendon, R. E.; Kao， J. C; Stenzel， T. T.; Rasheed, B. K. A.; Tourt-Uhlig， S. E.; Herndon， J. E.; Vredenburgh， J. J.; Sampson, J. H.; Friedman, A. H.; Bigner, D. D.; Friedman, H. S. J. Clin. Oncology 2004, 22， 133-142.)對(duì)臨床病理學(xué)提出了新的要求(Mellinghoff, I. K.; Wang， M. Y.; Vi窗co, I.; Haas國(guó)Kogan, D. A.; Zhu, S.; Dia, E. Q.; Lu, K. V" Yoshimoto, K，； Huang, J, H. Y" Chute, D. J.; Riggs， B. L.; Horvath， S.; Liau.， L M.; Cavenee, W. K.; Rao， P. N.; Beroukhim, R.; Peck, T. C; Lee, J. C; Sellers, W. R.; Stokoe， D.; Prados, M.; Cloughesy, T. F; Sawyers, C. L.; Mischel， P. S. N. Engl. J. Med. 2006,353， 2012-2024)。例如，傳統(tǒng)的病理學(xué)實(shí)踐(即組 織的顯^t鏡分析)不能區(qū)分對(duì)新的癌癥分子療法的潛在應(yīng)答者和非應(yīng)答者 (Betensky， R. A.; Louis, D. N.; Cairncross， J. G J. Clin. Oncology 2002， 20, 2495-2499)。最近有這樣的實(shí)例，其中少量參數(shù)(pauciparameter)分子測(cè)量
法被用于鑒定對(duì)至少兩種療法的潛在應(yīng)答者(Hughes, T.; Branford, S.,2003. Semin Hematol. 2 Suppl 2, 62-68. Lamb, J.; Crawford, E. D.; Peek, D.; Modell， J. W.; Blat， I. C; Wrobel， M. J.; Lerner， J.; Brunet， J. P.; Subramanian， A.; Ross, K. N.; Reich, M.; Hieronymus, H.; Wei， G; Armstrong, S. A.; Haggarty, S. J.; Clemons， P. A.; Wei， R.; Carr, S. A.; Lander, E. S.; Golub， T. R., Science 2006, 313, (5795)， 1929-1935. Martin, M.， CHn. Transl Oncol. 8, (1 )， 7-14. Radich, J. P.; Dai, H.; Mao, M.; Oehler, V.; Schelter， J.; Druker， B.; Sawyers, C. L.; Shah, N.; Stock, W.; Willman, C. L.; Friend, S.; Linsley, P. S.,TVarf.Sc/. 2006， 103, (8)， 2794-2799)。然而，單^lt測(cè)量法不太可能成為脊逸情況。取而代之， 分子診斷學(xué)與分子療法的聯(lián)合最^需要測(cè)量多參數(shù)(例如細(xì)胞、mRNA 和蛋白質(zhì))生物標(biāo)志物組合，其可用于指導(dǎo)患者進(jìn)行適當(dāng)?shù)寞煼ɑ蚪M合療 法。
目前，測(cè)量來(lái)自患病組織的多參數(shù)生物標(biāo)志物組合需要組合顯微鏡分 析、微陣列數(shù)據(jù)(Mischel， P. S.; Cloughesy, T. F.; "Nelson, S. F. Nature Rev. Neuroscience 2004， 5， 782- 794)、免疫組織化學(xué)染色、Western印跡 (Mellinghoff， I. K.; Wang, M. Y" Vivanco, I.; Haas曙Kogan, D. A.; Zhu, S.; Dia, E. Q.; Lu， K. V.; Yoshimoto， K.; Huang, J. H. Y; Chute, D. J.; Riggs, B. L.; Horvath, S.; Liau., L. M.; Cavenee， W. K.; Rao, P. N.; Beroukhim, R.; Peck， T. C; Lee, J. C.; Sellers, W. R.; Stokoe， D.; Prados, M.; Cloughesy, T. F.; Sawyers, C. L.; Mischel， P. S. N. Engl. J. Med. 2006， 353, 2012- 2024)和 其他方法。將收集的數(shù)據(jù)整合進(jìn)一些疾病模型中以產(chǎn)生診斷，所i^型例 如癌癥途4圣模型(Weinberg, R. A.， Cancer Biology. Garland Science: 2006)。 目前，進(jìn)行這些多種測(cè)量法需要外科手術(shù)切除的組織樣品。這類活檢樣品 的異質(zhì)性可導(dǎo)致顯著的取樣誤差，因?yàn)榧?xì)胞、mRNA和蛋白質(zhì)的多種測(cè)量 各自在組織的不同區(qū)域進(jìn)行。
發(fā)明概述
本文提供了基于將以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)與襯底多核苷酸組合使用 的方法和系統(tǒng)。本文公開的以多核普酸編碼的蛋白質(zhì)由特異性結(jié)合乾標(biāo)的 蛋白質(zhì)和附著于該蛋白質(zhì)的編碼多核香酸組成。所述編碼多核普酸由特異 性結(jié)合襯底多核苷酸的序列組成。本文公開的襯底多核普酸附著于襯底， 并由特異性結(jié)合所述編碼多核普酸的序列組成。根據(jù)本文公開的方法和系統(tǒng)可以進(jìn)行多種測(cè)定，包括但不限于用于檢 測(cè)和/或分離靶標(biāo)的測(cè)定，所述耙標(biāo)尤其是生物標(biāo)志物，例如細(xì)胞、蛋白質(zhì) 和/或多核苷酸。具體地，在使用本文公開的方法和系統(tǒng)的測(cè)定中，使用以
結(jié)合乾標(biāo)，并使用襯底多核苷酸將所述以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)-靶標(biāo)復(fù)合 體與襯底結(jié)合用于檢測(cè)。如技術(shù)人員閱讀^^開內(nèi)容后顯而易見的，本文 公開的方法和系統(tǒng)允許產(chǎn)生若干測(cè)定的有利性能，尤其是在微流體
(microfluidic)環(huán)境中。
根據(jù)第一個(gè)方面，z〉開了檢測(cè)樣品中乾標(biāo)的方法和系統(tǒng)，該方法和系 統(tǒng)基于組合使用附著于襯底的襯底多核普酸與以多核普酸編碼的蛋白質(zhì)， 所述以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)由蛋白質(zhì)和編碼多核苷酸組成，所述蛋白質(zhì) 特異性結(jié)合把標(biāo)，所述編碼多核苷酸特異性結(jié)合附著于襯底的襯底多核苷 酸。
在該方法中，將以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)與樣品及襯底多核苷酸在 一定條件下接觸一定時(shí)間，以允許該以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)在以多核 苷酸編碼的蛋白質(zhì)-靶標(biāo)復(fù)合體中與靶標(biāo)結(jié)合，并且允許編碼多核苷酸 與襯底多核苷酸結(jié)合，從而提供與襯底多核香酸結(jié)合的多核普酸編碼蛋 白質(zhì)-靶標(biāo)復(fù)合體。在該方法中，隨后通過(guò)技術(shù)人員閱讀本公開內(nèi)容后 可識(shí)別的檢測(cè)技術(shù)來(lái)檢測(cè)與襯底多核香酸結(jié)合的多核香酸編碼蛋白質(zhì)-靶標(biāo)復(fù)合體。
在該系統(tǒng)中，將襯底與多核苷酸編碼蛋白質(zhì)一起提供，所述襯底帶 有附著于該襯底的襯底多核苷酸，所述多核苷酸編碼蛋白質(zhì)包含特異性 結(jié)合靶標(biāo)的蛋白質(zhì)和特異性結(jié)合襯底多核苷酸的編碼多核普酸。
根據(jù)第二個(gè)方面，公開了用于檢測(cè)樣品中多種靼標(biāo)的方法和系統(tǒng)，該 方法和系統(tǒng)基于組合使用附著于襯底的多種襯底多核苷酸以及多種以多 核苷酸編碼的抗體。
在該方法和系統(tǒng)中，各種襯底多核普^A序列特異性的，并且在位置 上可彼此區(qū)分。在該方法和系統(tǒng)中，每種多核苷酸編碼蛋白質(zhì)由蛋白質(zhì)和 附著于該蛋白質(zhì)的編碼多核苷酸組成，其中所述蛋白質(zhì)與多個(gè)靶標(biāo)的預(yù)定 靶標(biāo)特異性結(jié)合，且所述編碼多核苷酸與所述多種襯底多核苷酸中序列特 異性且位置可區(qū)分的襯底多核苷酸特異性結(jié)合。另外，在該方法和系統(tǒng)中，各種蛋白質(zhì)和編碼多核普酸在結(jié)合方面可彼此區(qū)分。
在該方法中，將多種多核苷酸編碼抗體與樣品和多種襯底多核普酸在 一定條件下接觸一定時(shí)間，以允許抗體與靶標(biāo)在多種多核苷酸編碼蛋白質(zhì) -靶標(biāo)復(fù)合體中結(jié)合，并允許編碼多核苷酸與襯底多核苷酸結(jié)合。在該方法 中，隨后通過(guò)技術(shù)人員閱讀本公開內(nèi)容后可識(shí)別的檢測(cè)技術(shù)來(lái)檢測(cè)與襯底 上多種襯底多核苷酸結(jié)合的多種多核苷酸編碼蛋白質(zhì)-靶標(biāo)復(fù)合體。
在該系統(tǒng)中，包括了襯底和多種多核苷酸編碼抗體，所述襯底帶有附 著于該襯底的多種襯底多核苷酸。
根據(jù)第三個(gè)方面，公開了用于檢測(cè)樣品中多種靶標(biāo)的方法和系統(tǒng)，其 中所述耙標(biāo)包含至少一種靶多核苷酸。該方法和系統(tǒng)基于組合使用附著于 襯底的多種襯底多核苷酸、至少一種多核苷酸編碼蛋白質(zhì)和至少一種經(jīng)標(biāo) 記多核苷酸。
在該方法和系統(tǒng)中，各個(gè)村底多核苷^A序列特異性的，并且在位置 上可彼此區(qū)分。在該方法和系統(tǒng)中，所述至少一種經(jīng)標(biāo)記多核普酸與至少 一種靶多核苷酸特異性結(jié)合，各種經(jīng)標(biāo)記多核苷酸在結(jié)合方面可彼此區(qū) 分。在該方法和系統(tǒng)中，所述至少一種多核苷酸編碼蛋白質(zhì)由蛋白質(zhì)和編 碼多核苷酸組成，所述蛋白質(zhì)特異性結(jié)合所述多種靶標(biāo)中的預(yù)定靶標(biāo)，所 述編碼多核苷酸與所述多種襯底多核苷酸中序列特異性且位置可區(qū)分的 襯底多核苷酸特異性結(jié)合。在該方法和系統(tǒng)中，各蛋白質(zhì)和編碼多核苷 酸在結(jié)合方面可彼此區(qū)分，各蛋白質(zhì)還與各種經(jīng)標(biāo)記多核香酸在結(jié)合方 面可彼此區(qū)分，且各多核普酸編碼蛋白質(zhì)與各種經(jīng)標(biāo)記靶多核苷酸在結(jié) 合方面可彼此區(qū)分。
在該方法中，將所述至少一種經(jīng)標(biāo)記多核苷酸與樣品在一定條件下接 觸一定時(shí)間，以允許經(jīng)標(biāo)記多核苦酸與耙多核香酸結(jié)合，從而拔 映至少一 種經(jīng)標(biāo)記靶多核苷酸，其中所述至少一種經(jīng)標(biāo)記靶多核苷酸由這樣的序列 組成，所述序列與序列特異性且位置可區(qū)分的襯底多核普酸特異性結(jié)合。 此外，在該方法中，將所述至少一種多核普酸編碼蛋白質(zhì)與樣品在一定條 件下接觸一定時(shí)間，以允許該蛋白質(zhì)與靶標(biāo)在至少一種多核普酸編碼蛋白 質(zhì)-靶標(biāo)復(fù)合體中結(jié)合。另外，在該方法中，將所述至少一種經(jīng)標(biāo)記的靶多 核苷酸和所述至少一種多核苷酸編碼蛋白質(zhì)-靶標(biāo)復(fù)合體與多種襯底多核 苷酸在一定條件下接觸一定時(shí)間，以允許所述至少一種經(jīng)標(biāo)記的靶多核苷酸與相應(yīng)的襯底多核苷酸結(jié)合，并允許所述至少一種編碼多核苷酸與相應(yīng)
的襯底多核苷酸結(jié)合。在該方法中，NL^通過(guò)使用技術(shù)人員在閱讀4^Hf 內(nèi)容后可識(shí)別的檢測(cè)技術(shù)來(lái)檢測(cè)與襯底上空間定位的多種村底多核苷酸 結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記乾多核苷酸和多核普酸編碼蛋白質(zhì)-乾標(biāo)復(fù)合體。
在該系統(tǒng)中，包括了襯底以及至少一種經(jīng)標(biāo)記多核苷酸和至少一種多 核苷酸編碼蛋白質(zhì)，所述襯底帶有附著于該襯底的多種襯底多核苷酸。在 該系統(tǒng)中，該系統(tǒng)的至少一種經(jīng)標(biāo)記多核苷^A用于生產(chǎn)標(biāo)記的靶多核苷 酸，所述經(jīng)標(biāo)記的靶多核苷酸與序列特異性且位置可區(qū)分的襯底多核苷酸 特異性結(jié)合。
根據(jù)第四個(gè)方面，公開了用于分選多種靶標(biāo)中的靶標(biāo)的方法和系統(tǒng)， 該方法和系統(tǒng)基于組合使用附著于襯底的多種襯底多核苷酸以及多種多 核苷酸編碼抗體。在一些實(shí)施方案中，靼標(biāo)是細(xì)胞，該方法和系統(tǒng)用于分 選多種細(xì)胞。
在該方法和系統(tǒng)中，各襯底多核香^A序列特異性的且在位置上可彼 此區(qū)分。在該方法和系統(tǒng)中，各多核苷酸編碼蛋白質(zhì)由蛋白質(zhì)和附著于該 蛋白質(zhì)的編碼多核苷酸組成，其中所述蛋白質(zhì)與所述多種靶標(biāo)中的預(yù)定靶 標(biāo)特異性結(jié)合，且所述編碼多核苷酸與所述多種襯底多核苷酸中序列特異 性且位置可區(qū)分的襯底多核苷酸特異性結(jié)合。在該方法和系統(tǒng)中，各蛋白 質(zhì)和編碼多核苷酸在結(jié)合方面可彼此區(qū)分。
在該方法中，將多種多核苷酸編碼抗體與樣品在一定條件下接觸一定 時(shí)間，以允許抗體與靶標(biāo)結(jié)合，從而提供多種多核香酸編碼蛋白質(zhì)-耙標(biāo) 復(fù)合體。在該方法中，然后將多種多核苷酸編碼蛋白質(zhì)-靶標(biāo)復(fù)合體與 多種襯底多核苷酸在一定條件下接觸一定時(shí)間，以允許該編碼多核苷酸 與附著于襯底的襯底多核苷酸結(jié)合，從而在與襯底結(jié)合的多種多核苷酸 編碼蛋白質(zhì)-靶標(biāo)復(fù)合體中分選耙標(biāo)。
在該系統(tǒng)中，包括了襯底和多種多核普酸編碼抗體，所述襯底帶有附 著于該襯底的多種襯底多核苷酸。
根據(jù)第五個(gè)方面，公開了用于檢測(cè)樣品流體中一種或多種粑標(biāo)的陣列， 該陣列包含襯底，所述襯底帶有附著于所述襯底組件的多種襯底多核苷 酸，該襯底多核苷酸序列是特異性的并在位置上可區(qū)分，其中各襯底多核
14苷酸由與另一襯底多核苷酸序列互不影響(orthogonal)的序列組成。
根據(jù)第六個(gè)方面，本文公開的各方法、系統(tǒng)和陣列中的襯底與微流體 組件有效關(guān)聯(lián)，所述微流體組件包含用于裝載流體的微流體構(gòu)件。因此在 該方法中，至少編碼多核苷酸和/或經(jīng)標(biāo)記多核苷酸乾標(biāo)與襯底多核苷酸的 接觸可在微流體構(gòu)件裝載的流體中進(jìn)行。另外，本文公開的各系統(tǒng)還可包 含具有微流體構(gòu)件的微流體組件。
本文公開的方法和系統(tǒng)的第一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，在本文>^開的各方法和系統(tǒng) 中，多核普酸編碼蛋白質(zhì)與靶標(biāo)的接觸可在該蛋白質(zhì)與襯底結(jié)合之前進(jìn) 行。因此，在使用諸如細(xì)胞的靶標(biāo)時(shí)，襯底不會(huì)損害靶標(biāo)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)合位 點(diǎn)的接近，且在進(jìn)行接觸時(shí)蛋白質(zhì)和靶分子均會(huì)具有完全的取向自由，從 而提高了用所公開方法和系統(tǒng)進(jìn)行的任何相關(guān)測(cè)定的靈敏度。
本文公開的方法和系統(tǒng)的第二個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，在本文公開的各方法和系統(tǒng) 中，多核苷酸編碼蛋白質(zhì)可在溶液中裝配，從而使現(xiàn)有技術(shù)方法相關(guān)的蛋 白質(zhì)變性作用最小化，所述現(xiàn)有技術(shù)方法包括在結(jié)合后干燥襯底和提高溫 度(例如接近100"C )。在一些這類現(xiàn)有技術(shù)方法中，通過(guò)使用細(xì)針(fine pin) 在玻璃襯底上點(diǎn)樣(spotting)來(lái)產(chǎn)生蛋白質(zhì)陣列，從而制造步驟需要密切監(jiān) 測(cè)，以確保蛋白質(zhì)不干燥過(guò)度并因而變性。相反，在本文公開的方法和系 統(tǒng)中，可在溶液中將蛋白質(zhì)裝配在襯底上，從而將蛋白質(zhì)干燥過(guò)度和變性 最小化至零。
本文公開的方法和系統(tǒng)的第三個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，在本文公開的各方法和系統(tǒng) 中，生物污著(biofouling，即非編碼蛋白質(zhì)與襯底的非特異性結(jié)合)與本 領(lǐng)J^于蛋白質(zhì)的方法和系統(tǒng)相比大幅降低，從而允許更有效的結(jié)合，并 且允許在期望進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，與本領(lǐng)咸基于抗體的方法和系統(tǒng)相比更精確地 定量檢測(cè)樣品中的乾分子。
本文公開的方法和系統(tǒng)的第四個(gè)優(yōu)點(diǎn)是與本領(lǐng)域基于蛋白質(zhì)的方法和 系統(tǒng)相比，能夠進(jìn)行更高靶標(biāo)數(shù)的多路(multiplexed)檢測(cè)和/或分離。這歸 因于若干個(gè)因素。第一個(gè)因素是與組合使用多核苷酸編碼蛋白質(zhì)和附著于 襯底的襯底多核苷酸相關(guān)的生物污著降低允許更有效地使多核苷酸編碼 蛋白質(zhì)-靶標(biāo)復(fù)合體與襯底結(jié)合并進(jìn)行檢測(cè)。第二個(gè)因素是在本文公開的方 法和系統(tǒng)中，襯底多核苷酸的尺寸與本領(lǐng)g于蛋白質(zhì)的方法和系統(tǒng)中使 用的相應(yīng)錨定分子相比小得多。因此，與現(xiàn)有技^M目比，可在襯底上裝配更高密度的蛋白質(zhì)(例如每平方英寸約5,000個(gè)點(diǎn)，相比于例如ELISA技 術(shù)的96孔板)。
本文公開的方法和系統(tǒng)的第五個(gè)優(yōu)點(diǎn)是在本文公開的各方法和系統(tǒng) 中，有可能在單個(gè)襯底中檢測(cè)并分離化學(xué)性質(zhì)不同的靶標(biāo)，包括生物標(biāo)志 物如多核普酸、蛋白質(zhì)和具有不同表面標(biāo)志物的細(xì)胞。因此，本文爿〉開的 方法和系統(tǒng)允許在相同的環(huán)境中對(duì)基因、蛋白質(zhì)和細(xì)胞進(jìn)行多路檢測(cè)和/ 或分離。
本文公開的靶標(biāo)分選方法和系統(tǒng)的又一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，本文公開的方法和 系統(tǒng)使得分選后的細(xì)胞可立刻用于分選后分析(post-sorting analysis),這在 靶標(biāo)是能夠用于分選后分析細(xì)胞中基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的細(xì)胞的實(shí)施方案 中是尤其有關(guān)的。
用于進(jìn)旨斷測(cè)定時(shí)本文公開的方法和系統(tǒng)的一種額外的優(yōu)點(diǎn)是，可 在單一襯底上對(duì)來(lái)自相同組織區(qū)域的多種生物標(biāo)志物進(jìn)行多i^檢測(cè)。用于 進(jìn)旨斷測(cè)定時(shí)該方法和系統(tǒng)的又一種優(yōu)點(diǎn)是，所述生物標(biāo)志物可以是化 學(xué)性質(zhì)不同的生物標(biāo)志物，如細(xì)胞、mRNA和蛋白質(zhì)，并且檢測(cè)可以是定 量檢測(cè)和/或定性檢測(cè)。用于進(jìn)旨斷測(cè)定時(shí)本文>^開的方法和系統(tǒng)的再一 種優(yōu)點(diǎn)是，它們?cè)试S檢測(cè)復(fù)雜的基因組和/或蛋白質(zhì)組鐠，該鐠在與預(yù)定鐠 比^提供對(duì)以調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)混亂為特征的疾病(如癌癥)的診斷指示。用于 進(jìn)旨斷測(cè)定時(shí)本文公開的方法和系統(tǒng)的另一種優(yōu)點(diǎn)是，有可能以多參數(shù) 模式分析少量生物樣品，并且能夠?qū)⑸镄畔⒌娜齻€(gè)相關(guān)領(lǐng)域，即基因(由 DNA代表)、蛋白質(zhì)和細(xì)胞聯(lián)系在一起。
