專利名稱：低強度電場網(wǎng)絡(luò)介導遞送的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用低強度電場網(wǎng)向大動物和人的離體和體內(nèi)皮膚、軟組織、關(guān)節(jié) 和骨細胞遞送生物醫(yī)學治療學分子和制劑，包括藥物、基因、siRNA、蛋白質(zhì)、 肽、抗體的治療領(lǐng)域。 現(xiàn)有技術(shù)描述
電穿孔是一種向細胞和組織施加時間短、強度高的電場脈沖的技術(shù)。電刺激 可導致細胞膜不穩(wěn)定繼而形成納米大小孔洞。在此可滲透階段，細胞膜允許DNA、 酶、抗體和其它大分子通過進入細胞。電穿孔不僅使基因治療，而且使其它領(lǐng)域 例如經(jīng)皮膚藥物遞送和提高化療(效果)成為可能。自二十世紀80年代早期以 來，電穿孔就已作為一種研究工具使用，用來介導DNA、 RNA、蛋白質(zhì)、其 它大分子、脂質(zhì)體、乳膠微球，或全病毒顆粒進入活細胞。
電穿孔雖能有效介導外源基因進入活細胞，但由于采用杯形電極施加電脈 沖，該技術(shù)的應(yīng)用局限于培養(yǎng)細胞的懸浮液。電穿孔通常用于細胞系和原代培養(yǎng) 物的體外基因轉(zhuǎn)染，而用于組織的研究報道有限。在一項研究中，己證明對大鼠 腦腫瘤組織可用電穿孔介導基因轉(zhuǎn)染。組織電穿孔后立即動脈內(nèi)注射質(zhì)粒DNA。 休克療法三天后，在兩電極之間的電穿孔腫瘤組織中檢測到lac2基因或人單核細胞趨化蛋白-1 (MCP-1)基因的表達，但在毗鄰組織中未檢測到。
電穿孔也已用作大鼠肝組織基因遞送的組織靶向方法。該研究表明轉(zhuǎn)運的遺
傳標記(3-半乳糖苷酶(卩-gal)和熒光素酶48小時后獲得最高表達，約30-40%的 電穿孔細胞表達了 3 -gal，熒光素酶活性達到每mg組織2500pg的峰值水平。
在另一項研究中，將早期雞胚胎電穿孔與另兩種轉(zhuǎn)染方法微粒轟擊和脂質(zhì) 體轉(zhuǎn)染作比較。這三種轉(zhuǎn)染技術(shù)中，電穿孔產(chǎn)生的基因表達最強，擴展的胚胎區(qū) 域最大。
近年用電穿孔導管向家兔動脈壁遞送肝素，顯著提高了藥物遞送效率。 電場強度適當?shù)碾娒}沖可導致細胞膜短時可通透性(細胞釋放)，隨后導致 各種類型細胞，包括細菌、酵母、動物和人細胞等的快速基因轉(zhuǎn)化和操縱。另一 方面，高電場強度電脈沖可導致細胞膜永久性破壞(細胞裂解)。據(jù)目前可獲得 知識，施加于組織的電壓必須高達100-200 V/cm。如果我們在大動物或人器官上 (例如人心臟)使用電穿孔，電壓必須達幾千伏。這將導致大量組織損傷。因此， 該技術(shù)一直未應(yīng)用于臨床。
曾用電穿孔裝置作皮膚藥物遞送，采用2-6個針頭在皮膚上實施高電壓短時 脈沖。該系統(tǒng)由于針頭的直接傷害和高電壓沖擊造成了顯著的皮膚損傷和炎癥而 限制了其應(yīng)用。近年來公開的皮膚電穿孔微芯片裝置專利也采用高電壓，雖然還 未用于人和動物。
發(fā)明概述
已公開的許多實施方式能夠說明如何向組織施加LSEN或低電壓脈沖才能以 可接受的轉(zhuǎn)染效率遞送基因、蛋白質(zhì)和藥物的系統(tǒng)。第一種實施方式是用于向關(guān) 節(jié)及其相關(guān)軟組織和骨(細胞)遞送基因、蛋白質(zhì)和藥物的方法和裝置。在該系 統(tǒng)中，將一個裝有導管的長注射針插入關(guān)節(jié)囊中，然后拔掉導針。再將藥物、基 因、siRNA、 shRNA、肽、蛋白質(zhì)、抗體或其它生物醫(yī)學治療劑、或它們的組合 通過該導管注入。此外，可采用這些藥物、基因、siRNA、 shRNA、肽、蛋白質(zhì)、 抗體或其它生物醫(yī)學治療分子或制劑的抑制劑、增強劑、激動劑、拮抗劑、調(diào)節(jié) 劑、調(diào)控劑、修飾劑、或監(jiān)測劑、或它們的任何組合。然后活動關(guān)節(jié)使基因均勻 分布于關(guān)節(jié)內(nèi)。隨后將頂端連接陽極的電線插入到導管中。電線頂端伸出導管外。
10然后用裝有陰極陣列的襯墊包裹整個關(guān)節(jié)。用導電凝膠、折疊夾和繃帶使所有陰 極與關(guān)節(jié)皮膚緊密接觸。然后施加低強度電場網(wǎng)絡(luò)。
第二種實施方式是向肢體遞送基因、蛋白質(zhì)和藥物的方法和裝置。在此實施
方式中，用三種不同的方法將藥物、基因、siRNA、 shRNA、肽、蛋白質(zhì)、抗體
或其它生物醫(yī)學治療劑遞送入肢體內(nèi)。第一種方法是用靜脈泵或其它控制器經(jīng)血
管內(nèi)(靜脈和動脈)遞送基因、siRNA、 shRNA、肽、蛋白質(zhì)、抗體或其它生物 醫(yī)學治療劑。這種遞送應(yīng)在施加電場時連續(xù)進行。第二種方法是將基因、siRNA、 shRNA、肽、蛋白質(zhì)、抗體或其它生物醫(yī)學治療劑與溶液、油、凝膠或其它藥物 遞送物質(zhì)一同局部應(yīng)用。第三種方法是將基因、siRNA、 shRNA、肽、蛋白質(zhì)、 抗體或其它生物醫(yī)學治療劑通過皮下注射應(yīng)用。將陽極和陰極電極陣列以相同或 相似的方式安置在肢體或四肢上。
施加低強度電場網(wǎng)絡(luò)時，制作的電極陣列可裝在手的手套，腳的襪子，或手 臂袖套上，或其它與身體或組織表面相符的形式，以確保所有電極與皮膚緊密地 接觸。
第三種實施方式是向體表(包括皮膚和軟組織)遞送基因、蛋白質(zhì)和藥物的 方法和裝置。在此實施方案中，遞送藥物、基因、siRNA、 shRNA、肽、蛋白質(zhì)、 抗體或其它生物醫(yī)學治療劑的方法與肢體和四肢遞送方法相同。 一般認為局部應(yīng) 用更具實用性。如以上所述用膠帶、凝膠或繃帶固定電極陣列的相同或相似方法 將陽極和陰極電極陣列應(yīng)用于體表。
