專利名稱：用于質譜法檢測的底物和內標的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分析試劑和基于質譜法的方法，所述方法使用這 些試劑來同時量化樣品中的蛋白質。更具體而言，本發(fā)明涉及使用質 譜法量化溶酶體酶活性的多元分析和試劑。
背景技術：
溶酶體jJt積病是一組遺傳病癥，其特征為身體內特定酶的缺 乏，這導致身體不能分解代謝物質。作為一個實例，法布里病是每40,000 人之一人中可見的溶酶體貯積病。其是由于a-半乳糖苷酶的缺乏，然后 這導致身體不能分解被稱為球形三酰神經酰胺(globotriaosylceramide) 的特定脂質。第二個實例是高歇病，由于不能分解被稱為葡糖神經酰 胺(也稱為葡糖腦苷脂)的脂物質(fatty substance)或脂質(lipids)弓l起 的溶酶體貯積病?；加懈咝〉膫€體不能制造葡糖腦苷脂酶， 一種分 解這些脂質所需要的酶。然后，這些脂質聚集在肝、脾和骨髓的細胞 內。第三個實例是蓬珀病，由于被需要用來分解某些被稱為糖原的糖 的酶——酸性a-葡糖苷酶——的缺乏引起的溶酶體貯積病。當酶——酸 性a-葡糖苷酶——缺少時，糖原在身體內的多種組織和器官中聚集。
這些疾病大部分是兒科疾病。在大多數患者中，患者在出生 時是正常的，在過后的一些時間里漸進地開始神經學上惡化。在一些 患者中，該疾病在成年期表現。臨床表型取決于生化缺陷的類型和嚴 重性。這些溶酶體缺陷癥的一些例如蓬珀病和克臘比病，主要表現在嬰兒期。因此，已經正在努力開發(fā)在臨床癥狀開始前檢測這些病癥的 方法，以便可以開始治療介入。 在過去的十年內，檢測代謝性疾病的實驗室已經將串聯質譜 法引入其新生兒篩查計劃。串聯質譜法在臨床繼續(xù)得到流行，因為該 技術允許在單一樣品中分析多種代謝物。例如，該技術己被作為檢測 在新生兒中遺傳代謝性疾病的常規(guī)臨床實踐，在該技術中使用干血斑
樣品(SchulzeA等，Pediatrics 2003; 111:1399-406)。盡管溶酶體酶活性可 使用串聯質譜法量化(Gelb MH等，Clinical Chemistry 50:10, 1785-1796, 2004)，但是發(fā)表的分析方法不容易適用于臨床情況，這是因為麻煩的 過程和苛刻的分析成分例如氯仿。因此，繼續(xù)需要改進用于檢測溶酶體缺陷癥的方法和組合物。
發(fā)明概述 根據本發(fā)明的實施方式，提供使用質譜法檢測酶反應的改進 的組合物和方法。發(fā)明的底物(substrate)具有A—(B'—B"—B"的通式，其中A是
單糖或二糖，B'是CrC2。垸基、具有取代的C6-C20芳基的d-C20、含有N、
0或S雜原子的CVC2o雜環(huán)；BZ是
——^~(XR3)nR4-
(R2)3
其中R'是C廣C2o垸基；CrC2o醚；具有N、 O或S的取代基的Q-C^ 垸基；雜原子C6-C2。芳基、d-C2o羰基、CrC加酰胺基、(^-(:2()醚、C6-C20 芳基、含有N、 0或S雜原子的C6-C2o雜環(huán)；在每一情況中，f獨立 為H、 d-C2。烷基、具有CrC加烷基的取代基的C2-C2o烷基；在每一情 況中，X獨立為不存在、氧、硫或氮；在每一情況中，W獨立為不存 在、C,-C2。烷基、具有取代的C6-C2o芳基的CVC2()、含有N、 O或S雜 原子的C6-C2o雜環(huán)；n是0和30之間的整數，包括0和30;在每一情
況中，R"獨立為不存在、C,-C2Q烷基、具有取代的CVC2Q芳基的C,-C20、
C,-C2。羰基、C廣C2o酰胺基、C,-C2o醚、Q-C2。芳基、含有N、 O或S
雜原子的Q-C20雜環(huán)；和BS是不存在或C廣C20垸基、C4-C20醚；具有N、 0或S的取代基的C廣C2o垸基；C廣C2o酯;C廣C2o醇;C廣C2。鏈烯
基；雜原子C6-C2。芳基、含有N、 0或S雜原子的CVC2o雜環(huán)。
提供發(fā)明的方法，其包括用含有發(fā)明的底物和發(fā)明的內標的 分析溶液溫育樣品，并且對所形成的樣品進行質譜法分析。本發(fā)明的 方法消除了現有技術使用洗滌劑、使用者不友好溶劑如氯仿和液-液和 液-固相提取步驟的需要。因此，本發(fā)明的方法比現有技術方法所花時 間更少。
附圖簡述 圖l是用于檢測溶酶體貯積病的示例性底物結構。 圖2是使用本發(fā)明底物的一般酶反應方案。 圖3是本發(fā)明底物和現有技術底物之間的主要結構差異。圖4是與現有技術底物相比，本發(fā)明底物給予的檢測靈敏性增
加的機制。 圖5是采用雙重標記本發(fā)明底物檢測酶活性的可選方法。
圖6是使用質譜法檢測酶反應的發(fā)明方法，其與現有參照方法 相比具有優(yōu)勢。 圖7是根據本發(fā)明以及相應空白(blank)的針對法布里病的底 物樣品的串聯質譜。 圖8是涉及用于蓬珀病的GAA的本發(fā)明底物的串聯質譜，針對 患病樣品、健康樣品或空白。 圖9是表明在12個來自健康新生兒對象的樣品和3個來自蓬珀
病陽性的新生兒對象的樣品中有差別的GAA活性的散點圖。

圖10是一個實例，其中，通過使用含有兩種類型的底物和內