當(dāng)襯底與微流體組件有效關(guān)聯(lián)時(shí)，本文公開的所有方法和系統(tǒng)的又一 種顯著優(yōu)點(diǎn)是，與相應(yīng)的現(xiàn)有方法和系統(tǒng)相比，允許用尺寸顯著減小的樣 品，在減少的時(shí)間內(nèi)以減少的步驟數(shù)進(jìn)行多路多^測(cè)定。特別地，鑒于 進(jìn)行分析所需樣品量的減少使得處死小鼠的需要最小化，本文公開的多路 多參數(shù)微流體方法和系統(tǒng)在靶標(biāo)是來(lái)自組織的生物標(biāo)志物時(shí)是尤其有利 的。由此，在本文公開的微流體環(huán)境中進(jìn)行的方法和系統(tǒng)允許檢測(cè)少量包 含在樣品中的靶標(biāo)，從而允許檢測(cè)以低至約10飛摩爾/升(femtoMolar，fM) 的濃度存在于樣品中的分子。
當(dāng)用于進(jìn)行診斷測(cè)定時(shí)襯底與微流體組件有效關(guān)聯(lián)時(shí)，本文公開的方 法和系統(tǒng)的再一種優(yōu)點(diǎn)是，允許進(jìn)行生物標(biāo)志物的多路檢測(cè)，包括化學(xué)性質(zhì)不同的生物標(biāo)志物如多核苷酸、蛋白質(zhì)和細(xì)胞。在其中襯底與微流體組 件有效關(guān)聯(lián)的實(shí)施方案中，本文7>開的診斷方法和系統(tǒng)的又一種額外優(yōu)點(diǎn) 是，允許在來(lái)自異質(zhì)組織中相同微觀區(qū)域的單一樣品上進(jìn)行多路多參數(shù)測(cè) 定。因此，本，公開的 法和系統(tǒng)還使與異質(zhì)活檢，關(guān)聯(lián)的取樣誤差最小
物的診斷方法和系統(tǒng)的多種測(cè)量所需的。
本公開內(nèi)容的一種或多種實(shí)施方案的細(xì)節(jié)在附圖和下文的描述中公 開。其他特征、目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)從說(shuō)明書和附圖以及權(quán)利要求書中將是4艮明顯 的。
附圖簡(jiǎn)述


了本公開內(nèi)容的一種或多種實(shí)施方案，并與發(fā)明詳述一起解
釋;$^>開內(nèi)容的原理和實(shí)施，所述附圖引入本文并構(gòu)成說(shuō)明書的一部分。 在附圖中
圖l是用于制備本文公開的多核苷酸編碼蛋白質(zhì)的偶聯(lián)策略的圖解。 圖a是制備抗體的反應(yīng)的圖解；圖b是制備多核普酸的Jl^的圖解；圖c 展示了通過(guò)綴合圖a所示抗體與圖b所示多核苷酸而獲得的多核苷酸編碼 抗體；圖d顯示^Ji移率變動(dòng)測(cè)定(gd mobility shift assay),其顯示可通 過(guò)調(diào)節(jié)與圖a中所示抗體偶聯(lián)的分子的量來(lái)控制附著于抗體的多核普酸鏈
Al，的數(shù)目。此處泳道I-IV分別對(duì)應(yīng)于300:1、 100:1、 50:1、 25:1的偶聯(lián) 分子與抗體的化學(xué)計(jì)量比。
圖2是本文公開的多核普酸編碼蛋白質(zhì)的綴合化學(xué)的圖解。圖a顯示 多核苷酸和蛋白質(zhì)鏈霉親和素之間的綴合化學(xué)的圖解；圖b顯示多核苷酸 編碼的鏈霉親和素與含生物素的蛋白質(zhì)的裝配，生物素為鏈霉親和素的配 體；SA表示鏈霉親和素蛋白，"生物素-蛋白質(zhì)"表示含配體生物素的蛋白 質(zhì)。
圖3顯示了展示本文公開的用于細(xì)胞表面標(biāo)志物識(shí)別的優(yōu)化多核普酸 編碼抗體的多核苷酸載荷的簡(jiǎn)圖。圖a顯示FACS曲線，其將 a曙CD卯.2/FITC-多核苷酸綴合物(FITC-DNA-標(biāo)記的a-CD90.2 )與抗體 上不附著有多核普酸的FITC a-CD卯.2抗體(FITC a-CD90.2 )和無(wú)抗體并 且無(wú)多核苷酸編碼抗體(未標(biāo)記的)的陰性對(duì)照一起進(jìn)行比較。對(duì)應(yīng)于FITC通道的熒光強(qiáng)度在x軸上給出，y軸對(duì)應(yīng)于空熒光通道；圖b顯示附 著于抗體的不同數(shù)目FITC-多核苷酸平均熒光強(qiáng)度的直方圖；x軸上報(bào)告 了附著于抗體的多核苷酸數(shù)，y軸上才艮告了平均熒光強(qiáng)度。
圖4是組合使用本文公開的多核苷酸編碼抗體和襯底多核普酸的圖解。
圖5展示了方法和系統(tǒng)的實(shí)施方案，其中多核苷酸編碼蛋白質(zhì)是基于 鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)，且耙標(biāo)是細(xì)胞。圖a顯示圖2中多核苷酸編碼的 鏈霉親和素的裝配，其中含生物素的蛋白質(zhì)是主要組織相容性復(fù)合體 (MHC),且在目的細(xì)胞與玻璃襯底接觸前將多核苷酸編碼的鏈霉親和素預(yù) 裝配在襯底上。圖b顯示以多核香酸編碼的MHC與細(xì)胞在溶液中結(jié)合后 與微陣列接觸。
圖6展示了使用本文公開的多核苷酸編碼抗體和襯底多核普酸**測(cè) 多種靶標(biāo)的方法。圖a顯示組合4吏用本文^S開的多種多核香酸編碼抗體與 襯底多核苷酸組合的圖解；圖b顯示使用本文公開的多核普酸編碼抗體和 襯底多核苷酸進(jìn)行的相關(guān)免疫測(cè)定。
圖7顯示使用本文公開的多核苷酸編碼抗體和襯底多核苷酸進(jìn)行的空 間編碼蛋白質(zhì)測(cè)定。圖a顯示用三種相同的山羊抗人IgG (用Alexa488、 Alexa594或Alexa 647染料標(biāo)記)進(jìn)行并分別用多核苷酸Al，、 Bl'和Cl' 標(biāo)記的免疫測(cè)定；圖6顯示了來(lái)自于用白色線段指示的圖a陣列部分的免 疫測(cè)定結(jié)果的圖示；圖中顯示的標(biāo)度線段對(duì)應(yīng)于lmm。
圖8顯示免疫測(cè)定的結(jié)果，其顯示組合使用本文公開的多核苷酸編碼 抗體和襯底多核苷酸所導(dǎo)致的非特異性蛋白質(zhì)吸收最小化。圖a顯示同時(shí) 與山羊抗人IgG-Alexa488/A1，、山羊抗人IgG-Alexa647/Cl'(各自與特異 性多核苷酸綴合)和山羊抗人IgG-Alexa594 (無(wú)附帶的DNA)接觸的微 陣列；圖b顯示來(lái)自于用白色線段指示的圖a陣列部分的免疫測(cè)定結(jié)果的 圖示，圖中顯示的標(biāo)度線^t應(yīng)于lmm。
圖9闡述了襯底多核普酸的計(jì)算機(jī)(/" )無(wú)關(guān)化處理
(orthogonalization )的結(jié)果，其中每種襯底多核苷酸都與其他襯底多核 苷酸互不影響，并與其相應(yīng)的抗體特異性多核苷酸結(jié)合。圖a顯示暴露于 兩種多核苷酸編碼抗體的印有三種襯底多核苷酸的載玻片，所述兩種多核苷酸編碼抗體與三種襯底多核苷酸中的兩種互補(bǔ)；圖b顯示由Al的計(jì)算 機(jī)雜交以及與抗體特異性多核苷酸互補(bǔ)的兩種襯底多核苷酸的計(jì)算機(jī)雜 交所形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)；圖c顯示計(jì)算機(jī)產(chǎn)生其他襯底多核苷酸，其限制是 各鏈彼此互不影響，并且與其相應(yīng)互補(bǔ)序列互不影響；圖d顯示一組6條 互不影響的序列，從5'到3'端列出。
圖10展示了使用本文公開的多核普酸編碼抗體和襯底多核苷酸進(jìn)行 多路細(xì)胞分選的方法。圖a顯示均質(zhì)測(cè)定，其中多核苷酸編碼抗體與細(xì)胞 組合，然后將混合物引入已點(diǎn)樣的DNA陣列微芯片上；圖b顯示多核苷 酸編碼抗體被裝配在已點(diǎn)樣的DNA陣列上，然后引入細(xì)胞；圖c顯示多 路細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)的亮視野和熒光顯微鏡圖像，其中將表達(dá)mRFP的T細(xì) 胞(紅色通道)和表達(dá)EGFP的B細(xì)胞(綠色通道)的1 :1混合物空間層 積在點(diǎn)Al和Cl上，對(duì)應(yīng)于分別用Al'和Cl'編碼的a-CD90.2和a-B220 抗體；圖d是從小鼠收集的原代細(xì)胞多路分選的熒光顯微照片。分別利用 多核苷酸編碼的綴合物抗CD4-A1'和抗CD8-C1'，將來(lái)自EGFP轉(zhuǎn)基因小 鼠的CD4+細(xì)胞和來(lái)自dsRed轉(zhuǎn)基因小鼠的CD8+細(xì)胞的1:1混合物分離至 點(diǎn)A1和C1。
圖11是組合使用本文公開的多核香酸編碼抗體和襯底多核苷酸的圖 解，其用于細(xì)胞分選和/或共同檢測(cè)化學(xué)性質(zhì)不同的分子。
圖12展示了根據(jù)本文公開的方法和系統(tǒng)的實(shí)施方案，多核苷酸編碼蛋 白質(zhì)檢測(cè)多種靶標(biāo)的能力；圖a顯示暴露于抗體和多核普酸的微陣列，所 述抗體對(duì)以多核苷酸Cl編碼的抗原IL4具有特異性，所述多核香酸與以 熒光團(tuán)標(biāo)記的多核苷酸Bl互補(bǔ)；圖b顯示用于進(jìn)行測(cè)定的本文乂^開的方 法和系統(tǒng)的實(shí)施方案的圖示；圖c顯示圖A中以白色線段標(biāo)識(shí)的部分中所 示測(cè)定結(jié)果的圖示。
圖13顯示顯微圖像，其展示了同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞捕獲和基因與蛋白質(zhì)的多 ^^It檢測(cè)，圖中顯示的標(biāo)度線段對(duì)應(yīng)于300 nm。
圖14顯示一種蛋白質(zhì)陣列，其用于檢測(cè)在微流體中裝配的本文所公開 靶標(biāo)的實(shí)施方案中。
圖15顯示在微流體通道中執(zhí)行的以DNA為模板的蛋白質(zhì)免疫測(cè)定的 熒光圖像和亮視野圖像，用白色虛線畫出600 nm寬的通道。圖a顯示使疫測(cè)定；圖b顯示在本文所公開方法和系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施方案中檢測(cè)耙標(biāo)濃 度系列，其中使用基于熒光的技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)；圖c顯示在本文所公開方法 和系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施方案中檢測(cè)靶標(biāo)濃度系列，其中使用金的非電沉積作為 顯影和放大策略進(jìn)行檢測(cè)。
圖16是根據(jù)本文所公開方法和系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施方案組合使用多核苷 酸編碼抗體和襯底多核苷酸的圖解，多核苷酸編碼抗體用金屬納米顆粒標(biāo) 記。
圖17是圖16根據(jù)本文所公開方法和系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施方案組合使用的 另 一圖解，其顯示與襯底結(jié)合并用金屬納米顆粒標(biāo)記的多核苷酸編碼抗體 -靶標(biāo)復(fù)合體。
圖18是根據(jù)本文所公開方法和系統(tǒng)檢測(cè)信號(hào)的設(shè)備和相關(guān)方法的圖 解，所述信號(hào)來(lái)自用金屬納米顆粒標(biāo)記的多核苷酸編碼抗體。
圖19顯示用本文公開的方法和系統(tǒng)檢測(cè)蛋白質(zhì)組，其中使用金的非電 沉積作為顯影和放大策略進(jìn)行檢測(cè)。圖a顯示在約100 pM的濃度下檢測(cè)； 圖b顯示在約100 fM的濃度下檢測(cè)；圖c顯示在約100 aM的濃度下檢測(cè)。
圖20顯示用本文公開的方法和系統(tǒng)檢測(cè)蛋白質(zhì)組，其中使用金的非電 沉積作為顯影和放大策略進(jìn)行檢測(cè)。圖a顯示在約100pM的濃度下檢測(cè)； 圖b顯示在約1 pM的濃度下檢測(cè)；圖c顯示在約10 fM的濃度下檢測(cè)； 圖d顯示在約100 aM的濃度下檢測(cè)；圖e顯示直方圖，其將計(jì)數(shù)的蛋白 質(zhì)數(shù)(y軸)與其在溶液中的濃度(x軸)相關(guān)聯(lián)。
圖21顯示用本文 〉開的方法和系統(tǒng)檢測(cè)三種蛋白質(zhì)(IFN-y、 TNF-a 和IL-2)在加有(spiked with)這3種蛋白質(zhì)的組織培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)組， 其中^f吏用金的非電沉積作為顯影和放大策略進(jìn)行檢測(cè)。圖a顯示IFN-y的 檢測(cè)；圖b顯示TNF-a的檢測(cè)；圖c顯示IL-2的檢測(cè)。
圖22顯示用本文公開的方法和系統(tǒng)檢測(cè)三種蛋白質(zhì)(IFN-y、 TNF-a 和IL-2 )在加有這三種蛋白質(zhì)的血清樣品(圖a)中和健^Ajk清(圖b ) 中的蛋白質(zhì)組，其中使用金的非電沉積作為顯影和放大策略進(jìn)行檢測(cè)。
圖23是直方圖，其展示用本文公開的方法和系統(tǒng)對(duì)蛋白質(zhì)標(biāo)志物Pten校準(zhǔn)并定量；圖a顯示直方圖，其中展示了從圖b和c中所示微流體實(shí)驗(yàn) 中檢測(cè)到的平均熒光信號(hào)強(qiáng)度；圖b顯示來(lái)自校準(zhǔn)泳道的針對(duì)重組pten 的原始數(shù)據(jù)；圖c顯示來(lái)自樣品的原始熒光數(shù)據(jù)，所述樣品來(lái)自兩種細(xì)胞 系， 一種是表達(dá)基底水平pten的空U87，另 一種是it^達(dá)U-87-pten的細(xì) 胞樣品。
圖24展示了從通過(guò)串聯(lián)質(zhì)鐠法發(fā)現(xiàn)血清生物標(biāo)志物(圖a或1)到通 過(guò)大規(guī)模SPR (圖b或2 )進(jìn)行抗體確認(rèn)和選擇再到使用本文所公開方法 和系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施方案確認(rèn)臨床途徑(圖c或3 )的途徑。
發(fā)明詳述
本發(fā)明公開了檢測(cè)樣品中靶標(biāo)的方法和系統(tǒng)。在本文公開的方法和系 統(tǒng)中，將多核苷酸編碼蛋白質(zhì)與襯底多核苷酸組^<吏用，以檢測(cè)樣品中的 一種或多種乾標(biāo)。
本文使用術(shù)語(yǔ)"檢測(cè)"表示確定有限的空間部分中靶標(biāo)或信號(hào)的存在 (existence),出現(xiàn)(presence)或事實(shí)(fact)，所述有限的空間部分包括但不僅 限于樣品、反應(yīng)混合物、分子復(fù)合體和襯底。當(dāng)表示、涉及或包括測(cè)量靶 標(biāo)或信號(hào)的數(shù)量(quantity)或量(amount)時(shí)(也稱作"定量")，檢測(cè)是"定 量的"，其包括但不限于被設(shè)計(jì)為測(cè)定把標(biāo)或信號(hào)的量或比例的任何分析。 當(dāng)表示、涉及或包括就對(duì)另一靶標(biāo)或信號(hào)(未定量)的相對(duì)豐度來(lái)鑒定靶 標(biāo)或信號(hào)的性質(zhì)或種類時(shí)，檢測(cè)是"定性的"。
本文使用術(shù)語(yǔ)"靶標(biāo)"是指目的分析物。術(shù)語(yǔ)"分析物"是指待檢測(cè) 其在樣品中存在與否的物質(zhì)、化合物或組分。分析物包括但不限于生物分 子，尤其是生物標(biāo)志物。本文使用術(shù)語(yǔ)"生物分子"表示與生物環(huán)境相關(guān) 聯(lián)的物質(zhì)、化合物或組分，包括但不P艮于糖、氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、寡核 苷酸、多核苷酸、多肽、有機(jī)分子、半抗原、表位、生物細(xì)胞、生物細(xì)胞 的部分、維生素、激素等等。術(shù)語(yǔ)"生物標(biāo)志物"是指與生物環(huán)境的特定 狀態(tài)相關(guān)聯(lián)的生物分子，所述狀態(tài)包括但不限于細(xì)胞周期的階段、健康和 疾病狀態(tài)。生物標(biāo)志物的存在、缺失、減少、上調(diào)與特定狀態(tài)相關(guān)聯(lián)，或 指示特定的狀態(tài)。
本文使用術(shù)語(yǔ)"樣品"是指代表著更大量物品的有限量的該物品，包 括但不限于來(lái)自生物環(huán)境的流體、標(biāo)本、培養(yǎng)物、組織、商品重組蛋白質(zhì)、
21合成化合物或其部分。
本文使用術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"是指由兩個(gè)或更多單體組成的有機(jī)多聚體， 所述單體包括核普酸、核苷或其類似物。術(shù)語(yǔ)"核苷酸"是指若干以下化 合物中的任何一種，所述化合物由與噤呤或嘧咬g連接并與磷^連接 的核糖或脫氧核糖組成，并且是核酸的基本結(jié)構(gòu)單元。術(shù)語(yǔ)"核香"是指 這樣的化合物(例如鳥苷或腺苷)，其由與脫氧核糖或核糖組合的嘌呤或 嘧咬4組成，并且特別存在于核酸中。術(shù)語(yǔ)"核苷酸類似物"或"核苷 類似物"分別是指其中 一個(gè)或多個(gè)個(gè)體原子已被替換為不同原子或不同官
能團(tuán)的核苷酸或核普。因此，術(shù)語(yǔ)"多核普酸"包括任何長(zhǎng)度的核酸，DNA RNA類似物及其片段。三個(gè)或更多核苷酸的多核苷酸也被稱作核苷酸寡聚 物或寡核苷酸。
本文使用術(shù)語(yǔ)"多肽"是指由兩個(gè)或更多Jl^酸單體和/或其類似物組 成的有機(jī)多聚體。術(shù)語(yǔ)"多肽"包括任何長(zhǎng)度的JL^酸多聚體，包括全長(zhǎng) 的蛋白質(zhì)和肽，及其類似物和片段。三個(gè)或更多M酸的多肽也稱作蛋白 質(zhì)寡聚物或寡肽。本文使用術(shù)語(yǔ)"氨基酸"、"M酸單體"或"氨基酸殘 基"是指二十種天然存在氨基酸中的任何一種，包括具有非天然側(cè)鏈的合 成氨基酸，并包括D和L旋光異構(gòu)體。術(shù)語(yǔ)"氨基酸類似物"是指這樣的 氨基酸，其中一個(gè)或多個(gè)個(gè)體原子被替換為不同的原子、同位素或不同的 官能團(tuán)，但是其他方面與其天然氨基酸類似物相同。
本文使用術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)，，是指具有特定的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽， 其能夠參與(但不限于)與其他生物分子的相互作用，所述其他生物分子 包括其他蛋白質(zhì)、DNA、 RNA、脂質(zhì)、代謝物、激素、趨化因子和小分子。
本文使用術(shù)語(yǔ)"抗體"是指這樣蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)在抗原刺激后由 活化的B細(xì)胞產(chǎn)生，并與抗原特異性結(jié)合，在生物系統(tǒng)中促進(jìn)免疫應(yīng)答， 所述蛋白質(zhì)通常由四個(gè)亞基組成，包括兩條重鏈和兩條輕鏈。術(shù)語(yǔ)"抗體，， 包括天然抗體和合成抗體，包括但不限于單克隆抗體、多克隆抗體或其片 段。示例性的抗體包括IgA、 IgD、 IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgM等等。示例 性的片段包括FabFv、 Fab， F(ab')2等等。單克隆抗體是這樣的抗體，其 與另一生物分子中稱為"表位"的單個(gè)特定空間和極性結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合， 并因而定義為與之互補(bǔ)。多克隆抗體是指單克隆抗體的混合物，各個(gè)單克 隆抗體結(jié)合不同的抗原性^^位?？贵w可通過(guò)本領(lǐng)域z^知的才支術(shù)制備，例如免疫宿主并收集血清(多克隆抗體)，或通過(guò)制備連續(xù)雜交瘤細(xì)胞系并收 集所分泌的蛋白質(zhì)(單克隆抗體)。
本文在提及分子與另一分子結(jié)合時(shí)使用的措辭"特異性地"、"特異地" 或"特異性"是指所述分子與該另一分子之間識(shí)別、接觸并形成穩(wěn)定復(fù)合 體，并且所述分子和另一分子中的每一種與其他分子之間顯著更少直至不 發(fā)生識(shí)別、接觸和形成穩(wěn)定復(fù)合體。示例性的特異性結(jié)合是抗體-抗原相互 作用、細(xì)胞受體-配體相互作用、多核苷酸雜交、酶-底物相互作用等等。 本文在提及復(fù)合體的分子組分時(shí)使用的術(shù)語(yǔ)"特異性"是指該組分與其特 定復(fù)合體的獨(dú)特關(guān)聯(lián)，所述組分是所述特定復(fù)合體的一部分。本文在提及 多核苷酸序列時(shí)使用的術(shù)語(yǔ)"特異性，，是指該序列與作為其互補(bǔ)序列的單 個(gè)多核苷酸的獨(dú)特關(guān)聯(lián)。
措辭"多核苷酸編碼蛋白質(zhì)"是指多核苷酸-蛋白質(zhì)復(fù)合體，其包含蛋 白質(zhì)組分和附著于該蛋白質(zhì)組分的編碼多核苷酸，所述蛋白質(zhì)組分與靶標(biāo) 特異性結(jié)合并因而被定義為與該靶標(biāo)互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，附著于
蛋白質(zhì)的編碼多核苷i^l蛋白質(zhì)特異性的。這些實(shí)施方案可用于在任何靶
檢測(cè)其他蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子、趨化因子、小分子、DNA、 RNA、脂質(zhì)等等 的測(cè)定。