第四種實施方式是向軟組織腫瘤遞送基因、蛋白質(zhì)和藥物的方法和裝置。在 此實施方案中，遞送藥物、基因、siRNA、 shRNA、肽、蛋白質(zhì)、抗體或其它生 物醫(yī)學治療劑的方法與肢體和四肢遞送方法相同或相似。對腫瘤可采用局部注 射。如果腫瘤位置淺表，可將陽極和陰極電極陣列施加于體表?；蛘撸绻[瘤 位于肢體或四肢，可將陰極陣列置于腫瘤的一側(cè)而陽極置于在腫瘤的另一側(cè)。因 此，采用粘膠帶，凝膠或繃帶固定電極陣列使周邊電場跨越該腫瘤。當實施血管 內(nèi)遞送時，應(yīng)在向耙組織施加LSEN期間遞送藥物、基因、siRNA、 shRNA、肽、 蛋白質(zhì)、抗體或其它生物醫(yī)學治療劑。
在本發(fā)明的一實施方式中，采用致密的電極陣列和內(nèi)置的中央電極以產(chǎn)生通 過整個關(guān)節(jié)的環(huán)周電場網(wǎng)絡(luò)。電極陣列越致密，產(chǎn)生的分布于通過整個關(guān)節(jié)的周邊電場網(wǎng)絡(luò)越均勻。關(guān)節(jié)腔是一種封閉腔室?；蚧蛩幬镒⑸淙腙P(guān)節(jié)腔將在其中 保持很長時間。在基因和/或藥物注射入關(guān)節(jié)后，應(yīng)活動關(guān)節(jié)幫助藥物和/或藥物 分布于整個關(guān)節(jié)腔。
將一內(nèi)置電極線通過注射基因或藥物的同一導管插入關(guān)節(jié)中，從關(guān)節(jié)中抽出 該導管時此電線的頂端應(yīng)位于關(guān)節(jié)中央。整根電線除了鍍有高導電性材料(例如 鉑金)的小尖端外都是絕緣的。因此，當將梯級電勢或電壓施加于陣列的外部電 極和內(nèi)置電極線時，該環(huán)周電場即透過關(guān)節(jié)的所有結(jié)構(gòu)，包括骨、軟骨、韌帶、 肌腱、肌肉和軟組織。這是利用電場電能量效率最高的方法，因為所有的環(huán)周電 場都用作遞送藥物或基因的驅(qū)動力。
對于向細胞內(nèi)遞送帶正電荷的分子，應(yīng)將安置在體表的陣列的電極與脈沖發(fā) 生器的陰極相連接。正電荷分子將隨環(huán)周電場從關(guān)節(jié)腔向體表移動。對于向細胞 內(nèi)遞送帶負電荷的分子，應(yīng)將安置在體表的陣列的電極與脈沖發(fā)生器的陽極相連 接。這樣負電荷分子也將隨環(huán)周電場從關(guān)節(jié)腔向體表移動。
該裝置和方法可用于任何關(guān)節(jié)，例如膝、肩、腕、肘、踝、指、臀關(guān)節(jié)等。
如果不能纏繞整個關(guān)節(jié)，可采用平置電路，例如脊關(guān)節(jié)，顎關(guān)節(jié)等。圖4a—4e 說明了本發(fā)明的單極電極的應(yīng)用范圍，通過實施例顯示對膝關(guān)節(jié)，肩關(guān)節(jié)，肘關(guān) 節(jié)，腕關(guān)節(jié)和肌腱、及踝關(guān)節(jié)只用單極電極。每種情況都(在關(guān)節(jié)腔內(nèi))插入一 內(nèi)置電極，關(guān)節(jié)則用與關(guān)節(jié)外部形狀接近或緊密相容的單電極陣列纏繞。
為了語言的流暢性，雖然用功能性解釋描述了或?qū)⒚枋鏊龅难b置和方法， 但應(yīng)明確理解，除非35 USC U2作出明確闡述外，不應(yīng)以任何方式將本申請的 權(quán)利要求(范圍)理解為必然限于"方法"和"步驟"構(gòu)成的有限范圍內(nèi)，而是 按司法等同原理在本發(fā)明權(quán)利要求所提供的定義及其等同概念的整個范圍內(nèi)，在 權(quán)利要求按35 USC 112作出明確闡述時，則符合35 USC 112的全部法定等同條 款?，F(xiàn)轉(zhuǎn)到以下附圖
來更好地直觀顯示和說明本發(fā)明，圖中同樣的數(shù)字編號指同 樣的元件。
附圖簡要說明
圖la是根據(jù)本發(fā)明設(shè)計的用來產(chǎn)生LSEN電場驅(qū)使基因或藥物進入組織的 單極陣列的俯視圖。
12圖lb是圖la中通過直線lb—lb看的橫截面?zhèn)纫晥D。
圖2a是說明按照本發(fā)明在膝關(guān)節(jié)腔中插入導管輸送基因或藥物治療膝關(guān)節(jié) 腔的本發(fā)明方法第一步驟的圖解。
圖2b是說明圖2a方法將電極線插入關(guān)節(jié)中和活動該關(guān)節(jié)使基因和/或藥物 分布于關(guān)節(jié)腔的第二步驟的圖解。
圖2c是說明圖2a和圖2b方法將電極陣列圍繞關(guān)節(jié)安置和向關(guān)節(jié)腔施加 LSEN電場驅(qū)使基因和/或藥物進入組織的第三步驟的圖解。
圖2d是說明圖2a—2c的方法中施加LSEN電場方案概況的波形圖。
圖3a是按本發(fā)明設(shè)計的用于產(chǎn)生LSEN電場驅(qū)使基因或藥物進入組織的雙
電極陣列俯視圖。
圖3b為圖3a中通過直線3b—3b看的橫截面?zhèn)纫晥D。
圖3c為第二種實施方式圖3a通過直線3b — 3b看的橫截面?zhèn)纫晥D，其中該 陣列中加有藥物洗脫墊。
圖4a描述本發(fā)明在膝關(guān)節(jié)上的應(yīng)用。
圖4b描述本發(fā)明在肩關(guān)節(jié)上的應(yīng)用。
圖4c描述本發(fā)明在肘關(guān)節(jié)上的應(yīng)用。
圖4d描述本發(fā)明在腕關(guān)節(jié)和肌腱上的應(yīng)用。
圖4e描述本發(fā)明在踝關(guān)節(jié)上的應(yīng)用。
圖5a為雙電極體表電極陣列與藥物洗脫系統(tǒng)聯(lián)用的俯視圖。 圖5b為雙電極體表電極陣列與藥物滲透系統(tǒng)聯(lián)用的俯視圖。 圖5c為雙電極體表電極陣列與藥物滲透系統(tǒng)聯(lián)用時通過圖5b剖面線5c—5c
看的橫截面?zhèn)纫晥D。
圖6a為將本發(fā)明的藥物遞送系統(tǒng)應(yīng)用于肌體皮膚的照片說明。
圖6a步驟I和步驟II是將本發(fā)明的藥物遞送系統(tǒng)應(yīng)用于肌體皮膚的照片說明。