標的分析溶液處理樣品，本發(fā)明底物和內標被用于多元方法(multiplex)中。圖11是洗滌劑對本發(fā)明的內標的靈敏性的影響。圖12是在存在或不存在洗滌劑以及相應空白的情況下針對蓬
珀病的本發(fā)明底物樣品的有差別的串聯質譜。優(yōu)選實施方式詳述 本發(fā)明具有作為用于檢測溶酶體貯積病的分析試劑的效用。
通過應用容易溶解在適于質譜法分析的溶液中的底物和內標，檢測與 溶酶體貯積病相關的異常酶活性是更可行的而且較不麻煩的。 本發(fā)明涉及溶酶體酶耙向的底物，所述溶酶體酶包括酸性ot-半乳糖苷酶A (GLA)、酸性(3-葡糖腦苷脂酶(ABG)、半乳糖腦苷脂oc-半乳糖苷酶(GALC)、酸性a-葡糖苷酶(GAA)。這些酶對底物的作用被 用來在樣品中測量相應的異常酶活性，因此這些底物被用來檢測下列 溶酶體貯積病法布里病(GLA)、高歇病(ABG)、克臘比病(GALC)和 蓬珀病(GAA)。 發(fā)明的底物具有A—(B1—BZ—BS)的通式，其中A是單糖或二
糖，B'是d-C20垸基、具有取代的(VC2()芳基的d-C20、含有N、 O或S
雜原子的QrC2。雜環(huán)；82是
—^~(XR3)nR4-
(R2)3
其中W是C廣C2Q烷基；GrC2。醚；具有N、 O或S的取代基的d-C^ 垸基；雜原子C6-C2o芳基、C,-C2o羰基、C,-C2o酰胺基、CrC2o醚、C6-C20 芳基、含有N、 0或S雜原子的C6-C2Q雜環(huán)；在每一情況中，W獨立 為H、 CrC加垸基、具有CrC2o烷基的取代基的C2-C2o垸基；在每一情 況中，X獨立為不存在、氧、硫或氮；在每一情況中，W獨立為不存
在、C「C20烷基、具有取代的C6-C20芳基的d-C2Q、含有N、 O或S雜
原子的C6-C加雜環(huán)；n是0和30之間的整數，包括0和30;在每一情 況中，R"獨立為不存在、C廠C2。垸基、具有取代的Q-C2q芳基的d-C加、 C廣C加羰基、C廣C2o酰胺基、C廣C2o醚、CVC2o芳基、含有N、 O或S
雜原子的C6-C2Q雜環(huán)；和BS是不存在或Q-C2o垸基、CVC2Q醚；具有
N、 0或S的取代基的C,-C2。烷基;C廣C2o酯;Q-C2o醇；C廣C加鏈烯 基；雜原子C6-C2。芳基、含有N、 0或S雜原子的CVC2()雜環(huán)。
部分通過糖部分A例如A為單糖或二糖中的結構變化，提供底 物對特定溶酶體酶的特異性。示例性的糖部分包括用于檢測蓬珀病的 a-D-葡萄糖；用于檢測高歇病的(3-D-葡萄糖；用于檢測法布里病的a-D-半乳糖；和用于檢測克臘比病的(3-D-半乳糖。此外，底物的特異性也 通過BS的脂肪?；鶊F內的碳長度和飽和程度的變化來賦予。BS的示例 性化學結構包括特異性用于檢測蓬珀病的十二碳脂肪?；鶊F；特異性 用于檢測高歇病的十四碳脂肪?；鶊F；特異性用于檢測法布里病的十 六碳脂肪?；鶊F；和特異性用于檢測克臘比病的十八碳脂肪酰基團。
81是連接部分，其行使將糖部分A與底物的其余結構結合的功 能。Bi也作為糖部分A與底物的其余結構之間的間隔區(qū)行使功能，以便 對耙酶提供靈活的接近。 季銨基團是82的關鍵成分。該基團攜帶永久電荷，在大多數 情況下，為正電荷。在酶反應后，由于位于BZ上的季銨基團的存在， B'-B、BS的切割產物帶有期望的質子親和力和離子化效率(ionization efficiency)。這種特性在串聯質譜法分析中導致高信號，并且在所有的 分析中導致更少的限制。另外，永久電荷使本發(fā)明底物更溶于含水緩 沖液中，以便避免對于使用非常非極性溶劑如氯仿的需要。與現有技 術底物相比，根據本發(fā)明的底物更加親水，并且更少需要或者不需要 洗滌劑。這是優(yōu)點，因為像使用氯仿一樣，使用洗滌劑要求麻煩的清 潔步驟，包括勞動強度大的液-液和液-固相提取步驟。
底物的終端結構上為BS基團。如上所述，通過賦予碳鏈不同 的碳長度和/或飽和度，結構上調整BS以提供對各種酶的特異性。因此， 非常相似的底物被合成，它們的分子量發(fā)生質譜法分析可區(qū)分的變化。
因此，如在本發(fā)明預想的，可合成具有四種不同糖的底物， 每一個對特定溶酶體酶具有特異性，并且每一個的亞基團(subgroup)B3 具有輕微不同的鏈長。因此，在底物被用于多元分析一一其中兩種或 多種在同一樣品中或者在微量滴定板的相同管或孔中進行分析的情況 下，質量上的變化允許通過質譜法鑒別四種底物的每一個和相應的酶 產物。因此，該組合物考慮單一合成方案(single synthesis scheme)。在 現有技術中，每一底物要求獨特的合成途徑。具有兩種或更多種這些 底物的共同合成途徑，可意味著生產環(huán)境明顯節(jié)約，這是由于較短和 較不復雜的生產過程和應用共同的原料。 對于檢測蓬珀病，示例性糖部分是a-D-葡萄糖，并且示例性 BLB、BS部分是4-氨基苯基-肉堿基(cartnitinyl)-烷基鏈，其中83的長度
10為10-20個碳，優(yōu)選長度為12個碳。對于檢測高歇病，示例性糖部分是