本文使用術(shù)語(yǔ)"多核香酸編碼抗體"是指多核苷酸編碼蛋白質(zhì)，其中 所述蛋白質(zhì)組分是抗體。
本文使用術(shù)語(yǔ)"附著"或"附著的"是指通過(guò)鍵、連接(link)、力或聯(lián) 系(tie)連接或合并，從而將兩個(gè)或更多的組分保持在一起，該術(shù)語(yǔ)包括直 接或間接附著，使得例如其中第一分子與第二分子或材料直接結(jié)合，以及 其中一種或多種中間體分子被置于該第一分子和第二分子或材料之間的 實(shí)施方案。
本文使用措辭"襯底多核苷酸"是指附著于襯底從而維持結(jié)合其互補(bǔ) 多核苷酸的能力的多核苷酸。村底多核苷酸尤其可由下述序列組成，所述 序列與多核苷酸編碼蛋白質(zhì)的編碼多核普酸特異性結(jié)合，并因而被定義為 與之互補(bǔ)。
本文使用術(shù)語(yǔ)"襯底"是指底層的支持物或基底。示例性的襯底包括固體襯底，如玻璃板、微孔板、磁珠、硅晶片(silicon wafer)和技術(shù)人員閱 讀4^>開內(nèi)容后可識(shí)別的其他襯底。
在本文公開的多核苷酸編碼蛋白質(zhì)中，各蛋白質(zhì)與預(yù)定的靶標(biāo)特異性 結(jié)合并因而被定義為與之互補(bǔ)，并且各編碼多核普酸與預(yù)定的襯底多核普 酸特異性結(jié)合并因而被定義為與之互補(bǔ)。
在其中蛋白質(zhì)是抗體的實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)-靶標(biāo)相互作用是抗體-抗 原相互作用。在其中蛋白質(zhì)不是抗體的實(shí)施方案中，相互作用可以是受體 -配體相互作用、酶-底物相互作用和技術(shù)人員閱讀4^>開內(nèi)容后可識(shí)別的 其他蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。例如，在其中蛋白質(zhì)是鏈霉親和素的實(shí)施方 案中，蛋白質(zhì)-靶標(biāo)相互作用是受體-配體相互作用，其中受體是鏈霉親和 素，配體是游離或附著于任何其他生物分子的生物素。
另外，在本文>^開的方法和系統(tǒng)中，各襯底多核苷酸和編碼多核苷酸 在結(jié)合方面可彼此區(qū)分。在本文7>開的方法和系統(tǒng)的一些實(shí)施方案中，襯 底中的各襯底多核苷i^序列特異性的，并且在位置上可彼此區(qū)分。
本文涉及分子時(shí)使用的措辭"在結(jié)合方面可區(qū)分"是指可以基于與特
定分子特異性結(jié)合并因而被定義為與之互補(bǔ)的能力而進(jìn)行區(qū)分的分子。因 此，如果第一分子與第三分子特異性結(jié)合并因而被定義為與第三分子互 補(bǔ)，且第二分子與不同于第三分子的第四分子特異性結(jié)合并因而被定義為 與第四分子互補(bǔ)，則第一分子與第二分子在結(jié)合方面可區(qū)分。
本文涉及分子時(shí)使用的措辭"位置上可區(qū)分"是指可以基于分子占據(jù) 的點(diǎn)或區(qū)域而進(jìn)行區(qū)分的分子。因此，位置上可區(qū)分的襯底多核苷^1這 樣的襯底多核苷酸，其占據(jù)襯底上不同的點(diǎn)或位置，并因而是位置上可區(qū) 分的。
本文公開的多核苷酸編碼蛋白質(zhì)可以用常見的生物綴合方法 (bioconjugationmethod)來(lái)產(chǎn)生，例如化學(xué)交聯(lián)，包括依賴于蛋白質(zhì)中存在 待結(jié)合伯胺(通常存在于賴氨酸殘基上)的技術(shù)。特別地，多核苷酸編碼 蛋白質(zhì)尤其可以通過(guò)圖1和2中針對(duì)多核苷酸編碼抗體(圖1)和多核普 酸編碼的鏈霉親和素(圖2)而顯示的共價(jià)綴合策略來(lái)產(chǎn)生。
在圖1顯示的實(shí)施方案中，5'-胺化的多核苷酸通過(guò)腙鍵與抗體偶聯(lián) (Kozlov， I. A.; Melnyk， P. C; Stromsborg， K. E.; Chee, M. S.; Barker, D. L.;Zhao, C. Biopolymers 2004， 73， 621- 630)，如圖1所示和實(shí)施例1的示例。
相同的生物綴合化學(xué)及JI可用于生產(chǎn)任何多核香酸編碼蛋白質(zhì)，例如 以多核苷酸編碼的鏈霉親和素，如實(shí)施例2的示例和圖2所示。
待綴合特定的多核普酸編碼蛋白質(zhì)的編碼多核普酸數(shù)可以變化。尤其 可以調(diào)控附著于蛋白質(zhì)組分的多核苷酸數(shù)，以使待結(jié)合部分的大小最小 化，因而使其位阻最小化，而同時(shí)仍然保持綴合特異性。可通過(guò)實(shí)施例3 中示例并在相關(guān)的圖3中圖示的步驟進(jìn)行優(yōu)化。在實(shí)施例3和圖3中，產(chǎn) 生了不同批的多核苷酸編碼抗體，其中與各抗體相連的多核苷酸總數(shù)不 同。因?yàn)閳D3和實(shí)施例3的編碼多核普酸中含有熒光團(tuán)，所以可使用FACS 測(cè)出各變體對(duì)細(xì)#面標(biāo)志物的結(jié)合效率。應(yīng)當(dāng)注意，存在測(cè)量和優(yōu)化作 為多核普酸載荷函數(shù)的抗體親和力的其他類似技術(shù)，包括直接測(cè)量抗體的 結(jié)合動(dòng)力學(xué)的技術(shù)，如表面等離振子共振(surface plasmon resonance, SPR) 和等溫滴定測(cè)熱法(ITC)。
在一些實(shí)施方案中，待附著于每一蛋白質(zhì)的編碼多核苷酸數(shù)可以是從 1到6的任何數(shù)目。在一些實(shí)施方案(例如細(xì)胞分選)中，每個(gè)蛋白質(zhì)附 著3個(gè)編碼多核苷酸提供了使標(biāo)記的空間效應(yīng)最小化的額外優(yōu)點(diǎn)，并因此 允許用多種編碼多核苷酸來(lái)標(biāo)記多核苷酸編碼蛋白質(zhì)，用于與互補(bǔ)襯底多 核苷酸的高親和力雜交。
也可以控制形成待結(jié)合部分的多核苦酸的長(zhǎng)度，以優(yōu)化多核苷酸編碼 蛋白質(zhì)與襯底的結(jié)合。特別地，可以為了無(wú)關(guān)化處理的目的而優(yōu)化編碼多 核苷酸的長(zhǎng)度，如實(shí)施例8和圖9中所例證和下文進(jìn)一步討論的。
在以下的詳細(xì)描述中，經(jīng)常會(huì)參考其中多核苷酸編碼蛋白質(zhì)是多核苷 酸編碼抗體的實(shí)施方案。閱讀本公開內(nèi)容后，技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能夠使針對(duì)多 核苷酸編碼抗體提供的教導(dǎo)適應(yīng)于其他多核苷酸編碼蛋白質(zhì)。
可通過(guò)本領(lǐng)域的常見技術(shù)生產(chǎn)襯底多核苷酸。例如，首先可化學(xué)合成 多核普酸。然后根據(jù)Stanford的Pat Brown(Schena M, Shalon D, Davis RW， Brown PO. Science. 1995 Oct 20; 270(5235): 467-70指出的范例對(duì)多核苷酸 進(jìn)行針點(diǎn)樣(pin spotted).然后可#>據(jù)技術(shù)人員閱讀^^開內(nèi)容后可識(shí)別的 技術(shù)，將這樣生產(chǎn)的村底多核苷酸附著于襯底。特別地，用于生產(chǎn)襯底多 核苷酸的合適多核苷酸包括多聚賴氨酸襯底上的至少75單體長(zhǎng)度。在一些實(shí)施方案中，編碼多核普酸和/或襯底多核苷酸被無(wú)關(guān)化處理， 以使編碼多核苷酸與襯底多核苷酸之間的非特異性結(jié)合最小化。因此，無(wú) 關(guān)化處理的多核苷酸包括這樣的多核苷酸，其序列由計(jì)算機(jī)產(chǎn)生，以使不 完全的堿基配對(duì)、亞穩(wěn)態(tài)和/或其他二級(jí)結(jié)構(gòu)最小化，從而使多核普酸之間 的非特異性相互作用最小化，以及使通常與相關(guān)序列的隨機(jī)產(chǎn)生相關(guān)聯(lián)的 多核苷酸中的非線性次^目互作用最小化。
本文中使用術(shù)語(yǔ)"無(wú)關(guān)化處理"是指計(jì)算機(jī)產(chǎn)生一組多核苷酸的過(guò)程， 其中不完全堿基配對(duì)、亞穩(wěn)態(tài)和其他二級(jí)結(jié)構(gòu)被最小化，以使多核苷酸僅 與其互#^結(jié)合，不與其他任何鏈結(jié)合。本公開內(nèi)容中使用的示例性無(wú)關(guān)
化處理技術(shù)包括根據(jù)Dirks等(Dirks， R. M.; Lin， M.; Winfree， E.; Pierce, N. A. 7V"c/e/c J"Vfc i^se"/T/i 2004, 32， (4)， 1392-1403)所述范例進(jìn)行的無(wú)關(guān)化^ 處理。
具體地，在一些實(shí)施方案中，編碼多核苷酸和相應(yīng)的互補(bǔ)襯底多核普 ^A具有SEQ ID NO: 7到SEQ ID NO 18的序列的無(wú)關(guān)化處理多核苷酸 (見實(shí)施例8和相關(guān)的表1)。
可通過(guò)方法和步驟(如實(shí)施例8中例證并在圖9中闡述的多核苷酸的 計(jì)算機(jī)無(wú)關(guān)化處理(即計(jì)算機(jī)化的無(wú)關(guān)化處理)和技術(shù)人員閱讀本公開內(nèi) 容后會(huì)明白的其他步驟)進(jìn)一步鑒定其他無(wú)關(guān)化處理的多核香酸。
本文公開的方法和系統(tǒng)可用于進(jìn)行檢測(cè)耙標(biāo)的測(cè)定，包括單^lt測(cè)定 和多參數(shù)測(cè)定，均可作為多路測(cè)定進(jìn)行。
本文使用術(shù)語(yǔ)"單參數(shù)測(cè)定"是指用于測(cè)定一種耙標(biāo)的存在、不存在 或量的分析。術(shù)語(yǔ)"多參數(shù)測(cè)定"是指用于測(cè)定多種耙標(biāo)的存在、不存在 或量的分析。術(shù)語(yǔ)"多路"測(cè)定是指多種測(cè)定反應(yīng)(例如同時(shí)測(cè)定多種分 析物)在單一反應(yīng)室中進(jìn)行和/或以單一分離和檢測(cè)形式中分析的測(cè)定。
在一些實(shí)施方案中，本文公開的方法和系統(tǒng)能夠有利地用于進(jìn)旨斷 測(cè)定，其中待檢測(cè)的靶標(biāo)是與預(yù)定疾病相關(guān)聯(lián)的預(yù)定生物標(biāo)志物。這些實(shí) 施方案在這樣的診斷方法中是尤其有利的，其中不同種類的生物材料和生 物分子各自在通常為異質(zhì)的組織樣品中不同區(qū)域進(jìn)行測(cè)量，從而引入了不 可避免的難以定量的噪音源。
在本文公開的方法和系統(tǒng)的一些實(shí)施方案中，多核苷酸編碼蛋白質(zhì)和襯底多核普酸組^使用，如圖4所示，其中所示多核苷酸編碼蛋白質(zhì)是多 核普酸編碼抗體。
在圖4的實(shí)施方案中，多核普酸編碼抗體(10)與襯底(100)組合提供。 多核普酸編碼抗體(IO)由抗體(ll)和編碼多核苷酸(12)組成。襯底(100)帶有 與襯底表面結(jié)合的襯底多核苷酸(120)。編碼多核普酸(12)與襯底多核普酸 (120)互補(bǔ)，以使襯底多核苷酸(120)和編碼多核普酸(12)在接觸后雜交。
在圖4所示的實(shí)施方案中，本文公開的多核普酸編碼抗體形成蛋白質(zhì) 陣列，其能夠與樣品接觸，以檢測(cè)樣品中的耙標(biāo)。圖4的實(shí)施方案對(duì)于檢 測(cè)和/或分選蛋白質(zhì)靶標(biāo)而言尤其有利。
在另 一些實(shí)施方案中，尤其是適用于檢測(cè)和/或分選細(xì)胞乾標(biāo)的實(shí)施 方案中，在將多核苷酸編碼抗體與互補(bǔ)的襯底多核苷酸接觸之前，將一些 或全部多核苷酸編碼抗體與樣品接觸。在這另一些實(shí)施方案中，抗體與一 種或多種相應(yīng)的靼標(biāo)能夠在無(wú)襯底時(shí)(例如在溶液相中)結(jié)合，其中兩種 分子均具有完全的取向自由，并且靶標(biāo)對(duì)抗體結(jié)合口袋(binding pocket)的 接近不受襯底影響。另外，不發(fā)生表面誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)變性，因?yàn)槎嗪塑账?編碼抗體保留在溶液中，保持了蛋白質(zhì)的三級(jí)折疊。另外，生物污著被最
小化(也參見下文的描述)，從而與本領(lǐng)域的相應(yīng)方法和系統(tǒng)相比改善了 所進(jìn)行測(cè)定的靈敏度和特異性，以及與襯底結(jié)合的抗體靶標(biāo)復(fù)合體的可檢 測(cè)性。顯示一些上述優(yōu)點(diǎn)的示例性實(shí)施方案示于圖5、 7、 8、 11和13。
在本文公開的方法和系統(tǒng)中，最終從襯底上檢測(cè)與襯底結(jié)合的抗體-靶標(biāo)復(fù)合體。
在一些實(shí)施方案中，通過(guò)提供經(jīng)標(biāo)記的分子來(lái)進(jìn)行復(fù)合體的檢測(cè)， 所述經(jīng)標(biāo)記的分子包括能夠特異性結(jié)合待檢測(cè)的多核普酸編碼蛋白質(zhì)-乾 標(biāo)復(fù)合體的任何分子(例如抗體、適配體、肽等)，以及提供標(biāo)記信號(hào)的 標(biāo)記，所述經(jīng)標(biāo)記化合物附著于所述分子上。將經(jīng)標(biāo)記的分子與多核普酸 編碼蛋白質(zhì)-靶標(biāo)復(fù)合體接觸，然后可以根據(jù)技術(shù)人員閱讀4^>開內(nèi)容(尤 其是實(shí)施例部分)后可識(shí)別的方法^^測(cè)標(biāo)記信號(hào)，所述標(biāo)記信號(hào)來(lái)自與 襯底上多核普酸編碼蛋白質(zhì)-耙標(biāo)復(fù)合體結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記化合物。
在其中如下文更詳細(xì)描述的檢測(cè)一種或多種乾標(biāo)和/或多種乾標(biāo)的 實(shí)施方案中，經(jīng)標(biāo)記分子可以由多種經(jīng)標(biāo)記分子組成。每種經(jīng)標(biāo)記分子包
2含與一種或多種靶標(biāo)/多種耙標(biāo)中的一種靶標(biāo)特異性結(jié)合的分子，以及附著 于該分子的標(biāo)記化合物，該標(biāo)記化合物提供標(biāo)記信號(hào)，各經(jīng)標(biāo)記的分子在 檢測(cè)方面可彼此區(qū)分。本文涉及經(jīng)標(biāo)記分子使用的措辭"在檢測(cè)方面可區(qū)分"是指可以基 于附著于該分子的標(biāo)記化合物所提供的標(biāo)記信號(hào)進(jìn)行區(qū)分的分子。示例性 的標(biāo)記化合物(其能夠用于提供在檢測(cè)方面可區(qū)分的經(jīng)標(biāo)記分子)包括但 不限于放射性同位素、熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光染料、生色團(tuán)、酶、酶底物、酶輔因子、酶抑制劑、染料、金屬離子、納米顆粒、金屬溶膠(metalsol)、配 體(例如生物素、親和素、鏈霉親和素或半抗原)和技術(shù)人員閱讀本公開 內(nèi)容后可識(shí)別的其他化合物。在一些實(shí)施方案中，將多種經(jīng)標(biāo)記分子與多種多核苷酸編碼蛋白質(zhì)-靶標(biāo)復(fù)合體在一定條件下接觸一定時(shí)間，以允許多種多核苷酸編碼蛋白質(zhì) -靶標(biāo)復(fù)合體與多種經(jīng)標(biāo)記分子結(jié)合。然后檢測(cè)標(biāo)記信號(hào)，該信號(hào)來(lái)自與襯 底上多種多核苷酸編碼蛋白質(zhì)-靶標(biāo)復(fù)合體結(jié)合的多種經(jīng)標(biāo)記分子。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)方法可以通過(guò)基于熒光的讀數(shù)(readout)來(lái) 進(jìn)行，其中經(jīng)標(biāo)記抗體用熒光團(tuán)標(biāo)記，所述熒光團(tuán)包括但不僅限于小分子 染料、蛋白質(zhì)生色團(tuán)、量子點(diǎn)(quantum dot)和金納米顆粒。具體地，在一 些實(shí)施方案中，在本文公開的任何方法和系統(tǒng)中，檢測(cè)可在金納米顆粒標(biāo) 記的二級(jí)檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行，其中常用的攝影顯影液可放大金納米顆粒，如 下文進(jìn)一步描述。另外，如果讀數(shù)來(lái)自于金顆粒的暗視野(darkfield)散射， 則能夠進(jìn)行單分子數(shù)字蛋白質(zhì)組分析。其他的技術(shù)是技術(shù)人員閱讀本公開 內(nèi)容后可識(shí)別的，將不再進(jìn)一步詳細(xì)討論。本文用作復(fù)合體或分子之組分的術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記"和"經(jīng)標(biāo)記分子"是 指能夠檢測(cè)的分子，包括但不限于放射性同位素、熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光染料、 生色團(tuán)、酶、酶底物、酶輔因子、酶抑制劑、染料、金屬離子、納米顆粒、 金屬溶膠、配體(例如生物素、親和素、鏈霉親和素或半抗原)等等。術(shù) 語(yǔ)"熒光團(tuán)"是指能夠在可檢測(cè)的圖像中顯示出熒光的物質(zhì)或其部分。因 此，本文使用的措辭"標(biāo)記信號(hào)"是指由標(biāo)記發(fā)射的允許檢測(cè)該標(biāo)記的信 號(hào)，包括但不限于放射性、熒光、化學(xué)發(fā)光、在酶反應(yīng)的結(jié)果中產(chǎn)生化合 物等等。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)一種特異性靶標(biāo)。在這些實(shí)施方案中，可28冉 別
靶標(biāo)接觸。
其中在將多核苷酸編碼抗體與襯底接觸之前將多核苷酸抗體與靶標(biāo) 接觸的實(shí)施方案尤其適用于分選或檢測(cè)細(xì)胞。在這些實(shí)施方案中，抗體與 靶標(biāo)之間結(jié)合的效率和特異性被最大化，即便對(duì)于檢測(cè)單個(gè)靶標(biāo)也是如 此。 一種可能(但不確定)的解釋是，在本文公開的方法和系統(tǒng)中，靶標(biāo) 捕獲不是由抗體對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志物的相互作用驅(qū)動(dòng)，而是由通過(guò)協(xié)同結(jié)合 提高的抗體特異性多核苷酸與微陣列上相應(yīng)鏈的親和力來(lái)驅(qū)動(dòng)，這大幅提 高了捕獲效率。該優(yōu)點(diǎn)尤其與這樣的靶細(xì)胞相關(guān)，其能夠被有效地捕獲，
從而使用該方法典型地觀察到被匯合細(xì)胞層完全占據(jù)的DNA點(diǎn)(見實(shí)施 例5和圖5)。
其中在多核苷酸編碼抗體與襯底接觸之后將多核普酸編碼抗體與靶 標(biāo)接觸的實(shí)施方案尤其適用于以高靈敏度分選或檢測(cè)蛋白質(zhì)。本文公開的
觸的方法和系統(tǒng)的示例性實(shí)施方案示例于實(shí)施例12和13，并示于圖15、 19、 20、 21、 22、 23、 24(c)。在這些實(shí)施方案中，能夠消除已結(jié)合靼標(biāo)的 多核苷酸編碼蛋白質(zhì)與未結(jié)合靶標(biāo)的多核苷酸編碼蛋白質(zhì)之間對(duì)同一特 異性襯底多核苷酸的竟?fàn)?，因而提高測(cè)定的靈^t度。另外，在這些實(shí)施方 案中，通過(guò)決定各種結(jié)合的平衡熱力學(xué)定律，可以優(yōu)化襯底上多核苷酸的 濃度，使得更高濃度的多核苷酸編碼蛋白質(zhì)能夠與襯底結(jié)合，這進(jìn)而會(huì)導(dǎo) 致正確裝配的復(fù)合體的濃度更高，進(jìn)而提高整體檢測(cè)靈敏度。
可使用圖4和5以及實(shí)施例5中例證的方法和系統(tǒng)進(jìn)行單M測(cè)定， 所述方法和系統(tǒng)包括但不限于用于檢測(cè)血清中單一標(biāo)志物的任何測(cè)定， 生物樣品中單一蛋白質(zhì)檢測(cè)，根據(jù)一種表面標(biāo)志物進(jìn)行細(xì)胞分選，以及技 術(shù)人員閱讀4^Hf內(nèi)容后可識(shí)別的其他測(cè)定。
在一些實(shí)施方案中，根據(jù)圖6中所示的策略進(jìn)行多種靶標(biāo)的檢測(cè)。
產(chǎn)生多種多核普酸編碼抗體(10、 20和30)，每種多核苷酸編碼抗 體能夠特異性結(jié)合帶有抗體組分(11、 21和31)的一種預(yù)定靶標(biāo)，并能結(jié) 合帶有編碼多核苷酸組分(12、 22和32)的互補(bǔ)襯底多核苷酸。產(chǎn)生帶有 序列特異性并且位置可區(qū)分的襯底多核苷酸(112、 122和132)的襯底。然后將多核苷酸編碼抗體(IO)、 (20)和(30)與襯底多核苷酸(112)、 (122) 和(132)接觸，并且在抗體特異性多核苷酸與相應(yīng)的襯底多核苷酸結(jié)合后， 多核苷酸編碼抗體復(fù)合體在襯底上自裝配。
在圖6中所示的實(shí)施方案中，產(chǎn)生由多種結(jié)合可區(qū)分且位置可區(qū)分 的抗體組成的蛋白質(zhì)陣列。這些實(shí)施方案對(duì)于以高靈敏度分選和/或檢測(cè)不 同的蛋白質(zhì)-靶標(biāo)是尤其有利的。這些實(shí)施方案的示例性展示在實(shí)施例9、 10和12和圖10、 12、 13和15a中顯示。