圖6b步驟I和步驟II是將本發(fā)明的藥物遞送系統(tǒng)應(yīng)用于頭皮的照片說明。 圖6c步驟I和步驟II是將本發(fā)明的藥物遞送系統(tǒng)應(yīng)用于肢體的照片說明。 圖6d為將本發(fā)明的藥物遞送系統(tǒng)應(yīng)用于皮膚的透視圖，顯示皮膚結(jié)構(gòu)與陣 列相關(guān)。圖7a步驟I和步驟II描述本發(fā)明藥物遞送系統(tǒng)應(yīng)用于手部的基因和藥物輸注。
圖7b描述本發(fā)明藥物遞送系統(tǒng)應(yīng)用于腳部的基因和藥物輸注。
圖8a為顯微照片，顯示用本發(fā)明實施IL-10基因轉(zhuǎn)運方式時膝關(guān)節(jié)軟骨中 轉(zhuǎn)基因表達的原位雜交。
圖8b為顯微照片，顯示用本發(fā)明實施脂質(zhì)體介導IL-10基因轉(zhuǎn)運時膝關(guān)節(jié) 軟骨中轉(zhuǎn)基因表達的原位雜交。
圖8c以原位雜交所顯示的陽性染色細胞百分比，對本發(fā)明方法、脂質(zhì)體介 導和質(zhì)粒介導方法的基因轉(zhuǎn)染效率進行比較。
圖8d顯示用定量逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈式反應(yīng)(qRT-PCR)檢測的轉(zhuǎn)基因表達 水平，比較本發(fā)明方法與脂質(zhì)體介導方法。
現(xiàn)轉(zhuǎn)到下面對優(yōu)選實施方式的詳細描述，使本發(fā)明及其各種實施方式可被 更好地了解，這些優(yōu)選實施方式是用來作為權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的說明性實 施例。應(yīng)當明確理解，如權(quán)利要求書中所確定那樣，本發(fā)明的范圍可比下文所述 的說明性實施方式更廣泛。
優(yōu)選實施方式的詳細描述
本發(fā)明說明性實施方式是在施加低強度電場網(wǎng)絡(luò)的幫助下促進藥物、基因、 siRNA、 shRNA、肽、蛋白質(zhì)、抗體或其它生物醫(yī)學治療分子和制劑靶向輸入大 動物和/或人的離體和體內(nèi)的皮膚、軟組織、關(guān)節(jié)和骨組織細胞內(nèi)的方法和裝置。 所述藥物、基因、siRNA、 shRNA、肽、蛋白質(zhì)、抗體或其它的生物醫(yī)學治療分 子和制劑的例子包括以下物質(zhì)的基因、蛋白質(zhì)和抗體
1)白細胞標志，例如CD2、 CD3、 CD4、 CD5、 CD6、 CD7、 CD8、 CDlla,b，c、 CD13、 CD14、 CD18、 CD19、 CD20、 CD22、 CD23、 CD25、 CD27及其配體、 CD28及其配體B7.1,B7.2、 B7.3、 CD29及其配體、CD30及其配體、CD40及其配 體gp39、 CD44、 CD45及其異構(gòu)體、CDw52 (Campath抗原)、CD56、 CD58、 CD69、 CD72、 CD80、 CD86、 CTLA-4、 CTLA4Ig、 LFA-1禾口TCR，或它們的突 變體，例如LEA29Y;粘附分子抑制劑，例如LFA-1拮抗劑、ICAM-1或-3拮抗 劑、VCAM-4拮抗劑或VLA-4拮抗劑；或化療制劑。2) 組織相容性抗原，例如MHC I類或II類、Lewis Y抗原、Slex、 Sley、 Slea 和Selb;
3) 粘附分子，包括整合素，例如VLA-1、 VLA-2、 VLA-3、 VLA-4、 VLA-5、 VLA-6、 LFA-1、 Mac-l、 aV(33和p150、 95;禾口
4) 選擇素，例如L-選擇素、E-選擇素和P-選擇素和它們的對應(yīng)受體 VCAM-1、 ICAM-1、 ICAM-2和LFA-3;
5) 白介素，例如IL-1、 IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-7、 IL-8、 IL-9、 IL-IO、 IL-ll、 IL-12、 IL-13、 IL-14和IL-15;
6) 白介素受體，例如IL-1R、 IL-2R、 IL-3R、 IL-4R、 IL-5R、 IL-6R、 IL-7R、 IL-8R、 IL-9R、 IL-10R、 IL-11R、 IL隱12R、 IL-13R、 IL-14R和IL-15R;
7) 趨化因子，例如PF4、 RANTES、 MIPla、 MCP1、 IP-IO、 ENA-78、 NAP-2、 Gro-a、 Gro國卩和IL-8;
8) 生長因子，例如TNFa、 TGF卩、TSH、 VEGF/VPF、 PTHrP、 EGF家族、FGF、 PDGF家族、內(nèi)皮素、纖維化素(Fibrocin:F.sub、 sF.sub,l)、層粘連蛋白、和胃 泌素釋放肽(GRP);
9) 生長因子受體，例如TNFaR、 RGF卩R、 TSHR、 VEGFR/VPFR、 FGFR、 EGFR、 PTHrPR、 PDGFR家族、EPO-R、 GCSF-R和其它造血(因子)受體；
10) 干擾素受體，例如IFN-aR、 IFN-pR和IFN.sub.YR;
11) 免疫球蛋白(Ig)及其受體，例如IGE、 FceRI和FceRII;
12) 腫瘤抗原，例如her2-neu、粘液素、CEA和內(nèi)皮唾(液)酸蛋白；
13) 變態(tài)原，例如房塵螨抗原、lolpl (grass)抗原和漆酚(urushiol);
14) 病毒蛋白，例如CMV糖蛋白B、 H、和gCIII, HIV-1被膜糖蛋白、RSV 被膜糖蛋白、HSV被膜糖蛋白、EBV被膜糖蛋白、VZV被膜糖蛋白、HPV被膜 糖蛋白、肝炎家族表面抗原；
15) 毒素，例如假單胞菌內(nèi)毒素和骨橋蛋白/尿橋蛋白、蛇毒、蜘蛛毒和蜂
毒；
16) 血液因子，例如補體C3b、補體C5a、補體C5b-9、 Rh因子、纖維蛋白 原、血纖維蛋白、和髓磷脂相關(guān)生長抑制劑；
17) 酶，例如膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白、膜結(jié)合基質(zhì)金屬蛋白酶、和谷氨酸脫羧
15酶；禾口
18) 雜抗原，包括神經(jīng)節(jié)苷脂GD3、神經(jīng)節(jié)苷脂GM2、 LMP1、 LMP2、嗜 酸性粒細胞主要堿性蛋白、PTHrp、嗜酸性粒細胞陽離子蛋白、pANCA、 Amadori 蛋白、IV型膠原、糖基化脂、nu-干擾素、A7、 P-糖蛋白和Fas (AFO-l)及氧化-LDL;