(3-D-葡萄糖，并且示例性B、B、BS部分是4-氨基苯基-肉堿基-烷基，其 中BS的長度為10-20個碳，優(yōu)選長度為14個碳。對于檢測法布里病，示 例性糖部分是a-D-半乳糖，并且示例性B、B、BS部分是4-氨基苯基-肉堿 基-烷基，其中83的長度為10-20個碳，優(yōu)選長度為16個碳。對于檢測克 臘比病，示例性糖部分是P-D-半乳糖，并且示例性B部分是4-氨基苯基 -肉堿基-烷基，其中BS的長度為10-20個碳，優(yōu)選長度為18個碳。
本發(fā)明也涉及內標，其被設計用來測量在酶反應后，從本發(fā) 明底物切割的具有通式B'-B、BS的產物的量。內標結構上與切割產物相 同，只是由于包括同位素標記在內的修飾步驟，內標的質量與電荷之 比(m/z)與切割產物不同。因此，本發(fā)明的內標是穩(wěn)定的同位素標記的 切割產物的類似物，其中一個或多個原子被相應的原子的同位素取代， 以便產生質量的變化。這類標記的實例是用ZD取代BS?；系?11。結 果，具有取代的20的"較重的"內標分子在質譜法譜結果上顯示與切 割產物通常顯示的不同m/z。質量的變化被用來在質譜法實驗中識別切 割產物與內標。這是可能的，因為己知濃度的內標被加入到分析溶液 中。在一個具體的實施方式中，本發(fā)明底物的B'亞基團是取代的
氨基苯基。在另一個具體的實施方式中，結合的B、BS亞基團是具有帶正
電季銨部分的酰基肉堿，并且其?；驳奶奸L度為12到18。在另一個具體的實施方式中，用氘標記內標以引起從相應切
割產物的3到9道爾頓的質量變化。在另一個具體的實施方式中，特異性用于檢測克臘比病的本
發(fā)明底物的基團A為p-D-半乳糖、基團Bi為甲基、基團BS為具有季銨末
端的酰胺基以及基團BS為具有12到20個碳長度的鏈烯醇。在又一個具體的實施方式中，特異性用于檢測高歇病的本發(fā)
明底物的基團A為p-D-葡萄糖、基團B'為甲基、基團BS為具有季銨末端
的酰胺基以及基團BS為具有12到20個碳長度的鏈烯醇。本發(fā)明也涉及測量樣品內靶向溶酶體酶的活性的方法。該樣
品包括血清、血漿、全血、尿、唾液或其它生物流體或組織溶胞產物的樣品。該樣品在濾紙基質上沉積并干燥。然后，切除一部分的濾紙 樣品，并將其沉積在化驗管或微量滴定板孔中，向其中加入分析溶液。 分析溶液包括含水緩沖液、底物和內標，以及需要的蛋白酶抑制劑如 用于競爭性糖苷酶的抑制劑。然后，將樣品混合物在30至41攝氏度的
特定溫度下溫育30分鐘至8小時范圍的確定時間。溫育完成后，通過加
入用于沉淀酶的溶液來中止酶反應。示例性的溶液類型包括醇、乙腈 或稀釋的三氟乙酸。將部分溫育混合物轉移到新的分析容器中，向該 容器中加入凈溶液如甲醇、乙腈、水-甲醇混合物或水-乙腈。本領域普 通技術人員選擇其它類型的凈溶液，以與串聯質譜法分析相容。用等 分凈溶液這樣稀釋的檢測樣品減少內生競爭性物質的量，以便相對增 加串聯質譜法分析的靈敏性。將稀釋的樣品直接而沒有進一步修飾地 注入串聯質譜儀，這通過手動進行或者在自動取樣器和液體處理裝置 的幫助下自動進行。將串聯質譜儀設定為同時檢測加入的底物、相應 的所形成的酶產物和相應的內標。這樣的檢測通過母離子掃描、母體 離子掃描或多反應監(jiān)控掃描來實現。將串聯質譜儀設定為檢測一種或 多種底物、產物和相應的內標。觀察的產物和相應內標的相對豐度
(abundance)被用來測量相應的酶活性。 當從新生兒患者和兒童患者中篩查血液時，通常使用干血斑 形式的樣品。對于這些患者對象，收集血液，并且保存在濾紙上的是 可容易收集和容易儲存的實驗室樣品。在用分析溶液溫育前，可以洗 脫濾紙上的樣品。洗脫的步驟是從干濾紙將蛋白質釋放入含有水基緩 沖液如磷酸鹽緩沖鹽水和蛋白酶抑制劑的水溶液中。蛋白酶抑制劑可 以例如包括下列的一種或多種終濃度50到400昭/ml的AEBSF鹽酸鹽、 終濃度0.2到25 mg/ml的EDTA二鈉脫水物(EDTA disodium dehydrate)、 終濃度0.5到1 pg/ml的亮抑酶肽半硫酸鹽和終濃度0.5到l iug/ml的抑胃 酶肽A。洗脫可以進行20到60分鐘的時間，這取決于使用的樣品的大小， 并且可以使用立式或臥式振動促進。然后，將液體洗提物手動地或通 過自動化液體控制儀器轉移到管或微量滴定板。 從干血樣品溶解的總蛋白通過方法例如比色二辛可寧酸 (bicinchoninic acid， 2,2'-聯喹啉-4,4'-二羧酸)(BCA)分析法來量化。采用 這種方法，使用濃度為2、 1、 0.5、 0.2和0.05 mg/ml的牛血清白蛋白作為標準，產生蛋白標準曲線。用lml的混合BCA試劑稀釋樣品，旋轉混 合，并且在37。C下溫育60分鐘。使樣品冷卻至室溫，并且對照水空白 進行分析。在聚苯乙烯刮匙(curette)中，通過監(jiān)控562 nm下的吸光度來 分析樣品。平均的患者吸光度值經由線性回歸被空白修正并且與標準 對比。 在具有或不具有如上述首先溶解的情況下，干血樣品在分析 溶液中溫育。特別地，分析溶液是水基的。分析溶液含有適當的緩沖 液如磷酸鹽緩沖鹽水、適當的蛋白酶抑制劑如競爭糖苷酶的蛋白酶抑 制劑、底物——其用同位素進行標記、和內標——其用不同的同位素 進行標記。