在另一些實(shí)施方案中，在接觸襯底多核苷酸之前將多種多核苷酸編 碼抗體與樣品接觸，用于檢測(cè)相關(guān)乾標(biāo)。在這些實(shí)施方案中，本文公開的 方法和系統(tǒng)可用于進(jìn)行多路多參數(shù)測(cè)定，其中由于與抗體和靶標(biāo)在不存在 襯底時(shí)結(jié)合相關(guān)聯(lián)的靈敏度和選擇性的提高，并鑒于生物污著和蛋白質(zhì)變 性的減少，可以以定量和/或定性的方式有效檢測(cè)大量生物標(biāo)志物。這些實(shí) 施方案的示例性展示在實(shí)施例9、 10和12和圖10、 12、 13和15中顯示。
可用實(shí)施例9、 10和12中示例并示于圖10、 12、 13和15的方法和 系統(tǒng)進(jìn)行的多參數(shù)測(cè)定包括但不限于任何蛋白質(zhì)組學(xué)分析、組織分析、血 清診斷、生物標(biāo)志物、血清圖鐠(serum profiling),多參數(shù)細(xì)胞分選、單細(xì) 胞研究，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀本公開內(nèi)容后可識(shí)別的其他測(cè)定。
在一些實(shí)施方案中，圖6所示的組合使用可應(yīng)用于分選多種靶標(biāo)的 方法中，這在所述多種靶標(biāo)由不同類型的細(xì)胞(尤其是原代細(xì)胞)組成時(shí) 是尤其有利的。在這些實(shí)施方案中，根據(jù)實(shí)施例9中示例并示于圖10的方 法，優(yōu)選地在與襯底接觸之前將多核苷酸編碼抗體與包含細(xì)胞的樣品接 觸。
其中多種靶標(biāo)由不同類型細(xì)胞組成的方法和系統(tǒng)的實(shí)施方案尤其比 相應(yīng)的現(xiàn)有方法和系統(tǒng)例如淘洗(panning)更為有利，其中細(xì)胞與印在支持 襯底上的表面標(biāo)志物特異性抗體接觸(Cardoso， A. A.; Watt， S. M.; Batard， P.; Li, M. L.; Hatzfeld， A.; Genevier， H.; Hatzfeld, J.五jc/;. He附flto/. 1995， 23,407-412)。具體地，由于使用多核苷酸將抗體與襯底結(jié)合，所以相對(duì)于 現(xiàn)有技術(shù)的方法和系統(tǒng)而言在襯底上的細(xì)胞捕獲效率提高(見圖5和圖 10 )。另夕卜,這些優(yōu)選的實(shí)施方案沒(méi)有與常規(guī)點(diǎn)樣蛋白質(zhì)微陣列相同的限制， 例如不總是在表面上正確取向的抗體，和/或可能干燥過(guò)度并失去功能的抗 體。任何分選細(xì)胞的實(shí)施方案都具有優(yōu)于本領(lǐng)域已知細(xì)胞分選方法和系
統(tǒng)(如FACS)的若干優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)橥ㄟ^(guò)本文公開的方法和系統(tǒng)分選的細(xì)胞 可立即用于分選后的基因和/或蛋白質(zhì)表達(dá)分析。另夕卜，本文公開的方法和 系統(tǒng)對(duì)多種細(xì)胞進(jìn)行空間多路分選，這在根據(jù)多種細(xì)胞表面標(biāo)志物分選細(xì) 胞中尤其有效，并且不受可用于標(biāo)記分選用細(xì)胞表面標(biāo)志物的光謙不同的 熒光團(tuán)數(shù)量的限制，如實(shí)施例9和相關(guān)的圖10中所示。
在一些實(shí)施方案中，圖6中所示的組合^^吏用可用于根據(jù)圖11所示方 法檢測(cè)多種化學(xué)性質(zhì)不同的靶標(biāo)。具體地，顯示了該方法用于分離多種不 同的生物標(biāo)志物如DNA、細(xì)胞和蛋白質(zhì)。在圖11所示的實(shí)施方案中，在 用于分析細(xì)胞、基因和蛋白質(zhì)的多^lt測(cè)定中，使用附著有多種襯底多核 苷酸(3)的襯底(2)實(shí)施本文公開的方法和系統(tǒng)，以分離細(xì)胞(l)(見圖11, 箭頭A1)并分析相關(guān)的基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)特征(signature)(見圖11， 箭頭2)。
在一些這樣的實(shí)施方案中，將樣品與多種多核苷酸編碼抗體接觸， 以允許形成多種以多核苷酸編碼的生物標(biāo)志物復(fù)合體，然后將其與襯底如 DNA陣列接觸，其中抗體特異性多核苷酸特異性結(jié)合相應(yīng)的DNA鏈。在 期望檢測(cè)靶多核苷酸的一些實(shí)施方案中，還可將特異性結(jié)合乾多核普酸的 經(jīng)標(biāo)記多核苷酸與樣品結(jié)合，產(chǎn)生經(jīng)標(biāo)記的靶多核苷酸，其與襯底上的預(yù) 定DNA鏈特異性結(jié)合。經(jīng)標(biāo)記的靶多核苷酸最終與襯底多核苷酸結(jié)合并 被檢測(cè)。根據(jù)該方法，細(xì)胞、蛋白質(zhì)和DNA生物標(biāo)志物被分選，然后在 單一襯底上檢測(cè)，從而允許有利地進(jìn)行多路多參數(shù)測(cè)定。
在這些實(shí)施方案中，通過(guò)使用多核苷酸作為細(xì)胞、cDNA和蛋白質(zhì) 的通用裝配策略，可以針對(duì)點(diǎn)樣襯底上的高DNA載荷和抗體上的互補(bǔ) DNA載荷優(yōu)化襯底IHf 。該優(yōu)化以及襯底上與抗體基于多核苷酸結(jié)合相關(guān) 的生物污濁的降低允許進(jìn)行用于蛋白質(zhì)檢測(cè)的高靈敏度夾心法測(cè)定，以及 高效細(xì)胞分選(與傳統(tǒng)淘洗相比)。進(jìn)行化學(xué)性質(zhì)不同的生物標(biāo)志物檢測(cè) 的一種示例性方法和系統(tǒng)在實(shí)施例10中描述并示于圖13中。
使用實(shí)施例9、 10、 12和13中示例并示于圖13、 10c、 10d、 15a、 22、 23、 24的方法和系統(tǒng)可進(jìn)行的靼標(biāo)分選測(cè)定包括技術(shù)人員閱讀本公開 內(nèi)容后可識(shí)別的任何需要檢測(cè)混合物中特定靶標(biāo)(包括但不限于細(xì)胞靶 標(biāo)、蛋白質(zhì)靶標(biāo)或基因靶標(biāo))的測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，可通過(guò)抗體進(jìn)行單個(gè)或多種靶標(biāo)的高靈敏度檢 測(cè)，所述抗體以用于檢測(cè)的金屬納米顆粒進(jìn)行標(biāo)記，然后進(jìn)行非電沉積沉
積(electroless metal deposition)。
在這些實(shí)施方案中，可通過(guò)使用金屬納米顆粒(尤其是金納米顆粒) 作為標(biāo)記分子來(lái)實(shí)施本文公開的任何方法和系統(tǒng)，以檢測(cè)與襯底結(jié)合的以 多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)-靶標(biāo)復(fù)合體。具體地，金屬納米顆粒(如金納米顆 粒)與經(jīng)標(biāo)記的分子(例如第二抗體)綴合，用于標(biāo)記與襯底結(jié)合的多核 苷酸編碼蛋白質(zhì)-靶標(biāo)復(fù)合體。金屬顆粒(如金納米顆粒)具有獨(dú)特的光學(xué) 特性，因?yàn)楸瓤梢姽獠ㄩL(zhǎng)小得多的顆粒仍然能夠使用光"a射容易地成像。 這允許使用光散射顯微鏡通過(guò)計(jì)數(shù)納米顆粒標(biāo)記(并從而計(jì)數(shù)蛋白質(zhì))而 對(duì)免疫測(cè)定進(jìn)行讀數(shù)。該方法在本文中還被定義為數(shù)字方法和數(shù)字DEAL ——假設(shè)每個(gè)納米顆粒對(duì)應(yīng)于單個(gè)蛋白質(zhì)，則計(jì)數(shù)的顆粒數(shù)代表通過(guò)特異 性抗體捕獲的蛋白質(zhì)的絕對(duì)數(shù)量。
圖16和17顯示了本文7>開的方法和系統(tǒng)的一種示例性實(shí)施方案， 其中標(biāo)記分子包括金屬納米顆粒，如金納米顆粒。具體地，金納米顆粒(210) 通過(guò)接頭分子(211)附著于第二抗體(212)上。在第一抗體(213)上附著了一種 或多種ssDNA寡聚體(214)。待檢測(cè)的靶標(biāo)(217)處于溶液或生物環(huán)境中。 測(cè)定本身應(yīng)在包被有ssDNA， (215)的表面(216)上測(cè)量。示例性的實(shí)施方案 進(jìn)一步展示于圖18到22,并在實(shí)施例13中示例。
使用金屬納米顆粒進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，本文公開的方法和系統(tǒng)的一些實(shí)施 方案的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是不需要每次都在進(jìn)行蛋白質(zhì)測(cè)量后對(duì)免疫測(cè)定進(jìn)行校 準(zhǔn)，因?yàn)橛?jì)數(shù)的蛋白量代表絕對(duì)測(cè)量值。相比較而言，熒光測(cè)定或吸光度 測(cè)定代表了相對(duì)測(cè)量值，因?yàn)樗鼈內(nèi)Q于背景熒光(吸光度)水平、光放 大電子學(xué)、光漂白作用(對(duì)熒光而言)等等。本文公開的基于納米顆粒的 數(shù)字方法和系統(tǒng)可有利地用于(l)在高aM水平(超出常規(guī)ELISA免疫 測(cè)定103-106倍的改進(jìn))和廣濃度范圍下超靈敏地檢測(cè)蛋白質(zhì)；(2)在同一 芯片上多#測(cè)多種蛋白質(zhì)；和(3)檢測(cè)人患者血清中的胞外信號(hào)分子一一 細(xì)胞因子。
本文公開的方法和系統(tǒng)的一些實(shí)施方案(其中通過(guò)使用金屬納米顆 粒進(jìn)行標(biāo)記和檢測(cè))是基于下述檢測(cè)系統(tǒng)，如瑞利散射機(jī)制，其允許將與 檢測(cè)抗體綴合的個(gè)體等離振子納米顆粒(plasmonic nan叩article)間接顯現(xiàn)，從而實(shí)現(xiàn)單一蛋白質(zhì)計(jì)數(shù)，所述顆粒在該情況下為40nm的金納米顆 粒?？墒褂脠D形軟件接口 (graphical software interface)對(duì)顆粒的絕對(duì)數(shù)進(jìn) 行數(shù)碼計(jì)數(shù)，從而定量蛋白質(zhì)的量。這些實(shí)施方案與在放大后使用平均信 號(hào)讀數(shù)的常規(guī)定量方法截然相反。與DNA編碼的抗體文庫(kù)技術(shù)結(jié)合，本 文公開的使用金屬納米顆粒作為標(biāo)記化合物的方法和系統(tǒng)能夠通過(guò)同時(shí) 計(jì)數(shù)來(lái)自相同生物樣品的不同種類蛋白質(zhì)而使檢測(cè)多路化。
本文公開的方法和系統(tǒng)(其中使用納米顆粒作為標(biāo)記化合物)優(yōu)于 現(xiàn)有的高靈敏蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)(其基于ELISA方案的變體)的又一種優(yōu)點(diǎn) 是，有可能消除信號(hào)放大和相關(guān)的額外噪音以及運(yùn)行所需的時(shí)間?，F(xiàn)有技 術(shù)方法都需要某個(gè)放大步驟，并且每種方法都需要一定水平的校準(zhǔn)，所述 校準(zhǔn)必須針對(duì)所實(shí)施的每個(gè)測(cè)定來(lái)進(jìn)行。例如，已報(bào)道了其中使用DNA 標(biāo)記第二抗體并使用聚合Sm式反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增DNA的方法。這種擴(kuò)增后 的該DNA被檢測(cè)并隨后與所測(cè)量的蛋白質(zhì)濃度相關(guān)聯(lián)。在另一變型中， 用金納米顆粒標(biāo)記第二抗體，然后(通過(guò)非電沉積)將金屬銀沉積在金納 米顆粒上，從而產(chǎn)生放大的吸光度信號(hào)。對(duì)這兩種情況而言，放大步驟本 身都向測(cè)定中引入噪音，并且需要額外的時(shí)間，通常是大量的時(shí)間。
>使用納米顆粒的本文^^開的方法和系統(tǒng)優(yōu)于所述現(xiàn)有技術(shù)方法的另 一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是現(xiàn)有技術(shù)方法均不^_數(shù)字的，即這些方法均不涉及實(shí)際計(jì)數(shù)蛋 白質(zhì)數(shù)量，而是測(cè)量相對(duì)信號(hào)，如熒光或吸光度。這意味著它們必須被校 準(zhǔn)。相反， 一旦表征了通過(guò)本文公開的方法和系統(tǒng)(其使用金屬納米顆粒 作為標(biāo)記化合物)進(jìn)行的測(cè)定，則不需要校準(zhǔn)，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的計(jì)數(shù)產(chǎn)生能 夠與蛋白質(zhì)濃度相關(guān)聯(lián)的絕對(duì)數(shù)。
該應(yīng)用對(duì)于蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域中的檢測(cè)(圖21和22)和/或檢測(cè)以極 低濃度存在于小體積樣品(例如一滴血)中的生物標(biāo)志物(圖19和20) 而言是尤其有利的。
在另一些實(shí)施方案中，本文公開的任何方法和系統(tǒng)中的襯底可與微 流體組件相關(guān)聯(lián)，從而允許進(jìn)行基于微流體的測(cè)定?；谖⒘黧w的測(cè)定提 供下述優(yōu)點(diǎn)，例如如減小的樣品和試劑體積以及縮短的測(cè)定時(shí)間(Breslauer， D. N.; Lee, P. J.; Lee， L. P. Mo/.丑,V &對(duì).2006， 2， 97-112)。例如，在某些操 作條件下，表面結(jié)合測(cè)定動(dòng)力學(xué)主要由分析物(蛋白質(zhì))濃度和分析物/ 抗原親和力決定，而不是由擴(kuò)散決定(Zimmermann， M.; Delamarche, E.;Wolf, M.; Hunziker, P. 5,V nierf/ai/Af/cn^ev/c^ 2005,7, (2)， 99國(guó)1 10)。
本文使用術(shù)語(yǔ)"微流體"是指含有微流體構(gòu)件的組件或系統(tǒng)，例如 通常以微米或亞微米尺度制造的通道和/或腔室。例如，典型的通道或腔室 具有至少一個(gè)為約0.1微米到約1500微米、更通常為約0.2微米到約1000 微米、更通常為約0.4微米到約500微米的橫截面尺寸(cross-sectional dimension),個(gè)，流體構(gòu)件通常載有非常少量的流體，例如從約10納升 到約5亳升，更通常從約100納升到約2亳升，進(jìn)一步更通常從約200納 升到約500微升，或仍然更通常從約500納升到約200微升。
所述微流體組件可包含在集成設(shè)備(integrated device)中。本文使用 "集成設(shè)備"是指具有兩個(gè)(或更多)組件的設(shè)備，所述組件在物理上和 操作上組合在一起。組件可以(完全或部分地)彼此獨(dú)立制造并在其(完 全或部分)制it^組合，或者所述集成設(shè)備可制成該集成設(shè)備中包含不同 的組件。集成的微流體陣列(microfluidic array)設(shè)備包含與微流體組件組合 的陣列，其中該微流體組件和陣列組件彼此可操作地相關(guān)聯(lián)，從而該陣列 組件的陣列襯底與微流體組件的微流體構(gòu)件流體連通。微流體組件是這樣 的組件，其包含微流體構(gòu)件，并且適于與陣列組件可操作J^目關(guān)聯(lián)。陣列 組件是包含襯底并適于與微流體組件可^Mt^M目關(guān)聯(lián)的組件。
也可以以模塊形式提供微流體系統(tǒng)。"模塊"描述了這樣的系統(tǒng)或設(shè) 備，其具有多種用于一起使用的標(biāo)準(zhǔn)化組件，其中一類組件的多種不同實(shí) 例之一可被替換為同類組件中的另 一種，以改變系統(tǒng)或設(shè)備的功能或能 力；在這樣的系統(tǒng)或設(shè)備中，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化組件都是一個(gè)"模塊"。
進(jìn)行微流體測(cè)定的本文公開的方法和系統(tǒng)的示例性實(shí)施方案在實(shí)施 例10和11中描述并示于圖13和14。
在本文公開的方法和系統(tǒng)的微流體實(shí)施方案中，有可能在極小的樣 品體積中測(cè)量很大的蛋白質(zhì)標(biāo)志物鐠，并可能得到非常低的背景/生物污著
(見圖14)。
在本文公開的方法和系統(tǒng)的微流體實(shí)施方案中，還可以提高測(cè)定的 靈敏度，以檢測(cè)濃度低至10fM的耙標(biāo)，包括先前認(rèn)為在任何其他技術(shù)的 檢測(cè)水平以下的生物標(biāo)志物(例如Ajk清中的蛋白質(zhì))。
在示例性的實(shí)施方案中，通過(guò)以下步驟獲得這樣的結(jié)果提高襯底的載荷能力和使用以用于檢測(cè)的金屬納米顆粒標(biāo)記的抗體，然后進(jìn)行非電
沉積沉積(見實(shí)施例11和圖14(c))。
另外，因?yàn)樵谑纠缘膶?shí)施方案中，在本文公開的方法和系統(tǒng)中使 用空間的而不是比色的多路化，所以可將基于熒光的讀數(shù)轉(zhuǎn)化為光學(xué)讀 數(shù)。因此，本文公開的微流體方法和系統(tǒng)允許對(duì)測(cè)定進(jìn)行光學(xué)讀數(shù)，這比 相應(yīng)的現(xiàn)有方法和系統(tǒng)靈敏100-1000倍(見圖14)。因此，本文公開的微 流體方法和系統(tǒng)的又一優(yōu)點(diǎn)是，有可能使用所述方法和系統(tǒng)作為數(shù)字技 術(shù)，即通過(guò)單分子計(jì)數(shù)來(lái)定量檢測(cè)蛋白質(zhì)的技術(shù)。這種應(yīng)用尤其有利于蛋 白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的檢測(cè)(圖14)和/或以極低濃度存在于小體積樣品(例如 一滴血)中的生物標(biāo)志物的檢測(cè)。
因此，與用于分子檢測(cè)的相應(yīng)的現(xiàn)有微流體方法和系統(tǒng)以及其他非 微流體方法和系統(tǒng)相比，本文公開的微流體方法和系統(tǒng)允許在減少的時(shí)間 量中使用尺寸減小的樣品以更高的靈^t度進(jìn)行(i)單步驟測(cè)定(其中多核苷 酸編碼抗體、靶標(biāo)和經(jīng)標(biāo)記的抗體在單個(gè)步驟中接觸)和(ii)多步驟測(cè)定(其 中襯底先后與多核普酸編碼抗體、耙標(biāo)接觸，隨后與第二抗體接觸)(見 實(shí)施例11和12 )。
與本文公開的微流體方法和系統(tǒng)相關(guān)聯(lián)的另 一個(gè)優(yōu)點(diǎn)包括，有可能 在微流體環(huán)境中進(jìn)行涉及以襯底支持的抗體的任何測(cè)定，它們?cè)谑褂孟惹?的技術(shù)時(shí)無(wú)法承受微流體芯片的裝配。
與本文公開的方法和系統(tǒng)有關(guān)的另 一些優(yōu)點(diǎn)是有可能使用低成本 試劑如玻璃和塑料進(jìn)行靈敏的測(cè)量；有可能將襯底與用于樣品預(yù)處理和純 化的其他組件組合使用。
本文公開的方法和系統(tǒng)允許進(jìn)行目的生物標(biāo)志物的多路多參數(shù)檢 測(cè)、分選以;M目關(guān)的診斷分析。用于診斷分析的本文方法和系統(tǒng)應(yīng)用的示
例性展示在實(shí)施例14中描述并在圖23和24中展示，還有技術(shù)人員閱讀本 公開內(nèi)容后可識(shí)別的任何其他測(cè)定。
本文公開的系統(tǒng)可以以陣列或試劑盒的形式提供。陣列有時(shí)稱作"微 陣列"，是指可尋址區(qū)域的任何一維、二維或三維排列，所述區(qū)域帶有與 該區(qū)域相關(guān)聯(lián)的特定分子。通常特征性的特征尺寸為微米。圖4、 5、 6、 7、 8、 9和10提供了示例性的微陣列。在試劑盒中，多核普酸編碼蛋白質(zhì)和襯底獨(dú)立地包含在試劑盒中。 多核普酸編碼蛋白質(zhì)包含在一種或多種組合物中，各多核苷酸編碼蛋白質(zhì)
與合適的載體(vehicle)、運(yùn)載體(carrier)或輔助劑(auxiliary agent) 一起包含在組合物中。
系統(tǒng)中提供的襯底可帶有附著于該襯底的多核苷酸。在一些實(shí)施方 案中，襯底多核苷酸還可作為試劑盒的額外組件提供。額外組件可包括經(jīng) 標(biāo)記多核普酸、經(jīng)標(biāo)記抗體、標(biāo)記、微流體芯片、參比標(biāo)準(zhǔn)品，以及技術(shù) 人員閱讀本公開內(nèi)容后可識(shí)別的額外組件。具體地，試劑盒的組件可與合 適的使用說(shuō)明和其他必需試劑一起提供，以進(jìn)行本文公開的方法。試劑盒 通常在獨(dú)立的容器中含有組合物。試劑盒中通常包含用于進(jìn)行測(cè)定的說(shuō)明 書，例如紙或電子載體如磁帶或CD-ROM上的文字或音頻說(shuō)明書。根據(jù) 使用的具體方法，試劑盒也可含有其他包裝在內(nèi)的試劑和材料(即洗滌緩 沖液等等)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀4^>開內(nèi)容后可識(shí)別涉及鑒定組合物的合適運(yùn) 載體試劑(carrier agent)或輔助劑以及試劑盒的一般制造和包裝的其他 細(xì)節(jié)。