19) 鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，例如環(huán)孢霉素A或FK506;
20) mTOR抑制劑，例如雷帕霉素、40-O-(2-羥乙基)-雷帕霉素、CCI779、 ABT578或AP23573;
21) 具免疫抑制性能的子囊霉素，例如ABT-281、 ASM981;
22) 皮質(zhì)激素；環(huán)磷酰胺；咪唑硫嘌呤；甲氨喋呤；來氟米特；咪唑立賓； 霉酚酸；霉酚酸酯；15-2-脫氧鏈霉胺或它們的免疫抑制性同源物、類似物或衍生 物；禾口
23) 凋亡基因；或
24) 上述各組成員的任何組合。
可將這些成分作為單一活性成分給藥，或與其它藥物、免疫抑制劑或免疫調(diào) 節(jié)劑或其它抗炎癥藥物等輔佐劑聯(lián)合給藥，或作為化學治療劑，如抗惡性細胞增 殖劑聯(lián)合給藥，例如治療或預(yù)防同種異體或異種移植急性或慢性排斥或炎癥或自 身免疫疾病。術(shù)語"化療藥物"指任何化療藥物，其包括但不限于
I. 芳香酶抑制劑，
II. 微管活化劑、垸化劑、抗腫瘤抗代謝藥物或鉑化合物，
m.能靶向/減少蛋白質(zhì)或脂質(zhì)激酶的活性，或蛋白質(zhì)或脂質(zhì)磷酸酶活性的化
合物，及抗血管生成化合物或誘導細胞分化過程的化合物，
IV. 緩激肽1受體或血管緊張素II拮抗劑，
V. 環(huán)氧化酶抑制劑、二磷酸鹽、組蛋白脫?；敢种苿?、類肝素酶抑制劑(預(yù) 防硫酸類肝素降解)，例如PI — 889—種生物學應(yīng)答調(diào)節(jié)劑)，優(yōu)選淋巴因子或干 擾素，例如干擾素、quadrature遍在蛋白抑制劑、或能阻斷抗細胞凋亡途徑的抑 制劑，
VI. Ras癌基因同種型抑制劑，如H-Ras、 K-Ras或N-Ras，或法尼基轉(zhuǎn)移酶抑 制劑，例如L-744、 832或DK8G557,
VII. 端粒酶抑制劑，例如端粒轉(zhuǎn)移抑制素(telomestatin)，VIII. 蛋白酶抑制劑、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑、甲硫氨酸氨基肽酶抑制劑，
例如bengamide或其衍生物，或蛋白質(zhì)體抑制劑，例如PS-341，禾口/或
IX. mTOR抑制劑，或
X. 各組成員的任意組合。
可利用低強度電場網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)將治療性基因、siRNA、 shRNA、蛋白或藥物轉(zhuǎn) 運到分離的離體肢體、關(guān)節(jié)、皮膚和組織中，體內(nèi)的肢體、關(guān)節(jié)或體表，例如軟 組織、肌肉、肌腱、骨、或軟骨中。本發(fā)明已在兔關(guān)節(jié)和皮膚上進行了試驗。
本發(fā)明說明性實施方式包括四種優(yōu)選的實施方式1)將骨基因、蛋白質(zhì)和藥 物遞送入關(guān)節(jié)及其相關(guān)軟組織的的方法和裝置；2)將基因、蛋白質(zhì)和藥物遞送入 肢體的方法和裝置；3)將基因、蛋白質(zhì)和藥物遞送入皮膚和軟組織的方法和裝 置；和/或4)將基因、蛋白質(zhì)和藥物遞送入軟組織腫瘤的方法和裝置。
該說明性實施方式通過提供低強度電穿孔介導向分離的離體器官和組織，和 體內(nèi)血管和組織遞送基因、蛋白質(zhì)和藥物，顯示了現(xiàn)有技術(shù)的缺點。為了證明這 個觀點，我們進行了一系列研究，用本發(fā)明的低強度電穿孔系統(tǒng)向大型動物的離 體和體內(nèi)心臟遞送基因。我們發(fā)現(xiàn)該方法的基因轉(zhuǎn)移效率和效力最高，高于任何 現(xiàn)有的病毒和非病毒基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。迄今我們未發(fā)現(xiàn)對大動物心臟有任何不良作 用。而且，本發(fā)明的低強度電穿孔系統(tǒng)還特地擴大應(yīng)用于皮膚、軟組織、關(guān)節(jié)和 骨的基因、蛋白質(zhì)和藥物遞送。
本發(fā)明的說明性實施方式，是一種采用電極陣列形成的網(wǎng)絡(luò)用低電壓電場長 時間施加短時脈沖、脈沖組使細胞膜電滲透，從而將基因、蛋白質(zhì)、藥物靶向輸 送入離體和體內(nèi)的皮膚、軟組織和骨(細胞)的策略。該網(wǎng)絡(luò)提供的電磁場模式 在性質(zhì)上不同于常規(guī)電穿孔提供的電磁場模式的性質(zhì)，就本說明書的目的而言， 所述電磁場本身不應(yīng)稱為電穿孔電磁場，而是低強度電場網(wǎng)絡(luò)(LSEN)。
圖la為單極體表電極陣列的平面俯視圖，圖3a是本發(fā)明所用的雙電極體表 電極陣列的平面俯視圖。然而，必須明白提供該電極陣列和有效的LSEN產(chǎn)生源 并不局限于這兩種實施例，而應(yīng)包括目前已知或?qū)碓O(shè)計的能執(zhí)行相同或相似功 能的任何電極陣列。
圖la和3a的陣列包括可屈曲性電極陣列10。多個電極(12)、 (14)分別與陽 極電源(未顯示)或陰極電源或脈沖發(fā)生器(未顯示)偶聯(lián)。園柱形電極(12)、(14)固定或攜帶在可屈曲性基材或粘附墊(16)上并通過與多根導線或電線(18) 連接或偶聯(lián)而排成多排。電線(1S)的相反兩端偶聯(lián)于多個針狀連接器(20)。在圖 la的單電極實施方式中，每根電線(18)具有相同的極性電壓。在圖3a的雙電極實 施方式中，相鄰的每根電線(18)各具有相反極性的電壓。在圖la的實施方式中 電線(18)和圖3a實施方式中電線(18a)和((18b))可以是絕緣的，但是與同排的各 電極(12)、 (14)電路相連。例如在圖3a的雙電極實施方式中，電線(18a)與一排 只有一種極性電壓的電極(12)相連，而電線((18b))與電壓極性相反的一排電極(14) 相連。