蛋白酶抑制劑包括下列的一種或多種糖苷酶抑制劑、終 濃度50到400 lug/ml的AEBSF鹽酸鹽、終濃度0.2到25 mg/ml的EDTA二 鈉脫水物、終濃度0.5到1昭/ml的亮抑酶肽和終濃度0.5到l昭/ml的抑胃 酶肽A。在溫育期間，底物和內標均被感興趣的酶從干血樣品切割以形 成各自的產物。 在一個方面，通過加入純的醇、乙腈或稀釋的三氟乙酸來終 止溫育反應。從酶反應形成的產物是相當極性的，這主要是由于內在 (built-in)的帶正電荷部分例如季銨陽離子，因此，不需要使用非極性溶 劑如氯仿來終止酶促反應和保持產物于溶液中。由于MS/MS系統(tǒng)的復 雜性，最終經歷MS/MS系統(tǒng)的蛋白質需要處于不"有害于"MS/MS系 統(tǒng)的溶劑中。例如，這些溶解不應該是洗滌劑基的，也不應該含有腐 蝕劑如氯仿。優(yōu)選純的乙醇或純的甲醇，這僅僅因為其在機械干燥過 程中容易蒸發(fā)。在氮氣流中溫和加熱該板或氮氣或者加熱兩者，使用 特別設計用于該目的的干燥器，干燥包含于液體提取物中的有機溶劑。
對于待被檢測的每個酶， 一組特異性底物和內標被包含在分 析溶液中。分析溶液被設計為對于特定酶的檢測是獨特的和特異性的； 可選地，其被如此設計以對于同時檢測多種酶是適合的和通用的。在 單獨的管、小瓶中或者用多孔濾板如96-孔或386-孔濾板，實行溫育。
濾紙上樣品的所需大小和因此可有效用于檢測的干血的所需 量隨待被檢測的酶的數目而變化。實際上，對于單一酶的分析，通常 使用的濾紙上干血斑樣品的大小為l-3 mm。當待被分析的酶在樣品中 具有相對低的存在時，這種類型的樣品是特別有用的，因為在單一分析物分析的情況中，不需要多種酶提取?？蛇x地，相對高表達水平和/ 或酶活性的酶從更大尺寸的一個樣品中同時分析出。例如，含有干血
斑的3-10 mm的濾紙被水解，并且被用作多種酶檢測的統(tǒng)一的樣品來 源。 任選地，將酯化步驟加入到溫育步驟以衍生檢測樣品。更長 且更高的溫度條件與較冷的、較短的衍生條件相比傾向產生更強烈的 酰基肉堿水解。通過應用干燥氮除去衍生試劑，停止反應。在適合 MS/MS分析的類型的液體基質中，重構衍生的樣品。使用電霧化離子 化的通用方法需要揮發(fā)性的部分有機基溶劑，該溶劑任選地輕微酸化。 通常使用的溶劑是相等的乙腈和水的混合物。另外，甲酸可以以小百 分比加入，以酸化溶劑和增強離子化。 用于感興趣的選定蛋白的底物是天然或合成源的。感興趣蛋 白由與疾病狀態(tài)或先天缺陷相關的酶或者為醫(yī)學目的而被常規(guī)分析的 酶構成。感興趣的酶底物包括酸性a-半乳糖苷酶A、酸性P-葡糖腦苷脂 酶、酸性半乳糖腦苷脂a-半乳糖苷酶、酸性鞘磷脂酶和酸性a-葡糖苷酶。 通式A-B^B、BS的發(fā)明組合物在溶劑例如純的甲醇或純的乙 醇中是親水性的。A是單糖或二糖。Bi是連接臂，82含有永久帶正電的 季銨陽離子，BS是長的碳尾(carbon tail)。 A部分的類型或B、B、BS部分 中烷基鏈的長度根據檢測的靶酶而不同。設計連接臂B'以便賦予相對 親水的特性。特別地，連接臂B'具有氫酚(hydrophenol)結構。B'-B、B3 部分全部是親水性的，以確保底物良好的溶解性，并且它具有堿性基 團例如永久帶正電的季銨陽離子，其被ESI有效地質子化，并且因此確 保通過質譜法靈敏檢測。 在一個實施方式中，本發(fā)明提供式A^31—BZ—BS的試劑，其 中A是單糖或二糖，并且優(yōu)選地為乙醛糖或己酮糖；B是酚、硝基酚或 苯酯如苯甲酸苯酯；BS含有從這樣的結構延伸的側鏈季銨陽離子，在 單獨縮合到B'或還與BS尾縮合之前該結構是肉堿，<formula>formula see original document page 15</formula>
A是單糖或二糖，B'是d-C2o烷基、具有取代的C6-C2o芳基的d-C2。、含 有N、 0或S雜原子的C6-C2o雜環(huán)；82是
<formula>formula see original document page 15</formula>
其中W是C廣C2o垸基；CrC2o醚；具有N、 O或S的取代基的C廣C20 垸基；雜原子C6-C2Q芳基、含有N、 0或S雜原子的CVC2。雜環(huán)；在 每一情況中，W獨立為H、 d-C20垸基、具有d-C20烷基的取代基的 C2-C20烷基、C廣C20羰基、C廣C20酰胺基、C廣C20醚、C6-C20芳基、含有N、 0或S雜原子的CVC2o雜環(huán)；在每一情況中，X獨立為不存在、 氧、硫或氮；在每一情況中，W獨立為不存在、CpC2。烷基、具有取
代的CVC2o芳基的d-C2()、含有N、 0或S雜原子的C6-C2Q雜環(huán)；n是 0和30之間的整數，包括0和30;在每一情況中，R"獨立為不存在、