本文公開的方法和系統(tǒng)在以下的實(shí)施例中進(jìn)一步闡述，其以說(shuō)明性 方式提供，而不旨在限制。
實(shí)施例l:產(chǎn)生以多核苷酸編碼的抗體
根據(jù)圖1所示的兩步驟策略產(chǎn)生以DNA編碼的抗體。具體地，使用 市售試劑通過(guò)琥珀酰亞胺化學(xué)反應(yīng)向5-胺化的寡核香酸中引入醛官能團(tuán) (圖1圖a)。類似地，通過(guò)與相應(yīng)抗體中賴氨酸側(cè)鏈的反應(yīng)引入酰肼部分(圖 1圖a)。然后通過(guò)醛和酰肼官能團(tuán)之間的化學(xué)當(dāng)量的腙鍵形成來(lái)促進(jìn)DNA-抗體綴合物形成。 通過(guò)PAGE電泳,綴合物形成并控制DNA載荷(圖 l圖b)'
為了進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)，從Invitrogen購(gòu)買用AlexaFluor 488、 594和 647標(biāo)記的多克隆山羊抗人IgG。單克隆兔^A白介素-4 (克隆8D4-8)、 無(wú)熒光的和APC標(biāo)記的兔抗人肺瘤壞死因子-a (分別為克隆MAbl和 MAbll )，以及無(wú)熒光的和PE標(biāo)記的兔抗人干擾素-Y (分別為克隆NIB42
實(shí)施例和4S,B3)均購(gòu)自eBioscience。無(wú)熒光的和生物素標(biāo)記的小鼠抗人白介素 -2 (分別為克隆5344.111和B33-2 )購(gòu)自BD Biosciences,所有的DNA鏈 均以帶有5'-tJ^修飾的形式購(gòu)自Midland Certified Reagent公司。所有六 個(gè)26聚體及其相應(yīng)的命名在下表1中與各自的名稱/標(biāo)識(shí)符一起給出，通 過(guò)所述名稱/標(biāo)識(shí)符將序列列于附帶的序列表中。
表l
名稱/標(biāo)識(shí)符序列
SEQIDNO，Al: 5，-MH2-AAAAAAAAAACGTGACATCATGCATG-3，
SEQI關(guān)0 23'-GCACTGTAGTACGTACAAAAAAAAAA隱NH2-5，:Al，
SEQ1DN0 3B1: 5，-NH2-AAAAAAAAAAGGATTCGCATACCAGT-3，
SEQ〖DN043,-CCTAAGCGTATGGTCAAAAAAAAAAA-NH2-5，:B 1 ，
SEQ ID NO 5CI: 5，-NH2-AAAAAAAAAATGGACGCATTGCACAT-3，
SEQ ID NO 63，-ACCTGCGTAACGTGTAAAAAAAAAAA-NH2-5，:Cl，
使用前將所有的抗體脫鹽，將緩沖液更換為pH 7.4 PBS，并使用3000 MWCO離心濾器(MilliporeTM)將其濃縮至 lmg/ml。
將酰肼基團(tuán)平行引入單克隆抗體中，并從5'胺化的寡聚體制備5'醛 修飾的單鏈DNA (見圖1的圖a)。
具體地，以琥珀酰4-肼基煙酸丙酮腙(succinimidyl 4國(guó)hydrazinonicotinate acetone hydrazone， SANH, SolulinkT"對(duì)抗體不同 的i爾過(guò)量(1000:1到5:1)向抗體中添加DMF中的SANH。藉此改變引 入抗體的酰肼基團(tuán)數(shù)。獨(dú)立地以20倍摩爾過(guò)量向PBS中5'胺化的26元寡 聚體中添加DMF中的琥珀酰4-甲酰基苯甲酸酯(succinimidyl 4-formylbenzoate, SFB， SolulinkTM)。 SFB與DNA的這種比例確保5'胺基 完全反應(yīng)產(chǎn)生5'醛。在室溫下4小時(shí)后，所述抗體以及寡核苷酸偶^i^應(yīng) 二者均未觀察到產(chǎn)率的進(jìn)一步提高。去除過(guò)量的SANH和SFB，并使用蛋 白脫鹽離心柱(PierceTM)將樣品的緩沖液更換為pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液。然后將20倍過(guò)量的衍生化DNA與抗體結(jié)合，并允許在室溫下反應(yīng) 過(guò)夜，形成圖1的圖b中顯示的DNA編碼的抗體。用尺寸排阻離心柱 (Bio國(guó)Gel P-30, Bio國(guó)RadTM)去除未偶聯(lián)的DNA,或4吏用Pharmacia Superdex 200凝膠過(guò)濾柱在0.5 ml/分鐘的PBS等強(qiáng)度流(isocratic flow)下純化。 在60t:的寬松變性條件下用非還原性7.5% Tris-HCl SDS-PAGE驗(yàn)證 DNA-抗體綴合物的合成5分鐘，并用Molecular Imager FX凝膠掃描儀 (Bio-Rad)顯影。使用適當(dāng)?shù)腲和發(fā)射濾光片，類似iW涉及熒光抗體或 熒光標(biāo)記寡核苷酸的綴合>^應(yīng)進(jìn)行成4象。
通過(guò)凝膠遷移率變動(dòng)測(cè)定來(lái)測(cè)量^A IL-4上不同寡聚體(鏈Al，) 的載荷)(見圖1的圖b )。通過(guò)改變SANH與抗體的化學(xué)計(jì)量比(泳道I-IV 分別對(duì)應(yīng)于300:1、 100:1、 50:1、 25:1)，可以控制平均附著寡核普酸數(shù)。
值得注意的是，盡管上述綴合物合成方法預(yù)計(jì)導(dǎo)致針對(duì)每個(gè)抗體的 DNA載荷分布，但是該作用可受到進(jìn)行PAGE分析的方法的影響。尤其 觀察到，凝膠電泳之前的熱誘導(dǎo)變性的正常條件(100°5分鐘)降低了顯 影的DNA鏈數(shù)量，這可能是由于DNA與蛋白質(zhì)之間的腙鍵斷裂所致。通 it^:松變性條件，在60°加熱5分鐘(良好皿所需最小值)的樣品顯示 至多7條離散的條帶，而在100。加熱5分鐘的相同樣品顯示沒(méi)有附加的寡 核苷酸。
實(shí)施例2:生產(chǎn)多核苷酸編碼的鏈霉親和素
DNA編碼的鏈霉親和素的產(chǎn)生根據(jù)實(shí)施例1中所述的用于生產(chǎn) DNA編碼的抗體相同的途徑進(jìn)行。唯一的區(qū)別是SANH:鏈霉親和素比例 維持恒定為100:1。
實(shí)施例3:優(yōu)化多核苷酸編碼抗體的多核苷酸載荷
進(jìn)行多種測(cè)定時(shí)要考慮用寡核苷酸標(biāo)記抗體時(shí)的不利空間效應(yīng)，所 述測(cè)定例如本文所述的免疫測(cè)定和細(xì)胞分i^/捕獲實(shí)驗(yàn)。為此，研究了 DNA 所編碼的抗體保持識(shí)別細(xì)胞表面標(biāo)志物的能力，通過(guò)熒光活化細(xì)胞分選 (FACS)來(lái)顯現(xiàn)。通過(guò)使用共價(jià)標(biāo)記在DNA上而不是抗體上的熒光團(tuán)，使 用FACS對(duì)多核苦酸編碼的綴合物優(yōu)化DNA載荷。為進(jìn)行該分析，以 SANH與抗體的不同化學(xué)計(jì)量比(5:1、 25:1、 50:1、 100:1、 300:1)將5' 胺化的、3'FITC標(biāo)記的DNA標(biāo)記在抗CD90.2抗體上。這平均產(chǎn)生了分別具有1、 2、 3、 4-5和6-7條FITC-DNA鏈的綴合物，如通過(guò)劍歐遷移 率測(cè)定所測(cè)量的，見圖1的圖d。通過(guò)用流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)FITC熒光，測(cè) 試這些綴合物結(jié)合T細(xì)胞系VL3 (表達(dá)CD卯.2)的能力。使用B細(xì)胞系 A20 (CD卯.2陰性)作為陰性對(duì)照(見圖3圖a和b )。
具體地，將VL3和A-20細(xì)胞在水上與0.5 ng FITC-綴合的大鼠抗小 鼠CD90.2 (Thyl .2, BD Pharmingen,克隆30-H12,目錄號(hào)553012)在100 HL PBS-3% FCS中孵育20分鐘。還用等摩爾量的抗CD90.2/FITC-DNA 綴合物孵育細(xì)胞，所述綴合物特征是不同的FITC-DNA載荷。用PBS-3% FCS將細(xì)胞洗滌一次，然后在運(yùn)行BD FACSDivaTM軟件的BD FACSCantoTM設(shè)備上通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。
結(jié)果在圖3中顯示，其中顯示了將抗CD卯，2/FITC-DNA綴合物與 市售FITC抗CD卯.2抗體(無(wú)DNA)進(jìn)行比較的FACS曲線(圖a)和 直方圖(圖b)。
如圖3所示，該綴合物結(jié)合VL3細(xì)胞(100%),與A20具有4艮小的 非特異性相互作用(1.3%)。與FITC抗CD90.2相比，總體熒光強(qiáng)度下降 10倍，與A20的非特異性結(jié)合則稍高。圖b所示針對(duì)多種FITC-DNA載 荷的平均熒光強(qiáng)度的直方圖顯示，當(dāng)DNA鏈的數(shù)量從1提高至2至3時(shí) 熒光強(qiáng)度大致是線性的，對(duì)應(yīng)于l、 2和3個(gè)生色團(tuán)(每Ml個(gè))。對(duì)更 高的載荷而言。熒光^1穩(wěn)定的，然后下降。
具體地，在更高的載荷下，熒光的增加首先穩(wěn)定(4-5寡聚體)然后 降低直至最高載荷(6-7寡聚體)。因此，過(guò)量的DNA標(biāo)記(4-7寡聚體) 確實(shí)在空間上降低了抗體識(shí)別細(xì)胞表面標(biāo)志物的能力。用50:1的SANH: 抗體比例(對(duì)應(yīng)于約每個(gè)抗體三條DNA鏈)合成的抗體實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞表 面標(biāo)志物識(shí)別而言的最佳載荷?？紤]這一觀察結(jié)果而進(jìn)行了隨后的細(xì)胞分 選實(shí)驗(yàn)。與FITC抗CD90,2對(duì)照相比，DNA抗體綴合物具有減少了 10 倍的熒光和對(duì)A20細(xì)胞稍高的非特異性結(jié)合。 一個(gè)可能的因素是對(duì)于DNA 抗體綴合物和市售抗體而言，熒光團(tuán)與抗體的化學(xué)計(jì)量比是不同的。對(duì) DNA抗體綴合物而言，DNA的每糸^;僅附著于一個(gè)熒光團(tuán)(即帶有一條 DNA鏈的綴合物具有1:1的熒光團(tuán):抗體比例)，而市售抗體通常每個(gè)抗體 具有多于一個(gè)熒光團(tuán)(即熒光抗體具有>1的熒光團(tuán):抗體比例)。
因此，減少了 IO倍的熒光不應(yīng)被嚴(yán)格解釋為DNA抗體綴合物親和力減少了 10倍，盡管上文討論的寡聚體空間效應(yīng)確實(shí)有可能解釋相對(duì)熒光
強(qiáng)度的一部分降低。與相應(yīng)的未修飾抗體相比，使用如表面等離振子共振
(SPR)的方法直接測(cè)量DNA抗體綴合物的親和力能夠提供更多的結(jié)論性信 息。
如下進(jìn)行多核苷酸編碼抗體的多核苷酸載荷的進(jìn)一步優(yōu)化。研究了 兩種不同長(zhǎng)度的互補(bǔ)多核苷酸。 一組具有16個(gè)堿基的重疊，另一組具有 20個(gè)威基的重疊。根據(jù)以下實(shí)施例8中所示方法，針對(duì)16或20個(gè)的組設(shè) 計(jì)互不影響的DNA序列，并且根據(jù)經(jīng)騶，發(fā)現(xiàn)，16個(gè)威基不具有可能產(chǎn)生 大量互不影響序列數(shù)的序列總數(shù)變異性。在轉(zhuǎn)向20個(gè)威基時(shí)，可能序列的 原始庫(kù)顯著增加，并且計(jì)算互不影響序列似乎容易得多。應(yīng)當(dāng)注意，可能 序列的總數(shù)是指數(shù)性的(4n,其中n是互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度)。
實(shí)施例4:制it微陣列
用Institute for Systems Biology (ISB-Seattle， WA)的微陣列^殳施通過(guò) 標(biāo)準(zhǔn)方法將DNA微陣列印制在包被胺的載玻片上。具體地，印制具有多 種寡聚體組合的DNA微陣列，所述寡聚體具有序列SEQ ID NO 2、 SEQ ID NO 4、 SEQ ID NO 6、 SEQ ID NO 8、 SEQ ID NO 10、 SEQ ID NO 12、 SEQ ID NO 14、 SEQ ID NO 16和SEQ ID NO 18。
典型的點(diǎn)大小和間隔分別為150和500nm。多聚賴氨酸玻片是自制 的。在超聲浴中用IPA和7jCl^空白的載玻片清潔10分鐘。然后在150 W 下用氧等離子體將其處理60秒，然后迅速浸入去離子水中，產(chǎn)生硅醇末端 的高親7jC表面。用氮噴槍將其干燥后，用多聚-L-賴氨酸溶液(Sigma P8920, 0.1%w/v，未稀釋)應(yīng)用于所述經(jīng)等離子體處理的表面15分鐘，然后用去
離子水沖洗數(shù)秒。最后，將這些處理過(guò)的玻片在6or;烘烤i小時(shí)。然后將
這些玻片送至ISB并如上所述進(jìn)行印制。
實(shí)施例5:基于以多核苷酸編碼的抗體的單^lt免疫測(cè)定
圖5是使用DNA編碼的鏈霉親和素進(jìn)行細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)的一個(gè)實(shí)例。 這時(shí)，首先以4:1的生物素-MHC: DNA所編碼鏈霉親和素的比例，將DNA 所編碼鏈霉親和素與其配體生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)接觸。在此，所述蛋白質(zhì) 是主要組織相容性復(fù)合體(MHC)。淘洗對(duì)應(yīng)方案和溶液相細(xì)胞捕獲實(shí)驗(yàn)二 者平行進(jìn)行。具體地，將5 nl鏈霉親和素-C3'與20 nl酪氨酸酶MHC組合在200filRPMI培養(yǎng)基中。使它們?cè)谒涎b配20分鐘。之后，對(duì)淘洗對(duì)應(yīng) 方案而言，使四聚體與襯底結(jié)合30分鐘并在PBS中沖洗，隨后使2xl06 個(gè)細(xì)胞與陣列接觸。在圖b中，首先允許DNA編碼的MHC與相同數(shù)量 的細(xì)胞在水上結(jié)合20分鐘，之后與下層DNA陣列接觸。兩組之間的細(xì)胞
捕獲效率是明顯的。pMHC復(fù)合體的溶、;^目捕獲比淘洗對(duì)應(yīng)方案高得多。
值得注意的是，后一組事件的細(xì)胞捕獲效率提高。
實(shí)施例6:包含以多核苷酸編碼的抗體的蛋白質(zhì)陣列
使用三種相同的山羊抗人IgG來(lái)展示用于空間定位抗體的多核苷酸 編碼蛋白質(zhì)方法，所述三種IgG各自帶有不同的分子熒光團(tuán)并且各自以獨(dú) 特的DNA鏈編碼。然后向用互補(bǔ)寡核苷酸點(diǎn)樣的微陣列上引入含有所有 三種抗體的溶液。雜交兩個(gè)小時(shí)并進(jìn)行村底沖洗后，抗體根據(jù)
Watson-Crick >5^配對(duì)進(jìn)行自裝配。
具體地，如下產(chǎn)生抗體微陣列首先用0.1% BSA在3xSSC中將 DNA玻片在37匸下封閉30分鐘。用dH20洗滌玻片并吹干。含有DNA-抗體綴合物的30nl溶液(3xSSC、 0.1%SDS、 0.1%BSA、 15ng/nl各種 綴合物)夾在顯微鏡載玻片與陣列之間，并在37X:孵育4小時(shí)。然后于37 匸下首先在1 x SSC、0.05% SDS中洗滌陣列并柔和攪動(dòng)，然后在0.2 x SSC 中、最后在0.05 x SSC中洗滌。將玻片吹干并用Gene Pix 4200 A雙色陣 列掃描儀(Axon InstrumentsTM)掃描。
對(duì)免疫測(cè)定而言，在單個(gè)試管中組合DNA編碼的第一抗體(15 ng/pl)、抗原(3 ng/fil)和熒光標(biāo)記的第二抗體(0.5 ng/ji1)。在37"C孵育2小 時(shí)后，如上文實(shí)施例3中所述將形成的抗體-抗原-抗體復(fù)合體引入微陣列 中。隨后的洗滌步驟和顯影是相同的。
具體地，分別用寡聚體A1'、 Bl'和Cl'標(biāo)記三種在生物化學(xué)方面相 同的山羊抗人IgG (用Alexa488、 Alexa594或Alexa 647染料標(biāo)記)。孵育 2小時(shí)后，將抗體/DNA綴合物定位于下層DNA微陣列指示的特定位點(diǎn)。
結(jié)果顯示于圖6和7中，其中顯示了具有標(biāo)度片段的空間編碼蛋白 質(zhì)陣列，所述標(biāo)度片段對(duì)應(yīng)于l mm。如圖7所表明的，抗體與襯底上的 DNA裝配，從而將>卯0個(gè)點(diǎn)的互補(bǔ)DNA芯片轉(zhuǎn)化為多元件抗體微陣列(見 圖7)。該觀察結(jié)果意味著可以用類似的方式裝配相當(dāng)大的抗體陣列。實(shí)施例7:減少生物污著
任何蛋白質(zhì)陣列的臨界大小很可能被蛋白質(zhì)非特異性結(jié)合的干擾所限制。在顯現(xiàn)非特異性結(jié)合的影響的嘗試中，向微陣列上相似地引入三種抗體兩種帶有以互補(bǔ)DNA標(biāo)記點(diǎn)樣的寡核苷酸的抗體，第三種是未修飾的抗體。具體地，使微陣列同時(shí)接觸山羊抗人IgG-Alexa488/Al'、山羊抗人IgG-Alexa647/Cl，多核苷酸編碼的綴合物以及不帶有附加的DNA的山羊抗人IgG^Alexa594。
為了展示目的，在雜交后不將玻片徹底沖洗，因此觀察到由非編碼的熒光標(biāo)記抗體的非特異性吸附所引起的高背景信號(hào)。
結(jié)果在圖8中顯示，其顯示了多核苷酸編碼蛋白質(zhì)的方法對(duì)非特異性蛋白質(zhì)吸附的抗性。
當(dāng)陣列未被完4^閉和/或沖洗時(shí)，在載玻片的表面上觀察到非特異性結(jié)合，但是在印制的DNA非互補(bǔ)性點(diǎn)上未觀察到，即B1點(diǎn)沒(méi)有來(lái)自非互補(bǔ)性IgG綴合物的熒光，也不顯示來(lái)自未以DNA編碼的蛋白質(zhì)(山羊抗人IgG-Alexa594)的熒光。
抗體未進(jìn)行化學(xué)編碼的點(diǎn)樣核苷酸區(qū)逸艮示少得多的非特異性附著蛋白質(zhì)，意味著DNA大幅減小了活躍區(qū)域的生物污著。這樣的生物污著阻滯讓人容易聯(lián)想到以聚乙二醇(PEG)功能化的襯底(Prime, K. L.;Whitesides， G. M. Science 1991, 252， 1164-1167. Prime, K. L.; Whitesides,G. M. J. Am. Chem. Soc. 1993,115， (23), 10714 - 10721)。與PEG相關(guān)的推定機(jī)制進(jìn)行類比(Jeon, S. I.; Lee, J. H.; Andrade, J. D.; De Ge腿s， P. GJournal of Colloid and Interface Science 1991， 142， (1)， 149- 158. Jeon， S. I.;Andrade, J. D. Journal of Colloid and Interface Science 1991, 142， (1)，159-166. Andrade, J. D.; Hlady, V. Advances in Polymer Science 1986, 79，(1- 63))，申請(qǐng)人推測(cè)點(diǎn)樣寡核苷酸的親水特性與非特異性吸附期間經(jīng)常暴露的蛋白質(zhì)疏7jC部分的相互作用最小化。還在計(jì)算的雙鏈體解鏈溫度的5度以內(nèi)進(jìn)行了綴合物雜交實(shí)驗(yàn)，利用Watson-Crick嚴(yán)格性并從而消除了非特異性的DNA相互作用。在任何情況下，這種減少的生物污著意味著多核苷酸編碼蛋白質(zhì)方法很可能能夠用于在單一環(huán)境中檢測(cè)相當(dāng)大的蛋白質(zhì)組合。實(shí)施例8:以計(jì)算機(jī)進(jìn)行多核苷酸無(wú)關(guān)化處理
另 一個(gè)重要的經(jīng)驗(yàn)性考量是非互補(bǔ)性DNA鏈之間的相互干擾(cross talk)水平。DNA序列A1、 Bl和Cl與其互補(bǔ)體一起隨機(jī)產(chǎn)生。惟一的限 制是包含用于實(shí)現(xiàn)靈活性(flexibility)的5， A1()區(qū)段和16個(gè)威基的識(shí)別長(zhǎng)度。 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)存在少量但是可感知的噪音，所述噪音來(lái)自由于非線性 二IM目互作用而錯(cuò)配的序列。僅使用嚴(yán)格洗滌不能明顯清除噪音。在任何 現(xiàn)實(shí)的多M平臺(tái)中，該噪音都可與研究中的M數(shù)量成比例地增加。因 此，模型平臺(tái)應(yīng)當(dāng)利用這樣的DNA序列，所述序列彼此互不影響并且與 印制在DNA陣列上的所有暴露的互補(bǔ)鏈互不影響。
因此，以在37"C下所述序列與互補(bǔ)耙標(biāo)之間的任何分子內(nèi)和分子間 相互作用最小化為目標(biāo)來(lái)設(shè)計(jì)DNA序列。使用Dirks等(Dirks， R. M.; Lin, M.; Winfree， E.; Pierce， N. A. Nucleic Acids Research 2004， 32， (4), 1392-1403)描述的范例進(jìn)行計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)。具體地，設(shè)計(jì)并根據(jù)經(jīng)驗(yàn)發(fā)汪了 六個(gè)互不影響的序列，并在表2中才艮道。
表2
編碼多核苷酸 相應(yīng)的基質(zhì)多核苷酸 .