如圖la和3a中所示，相鄰排的電極(12)、 (14)相互補償而提高了襯墊(16) 上的電極密度。電極(12)、 (14)形狀為圓柱形，其平均直徑優(yōu)選等于或小于2mm。 電極表面從陣列10的平面向上突出至少0.05cm。電線(18)優(yōu)選間隔約0.5cm，電 極(12)沿各電線(18)安置， 一個電極(12)的表面與同根電線(18)連接下一個毗鄰電 極之間間隔為0.3cm。電極(12)、 (14)的直徑約為0.15cm。因此，突出的電極(12)、 (14)能與體表皮膚緊密接觸。宜將所有電極鍍上鉑金或其它導電的生物相容性金 屬。整個陣列10優(yōu)選用絕緣層(22)包裹。只有面積非常小的電極(12)、 (14)的球 形尖端(< 0.05 cm2)直接與皮膚接觸。這樣，可將熱傷害減少到最小。陣列IO 的不同元件尺寸取決于其應(yīng)用，此處所提供的尺寸只是為了進行說明。陣列10 的形狀還可根據(jù)其最終應(yīng)用的性質(zhì)而改變。可根據(jù)本發(fā)明所述并利用普通設(shè)計原 理對形狀和尺寸作出改變。
圖lb是通過圖la線lb—lb平面看的橫截面?zhèn)纫晥D。顯示單極性電極(12) 為高約0.075cm的子彈形圓柱，與圓柱底墊(16)上攜帶的電線(18)相連，該圓柱電 極通過絕緣層(22)伸出的鈍頭突出部與皮膚或組織接觸。應(yīng)明確理解可改變電極 (12)、 (14)的接觸表面或突出部為任何需要的形狀，包括更扁平、尖銳、圓錐形或 類似針尖形。
類似地，圖3a和3c顯示通過圖3a線3b—3b平面看的雙電極陣列10兩種實 施方式的橫截面?zhèn)纫晥D。圖3b的橫截面?zhèn)纫晥D顯示單極性電極(12)或(14)與電線 (18a)或((18b))分別偶聯(lián)。圖3b的構(gòu)形與圖lb所述連接相同，而圖3c實施方式 顯示電極(14)的第一組(26a)提高了圓柱高度，而第二組(26b)具有圖3b電極(12) 的原先或相同的圓柱高度，艮卩0.075cm。通過絕緣圓柱墊片(40)提高了組(26a)電 極(12)、 (14)的高度。藥物洗脫墊(24)安置在墊層(22)上，但不掩蓋組(26a)的電極
1(14)。藥物洗脫墊(24)與電極(12)、 (14)通過絕緣涂層或墊片(40)上的墊層在電路上 絕緣。藥物洗脫墊(24)的用途將在下文中更詳細描述。除了高度差別之外，組(26a) 和(26b)的電極(14)彼此在(例如)所需的形狀、材料組成、結(jié)構(gòu)和其它設(shè)計參數(shù) 上可有所不同。顯示襯墊上可選擇性地安置在陣列10，但也可考慮襯墊(24)上可 安置整個陣列io或陣列10的多個選擇部分。
圖3a—3c的實施方式表明向表面區(qū)域遞送藥物的應(yīng)用方法，和/或不插入內(nèi) 置中央電極的應(yīng)用方法，例如當向皮膚、皮下組織、軟組織、頭皮、面部、軀干、 手、足等遞送藥物時。
雖然圖la—lb和圖3a—3c實施方式的主要結(jié)構(gòu)相同，但有一些差別。因為 沒有內(nèi)置電極，將陽極和陰極(12)、 (14)都包括在同一陣列10上。如圖la陣列 10的平面圖所示，電線(18a)和(18b)提供了陰極和陽極連接線，或反之亦然，以 相同模式交替排列。為了能應(yīng)用于小區(qū)域，例如傷口愈合、脫毛毛囊、皮膚病損 和斑痕或皺紋去除等，可以增加電極(12)、 (14)的密度和減小電極(12)、 (14)的整 體尺寸同時減小陣列10的尺寸。
對于小型陣列10，可利用圍繞陣列10的膠帶將陣列10固定在皮膚上。陣列 上加用額外的膠帶和繃帶可以確保電極(12)、 (14)與皮膚之間緊密接觸?？蓪⒑?基因和藥物的軟膏、油、液體、凝膠、粉末或其它制劑直接涂在皮膚上，然后將 陣列10固定于該皮膚。也可用單次或多次注射，或通過血管內(nèi)注射或灌輸，將 藥物直接注射入皮膚。
電線(18)用銅或其它導電材料制成。優(yōu)選將電線(18)固定在由生物相容材料， 如塑料膜或其它非常柔軟和可拉伸、塑造或定形的材料制成的襯墊(16)上或襯墊 (16)中，使所有的電極(12)、 (14)與相鄰的皮膚或組織緊密接觸。利用陣列10上 的膠帶、繃帶或氣袋(未顯示)可進一步將襯墊(16)壓緊在皮膚或組織上以增加 電極(12)、 (14)與皮膚或組織直接接觸程度。電極(12)、 (14)與皮膚或組織之間接 觸越緊密，電導越好，電熱損傷越少。
圖2a—2c利用膝(關(guān)節(jié))作為本發(fā)明圖解說明實施方式的例子。第一步是 將帶有注射針30的血管導管28插入膝關(guān)節(jié)腔32中，然后拔出針30。注入生物 醫(yī)學制劑或藥物，然后將內(nèi)置電極34插入導管28中。導管尖端應(yīng)向關(guān)節(jié)腔32 中央推進。然后將(連接)該電極的電線插入導管。內(nèi)置電極34可以用銅、不銹鋼或其它生物相容材料制成，并且用絕緣層包裹。只有暴露的電線尖端鍍上鉑
金。該尖端應(yīng)非常小，<lmm3 。應(yīng)將此電線制成易于彎曲和柔軟，方能避免在插 入時傷害任何組織。然后可將導管28從關(guān)節(jié)中抽出。然后活動關(guān)節(jié)使基因或藥 物均勻分布于關(guān)節(jié)腔32中，見圖2b中的描述。
然后，我們可以如圖2c所示用圖la—lb的單電極體表電極陣列10纏繞整 個關(guān)節(jié)。通過繃帶、膠帶或壓力袋使所有的電極(12)緊密接觸皮膚。如圖2c所示， 對于帶負電荷分子的細胞內(nèi)遞送，應(yīng)將陣列10上的電極與脈沖發(fā)生器36的陽極 連接。對于帶正電荷分子的細胞內(nèi)遞送，應(yīng)將陣列10上的電極(12)與脈沖發(fā)生器 36的陰極連接。對于中性分子，可用極性連接。然后施加LSEN脈沖組。
如圖2d波形圖所示，LSEN脈沖組方案由約5-50個短脈沖組成，各脈沖持 續(xù)約2-20毫秒，間隔約5-30毫秒，各脈沖組間隔時間約為1-5分鐘，電場強度 約為O.l伏/厘米。治療性脈沖組總共可持續(xù)l秒鐘到幾個小時。