Q-C20烷基、具有取代的CVC2()芳基的C廣C2()、含有N、 O或S雜原子 的CVC20雜環(huán)；和B3是不存在或d-C加烷基、C4-C2o醚；具有N、 O 或S的取代基的C廣C2o垸基；C廣C2o酯；C廣C2o醇；C廣C2o鏈烯基；雜 原子C6-C20芳基、含有N、 O或S雜原子的C6-C20雜環(huán)。 圖l示出用于檢測溶酶體貯積病的示例性底物結構。該結構由 葡萄糖或半乳糖形式的銜A)和脂肪族基團B構成。基團B進一步由硝基 苯基形式的連接臂(B1)、肉堿基的BZ亞基團和具有碳長度范圍為12、 14、 16或18的烷基形式的BS亞基團。位于BS亞基團上的季銨陽離子提供免 于需要進一步離子化的離子，該離子化在別的情況下是質譜法檢測需 要的。 圖2表明使用本發(fā)明底物的一般酶反應。在特異性親和結合和 酶反應后，底物被切割成兩個基團，糖部分A和脂肪族基團B。基團B 由硝基苯基、肉堿基和長鏈烷基部分構成。然后，這兩個基團都用 MS/MS分析。內標也同時進行MS/MS分析。內標是同位素標記的B的 類似物，其中用氘取代甲基基團上的氫原子(一個或多個)。
圖3闡明本發(fā)明底物和本領域已知的現有技術參照底物之間 的主要結構差異。主要在長鏈?；糠执嬖诓町?，其中與現有技術底 物相比，本發(fā)明底物中存在的永久帶正電的季銨陽離子為了下游質譜 法分析的目的，使其本身成為"現成的"離子。因此，不需要進一步 的離子化，并且因此沒有信號強度的損失。此外，與現有技術底物相 比，本發(fā)明底物化學非極性更小。因此，溶解本發(fā)明底物的溶劑既不 須是極端非極性的，也不需要加入洗滌劑。極端非極性溶劑例如氯仿 不是使用者友好的，并且不被推薦用于ESI-MS/MS。洗滌劑的應用也 降低了質譜儀的功能性，因為洗滌劑非?？焖俚匚廴举|譜儀的內部部 件，以致引起性能明顯降低。當使用這樣的試劑時，在樣品進行MS/MS 分析之前，需要增加額外的步驟來除去這些試劑。為了回收待被分析 的產物，現有技術在液-液提取步驟中，使用氯仿或乙酸乙酯。為了除去洗滌劑，現有技術使用固相提取。因此，盡管可能在臨床實驗室中 改變這些過程，但是如果不是不可行的，現有技術底物使它們的應用 極端麻煩。 圖4闡明本發(fā)明底物和現有技術底物之間的結構差異。在親 和識別和酶反應之后，部分本發(fā)明底物——被稱為"酶產物"，被切割。 不像從現有技術底物制造的產物，本發(fā)明的酶產物具有固有的"現成 的"離子(下半部分圖)——其是永久帶正電的。被引入質譜儀的任何分 析物必須被賦予作為待檢測的離子。影響靈敏性的最重要因素之一是 離子化效率，即暴露于離子源后，分析物離子化的容易程度。暴露于 離子源后，分子彼此競爭質子。具有高質子親和力的分子對于質子結 合的競爭更有效，并且被更有效地離子化。在已經擁有了永久正電荷 的本發(fā)明分子的情況中，分子被質子化；結果是，本發(fā)明的酶產物發(fā) 出更大數量級的信號強度。 圖5示出使用根據本發(fā)明的發(fā)明方法測量酶表達和活性的過 程中的差異。發(fā)明方法允許同時測量底物水平的減少和產物水平的增 加。這相比于僅僅測量酶反應產物的本領域其它方法是有利的。因此， 發(fā)明方法提供更高的靈敏性和特異性。對于本發(fā)明底物，A部分和B部 分都用第一信號標記物標記。示例性信號標記物是同位素標記。對于 用于底物的發(fā)明的內標，A部分和B部分都用與第一信號標記物不同的 第二信號標記物標記。信號標記物第一號和信號標記物第二號每一個 獨立地是下列之一碳-12、碳-13、氕、氘、碘-131、氮-15、磷-31、 氦-3和鈾-238。 圖6闡述示例性的發(fā)明方法，其中下部分圖表描述使用質譜法 檢測酶反應，與在該圖上部示出的現有技術參照方法相比，該方法具 有優(yōu)勢。與現有技術方法相比，發(fā)明的方法消除了應用非極性底物和 它們的相對內標固有的許多步驟。更具體而言，發(fā)明的方法不再需要 用于清除非極性溶劑和/或洗滌劑的步驟——包含它們對質譜儀器是有 害的。這些步驟包括通過液-液提取步驟除去氯仿，通過硅膠分離步驟 除去洗滌劑，和固相提取(SPE)方法的步驟。這些額外的步驟也增加了 添加到下游分析的統(tǒng)計誤差。因為根據本發(fā)明的底物相對于現有技術
17非極性更低，所以更小非極性的溶劑例如純的甲醇或純的乙醇在本文 是有效的。任選地，A部分和B、B、BS部分每一個均用信號標記物標記。 信號標記物位于包括C、 H、 P、 N或S的一個或多個原子上。信號標記 物包括但不限于熒光標記物和同位素標記物。在同位素標記的情況下， 底物結構中的至少一個原子用穩(wěn)定的同位素取代。例如，用D取代氫， 或者用^C取代12。 當通過結合針對各自酶的多種底物而同時檢測一種以上疾病 時，底物不但在賦予酶特異性的糖部分類型上不同，也在83尾部分的 長度上不同。在使用MS/MS作為檢測工具時，這是特別重要的，因為 具有相應的有差別的質量指數(mass index)的有差別的本發(fā)明底物分子 與被檢測的不同酶相應。 使用內標測量樣品中蛋白質的絕對數量的量(absolute quantitative amounts)。內標被同位素標記，以量化酶反應的親和標記產 物。內標與通過酶對親和標記的酶底物作用產生的標記的酶產物化學 上相同，但是內標攜帶同位素標記——其可以包括D、 13C、 15N、 170、 180或345，這樣允許通過MS技術獨立檢測同位素標記的類似物。內標 與從消化親和標記蛋白產生的相應的親和標記肽化學上基本相同，除 了它們被不同地同位素標記，以使它們被MS技術獨立檢測。內標被不 同地標記在其糖部分A和連接部分B、B、BS上。使用質譜法，提供同時 的測量，以便底物信號的減小和產物A以及B'-B、BS的增加被同時記錄。 這種設計增加分析的靈敏性和特異性。 應用通用底物混合緩沖液提取每個患者的單一干血樣品，隨 后分配入多個分析反應中，對于自動和高產量篩選是有優(yōu)勢的，因為 其避免需要從同一干血樣品獲得數個樣品穿孔(sample punch)。這也減 少濾紙上的血液不均勻分布引起的變化。應用通用底物混合緩沖液也 減少濾紙上血液不均勻分布引起的變化。提取效率可以隨著被分析的 不同酶而變化。特別地，選擇發(fā)明的通用底物混合緩沖液的組合物以 確保酶的最高性能，這使得所有酶的最低特異活性被檢測到。