SEQ翻0:7 ,aaaaaaaaaaatcctggagctaagtccgtaSEQ!DNO:8 a今aaaaaaaatacggActtagctccaggat
SEQ翻0:9 aaaaaa'aaaagcctcattgaatcatgcctaSE(JiDNO:lO aaaaaaaaaataggcatgattcaatgaggc
SEQIDNO:II aaaaaaaaaaagcactcgtctactatcgctaSEQIDNO:12 aaaaaaaaaatagcgatagtagacgagtgc
SEQDN0:.13 aaaaaa人aaaatggtcgagatgtcagagtaSEQ圃O(shè): 14 aaaaaaaaaatactctgacatctcgaccat
SEQDNO:15 aaaaaaaaaaatgtgaagtggcagtatctaSE辨NO: 16 aaaaaaaaaatagatactgccacttcacat
SEQ翻O:H 'aaaaaaaaaaatcaggta.aggttcacggtaSEQIDNO:I8. ' aaaaaaaaaattaccgtgaaccttacctgat
技術(shù)人員能夠在閱讀本公開內(nèi)容后識(shí)別其他的無(wú)關(guān)化處理多核苷
實(shí)施例9:細(xì)胞捕獲、分離和分選方法通過(guò)使用DNA標(biāo)記的抗體來(lái)展示多核苷酸編碼蛋白質(zhì)用于多路細(xì) 胞分選的優(yōu)化和用途。
使用標(biāo)準(zhǔn)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)方案將兩種鼠細(xì)胞系VL-3 T細(xì)胞(胸腺淋 巴瘤細(xì)胞系(Groves, T.; Katis， P.; Madden, Z.; Manickam， K.; Ramsden, D.; Wu, G; Guidos, C. J. J. Immunol. 1995,154， 5011-5022))和A20 B細(xì)胞 (小鼠B細(xì)胞淋巴瘤(Kim, K. J.; Langevin， C. K.; Merwin, R. M.; Sachs, D. H.; Asfsky, R. J. Immunol. 1979， 122, 549-554)，購(gòu)自ATCC )設(shè)計(jì)為分 別表達(dá)mRFP和EGFP。如上所述，將針對(duì)這些細(xì)胞系各自表面標(biāo)志物的 抗體(VL-3為抗CD卯.2， A20為抗B220(eBioscience))分別以DNA鏈 Al'和Bl'編碼。
對(duì)分選實(shí)驗(yàn)而言，以106個(gè)細(xì)胞/100 nl培養(yǎng)基的濃度將細(xì)胞傳代至 新鮮的培養(yǎng)基[RPMI .1640 (ATCC)，補(bǔ)充有10%胎牛血清、0.1 mM非必 需氨基酸和0.05 mM p-巰基乙醇，并與DNA-抗體綴合物(0.5照/100 pi) 在冰上孵育30分鐘。離心后從上清液中去除過(guò)量的綴合物，之后將細(xì)胞重 懸于新鮮培養(yǎng)基中。細(xì)胞孵育之前，通過(guò)將殘余胺基與pH = 7.4PBS中10 mM甲基-PEOu-NHS酯(Pierce)在室溫下反應(yīng)4小時(shí)而將微陣列玻片鈍化， 以減少非特異性的細(xì)胞粘附。將細(xì)胞均勻地涂在微陣列表面上，并使其在 水上定位1小時(shí)。這段時(shí)間過(guò)后，在室溫下用含1 mMMgCl2的Tris緩沖 鹽溶液輕柔洗滌，去除未粘附細(xì)胞。同樣地進(jìn)行細(xì)胞富集實(shí)驗(yàn)，只是孵育 步驟在T細(xì)胞和B細(xì)胞(各106個(gè)/100 nl) 二者的1:1混合物存在下進(jìn)行。
使用標(biāo)準(zhǔn)磁珠負(fù)選擇方案和BD IMagTM細(xì)胞分離系統(tǒng)，分別從 EGFP和dsRed轉(zhuǎn)基因小鼠(得自Jackson Laboratories )中純化原代CD4+ 和CD8+T細(xì)胞。在基于多核苷酸編碼的分級(jí)前，通過(guò)FACS分析這些群 體的純度，發(fā)現(xiàn)其高于80%。
與先前所述類似，在PEG化的微陣列機(jī)制上同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞、基因和 蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)。
簡(jiǎn)言之，在用抗B220-B1， (0.5 ng/100 pl)標(biāo)記后，將表達(dá)GFP的B 細(xì)胞(106個(gè)/100 jil)定位于Bl點(diǎn)上。去除未粘附的細(xì)胞后，將帶有Cl'編碼 的第一抗體和APC標(biāo)記的第二抗體的TNF-a ELISA對(duì)與0.5 ng/pl FITC 標(biāo)記的A1'—起引入，并使其在室溫下雜交30分鐘。然后用TBS+MgCl2 沖洗玻片并通過(guò)亮視野和熒光顯微術(shù)顯影。平行進(jìn)行均質(zhì)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和淘洗細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。對(duì)均質(zhì)細(xì)胞捕獲過(guò)程而言，
將5 x 106個(gè)Jurkats (ATCC)與5照抗CD3/C3'綴合物一起懸浮在1 ml RPMI培養(yǎng)基中，并在冰上孵育l小時(shí)。通過(guò)離心去除過(guò)量的綴合物，并 將Jurkats重懸于200 fil新鮮培養(yǎng)基中，之后與DNA微陣列接觸。在冰 上孵育1小時(shí)后，用TBS柔和地沖洗玻片。平行進(jìn)行細(xì)胞淘洗實(shí)驗(yàn)；在水 上將1 ml RPMI中5 jig抗CD3/C3，綴合物在微陣列上孵育1小時(shí)，之后 在0,5xpBS中沖洗，然后在去離子水中沖洗。不要吹干玻片，而是輕叩 玻片，以去除大多數(shù)過(guò)量的溶液，保持陣列濕潤(rùn)。在冰上將Jurkats (5x 106個(gè)/200 jiL)立即置于陣列上1小時(shí)。隨后的洗滌和顯影步驟是相同的。
這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖10，其中圖a和b顯示亮視野圖像，其顯示 根據(jù)本文公開的方法和系統(tǒng)的實(shí)施方案的均質(zhì)細(xì)胞捕獲過(guò)程的效率。
具體地，在圖a中描述了均質(zhì)測(cè)定，其中將以DNA標(biāo)記的抗體與細(xì) 胞組合，然后將混合物引入點(diǎn)樣的DNA陣列微芯片上。在圖b中，首先 在點(diǎn)樣的DNA陣列上裝配以DNA標(biāo)記的抗體，然后引入細(xì)胞。這些異質(zhì) 過(guò)程與使用表面結(jié)合抗體誘捕特定細(xì)胞的傳統(tǒng)淘洗方法是類似的。
通過(guò)比較圖a和b中所示結(jié)果，通過(guò)評(píng)價(jià)均質(zhì)細(xì)胞捕獲(溶液相細(xì) 胞捕獲)和非均質(zhì)細(xì)胞捕獲(表面限定細(xì)胞捕獲)，將基于多核普酸編碼 蛋白質(zhì)的細(xì)胞分選與淘洗進(jìn)行比較。均質(zhì)的DNA編碼蛋白質(zhì)方法顯示更 高的細(xì)胞捕獲效率。
捕獲效率的提高可能是由于若干因素。在均質(zhì)細(xì)胞捕獲中，DNA-抗體綴合物可以正確取向并與溶液中的細(xì)胞表面標(biāo)志物結(jié)合。細(xì)胞捕獲不 是由抗體與細(xì)胞表面標(biāo)志物的相互作用驅(qū)動(dòng)的，而是由多價(jià)DNA-抗體綴 合物與微陣列上互補(bǔ)DNA鏈通過(guò)協(xié)同結(jié)合而提高的親和力驅(qū)動(dòng)的，這大 幅提高了捕獲效率。對(duì)納米顆粒、DNA雜交方案已報(bào)道了類似的趨勢(shì) (Taton， T. A.; Mirkin, C. A.; Letsinger, R. L. Science 2000, 289,1757-1760)。 使用淘洗方法(其與本文公開的非均質(zhì)DNA-抗體定義的陣列相似)時(shí)， 捕獲劑被限制為在表面上采取隨機(jī)方向?？贵w的活性被降低，就是因?yàn)榕c 細(xì)胞表面標(biāo)志物相互作用的不正確取向，降低了最大親和力和與相鄰抗體 的協(xié)作。
在圖c中顯示了多路細(xì)胞分選實(shí)驗(yàn)的亮視野和熒光顯微圖像，其中 表達(dá)hiRTP的T細(xì)胞(紅色通道)和表達(dá)EGFP的B細(xì)胞(綠色通道)的1:1混合物被空間層疊在點(diǎn)Al和Cl上，這兩點(diǎn)分別對(duì)應(yīng)于Al'和CI' 對(duì)抗CD90.2和抗B220抗體的編碼。具體地，在圖10c的實(shí)驗(yàn)中，兩條獨(dú) 特的DNA鏈與分別針對(duì)T細(xì)胞標(biāo)志物CD卯.2 (ThyL2)和B細(xì)胞標(biāo)志物 CD45R (B220)產(chǎn)生的抗體綴合。通過(guò)將表達(dá)單體紅色熒光蛋白(Campbell, R. E.; Tour， O.; Palmer, A. E.; Stdnbach， P. A.; Baird， G S.; Zacharias， D. A.; Tsien, R. Y. iVw. A^/JoiA 2002， 99， 7877-7882) (mRFP)的T細(xì)胞 (VL-3，鼠胸腺淋巴瘤)和表達(dá)EGFP的B細(xì)胞(小鼠B細(xì)胞淋巴瘤) 的1:1混合物空間分離，展示了基于DNA-抗體的多路細(xì)胞分選。將該混 合物與針對(duì)T和B細(xì)胞標(biāo)志物二者的獨(dú)特編碼的DNA-抗體綴合物一起孵 育，并引入適當(dāng)點(diǎn)樣的微陣列。結(jié)果顯示，亮視野和假色熒光顯微照片都 顯示表達(dá)mRFP的T細(xì)胞在點(diǎn)Al富集，而表達(dá)EGFP的B細(xì)胞定位于 Bl，與各自抗體的DNA編碼一致。
在圖d中，展示了從小鼠收集的原代細(xì)胞多路分選的熒光顯微照片。 通過(guò)分別使用以多核苷酸編碼的綴合物抗CD4-A1，和抗CD8-C1，，將來(lái)自 EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠的CD4+細(xì)胞和來(lái)自dsRed轉(zhuǎn)基因小鼠的CD8+細(xì)胞的 1:1混合物分離至點(diǎn)Al和Cl。原代細(xì)胞通常比已建立的細(xì)胞系更加脆弱。 這是由于它們必須從周圍組織中提取出來(lái)(通常通過(guò)酶消化)，這是可導(dǎo) 致生存力降低的過(guò)程。另外，培養(yǎng)過(guò)程常選擇特征是生存力和增殖潛能大 幅提高的克隆。因此， 一般性(generalized)的細(xì)胞分選技術(shù)還必須以最小 的樣品處理適用于原代細(xì)胞。為了展示以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)方法用于 原代細(xì)胞分選的效用，通過(guò)磁性負(fù)排除分別從EGFP-和dsRED-轉(zhuǎn)基因小 鼠中分離CD4+和CD8+ T細(xì)胞的合成混合物。使用抗CD4和抗CD8 DNA-抗體綴合物使混合物成層(stratified)。如圖10d中所示，這兩種細(xì)胞類型 根據(jù)附加的DNA編碼被分離至不同的空間位置。
實(shí)施例10:使用以DNA編碼的抗體與DNA印刷陣列的組合來(lái)進(jìn)行多參 數(shù)多路分析
根據(jù)圖12所示策略進(jìn)行多^lt分析(細(xì)胞、mRNA和蛋白質(zhì))。
圖11顯示了用于細(xì)胞分選以及共檢測(cè)蛋白質(zhì)和cDNA(mRNA)的以 多核苷酸編碼蛋白質(zhì)方法。用不同的DNA寡聚體標(biāo)記針對(duì)蛋白質(zhì)(用于 細(xì)胞分選)的抗體或者其他蛋白質(zhì)(包括細(xì)胞表面標(biāo)志物)。然后將這些 綴合物與生物樣品(細(xì)胞、組織等)組合，在那里它們與其相應(yīng)的抗原結(jié)
46合。引入DNA微陣列上時(shí)，根據(jù)Watson-Crick4^配對(duì)進(jìn)行的平行自裝 配將結(jié)合的物質(zhì)(bound species)定位至特定的空間位置，允許進(jìn)行多路多 錄分析。
進(jìn)行了免疫測(cè)定來(lái)展示本文公開的多核苷酸編碼蛋白質(zhì)檢測(cè)多種靶 標(biāo)(包括化學(xué)性質(zhì)不同的靶標(biāo))的能力。具體地，進(jìn)行該測(cè)定來(lái)檢測(cè)蛋白 靶標(biāo)IL4和多核苷酸B1。為此目的，用多核普酸C1編碼對(duì)蛋白耙標(biāo)IL4 具有特異性的抗體，并制備與多核苷酸B1互補(bǔ)的多核苷酸。如上所述將 與多核苷酸Bl互補(bǔ)的多核普酸和Cl'編碼的抗IL4 一起孵育。特異性結(jié)合 后，引入針對(duì)IL4的熒光團(tuán)第二抗體，并如圖12中所示進(jìn)行蛋白靼標(biāo)IL4 和寡核苷酸Bl的同時(shí)檢測(cè)。
為了強(qiáng)調(diào)圖11所示平臺(tái)的普遍多樣性，將表達(dá)GFP的B細(xì)胞用Bl' DNA編碼的抗體綴合物進(jìn)行標(biāo)記，并空間定位于以互補(bǔ)寡核苷酸編碼的點(diǎn) (Bl)上。細(xì)胞定位后，組合成FITC標(biāo)記的Al， DNA和以Cl，編碼的TNF-a 的免疫夾層，并引入相同的微陣列平臺(tái)中。圖13中所示的所得亮視野和熒 光顯微圖像顯示了本文所公開方法和系統(tǒng)一個(gè)實(shí)施方案的平臺(tái)用于同時(shí) 擴(kuò)展至不同生物學(xué)復(fù)雜性水平的有效性。
具體地，圖13顯示顯微圖像，其顯示了同時(shí)發(fā)生的B1點(diǎn)細(xì)胞捕獲 以及Al與Cl點(diǎn)分別進(jìn)行的基因和蛋白質(zhì)多參數(shù)檢測(cè)。亮視野圖像顯示位 于點(diǎn)Bl的表達(dá)EGFP的B細(xì)胞(綠色通道)、Al處FITC標(biāo)記的(綠色) cDNA，和編碼至Cl的APC標(biāo)記的TNF-a夾層免疫測(cè)定(藍(lán)色)。標(biāo)度 線^J"應(yīng)于300nm。
本文示例的多核苷酸編碼蛋白質(zhì)方法和系統(tǒng)的效率可能是由于使用 了將抗體錨定在襯底上的多核苷酸特異性結(jié)合。用于蛋白質(zhì)檢測(cè)或用于淘 洗細(xì)胞的常規(guī)抗體陣列(Wysocki, L. J.; Sato, V. L.,7Va汰爿cflrf. 1978，75,(6)，2844-2848)需要將抗體固定在醛、環(huán)氧、馬來(lái)酰亞胺或疏水固 體支持物上(Liu， X.; Wang, H.; Herron, J.; Prestwich, Ci, Bioconjugate Chem. 2000,11, (755-761). Macbeath， G; Schreiber, S. L. Science 2000， 289， 1760-1763. Pal5 M.; Moffa, A.; Sreek腿ar， A.; Ethier， S.; Barder， T.; Chinnaiyan, A.; Lubman， D.爿wfl/. C/^附.2006, 78， 702-710. Thirumalapura， N. R.; Morton, R. J.; Ramachandran， A.; Malayef， J. R. Journal of Immunological Methods 2005， 298, 73-81)。由于表面誘導(dǎo)的變性，通常難以保持折疊的(活性的)抗體構(gòu)象，所述變性取決于許多變量，
包括pH、離子強(qiáng)度、溫度和濃度(Sdgel， R. R.; Harder, P.; Dahint, R.; Grunze, M.; Josse, F.; Mrksich， M.; Whitesides， G M.C7i亂1997, 69, 3321-3328. Ramsden， J. J. Chem. Soc. Rev. 1995， 24, 73-78. Fainerman, V. B.; Lucassen-Reynders, E.; Miller, R. Colloids Surf. A1998,143,141)。這 促進(jìn)了對(duì)保持蛋白質(zhì)天然構(gòu)象的替代方法的開發(fā)，包括3維襯底如水皿 和聚丙烯酰胺(Arenkov， P.; Kukhtin, A.; Gemmel, A.; Voloshchuk， S.; Chupeeva, V" Mirzabekov， A. J朋/.及V c/r亂2000， 278， 123-131. Kiyonaka, S.; Sada, K.; Yoshimura， l.; Shinkai， S.; Kato， N.; Hamachi, I. Nature Materials 2004,3, 58-64.)，角質(zhì)酶指導(dǎo)抗體在SAM上的固定(Kwon， Y.; Han， Z.; Karatan， E.; Mrksich, M.; Kay, B. K.爿na/. C7i亂2004， 76, 5713-5720)，和生物素化抗體在鏈霉親和素包被表面上的偶聯(lián)(Peluso, P.; Wilson, D.; Do, D.; Tran, H.; Venkatasubbaiah， M.; Quincy， D.; Heidecker， B.; Poindexter, K.; Tolani， N.; Phelan， M.; Witte, K.; Jung, L.; Wagner, P.; Nock，S.爿/ifl/.祝oc/^附.2003,312,113-124)。另外，陣列在整個(gè)制造過(guò)程中 需要始終維持濕潤(rùn)，以防止蛋白質(zhì)變性(Macbeath， G; Schreiber, S. L. Science 2000， 289， 1760-1763)。另一方面，DNA微陣列通常被靜電吸附(通 過(guò)點(diǎn)樣)在胺表面上。
在同一玻片上同時(shí)檢測(cè)DNA和蛋白質(zhì)的一種選擇可以是在同一襯 底上形成用于固定DNA和蛋白質(zhì)的兩種官能團(tuán)，但這會(huì)顯著提高系統(tǒng)的 復(fù)雜性和設(shè)計(jì)?；蛘?，兼容性表面可以是活化酯載玻片，胺-DNA和蛋白 質(zhì)均可與之共價(jià)附著。然而，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，與印制在共價(jià)制備的胺玻片上 的DNA相比，這些玻片對(duì)DNA的載荷能力是減小的，導(dǎo)致較差的信號(hào)強(qiáng) 度。另外，未反應(yīng)的酯被7jC解成羧酸，其在正常的雜交緩沖液(pH 7)中帶 負(fù)電，通過(guò)靜電作用降低了 DNA相互作用。另外，為了研究細(xì)胞和蛋白 質(zhì)，減少細(xì)胞非特異性結(jié)合而同時(shí)維持完整抗體功能性的最佳表面為丙烯 酰胺(Soen， Y.; Chen， D. S.; Kraft, D. L.; Davis, M. M.; Brown, P. O. PLoS Biology 2003,1， (3)， 429-438. Boozer, C; Ladd， J.; Chen， S.; Yu, Q.; Homola， J.; Jiang, S.爿""/. C7^附.2004， 76， 6967-6972)，其與DNA是不i容的。
另外，通過(guò)使用DNA作為用于細(xì)胞、cDNA和蛋白質(zhì)的通用裝配策 略，能夠優(yōu)化用于點(diǎn)樣襯底上高DNA載荷和用于抗體上互補(bǔ)DNA載荷的 襯底條件。這導(dǎo)致用于蛋白質(zhì)檢測(cè)的高靈敏夾層測(cè)定以及高效細(xì)胞分選(與傳統(tǒng)淘^目比)。
實(shí)施例ll:制it微流體i殳備
基于微流體的測(cè)定提供了優(yōu)點(diǎn)，如降低的樣品和試劑體積，以及縮 短的測(cè)定時(shí)間(Breslauer， D. N.; Lee， P. J.; Lee， L. P. Mol. BioSyst. 2006， 2， 97-112)。例如在某些操作條件下，表面結(jié)合測(cè)定動(dòng)力學(xué)主要由分析物(蛋 白質(zhì))濃度和分析物/抗原親和力決定，而不是由擴(kuò)散決定(Zimmermann, IVL; Delamarche, E.; Wolf， M.; Hunziker, P. Biomedical Microdevices 2005， 7， (2)， 99-110)。通過(guò)將基于聚二曱基法氧烷(PDMS)的微流體通道結(jié)合在 DNA微陣列頂部來(lái)評(píng)價(jià)基于微流體的多核苷酸編碼蛋白質(zhì)途徑。
具體地，使用常規(guī)軟平版印刷(soft lithographic)技術(shù)由聚二曱基珪氧 烷(PDMS)制造微流體通道。目標(biāo)是制造堅(jiān)固的微流體通道，其在表面測(cè)定 完成后能夠解體用于光學(xué)分析。通過(guò)光刻工藝(photoli也ographically)由高 分辨率透明掩蔽物(CadArt)制造主模，使得得到的流體網(wǎng)絡(luò)由20條平行的 通道組成，每條通道具有10 x 600 jim的橫截面輪"廓并且長(zhǎng)為2 cm。 it^t 應(yīng)于120 nl的通道體積。混合珪酮彈性體(Dow Corning Sylgard 184TM)# 將其傾倒在模具的頂部。固化后從模具上去除PDMS并用20號(hào)鋼針 (Technical InnovationsTM)刺出樣品輸入口和輸出口 。然后將微流體通道 對(duì)準(zhǔn)微陣列頂部并在80"C烤箱與襯底結(jié)合過(guò)夜。