在圖3c和5a中，雙電極陣列10聯(lián)合藥物緩釋墊或藥物洗脫墊(24a)構(gòu)成了 完整的體表LSEN-藥物遞送系統(tǒng)。藥物緩釋墊或藥物洗脫墊(24a)必須橫置于整個 陣列10上，而不在同一水平。襯墊(24)b部分比較薄，含有累積劑量較低的藥物 或不含藥物，是提供給陣列10的可選擇部分。主要結(jié)構(gòu)與圖3a — 3b雙電極陣列 裝置所述相同。此外，將藥物緩釋墊(24a)疊壓在絕緣層(22)的上部。為了不使藥 物釋放墊(24)掩蓋電極(12)、 (14)，在襯墊(24a)中打洞使電極(12)、 (14)透過襯墊 (24a)。所有的電極(12)、 (14)通過加入可容納襯墊(24a)厚度的墊片(40)而變得更 長。制作電極(12)、 (14)的墊片(40)的材料與電極本身相同，但有一絕緣層使墊片 (40)與襯墊(24a)相隔離。只有電極尖端鍍有高導電材料，例如鉑金。
為了能成功地用于控制緩釋藥物制劑，制作襯墊(24a)的材料必須是化學惰性 和沒有可濾去的雜質(zhì)。它還必須有合適的物理結(jié)構(gòu)，不希望有的老化應(yīng)最小并易 于加工。目前使用或研究的一些控制藥物遞送材料包括聚(異丁烯酸2-羥基乙 酯)、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(乙烯醇)、聚(丙烯酸)、 聚丙烯酰胺、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(乙二醇)、聚(甲基丙烯酸)。然而，近 幾年來主要為醫(yī)學應(yīng)用而設(shè)計的其它聚合物也已進入控釋舞臺。設(shè)計的許多這種 材料可在體內(nèi)降解，其中有聚乳酸化合物(pla)、聚乙交酯(pga)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(plga)、聚酐、聚正酯類。那些材料也可被采用。如圖5b和5c所示，襯墊(24a)可用藥物緩釋袋38替代。藥物緩釋袋38可作 為藥物儲存室構(gòu)成完整的體表LSEN-藥物遞送系統(tǒng)。在釋放袋38中制作的微孔 39可將藥物緩釋到體表。藥物釋放速度可用施加在釋放袋上的壓力控制。此系統(tǒng) 更適合用于遞送液體和稀油或凝膠制劑?？梢约佑脷獯蚰z帶(未顯示)提供藥 物從緩釋袋38釋放所需的驅(qū)動力。這種實施方式的優(yōu)點是可用于肢體或軀干。 對于平坦的體表，可采用灌注槽設(shè)備和液體控制泵來控制藥物進出釋放袋38，然 后控制袋38的藥物釋放。
因為塑料袋不導電，所以不需要在電極(12)、 (14)的墊片上涂加絕緣層。但各 個電極(12)、 (14)下仍然需要疊加墊片(40)以增高電極(12)、 (14)，使其能與體表緊 密接觸。
采用圖3a—3c所示陽極和陰極交替安置模式的方法產(chǎn)生了與體表平行的電 場。在此網(wǎng)絡(luò)電場模式中，與皮膚平面平行的周邊電場可透過皮膚、皮下組織和 深部結(jié)構(gòu)。此時，皮膚與電極(12)、 (14)之間的距離越大，深層組織中的電場強度 越弱。因此，如圖6a—6d實施方式所示，淺表面組織的基因和藥物遞送采用雙 電極陣列IO較佳。
另一方面，提高電極(12)、 (14)的密度使陽極和陰極電極對之間的距離變短而 施加定量的電壓。陰陽電極對之間距離的V/cm即為電場強度。因此，對與電極 (12)、 (14)距離更遠的組織應(yīng)加強電場強度。換言之，如圖6d說明的那樣，由于 兩電極之間的電場力減小，皮膚組織結(jié)構(gòu)中的垂直電場強度升高。因此，釆用電 極密度提高的系統(tǒng)即使是深層區(qū)域的結(jié)構(gòu)(如軟組織、脂肪組織、肌肉、小血管， 神經(jīng)、肌腱、骨、軟骨)也能觸及。此外，更高密度電極模式將使此電場網(wǎng)絡(luò)模 式更均勻地分布于皮膚和組織中。
本發(fā)明的一實施方式是局部應(yīng)用雙電極陣列10在皮膚傷口中遞送基因和藥 物的LSEN—藥物遞送方法，例如圖6a步驟I和步驟II向胸腔遞送。所述藥物可 以是液體、凝膠、藥膏、粉末、或其它制劑。將藥物涂在體表后，如圖6a步驟I 所示用分配器將藥物均勻地分配在應(yīng)用區(qū)域內(nèi)。如圖6a步驟II所示，然后將雙 電極陣列10施加于該區(qū)域并與脈沖發(fā)生器36連接。如上文中所述，可施加幾秒 到幾個小時的電脈沖。
在圖6b步驟I和步驟II所示的治療中，另一實施方式是用帶有藥物緩釋墊24的雙電極陣列IO在頭皮上實施LSEN藥物遞送。如圖6b步驟I所示，可用雙 電極陣列IO聯(lián)合藥物緩釋墊覆蓋脫毛區(qū)域。在圖6b-步驟II所示的治療中，將陣 列10與脈沖發(fā)生器36的陽極和陰極連接后，施加上文所述的電脈沖。還可以通 過上文所述的多次注射或局部制劑施加藥物。
在還有另一種LSEN-藥物遞送實施方式中，同樣如圖6c-步驟I所示，以上 述采用襯墊的類似方式用帶有藥物緩釋袋的雙電極體表電極陣列實施肢體或軀 干藥物遞送?？衫脡浩葰獯蚩噹砜刂扑幬镝尫糯鼔毫?。如圖6c —步驟II 所示，施加LSEN電場時，利用帶泵的灌輸或注射槽裝置控制藥物釋放是優(yōu)選的 方法。對末端肢體，例如糖尿病病人的小腿，也可將藥物通過灌注管遞送入小腿 血管。然后用雙電極陣列輔助藥物遞送。
總而言之，必須理解本說明書公開的向關(guān)節(jié)及其相關(guān)軟組織和骨遞送基因、 蛋白質(zhì)和藥物的方法和裝置可用于任何關(guān)節(jié)疾病和/或其相關(guān)的骨、軟骨、韌帶和 肌肉疾病。本說明書公開的方法和裝置可用于將基因、蛋白質(zhì)和藥物遞送入肢體 治療任何手足疾病，例如原發(fā)雷諾(氏)病、和繼發(fā)雷諾(氏)綜合征、糖尿病足綜合 征、Burgers綜合征、類風濕關(guān)節(jié)炎、或相似疾病或狀況，如圖7a和7b圖中的說 明，實施基因輸入是通過局部血管注射或通過安裝在短襪或手套中的電極陣列10 中的局部用凝膠或藥物洗脫墊來局部應(yīng)用。這種實施方式還可用于四肢的任何疾 病，如靜脈瘤、靜脈曲張性潰瘍、血栓、任何栓塞、軟組織腫瘤、長骨腫瘤、和 任何軟組織疾病。本文公開的向體表(包括皮膚和軟組織)遞送基因、蛋白質(zhì)和 藥物的方法和裝置可用于機體任何皮膚和軟組織疾病，機體淺表軟組織腫瘤，如 任何種類的創(chuàng)傷(外科傷口、傷疤、燒傷等)、皮膚病、皮膚癌、皮膚潰瘍、脫 毛，白斑，皮膚護理(去皺紋等)、機體腫瘤、肉瘤。在移植時，這種實施方式 還可以用于向移植的供者離體皮膚、軟組織、骨和關(guān)節(jié)遞送免疫抑制藥和抗炎藥。 將基因、蛋白質(zhì)和藥物遞送給軟組織腫瘤的方法和裝置應(yīng)安置在四肢或肢體的較 深處，如肉瘤、骨腫瘤處。