任選地，包括底物、切割產物和內標的所有試劑被反相HPLC 純化至均勻，并且被高磁場ESI-MS表征。分析成分例如酶底物、分析產物和內標被通過介質處理以便除去過量的緩沖液成分。除去緩沖液 成分特別適合用于串聯質譜法，因為認為分析物的電霧化離子化被過 量緩沖液成分的存在所抑制。 就使用根據本發(fā)明的底物試劑和ESI-MS測定酶所描述的方 法可以被廣泛應用。多種技術可被擴展以在單一反應中同時檢測許多 或多種酶，這排除了多個分析的需要，有助于證實罕見疾病的診斷。 當評估通過特定生物化學通路的化學通量的級別或者用于監(jiān)控生物化 學信號傳導通路時，該方法可被用來同時測量多種酶。因為使用的 ESI-MS檢測的高靈敏性——每個分析僅需要亞微克量的底物試劑，在 低-克規(guī)模上數百種底物試劑的合成變得實際和經濟。因為大多數酶活 性位點暴露于溶劑，所以將親和標記的連接子結合到大多數酶底物而 同時保持酶活性是可能的。
實施例 實施例1 對于每種樣品，將3mm直徑的圓片從濾紙上的干血區(qū)域打孔 入微量離心管或96-孔微量滴定板的孔中。然后，將該血圓片(blood disk) 用含有終濃度為3 mmol/L的針對法布里病的底物和終濃度為0.05 mmol/L的內標的分析溶液直接溫育。對于該分析溶液，也加入終濃度 0.5 mol/L的乙酸鈉緩沖液。含有血圓片的分析混合物在37。C下、在恒 溫空氣搖床中的軌道搖動(150rpm)下溫育15到24小時。在溫育時期后，
將等分的純甲醇(沒有使用氯仿)加入到每個管或孔中，以終止酶反應。 在進入質譜儀之前，該溫育的反應混合物被除去溶劑并且借助真空干 燥器干燥徹底(dry down)。對于質譜法分析，電噴霧源以正模式(positive mode)操作，離子以母離子和中性損失掃描模式(parent-ion and neutral-loss scan mode)檢測。通過使用注射器驅動，流動注入通過熔融 硅石毛細管，將干燥的樣品以3W/min的流速引入。從產物與內標的離 子豐度比率減去空白值，計算酶產物的量。如在圖7中所示，內標在m/z為494.5處被檢測；針對法布里病 的底物的酶產物在m/z為491.5處被檢測，在水空白中為最小量(上圖)， 在存在干血樣品下(下圖)為顯著量。實施例2 使用針對蓬珀病的底物的酶反應和隨后的質譜法分析用在實 施例1中詳細說明的方法實行。 圖8示出如此實施例，其中使用a-D-葡萄糖作為糖部分，合成 本發(fā)明底物，例如在圖l中描述的那些，因此對溶酶體酶GAA(蓬珀病) 具有特異性。選擇對于該具體實施例的垸基鏈含10個碳，并且因此在 底物的合成中使用癸?；?肉堿。相似地，使用癸酰基-肉堿合成相應的 內標，在肉堿基部分的3個甲基中的一個上將3個氫取代為気。使用這
種底物和內標，來自兩個新生兒--個健康的個體和另一個證實為
蓬珀病陽性的個體的干血斑樣品被用如圖5中描述的本發(fā)明方法處理。 另外，不含有血液的空白濾紙樣品按照與干血斑相同的步驟進行處理。 含有緩沖液、底物、抑制劑和內標的相同的分析溶液被用于所有三個 樣品。因此，所有樣品接受相同濃度的試劑。在Waters Quattro Micro ESI-triple四極串聯質譜儀上，使用176的母離子掃描，分析最終的樣 品溶液。在光譜中示出的主峰是與完整底物、內標和相應的酶產物相 應的。因為所有的樣品用同樣濃度的試劑處理，產物和內標之間的相 對豐度表明了樣品之間的相對酶活性。 這些譜清楚表明，在健康的個體中有豐富的GAA活性，因為 根據產物的豐度相對于內標的豐度，底物轉化為產物是非常明顯的。 與之相反，相應于蓬珀病陽性新生兒的樣品顯示可忽略不計的GAA酶 活性，因為沒有明顯的底物向產物的轉化。在蓬珀病陽性新生兒的譜 中明顯的對應于產物的小峰被描述為背景。對處理空白樣品所形成的 譜的檢査也顯示對應于產物的小峰。在這種情況中，由于該樣品中不 存在血，明顯的是樣品處理引起底物低程度的非酶水解。在蓬珀病和 空白的譜中的產物/內標峰的相對豐度的比較表明，在蓬珀病陽性樣品 中的小的產物峰主要是由于非酶水解。有小量的非酶底物水解的事實 并不令人吃驚，因為糖苷鍵是相當不穩(wěn)定的。然而，從該實施例明顯 可見，在與健康個體中產物轉化的量相比，非酶底物水解的程度是可 以忽略不計的。因此，這種背景不應該對該方法有任何限制。這些譜 清楚表明本發(fā)明底物的效用，因為它們明顯表明其是臨床特異性的、靈敏的并且穩(wěn)定的。進一步，這些試劑保留它們的效用，同時允許顯 著簡化的分析。