實(shí)施例12:使用以DNA編碼的抗體進(jìn)行基于微流體的測(cè)定步驟
用23號(hào)鋼針和TygonTM管連接微流體設(shè)備，允許產(chǎn)生~ 0.5 jil/分鐘 的氣動(dòng)控制流速。在Tris緩沖鹽水(TBS)中進(jìn)行多種測(cè)定，已發(fā)現(xiàn)TBS在 降低背景噪音方面比1 x SSC和PBS更好。用TBS中的1.0% BSA封閉各 通道，然后在流動(dòng)條件下與DNA-抗體綴合物或免疫測(cè)定對(duì)接觸10分鐘。 在流動(dòng)條件下與綴合物或抗原接觸10分鐘后，用緩沖液將通道洗滌2分鐘， 并且將所述微流體構(gòu)件從載玻片上取下，以用于掃描。在臨成像前將整個(gè) 玻片在TBS中簡(jiǎn)單沖洗、吹干并在如上所述的陣列掃描儀上成《象。
在第一系列測(cè)定中，分別用寡聚體Al，和Bl，標(biāo)記兩種山羊抗人IgG (用Alexa594或Alexa 647標(biāo)記)，并將其引入結(jié)合在微陣列DNA頂部的 微流體設(shè)備中，所述微陣列帶有相應(yīng)的互補(bǔ)鏈Al和Bl及非互4h^ Cl。 不添加編碼至點(diǎn)Cl的多核苷酸編碼的綴合物。在~ 0.5 jil/分鐘流動(dòng)10分
49鐘后，去除微流體PDMS板并對(duì)載玻片成像。圖14所示結(jié)果顯示，抗體 綴合物在<10分鐘內(nèi)自裝配在附加的寡核苷酸所編碼的精確空間位置上 (見圖14 )，與微流體中DNA雜交所報(bào)道的時(shí)間尺度一致(Erickson， D.; Li， D.; Krull, U.fiioc/^附.2003, 317， 186-200. Bunimovich， Y.; Shin， Y.; Yeo, W.; Amori, M.; Kwong, G; Heath, J. J. Am, Chem. Soc. 2006網(wǎng)絡(luò)7〉 開時(shí)間2006年12月1日)DOI: 10.1021/ia065923u. Wei, C; Cheng， J.; Huang, C; Yen, M.; Young, T. Nucleic Acids Research 2005, 33， (8), 1-11)。 為了確認(rèn)用于蛋白質(zhì)檢測(cè)的多核苷酸編碼蛋白質(zhì)策略，進(jìn)行了其它測(cè)定， 其中利用編碼抗體在多種標(biāo)準(zhǔn)免疫測(cè)定中檢測(cè)相關(guān)抗原。
在標(biāo)準(zhǔn)免疫測(cè)定(Engvall， E.; Perlmann， P. O. J. Immunol. 1972， 109， 129-135)中，第一抗體被吸附在固體支持物上，然后依次引入含抗原樣品 和標(biāo)記的第二 "讀數(shù)抗體"并孵育，其間進(jìn)行沖洗步驟。為了簡(jiǎn)化這種常 規(guī)的五步式免疫測(cè)定，使用DNA所編碼抗體的編碼能力將整個(gè)夾層復(fù)合 體定位至用于多路讀數(shù)的適當(dāng)位置，將該測(cè)定減少至單步驟。
具體地，將非熒光的、DNA編碼的第一抗體與抗原和熒光標(biāo)記的(無(wú) DNA)第二抗體組合。在這些條件下，只有當(dāng)抗體-抗原-抗體夾層在均質(zhì) 溶液中成功形成并定位在微陣列上時(shí)，才能空間編碼熒光信號(hào)。
具體地，在其他的第一系列測(cè)定中，引入針對(duì)兩種細(xì)胞因子(人IFN-y 和TNF-a)的DNA編碼的抗體、相應(yīng)抗原以及熒光標(biāo)記的第二抗體。DNA 編碼的抗體夾層測(cè)定自裝配至其特定的空間位置，并在那里^l檢測(cè)，如圖 15a所示。完成這種多蛋白質(zhì)免疫測(cè)定法也需要10分鐘。
在使用第三白介素IL-2的第二系列測(cè)定中研究了基于微流體DNA 編碼抗體的夾層免疫測(cè)定法的靈敏度極限。結(jié)果顯示于圖15b和圖15c中， 其中使用熒光第二抗體(圖b)顯影并分別使用金非電沉積作為顯影和放 大策略(圖c)。
使用焚光讀數(shù)策略，該測(cè)定法在以5 nM飽和濃度的互補(bǔ)DNA印制 的玻片上達(dá)到約l nM的靈敏度極限峰值(數(shù)據(jù)未顯示)。對(duì)人IL-2-濃度 系列而言，首先將第一 DNA-抗體綴合物鋪在表面上，然后與抗原和第二 抗體接觸。這是因?yàn)樵谳^低的抗原濃度下信號(hào)減弱，因?yàn)楦弑壤奈唇Y(jié)合 抗原的第一抗體與結(jié)合有抗原的第一抗體竟?fàn)幣cDNA陣列雜交。通過(guò)先 將陣列與第一 DNA-抗體綴合物接觸，在隨后與抗原和第二抗體接觸之前洗掉了過(guò)量物，增強(qiáng)了信號(hào)。
使用了多種策略來(lái)提高靈敏度。首先，申請(qǐng)人推斷，提高載玻片對(duì)
DNA的載荷能力會(huì)提高定位的多核苷酸編碼綴合物的密度，因而提高可能 的捕獲事件數(shù)。常規(guī)DNA微陣列被印制在胺^J^烷與玻璃Jl應(yīng)而產(chǎn)生的 伯胺表面上(Pirrung, M. Angew. Chem. Int. Ed. 2002， 41,1276-1289)。通 過(guò)DNA磷酸主鏈上的負(fù)電荷與來(lái)自質(zhì)子化胺的正電荷之間的靜電相互作 用，在中性pH^Hf下固定DNA鏈。為了提高玻片的載荷能力，產(chǎn)生了多 聚賴氨酸表面，從而提高電荷密度以及與DNA相互作用的表面積。通過(guò) 釆用這些改變，有可能以100 nM的飽和濃度在載玻片上印制互補(bǔ)DNA。 相應(yīng)地，基于熒光的測(cè)定法的靈敏度提高至10 pM (圖15b )。
在一種不同的顯影途徑中，使用以金納米顆粒標(biāo)記的第二抗體，然 后使用非電沉積沉積(Hainfeld， J. F.; Powell, R. D.， Silver- and Gold-Based Autometallography of Nanogold. Gold and Silver Staining: Techniques in Molecular Morphology, Hacker, G. W" Gu， J.， Eds. CRC Press: Washington, DC， 2002; 29-46頁(yè))進(jìn)一步放大信號(hào)，并將基于熒光的讀數(shù)轉(zhuǎn) 化為光讀數(shù)。這是可能的，因?yàn)槭褂昧丝臻g而不是比色的多游"化。
具體地，以與上文公開相似的方式進(jìn)行基于微流體的金放大實(shí)驗(yàn)， 重要的區(qū)別是使用生物素-第二抗體代替熒光標(biāo)記的抗體。隨后向每條通道 0ng/jil)中引入金-鏈霉親和素(Nanoprobes)保持10分鐘，之后用緩沖液將 通道徹底沖洗。去除PDMS后，根據(jù)制造商的方案用金增強(qiáng)試劑盒 (Nanoprobes)對(duì)整個(gè)玻片進(jìn)行放大。
采用這些改i^，可在低于10 fM的濃度極限下容易地檢測(cè)IL-2白 介素的存在(圖15c),這代表高于基于熒光的微流體免疫測(cè)定法至少1000 倍的靈敏度。相比較而言，該方法比常規(guī)的ELISA靈敏度高100-1000倍 (Crowther, J. R.， ELISA; Theory and Practice. In Methods in Molecular Biology, Humana Press Inc.: Totowa， New Jersey, 1995)， t匕來(lái)自命J造商的 相應(yīng)人 IL-2 ELISA 數(shù)據(jù)靈敏度高 150 倍 (http:〃www.bdbiosciences.com/ptProduct.isp prodId=6725)。
這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，與1步式免疫測(cè)定法相比，特別是在^[氐抗原 濃度下，通過(guò)與試劑依次接觸進(jìn)行的測(cè)定法具有提高的靈敏度。這很可能 是由于帶有或不帶有載荷的DNA抗體綴合物之間對(duì)下層DNA微陣列上雜交的竟?fàn)幮越Y(jié)合。通過(guò)將陣列依次與多核苷酸編碼的綴合物、抗原接觸， 然后與第二抗體接觸，提高了靈敏度。最合適的方法必須根據(jù)在便利性和
靈敏度方面所期望的結(jié)果來(lái)進(jìn)行選擇。然而仍然要強(qiáng)調(diào)，在微流體流動(dòng)條
件下對(duì)各步驟而言仍然在10分鐘內(nèi)達(dá)到最大信號(hào)。因此在完全自動(dòng)化的設(shè) 備中，可在1小時(shí)(包括30分鐘的金放大步驟)內(nèi)以低至10 fM的靈敏 度獲得完整的微流體免疫測(cè)定。
實(shí)施例13:使用以金屬納米顆粒標(biāo)記的DNA編碼抗體進(jìn)行靼標(biāo)定量
使用以DNA編碼的抗體與DNA陣列組合，根據(jù)圖16和17中所述 策略檢測(cè)數(shù)字蛋白質(zhì)組學(xué)情況。具體地，進(jìn)行測(cè)定來(lái)檢測(cè)某些細(xì)胞因子 (IL2、 TNF-a和IFN-y )。以與上述3步式免疫測(cè)定相似的方式進(jìn)行所有 的實(shí)驗(yàn)，重要的區(qū)別是使用40nm金顆粒并且檢測(cè)方案是暗視野光散射顯
具體地，在數(shù)字方法中，用40 nm金納米顆粒標(biāo)記第二抗體，所述 金納米顆粒通過(guò)暗視野光散射顯微術(shù)可容易地檢測(cè)。更具體地，使用40 納米的金納米顆粒-鏈霉親和素綴合物作為數(shù)字測(cè)定的檢測(cè)探針。
用圖18所示方法進(jìn)行相關(guān)數(shù)字免疫測(cè)定的檢測(cè)。根據(jù)圖18所示方 法，使用暗視野顯微鏡的物鏡測(cè)量散射光。即便是非常小的金納米顆粒的 等離振子應(yīng)答也容易地選取和檢測(cè)。手動(dòng)或使用顆粒計(jì)數(shù)的自動(dòng)化軟件包 計(jì)數(shù)個(gè)體顆粒。注意所有顆粒的散射顏色是非常類似的-黃至綠色。這是因 為金納米顆粒(10)具有相當(dāng)窄的尺寸范圍(~60納米直徑)。在光散射顯微 鏡中可使用濾光片消除所有其它散射顏色，因而降低背景。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示于圖19到22中，其中使用瑞利光Jt射來(lái)顯影綴合物。
在圖19和20中顯示了根據(jù)本文所公開方法和系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)施方案 進(jìn)行的數(shù)字測(cè)定法的靈敏度，其中展現(xiàn)了 TNF-a的濃度系列。來(lái)自該蛋白 質(zhì)的信號(hào)可在低至IOO aM的濃度下被容易地鑒定。圖19和20顯示用本 文公開的方法和系統(tǒng)在不同的濃度下進(jìn)行的TNF-a數(shù)字免疫測(cè)定的代表 性暗視野圖像。使用由NIH提供的一種科學(xué)圖像處理軟件ImageJTM來(lái)自 動(dòng)計(jì)數(shù)顆粒數(shù)。金納米顆粒和TNF-a濃度繪制在圖20的直方圖中。
為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)該新技術(shù)在血清測(cè)量中的能力，在人血清(購(gòu)自 Sigma-Aldrich )中加入上述三種細(xì)胞因子蛋白(IL2、 TNF-a和IFN-y)并進(jìn)行與上文相同的基于金納米顆粒的測(cè)定法。結(jié)果顯示于圖21中。具體 地，圖a的圖像從加入了下述三種蛋白質(zhì)的血清樣品中收集IFN-y、TNF-a 和IL-2。圖b的圖像來(lái)自數(shù)字免疫測(cè)定，其根據(jù)本文公開的方法和系統(tǒng)的 一種實(shí)施方案從健;^A血清中測(cè)量。所有這三種蛋白質(zhì)通常均以低于可檢 測(cè)的濃度存在于Aj6l清中。tnf-a低于檢測(cè)限，但是ifn- y和il-2以數(shù) 飛摩爾/升(10"5M)的濃度水平存在。這一蛋白量遠(yuǎn)低于常規(guī)吸光度或熒光 elisa或甚至用本文公開的方法和系統(tǒng)的另一實(shí)施方案進(jìn)行的免疫檢測(cè) 的檢測(cè)限。
發(fā)現(xiàn)根據(jù)上文所述的實(shí)施方案的方法在血清中運(yùn)行良好，具有高靈 敏度和非常小的背景噪音。重要的是，數(shù)字免疫測(cè)定實(shí)施方案對(duì)這樣的細(xì) 胞因子是靈敏的，所述細(xì)胞因子是生物信息性分子，但是以痕量存在于純 的健;^^^jk清中。如圖21右側(cè)顯示，存在對(duì)應(yīng)于人ifn-y和il-2的信號(hào)， 但是未檢測(cè)到tnf-a。該結(jié)果顯示了其中使用金屬納米顆粒進(jìn)行檢測(cè)的本 文所>&開方法和系統(tǒng)的能力。
測(cè)試了均以相同濃度制備的上述三種人細(xì)胞因子蛋白的檢測(cè)(圖 22)。具體地，將三種不同的ssDNA'分子點(diǎn)樣到襯底上，各個(gè)ssDNA'與標(biāo) 記在第一抗體(抗IFN-y;抗TNF-a和抗IL-2 )上的ssDNA寡聚體互補(bǔ)。 在襯底與血清/蛋白質(zhì)混合物接觸后，引入用60納米直徑金納米顆粒標(biāo)記 的第二抗體。使用暗視野光散射顯微鏡顯影納米顆粒。
圖22中所示結(jié)果可明確地顯示出來(lái)，并且與基于熒光的測(cè)定一致的 是，由于與第一抗tnf-a抗體的高親和力，tnf-a顯示最佳信號(hào)強(qiáng)度。
應(yīng)當(dāng)注意，背景接近零，并且檢測(cè)到蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)范圍為至少106。 這些類型的測(cè)定已被用于從健;^Ajk清中檢測(cè)某些細(xì)胞因子(il2、 TNF-a 和IFN-y)。這在之前是不可能的，因?yàn)檫@些蛋白質(zhì)僅以l-5飛摩爾/升的水 平存在(通過(guò)我們的測(cè)量)。應(yīng)當(dāng)注意， 一旦表征了抗體/蛋白質(zhì)親和力， 則這些類型的測(cè)定就是絕對(duì)和定量的，意味著它們不需要校準(zhǔn)。
用本文公開的方法和系統(tǒng)對(duì)分子的數(shù)字檢測(cè)易于適用于微流體環(huán)境 (來(lái)自圖21的結(jié)果在微流體環(huán)境中進(jìn)行)。除了這類微流體免疫測(cè)定帶來(lái) 的樣品大小和時(shí)間尺度益處外，還存在其它優(yōu)點(diǎn)。例如，因?yàn)樵谧x數(shù)之前 整個(gè)測(cè)定在溶液中進(jìn)行，所以蛋白質(zhì)變性(點(diǎn)樣抗體微陣列的一個(gè)問(wèn)題) 不降低結(jié)合效率。另外，涉及襯底支持抗體的任何測(cè)定都無(wú)法承受微流體芯片裝配(其涉及在80匸的長(zhǎng)時(shí)間烘烤)。將該方法設(shè)計(jì)成得到堅(jiān)固的 PDMS微流體通道，其隨后可解體用于光學(xué)讀數(shù)步驟。
進(jìn)行溶液相測(cè)定的另一益處是抗原和抗體均享有取向自由，確保固 體支持物不會(huì)限制分析物對(duì)捕獲劑結(jié)合口袋的接近。
實(shí)施例14:診斷方法和系統(tǒng)
用于分析生物標(biāo)志物的本文所公開方法和系統(tǒng)的一些初步校正和定 量在PI3K通路中進(jìn)行，該通路在許多癌癥中尤其是在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中是 混亂的。具體地，在圖23中顯示了一種實(shí)施方案，其中應(yīng)用該技本險(xiǎn)測(cè)生 物標(biāo)志物pten，它是成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(腦癌)中的重要標(biāo)志物。
本文公開的方法和系統(tǒng)首先被用于基于熒光的測(cè)定中，以通過(guò)使用 pten作為標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)設(shè)備(圖23，圖a和b )。蛋白pten的校準(zhǔn)用左側(cè)7 個(gè)格表示，范圍從25 nM到375 pM。右側(cè)三個(gè)襠^R表pten陽(yáng)性和pten 空白的樣品。通過(guò)與校準(zhǔn)格比較。能夠內(nèi)插得到pten的濃度在1 nM附近。 發(fā)明人隨后繼續(xù)定量成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87中的pten表達(dá)水平(圖a 和c)。顯然，如圖23所示，合理的pten水平(lnM)使用本文公開的方法 和系統(tǒng)是可檢測(cè)的。
使用本文公開的方法和系統(tǒng)還可以在血清中進(jìn)行生物標(biāo)志物的檢測(cè) 和相關(guān)分析，作為個(gè)體健康狀態(tài)的指示。具體地，可使用本文公開的方法 和系統(tǒng)進(jìn)行肝毒性研究。肝中的結(jié)果是特別有意義的，因?yàn)楦问侨梭w中第 二大的器官(第一是皮膚)，并且與血持續(xù)接觸。因此很有可能該器官中 的混亂會(huì)導(dǎo)致血清中所存在的肝特異性蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物數(shù)量發(fā)生顯著 改變。
從血清生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)到臨床確認(rèn)的示例性途徑示于圖24。
血清生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)步驟涉及通過(guò)現(xiàn)有方法在串聯(lián)質(zhì)譜法 中對(duì)血中蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。因此，使用串^t鐠法發(fā)現(xiàn)在對(duì)鼠 模型施用高水平對(duì)乙酰氨基酚(acetomaniphen )后，約25種蛋白質(zhì)的初 步蛋白質(zhì)列表被上調(diào)或下調(diào)(圖24的圖a(l))。具體地，將所檢測(cè)的肽回 復(fù)作圖(map back),產(chǎn)生候選蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的列表。使用現(xiàn)有方法 在表面等離振子共振中篩選和驗(yàn)證這些生物標(biāo)志物及其相關(guān)的捕獲劑(抗 體)。具體地，使用SPR確認(rèn)尤其有效的抗體對(duì)(圖24的圖b(2))。最后，為了能夠進(jìn)行高靈敏度的多i^監(jiān)測(cè)，將這些經(jīng)證實(shí)的蛋白質(zhì)捕獲劑轉(zhuǎn)變到 根據(jù)本文公開的實(shí)施方案的微流體系統(tǒng)，使得可以監(jiān)測(cè)血中的血清生物標(biāo)
志物。具體地，設(shè)計(jì)并測(cè)試芯片，以檢測(cè)來(lái)自全血清的4種肝特異性血清 蛋白和3種免疫特異性蛋白(圖24的圖c(3))。圖24所示的結(jié)果表明，從 血清中亳無(wú)困難地檢測(cè)出了所有的靶標(biāo)。
所有上述證實(shí)均已在鼠或人或二者的血清樣品中完成。
總而言之，本文提供了用于在樣品中檢測(cè)和/或分選乾標(biāo)的方法和系 統(tǒng)，其基于組^H"吏用多核苷酸編碼蛋白質(zhì)和襯底多核苷酸。所述以多核苷
苷酸的編碼多核苷酸組成，其中所述襯底多核苷酸附著于襯底。
提供了上文公開的實(shí)施例以對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員完整公開和描述 如何制造和使用;^^開內(nèi)容的設(shè)備、系統(tǒng)和方法的實(shí)施方案，而不旨在限 制發(fā)明人認(rèn)為的公開內(nèi)容的范圍。用于實(shí)施;^/>開內(nèi)容的上^式的修改 對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，并且旨在包含于以下的權(quán)利要求范圍 內(nèi)。說(shuō)明書中提到的所有專利和出版物代表了;$^>開內(nèi)容所屬領(lǐng)域技術(shù)人 員的技術(shù)水平。；^^開內(nèi)容中引用的所有參考文獻(xiàn)均通過(guò)引用并入，其程 度相當(dāng)于各參考文獻(xiàn)單獨(dú)地通過(guò)引用以其整體并入。
在背景技術(shù)、發(fā)明詳述和實(shí)施例中引用的每篇文獻(xiàn)(包括專利、專 利申請(qǐng)、雜志文章、摘要、實(shí)驗(yàn)手冊(cè)、書籍或其他公開內(nèi)容)的全部公開 內(nèi)容均通過(guò)引用并入本文。另外，與本文一起提交的序列表的硬拷貝和相 應(yīng)的計(jì)算機(jī)可讀形式均通過(guò)引用整體并入本文。
應(yīng)當(dāng)理解，；^/>開內(nèi)容不限于具體的組合物或生物系統(tǒng)，它們當(dāng)然 可以變化。還應(yīng)當(dāng)理解，本文使用的命名法僅用于描述具體實(shí)施方案的目 的，并不旨在限制。本說(shuō)明書及所附權(quán)利要求書中使用的無(wú)數(shù)量詞修飾的 名詞均包括其復(fù)數(shù)含義，除非上下文明確表明不是這樣。術(shù)語(yǔ)"多個(gè)"包 括兩個(gè)或更多個(gè)指代物，除非上下文明確表明不是這樣。除非另有i兌明，