本發(fā)明開創(chuàng)了一個將基因、蛋白和藥物靶向輸送入大動物和人的體內(nèi)和離體 皮膚、軟組織、關(guān)節(jié)和骨(細胞)來預(yù)防和治療大動物和人類疾病的新時代?，F(xiàn) 有技術(shù)尚不能應(yīng)用于人類。
本發(fā)明實施方式具有四個主要優(yōu)點1)采用低電壓可減少細胞損傷；2)采
22用更多和更長時間脈沖提高了基因和藥物的遞送效率；3)利用電場網(wǎng)絡(luò)施加在 在組織表面的電場分布更均勻強度更均一；4)電極與皮膚接觸更好而節(jié)省了能 量，顯著減少了皮膚損傷。
作為此觀點的一個證據(jù)，我們進行了實驗，用LSEN單電極陣列10在家兔 膝關(guān)節(jié)中遞送基因。此方法上文已有描述。簡言之，在全身麻醉下，將帶注射針 的導管插入兔膝關(guān)節(jié)中。然后抽出(引導)針。抽入注射器約50^1的關(guān)節(jié)液后丟 棄，然后將100pl含IL-10基因的質(zhì)粒(IOO嗎)注射入膝關(guān)節(jié)。將一內(nèi)置電極線 插入導管安置在膝關(guān)節(jié)腔中央。抽出導管。我們活動膝關(guān)節(jié)使基因均勻分布于整 個關(guān)節(jié)腔。用體表單電極陣列纏繞膝部，在該裝置上加用膠帶以確保所有的電極 (12)、 (14)緊密接觸膝部。將陰陽電極與脈沖發(fā)生器連接。產(chǎn)生脈沖組的方案為 (短)脈沖持續(xù)時間5毫秒，脈沖間隔15毫秒，每個脈沖組10個脈沖，各脈沖 組間隔2分鐘。電場強度為lV/cm。處理膝關(guān)節(jié)30分鐘。
處理4天后，處死家兔取出膝部。用原位雜交觀察到LSEN輔助的IL-10基 因轉(zhuǎn)移誘導了膝關(guān)節(jié)軟骨中轉(zhuǎn)基因表達。圖8a顯微照片顯示，轉(zhuǎn)基因效率為 65±6%。圖8a顯微照片顯示，與之相比，其它程序相同但不用LSEN而用脂質(zhì)體 復(fù)合的IL-10基因處理膝關(guān)節(jié)的另一組家兔基因轉(zhuǎn)染效率只有圖8c所示的 13±3%。不用LSEN而只單獨用含IL-10基因的質(zhì)粒處理膝關(guān)節(jié)則未見有任何轉(zhuǎn) 染的細胞。如圖8d所示，通過轉(zhuǎn)基因與持家基因GAPDH的比率檢測到轉(zhuǎn)基因 表達水平在手術(shù)后4天和8天增加了 80倍。這些發(fā)現(xiàn)直接證明LSEN輔助的基 因轉(zhuǎn)移的效率在所有采用病毒和非病毒介導的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)中是最高的。
結(jié)論是，本發(fā)明闡述的實施方式不僅建立了通過低強度電場網(wǎng)絡(luò)介導將藥物 和生物制劑遞送入大動物和人的離體和體內(nèi)皮膚、軟組織、關(guān)節(jié)和骨(細胞)的 方法和裝置。而且最重要的是具有非常高的市場價值。皮膚，軟組織、關(guān)節(jié)和骨 疾病在所有年齡段中都很常見。這些疾病的治療是否成功常常受到局部藥物遞送 無效或所用藥物遞送系統(tǒng)可誘導不良作用的限制。目前還沒有任何更好的策略來 克服這些問題。而此技術(shù)安全、成本-效益佳和易于開發(fā)。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可不背離本發(fā)明思路和范圍而對本發(fā)明做出許多更改 和修飾。因此，必須明白，提供的說明性實施方式目的只是舉例，不應(yīng)認為本發(fā) 明受限于本文說明及其各種實施方式所定義的范圍。例如，盡管權(quán)利要求提出了以下某些組合中的元件，但必須明確地理解，本 發(fā)明包括其它具有更少、更多或不同元件的其它組合，即使對此類組合先前未提 出權(quán)利要求，但這些元件已在本文中公開。也要理解權(quán)利要求提出了一種組合中 采用兩種元件組合，還應(yīng)當認為允許權(quán)利要求可提出在另一種組合中這兩種元件 并不相互組合，而可單獨使用或在其它組合中進行組合。刪除本發(fā)明任何公開的 元件都應(yīng)明確認為也屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
應(yīng)明白，本說明書中用于描述本發(fā)明及各種實施方式所用的詞語不僅具有它 們通用的含義，還包括在本說明書所述結(jié)構(gòu)、材料或作用中超越通用定義范圍的 特殊含義。因此，應(yīng)理解如果用于某要素的詞語在本說明書中的含義包括一種以 上的含義，那么此詞語用于權(quán)利要求書中時必須理解為指該要素的通用含義，以 及得到本說明書和該詞語本身支持的所有可能的含義。
因此，下面權(quán)利要求中所用詞語或要素的定義即說明書中所定義的，不僅包 括字面上闡述的這些要素的組合，而且包括以基本相同的方式獲得基本相同結(jié)果 的具有基本相同功能的等同結(jié)構(gòu)、材料或作用。因此，在此意義上認為下面權(quán)利 要求中任何一種要素可用兩種或多種等同要素取代，或權(quán)利要求中的兩種或多種 要素可用一種要素取代。雖然上文描述的要素可在某些組合中起作用，甚至最初 已對其提出權(quán)利要求，但應(yīng)明確地理解，要求保護的某組合中的一種或多種要素
在某些情況下可從該組合中刪除，要求保護的組合可以是針對亞組合或改變的亞 組合。
按照本領(lǐng)域普通技術(shù)人員、現(xiàn)有知識或后來的設(shè)計來考慮，要求保護主題的 非實質(zhì)性改變應(yīng)明確地認為同等地屬于本發(fā)明權(quán)利要求的范圍內(nèi)。因此，本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員目前或?qū)碇赖母鞣N明顯替換也屬于已定義要素的范圍內(nèi)。