實施例3 圖9示出處理12個來自健康新生兒的和3個來自蓬珀病陽性的 新生兒的干血斑樣品的結果。使用的試劑和方法與圖6中描述的那些相 同。因為以己知濃度引入內標，所以通過將產物和內標的相對豐度和 內標的濃度相關聯，量化酶活性是可能的。該圖示出對于15個研究的 對象以微摩爾/小時/升的血液單位表示的確定的酶活性的散點圖。從該 圖，明顯可見，在健康新生兒的GAA活性和受侵襲的新生兒的活性之 間存在明顯不同。三個蓬珀病患者記錄的活性與那些健康的個體相比 忽略不計。注意，如在圖6中所描述的，非酶水解產生小程度的背景。 這里提供的數據沒有對背景修正。健康和患病之間的差異仍然是顯著 的。
實施例4 圖10示出如此實施例，其中通過使用含有兩種類型的底物和 內標的分析溶液處理樣品，在圖l中描述的本發(fā)明底物和內標被用于多 元方法中。在底物靶向蓬珀病和其它克臘比病時，使用的方法與在圖8 中描述的方法相同，唯一的差別在于現在分析兩種酶的底物。蓬珀病 底物是用癸?；?肉堿制備的圖l的底物，克臘比病底物是用四癸?；?肉堿(tetredecanoyl-camitine)制備的圖1的底物。在該實施例中使用的樣 品是來自健康新生兒的干血斑樣品。另外，不含血液的空白溶液樣品 按照相同的過程處理。與在圖8中描述的單一酶分析相比，在圖10的譜 中示出的主峰與加入到溶液中的完整的兩個底物、加入到溶液中的兩 個內標和兩個相應的酶產物相應。 在該實施例中，可見兩種或多種酶的活性可同時檢測，同時 保持足夠好的靈敏性。該實施例通過提供對該方法的附加簡化進一步 表明本發(fā)明的效用，因為其可能鞏固樣品制備。實施例5圖ll示出洗滌劑對本發(fā)明的內標的靈敏性的影響。這些數據
被用來例證洗滌劑對分析的總體靈敏性的影響。盡管在質譜法分析之 前內標已經帶電的事實，離子抑制可仍舊在它們的靈敏性中起作用。 已知洗滌劑引起重要的離子抑制。在這種情況中，具有和不具有洗滌 劑的凈溶液(純甲醇)中的內標的靈敏性得以顯示。另外，在具有和不具 有洗滌劑的、含有提取的干血斑的溶液中內標的靈敏性也被顯示。在
該實施例中，含有a-和p-葡萄糖和半乳糖的數種垸基鏈長度的內標被溶 解在凈溶液中，或者溶解在分析溶液中，使用這些溶液，如圖8和10中 描述的提取和處理干血斑。在該實施例中，等分的每種溶液類型不含 洗滌劑，另一種溶液含有洗滌劑。因此，在這些成對樣品中，唯一的 差異是存在或不存在洗滌劑。通過串聯質譜法分析該成對樣品。在每 一樣品中，內標的信號強度被記錄并被用來產生平均相對靈敏性。該 圖示出使用和不使用洗滌劑處理的樣品的歸一化的平均強度。明顯地， 洗滌劑引起離子抑制，這通過含有洗滌劑的樣品中的較低強度可見。 該圖也表明洗滌劑的影響在含有復合基質如血液的樣品中顯著得多， 因此更加需要在串聯質譜法分析中避免使用這類物質。
實施例7 圖12示出如此實施例，其中分析洗滌劑對酶活性的影響。在 該實施例中，含有ot-D-葡萄糖和16-碳脂肪酸鏈的本發(fā)明的底物(圖l)被 用來根據圖6中描述的過程處理干血斑。為了檢測洗滌劑的影響，同一 患者的平行樣品根據上述方法在具有和不具有洗漆劑情況下進行制 備。圖ll表明洗滌劑降低分析的靈敏性。然而，問題是洗滌劑是否對 酶活性有影響。在圖12中示出的譜明確表明洗滌劑的確對評估的酶活 性具有影響。在這種情況下，分析溶液中缺乏洗滌劑增強酶活性的速 率，如對于在沒有洗滌劑的情況下處理的樣品，與相應的內標相比產 物豐度更多升高所表明的。通過表明通過減小離子抑制和增強靶酶的 活性，不但方法可以被簡化，而且在這樣進行時增強了分析的靈敏性， 該實施例進一步再次證實本發(fā)明的效用。
在說明書中提到的專利文獻和出版物表明本發(fā)明涉及領域的 普通技術人員的水平。這些文獻和出版物被引入本文作為參考，引入 程度如同每一獨立文獻或出版物被明確和單獨引入本文作為參考的程度。前述說明書是說明本發(fā)明的具體實施方式
，但是不意欲限制其 實踐。所附權利要求書包括其所有的等同物意圖限定本發(fā)明的范圍。
權利要求
1. 用于酶的質譜分析的底物，具有下式A—(B1—B2—B3) (I)其中A是單糖或二糖，B1是C1-C20烷基、具有取代的C6-C20芳基的C1-C20、含有N、O或S雜原子的C6-C20雜環(huán)；B2是其中R1是C1-C20烷基；C4-C20醚；具有N、O或S的取代基的C1-C20烷基；雜原子C6-C20芳基、C1-C20羰基、C1-C20酰胺基、C1-C20醚、C6-C20芳基、含有N、O或S雜原子的C6-C20雜環(huán)；在每一情況中，R2獨立為H、C1-C20烷基、具有C1-C20烷基的取代基的C2-C20烷基；在每一情況中，X獨立為不存在、氧、硫或氮；在每一情況中，R3獨立為不存在、C1-C20烷基、具有取代的C6-C20芳基的C1-C20、含有N、O或S雜原子的C6-C20雜環(huán)；n是0和30之間的整數，包括0和30；在每一情況中，R4獨立為不存在、C1-C20烷基、具有取代的C6-C20芳基的C1-C20、C1-C20羰基、C1-C20酰胺基、C1-C20醚、C6-C20芳基、含有N、O或S雜原子的C6-C20雜環(huán)；和B3是不存在或C1-C20烷基、C4-C20醚；具有N、O或S的取代基的C1-C20烷基；C1-C20酯；C1-C20醇；C1-C20鏈烯基；雜原子C6-C20芳基、含有N、O或S雜原子的C6-C20雜環(huán)。