員通常所理解的相同含義。盡管實(shí)踐中能夠使用與本文公開的相似或等同 的所有方法和材料，但是在本文中描述了用于測(cè)試具體實(shí)例的合適材料和 方法。已描述了4^>開內(nèi)容的大量實(shí)施方案。盡管如此，應(yīng)當(dāng)理解，可進(jìn) 行多種修改而不偏離本公開內(nèi)容的構(gòu)思和范圍。因此，其他實(shí)施方案也在 以下權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1. 檢測(cè)樣品中靶標(biāo)的方法，該方法包括將附著于襯底的襯底多核苷酸與以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)相組合，該以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)包含蛋白質(zhì)和附著于該蛋白質(zhì)的編碼多核苷酸，其中所述蛋白質(zhì)與所述靶標(biāo)特異性結(jié)合，且所述編碼多核苷酸與所述襯底多核苷酸特異性結(jié)合；和檢測(cè)與附著于襯底的襯底多核苷酸相結(jié)合的以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)-靶標(biāo)復(fù)合體。
2. 權(quán)利要求l的方法，其中如下進(jìn)行附著于襯底的襯底多核苷酸 與以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)的組合提供附著于襯底的襯底多核苷酸；提供以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)，其包含蛋白質(zhì)和附著于該蛋白質(zhì)的 編碼多核苷酸，其中所述蛋白質(zhì)與所述靶標(biāo)特異性結(jié)合，且所述編碼多 核香酸與所述襯底多核苷酸特異性結(jié)合；和將該以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)與樣品和襯底在一定條件下接觸一 定時(shí)間，以允許所述以多核普酸編碼的蛋白質(zhì)在以多核普酸編碼的蛋白 質(zhì)-靶標(biāo)復(fù)合體中與靶標(biāo)結(jié)合，并且允許所述編碼多核苷酸與所述襯底 多核苷酸結(jié)合。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中如下進(jìn)行所述以多核苷酸編碼的蛋白 質(zhì)與樣品和與襯底的接觸將所述以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)與樣品在一定條件下接觸一定時(shí) 間，以允許該以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)在以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)-靶 標(biāo)復(fù)合體中與靶標(biāo)結(jié)合；和將所述以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)-靶標(biāo)復(fù)合體與襯底在一定條件下 接觸一定時(shí)間，以允許所述編碼多核普酸與所述襯底多核普酸結(jié)合。
4. 權(quán)利要求2的方法，其中如下進(jìn)行所述以多核普酸編碼的蛋白 質(zhì)與樣品和與襯底的接觸將所述以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)與所述襯底在一定條件下接觸一 定時(shí)間，以允許所述編碼多核苷酸與所述襯底多核普酸結(jié)合；和將所述以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)與樣品在一定條件下接觸一定時(shí)間，以允許所述以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)在以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)-靶標(biāo)復(fù)合體中結(jié)合。
5. 權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)的方法，其中如下對(duì)襯底上所述以多核 苷酸編碼的蛋白質(zhì)-靶標(biāo)復(fù)合體進(jìn)行檢測(cè)提供經(jīng)標(biāo)記的分子，其包含與靶標(biāo)特異性結(jié)合的分子和附著于該分 子的標(biāo)記化合物，該標(biāo)記化合物提供標(biāo)記信號(hào)；將所述經(jīng)標(biāo)記的分子與所述以多核普酸編碼的蛋白質(zhì)-乾標(biāo)復(fù)合體 在一定條件下接觸一定時(shí)間，以允許所述經(jīng)標(biāo)記的分子與所述以多核苷 酸編碼的蛋白質(zhì)-靶標(biāo)復(fù)合體結(jié)合；和檢測(cè)來(lái)自與襯底上以多核香酸編碼的蛋白質(zhì)-耙標(biāo)復(fù)合體相結(jié)合的 經(jīng)標(biāo)記分子的標(biāo)記信號(hào)。
6. 權(quán)利要求5的方法，其中所述標(biāo)記化合物是金屬納米顆粒。
7. 權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)的方法，其中所述以多核苷酸編碼的蛋 白質(zhì)是抗體。
8. 權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)的方法，其中所述靶標(biāo)是多種靶標(biāo)，且 其中如下將附著于村底的襯底多核苷酸與以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)相 組合提供多種附著于襯底的襯底多核苷酸，各種襯底多核苷酸是序列特 異性的，并且在位置上可彼此區(qū)分；提供多種以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)，每種以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì) 包含蛋白質(zhì)和附著于該蛋白質(zhì)的編碼多核普酸，其中所述蛋白質(zhì)與所述 多種靶標(biāo)中的靶標(biāo)結(jié)合，且所述編碼多核苷酸與所述多種襯底多核普酸 中的序列特異性且位置上可區(qū)分的襯底多核苷酸特異性結(jié)合，各種蛋白 質(zhì)和編碼多核苦酸在結(jié)合方面可彼此區(qū)分；和將所述多種以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)與樣品和所述多種襯底多核 苷酸在一定條件下接觸一定時(shí)間，以允許所述蛋白質(zhì)與靶分子在多種以 多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)-靶標(biāo)復(fù)合體中結(jié)合，并且允許所述編碼多核苷 酸與所述襯底多核苷酸結(jié)合。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中如下對(duì)襯底上多種以多核苷酸編碼的 蛋白質(zhì)-靶標(biāo)復(fù)合體的進(jìn)行檢測(cè)提供多種經(jīng)標(biāo)記的分子，每種經(jīng)標(biāo)記的分子包含與所述多種靶標(biāo)的 一種靶標(biāo)特異性結(jié)合的分子以及提供標(biāo)記信號(hào)的標(biāo)記化合物，該標(biāo)記化 合物附著于所述經(jīng)標(biāo)記的分子，各種經(jīng)標(biāo)記的分子在檢測(cè)方面可彼此區(qū)分；將所述多種經(jīng)標(biāo)記的分子與所述多種以多核香酸編碼的蛋白質(zhì)-靶 標(biāo)復(fù)合體在一定條件下接觸一定時(shí)間，以允許所述多種以多核苷酸編碼 的靶標(biāo)復(fù)合體與所述多種經(jīng)標(biāo)記的分子結(jié)合；和檢測(cè)來(lái)自與村底上多種以多核苷酸編碼的靶標(biāo)復(fù)合體結(jié)合的多種 標(biāo)記分子的標(biāo)記信號(hào)。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中所述標(biāo)記化合物是金屬納米顆粒。
11. 權(quán)利要求8到10中任一項(xiàng)的方法，其中所述以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)中的蛋白質(zhì)組分是抗體。
12. 權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)的方法，其中所述靶標(biāo)是多種靶標(biāo)， 該靶標(biāo)包含至少一種靶多核苷酸，且其中如下將附著于襯底的襯底多核 苷酸與以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)相組合提供多種附著于襯底的襯底多核苷酸，各種襯底多核苷酸是序列特 異的并且在位置上可彼此區(qū)分；提供至少一種經(jīng)標(biāo)記的多核苷酸，其特異性結(jié)合至少一種靶多核苷 酸，各種標(biāo)記多核苷酸在結(jié)合方面可彼此區(qū)分；將所述至少一種經(jīng)標(biāo)記的多核苷酸與樣品在一定條件下接觸一定 時(shí)間，以允許所述經(jīng)標(biāo)記的多核苷酸與靼多核苷酸結(jié)合從而提供至少一 種經(jīng)標(biāo)記的靶多核苷酸，其中所述至少一種經(jīng)標(biāo)記的乾多核苷酸由這樣 的序列組成，所述序列與序列特異性且位置上可區(qū)分的襯底多核苷酸特 異性結(jié)合；提供至少一種以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)，其包含蛋白質(zhì)和附著于該 蛋白質(zhì)的編碼多核苷酸，其中所述蛋白質(zhì)與所述多種靶標(biāo)中的靶標(biāo)特異 性結(jié)合，且所述編碼多核苷酸與序列特異性且位置上可區(qū)分的襯底多核 苷酸特異性結(jié)合，各種蛋白質(zhì)和編碼多核苷酸在結(jié)合方面可彼此區(qū)分， 各種蛋白質(zhì)在結(jié)合方面與各種經(jīng)標(biāo)記的多核苷酸可區(qū)分，各種以多核苷 酸編碼蛋白質(zhì)在結(jié)合方面與各種經(jīng)標(biāo)記的靶多核苷酸可區(qū)分；將所述至少一種以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)與樣品在一定條件下接觸一定時(shí)間，以允許所述蛋白質(zhì)與靶標(biāo)在至少一種以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)-靶標(biāo)復(fù)合體中結(jié)合；和將所述至少一種經(jīng)標(biāo)記的靶多核苷酸與所述至少一種以多核苷酸 編碼的蛋白質(zhì)-靶標(biāo)復(fù)合體和多種襯底多核苷酸在一定條件下接觸一定 時(shí)間，以允許所述至少一種經(jīng)標(biāo)記的靶多核普酸與相應(yīng)的襯底多核苷酸 結(jié)合，并且允許所述至少一種編碼多核普酸與相應(yīng)的襯底多核普酸結(jié) 合；該方法還包括檢測(cè)與襯底上多種空間定位的襯底多核苷酸相結(jié)合的所述經(jīng)標(biāo)記 的靶多核苷酸。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中如下對(duì)襯底上所述以多核苷酸編碼的 蛋白質(zhì)-靶標(biāo)復(fù)合體進(jìn)行檢測(cè)提供多種經(jīng)標(biāo)記的蛋白質(zhì)，每種經(jīng)標(biāo)記的分子包含與所述多種乾標(biāo) 的一種靶標(biāo)特異性結(jié)合的分子組分以及提供標(biāo)記信號(hào)的標(biāo)記化合物；該 標(biāo)記化合物附著于所述經(jīng)標(biāo)記的分子；將所述多種經(jīng)標(biāo)記的分子與所述多種以多核香酸編碼的蛋白質(zhì)-靶 標(biāo)復(fù)合體在一定條件下接觸一定時(shí)間，以允許所述多種以多核苷酸編碼 的靶標(biāo)復(fù)合體與所述多種經(jīng)標(biāo)記的分子結(jié)合；和檢測(cè)來(lái)自與襯底上多種以多核苷酸編碼的靶標(biāo)復(fù)合體相結(jié)合的所 述多種經(jīng)標(biāo)記蛋白質(zhì)的標(biāo)記信號(hào)。
14. 權(quán)利要求13的方法，其中所述標(biāo)記化合物是附著于該蛋白質(zhì)的 金屬納米顆粒。
15. 權(quán)利要求12到14中任一項(xiàng)的方法，其中所述以多核普酸編碼 的蛋白質(zhì)中的蛋白質(zhì)組分是抗體。
16. 用于檢測(cè)樣品中的靶分子的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含襯底，帶有附著于該襯底上的襯底多核苷酸；和以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)，其包含蛋白質(zhì)和附著于該蛋白質(zhì)的編碼 多核苷酸，其中所述蛋白質(zhì)與靶標(biāo)特異性結(jié)合，且所述編碼多核普酸與 所述襯底多核普酸特異性結(jié)合。
17. 權(quán)利要求16的系統(tǒng)，該系統(tǒng)還包含經(jīng)標(biāo)記的分子，其包含特異性結(jié)合靶標(biāo)的分子和附著于所述蛋白質(zhì) 的標(biāo)記化合物，該標(biāo)記化合物提供標(biāo)記信號(hào)。
18. 權(quán)利要求16的系統(tǒng)，其中靶標(biāo)是多種靶標(biāo)，該系統(tǒng)包含襯底，其帶有附著于該襯底上的多種襯底多核苷酸，所述多種附著 于襯底上的襯底多核苷酸中的各種多核苷酸是序列特異性的且在位置 上可彼此區(qū)分；和多種以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)，每種以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)包含 蛋白質(zhì)和附著于該蛋白質(zhì)的編碼多核苷酸，其中所述蛋白質(zhì)與所述多種 靶標(biāo)中的預(yù)定靶標(biāo)特異性結(jié)合，且所述編碼多核香酸與所述多種附著于 襯底上的多核苷酸中序列特異性且在位置上可區(qū)分的多核苷酸特異性 結(jié)合，各種蛋白質(zhì)和編碼多核普酸在結(jié)合方面可彼此區(qū)分。
19. 權(quán)利要求18的系統(tǒng)，該系統(tǒng)還包含多種經(jīng)標(biāo)記的分子，每種經(jīng)標(biāo)記的分子包含與所述多種靶標(biāo)中 一種 靶標(biāo)特異性結(jié)合的分子以及附著于該蛋白質(zhì)組分的標(biāo)記化合物，該標(biāo)記 化合物提供標(biāo)記信號(hào)，各種經(jīng)標(biāo)記的分子在檢測(cè)方面可彼此區(qū)分。
20. 權(quán)利要求16的系統(tǒng)，其中所述靶標(biāo)是多種靶標(biāo)，所述多種靶標(biāo) 包含至少一種靶多核苷酸，該系統(tǒng)包含襯底，其帶有附著于該襯底的多種襯底多核苷酸，各種襯底多核苷 酸是序列特異性的且在位置上可彼此區(qū)分；至少一種經(jīng)標(biāo)記的多核苷酸，其與所述至少一種靶多核普酸特異性 結(jié)合，各種標(biāo)記多核普酸在結(jié)合方面可彼此區(qū)分，各種經(jīng)標(biāo)記的多核普 酸用于生產(chǎn)經(jīng)標(biāo)記的靶多核苷酸，所述經(jīng)標(biāo)記的靶多核苷酸與所述多種 空間定位的襯底多核苷酸中序列特異性且在位置上可區(qū)分的襯底多核 苷酸特異性結(jié)合；至少一種以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)，其包含蛋白質(zhì)和附著于該蛋白 質(zhì)的編碼多核苷酸，其中所述蛋白質(zhì)與所述多種靶標(biāo)的靶標(biāo)特異性結(jié) 合，且所述編碼多核苷酸與序列特異性且在位置上可區(qū)分的襯底多核苷 酸特異性結(jié)合，各種蛋白質(zhì)和編碼多核苷酸在結(jié)合方面可彼此區(qū)分；各種蛋白質(zhì)在結(jié)合方面可與各種經(jīng)標(biāo)記的多核苷酸區(qū)分；各種以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)在結(jié)合方面可與各種經(jīng)標(biāo)記的把多 核普酸區(qū)分。
21. 權(quán)利要求20的系統(tǒng)，該系統(tǒng)還包含至少一種經(jīng)標(biāo)記的分子，其包含與至少一種靶標(biāo)特異性結(jié)合的分子 以及附著于該分子的標(biāo)記化合物，該標(biāo)記化合物提供標(biāo)記信號(hào)。
22. 從多種靶標(biāo)中分選靶標(biāo)的方法，該方法包括提供附著于襯底的多種襯底多核苷酸，各種襯底多核苷酸是序列特 異性的并且在位置上可彼此區(qū)分；提供多種以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)，每種以多核普酸編碼的蛋白質(zhì) 包含蛋白質(zhì)和附著于該蛋白質(zhì)的編碼多核苷酸，其中該蛋白質(zhì)與所述多 種靶標(biāo)中的預(yù)定靶標(biāo)特異性結(jié)合，且所述編碼多核普酸與所述多種襯底 多核苷酸中序列特異性且在位置上可區(qū)分的襯底多核苷酸特異性結(jié)合， 各種蛋白質(zhì)和編碼多核苷酸在結(jié)合方面可彼此區(qū)分；將所述多種以多核苷酸編碼的抗體與樣品在一定條件下接觸一定 時(shí)間，以允許所述抗體與靶標(biāo)結(jié)合，從而提供多種以多核普酸編碼的蛋 白質(zhì)-靶標(biāo)復(fù)合體；和將所述多種以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)-靶標(biāo)復(fù)合體與所述多種襯底 多核苷酸在一定條件下接觸一定時(shí)間，以允許所述編碼多核苷酸與附著 于襯底的襯底多核苷酸結(jié)合；由此在與襯底結(jié)合的多種以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)-靶標(biāo)復(fù)合體中 分選所述多種靶標(biāo)。
23. 權(quán)利要求22的方法，其中所述靶標(biāo)是細(xì)胞。
24. 分選多種靶標(biāo)的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含襯底，其帶有附著于該襯底的多種襯底多核苷酸，所述附著于襯底 的多種襯底多核苷酸中的各種多核苷酸是序列特異性的且在位置上可 彼此區(qū)分；和多種以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)，每種以多核普酸編碼的蛋白質(zhì)包含 蛋白質(zhì)和附著于該蛋白質(zhì)的編碼多核苷酸，其中所述蛋白質(zhì)與所述多種 靶標(biāo)中的預(yù)定靶標(biāo)特異性結(jié)合，且所述編碼多核苦酸與所述多種附著于 襯底的多核苷酸中序列特異性且在位置上可區(qū)分的多核普酸特異性結(jié) 合，各種蛋白質(zhì)在結(jié)合方面可彼此區(qū)分，各種編碼多核苷酸在結(jié)合方面 可彼此區(qū)分。
25. 用于在樣品流體中檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)靶標(biāo)的微流體陣列，其包含具有用于裝載樣品流體的微流體構(gòu)件的微流體組件，和襯底組件，其帶有多種附著于該襯底組件的襯底多核普酸，該襯底 多核苷酸是序列特異性的且在位置上可區(qū)分，該襯底組件與用于分析樣 品流體的微流體組件中的微流體構(gòu)件有效關(guān)聯(lián)；其中每種所述襯底多核普酸由與其他襯底多核苷酸的序列互不影 響的序列組成。
26. 在樣品流體中檢測(cè)一種或多種靶標(biāo)的方法，包括用權(quán)利要求25 的微流體陣列進(jìn)行權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)的方法。
27. 在樣品流體中檢測(cè)一種或多種靶標(biāo)的方法，包括用權(quán)利要求25 的微流體陣列進(jìn)行權(quán)利要求8到11中任一項(xiàng)的方法。
28. 在樣品流體中檢測(cè)一種或多種耙標(biāo)的方法，包括用權(quán)利要求25 的微流體陣列進(jìn)行權(quán)利要求12到15中任一項(xiàng)的方法。
全文摘要
本文提供了基于將以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)與襯底多核苷酸組合使用而檢測(cè)和/或分選樣品中靶標(biāo)的方法和系統(tǒng)。所述以多核苷酸編碼的蛋白質(zhì)由與預(yù)定靶標(biāo)特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)以及與襯底多核苷酸特異性結(jié)合的編碼多核苷酸組成，其中所述襯底多核苷酸附著在襯底上。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101522915SQ200780036725
公開日2009年9月2日 申請(qǐng)日期2007年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月2日
發(fā)明者榮 樊, 瑞安·貝利, 蓋布·克翁, 詹姆斯·R·希思 申請(qǐng)人:加州理工學(xué)院