2. 權利要求l所述的底物，其中A和(B'—B2—B勺由于所述酶的 作用分開。
3. 權利要求l所述的底物，其中A是乙醛糖或己酮糖。
4. 權利要求l所述的底物，其中A是D-葡萄糖或D-半乳糖。
5. 權利要求1所述的底物，其中B'是具有從環(huán)延伸的取代基的。6芳基。
6. 權利要求l所述的底物，其中B!是苯基、硝基苯基或苯酯。
7. 權利要求6所述的底物，其中BZ是肉堿基。
8. 權利要求7所述的底物，其中BS是具有以羰基存在的0的取代基的C2-C2。烷基。
9. 權利要求l所述的底物，其中A和(B1^62—B"部分每一個包 括元素的穩(wěn)定二級流行同位素。
10. 權利要求9所述的底物，其中在每一情況中，所述穩(wěn)定二級 流行同位素選自2D、 13c、 15n、 170、 180、 "p和34s。
11. 用于酶的質譜分析的方法，包括將所述酶與根據權利要求1的式I A—(Bi—B2—B"的所述底物接 觸，以在酶反應后產生具有切割產物分子量的式(B'—BZ—B"的切割產 物；提供所述底物的式(B'—BZ—BS)，的內標，其中(B'—BZ—B3)，具有與所述切割產物分子量不同的分子量的至少一種穩(wěn)定二級流行同位 素，并且(Bi—B2—B3)'的B1、 82和BS如在根據權利要求1的式I中所詳述；和使用質譜分析，量化所述切割產物和所述內標之間的質量/電荷比。
12. 權利要求ll所述的方法，其中所述酶選自酸性a-半乳糖苷酶 A、酸性P-葡糖腦苷脂酶、半乳糖腦苷脂a-半乳糖苷酶、酸性鞘磷脂酶 和酸性a-葡糖苷酶。
13. 權利要求11所述的方法，其中所述^一BZ—B"的切割產物 與所述(Bi—BZ—BS)'的內標結構上相同。
14. 一種商業(yè)包裝，其包括根據權利要求1的式I A—(B'—BZ—B3)的底物作為活性成分；具有與(B1—BZ—B,不同的穩(wěn)定二級流行同位素 分子量的(B'—BZ—B3)，的內標；和用于通過質譜分析檢測樣品中的酶 活性的說明。
15. 用于酶的質譜分析的方法，包括用同位素標記物Ll標記根據權利要求1的式I A—(B'—BZ—B3) 的底物，以形成第一底物l乂A) — u(B'—B2—B3);用同位素標記物L2標記根據權利要求1的式I A—(Bi—B2—83) 的試劑，以形成第二底物、A) — "(Bi—B2—B3)，其中所述同位素標 記物L2不同于所述同位素標記物Ll;在容器中使所述第一底物U(A) — u(B'—BZ—B^和所述第二底物U(A) — "(B^B2—B"與所述酶結合，其中所述第一底物U(A) — li(b1一^一bS)被所述酵切割形成lia和u(b1一^一b3)，其中所述第二底物U(A) — l2(bi__b2_b3)被所述酶切割形成"A和 "(B1—B2—B3);和量化所述第一底物U(A) — u(B'—B2—B"和所述第二底物、A)— l2(b'一b2一b3)的減少，和所述L1A 、 "(b'—B2—b3) 、 L2A和L2(b1一b2一b3)的増加。
16. 根據權利要求15所述的方法，其中所述容器是檢測試管、檢 測小瓶或多孔微量培養(yǎng)板。
17. 根據權利要求15所述的方法，其中所述測量通過質譜法完成。
18. 根據權利要求15所述的方法，其中所述酶選自酸性ct-半乳糖 苷酶A、酸性f3-葡糖腦苷脂酶、半乳糖腦苷脂a-半乳糖苷酶、酸性鞘 磷脂酶和酸性a-葡糖苷酶。
19. 一種使用根據權利要求1所述的底物檢測在從個體收集的樣 品中的第一種溶酶體貯積病的方法。
20. 根據權利要求19所述的方法，進一步包括同時檢測第二種溶酶體貯積病。
21. 檢測溶酶體貯積病的方法，基本上如本文關于所附實施例的 任何一個所描述。
22. 用于克臘比病的質譜檢測的底物，其具有根據權利要求1的式A一(Bi—B2—B3)，其中基團A為(3-D-半乳糖、81為甲基、82為具 有季銨末端的酰胺基和B3為具有12到20個碳長度的鏈烯醇。
23. 用于高歇病的質譜檢測的底物，其具有根據權利要求1的式 A一(Bi一^一B3)，其中基團A為(3-D-半乳糖、B'為甲基、82為具有季 銨末端的酰胺基和B3為具有12到20個碳長度的鏈烯醇。
全文摘要
本發(fā)明的名稱是用于質譜法檢測的底物和內標。提供發(fā)明的底物，其包括式A-B¹-B²-B³的底物化合物其中A是糖部分；B¹是使部分A和底物的剩余結構連接的連接部分；B²含有永久帶電元素例如季銨基團，以便為質譜分析增加質子親和力和離子化效率；和B³具有賦予靶酶特異性的不同碳長度。也提供的是檢測溶酶體缺陷癥的方法，這通過將樣品與發(fā)明的底物連同內標接觸來完成，所述內標是被該底物的靶酶切割的產物的同位素標記類似物。
文檔編號C12Q1/34GK101426926SQ200780014149
公開日2009年5月6日 申請日期2007年3月13日 優(yōu)先權日2006年3月13日
發(fā)明者B·賽達 申請人:珀金埃爾默Las公司