因此應(yīng)明白，本申請的權(quán)利要求包括所有上述具體圖解說明和描述的內(nèi)容， 所有概念上等同的內(nèi)容，所有可被明顯替代的內(nèi)容，及所有基本上摻入了本發(fā)明 基本思路的內(nèi)容。
權(quán)利要求
1、一種將藥物、基因、siRNA、shRNA、肽、蛋白質(zhì)、抗體或生物醫(yī)學治療分子或制劑轉(zhuǎn)染入關(guān)節(jié)、骨組織，關(guān)節(jié)或骨相關(guān)軟組織，或轉(zhuǎn)染入軟組織的方法，該方法總的包括以下步驟使所述藥物、基因、siRNA、shRNA、肽、蛋白質(zhì)、抗體或生物醫(yī)學治療分子或制劑分布于整個組織；在該組織中或該組織上安置至少一個陽電極；靠近要轉(zhuǎn)染的整個組織安置一陰電極陣列；和向要轉(zhuǎn)染的整個組織施加低強度網(wǎng)絡(luò)電場(LSEN)脈沖。
2、 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述在靠近要轉(zhuǎn)染的整個組織處安置 陰電極陣列，包括安置多個陰電極與該組織上的皮膚低電阻接觸。
3、 如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述安置多個陰電極與組織上的皮膚 低電阻接觸，包括使多個陰電極與皮膚機械緊密接觸。
4、 如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述安置多個陰電極與組織上的皮膚 低電阻接觸，包括在多個陰電極與皮膚之間安置可導電的凝膠。
5、 如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述使多個陰電極與皮膚緊密機械接 觸，包括用折疊夾和/或圍繞該陣列與皮膚的膠帶機械加壓和維持多個陰電極與皮 膚之間的壓力。
6、 如權(quán)利要求l所述的方法，其中，使所述藥物、基因、siRNA、 shRNA、 肽、蛋白質(zhì)、抗體或生物醫(yī)學治療分子或制劑分布于整個組織包括在關(guān)節(jié)囊中插入引導針；在引導針內(nèi)或通過引導針安置輸液導管；移去引導針；通過導管注入所述藥物、基因、siRNA、 shRNA、多肽、蛋白、抗體或生物 醫(yī)學治療分子或制劑；和活動接受注射的關(guān)節(jié)囊相應(yīng)的關(guān)節(jié)。
7、 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述在組織中安置至少一個陽電極， 包括將末端帶有陽電極的電線插入輸液導管中。
8、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述在靠近要轉(zhuǎn)染的整個組織處安置陰電極陣列，包括安置其中含有陰電極陣列的襯墊，并用該襯墊覆蓋要處 理的整個組織。
9、 如權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述使藥物、基因、siRNA、 shRNA、 肽、蛋白質(zhì)、抗體或生物醫(yī)學治療分子或制劑分布于整個組織，包括用靜脈泵或 控制器向要轉(zhuǎn)染的整個組織連續(xù)血管內(nèi)遞送，同時施加低強度電場網(wǎng)絡(luò)(LSEN) 脈沖，使藥物、基因、siRNA、 shRNA、肽、蛋白質(zhì)、抗體或生物醫(yī)學治療分子 或制劑分布進入肢體。
10、 如權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述使藥物、基因、siRNA、 shRNA、 肽、蛋白質(zhì)、抗體或生物醫(yī)學治療分子或制劑分布于整個組織，包括通過溶液、 油、凝膠或藥物遞送材料同時施加低強度電場網(wǎng)絡(luò)(LSEN)脈沖，向要轉(zhuǎn)染的 整個組織局部施用所述藥物、基因、siRNA、 shRNA、肽、蛋白質(zhì)、抗體或生物 醫(yī)學治療分子或制劑，使所述藥物、基因、siRNA、 shRNA、肽、蛋白質(zhì)、抗體 或生物醫(yī)學治療分子或制劑分布進入肢體。
11、 如權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述使藥物、基因、siRNA、 shRNA、 肽、蛋白質(zhì)、抗體或生物醫(yī)學治療分子或制劑分布于整個組織，包括向要轉(zhuǎn)染的 整個組織通過皮下注射局部施加藥物、基因、siRNA、 shRNA、肽、蛋白質(zhì)、抗 體或生物醫(yī)學治療分子或制劑，同時施加低強度電場網(wǎng)絡(luò)(LSEN)脈沖，使藥 物、基因、siRNA、 shRNA、肽、蛋白質(zhì)、抗體或生物醫(yī)學治療分子或制劑分布 于肢體。
12、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述使藥物、基因、siRNA、 shRNA、肽、蛋白質(zhì)、抗體或生物醫(yī)學治療分子或制劑分布于整個組織，包括向 要轉(zhuǎn)染的整個組織局部施加藥物、基因、siRNA、 shRNA、肽、蛋白質(zhì)、抗體或 生物醫(yī)學治療分子或制劑，并用膠帶、凝膠或繃帶將所述陰電極陣列固定在機體 表面，包括皮膚和軟組織，同時施加低強度電場網(wǎng)絡(luò)(LSEN)脈沖，使所述藥 物、基因、siRNA、 shRNA、肽、蛋白質(zhì)、抗體或生物醫(yī)學治療分子或制劑分布 于肢體。
13、 如權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述使藥物、基因、siRNA、 shRNA、肽、蛋白質(zhì)、抗體或生物醫(yī)學治療分子或制劑分布于整個組織，包括向要轉(zhuǎn)染的 整個組織經(jīng)局部血管內(nèi)輸送施加藥物、基因、siRNA、 shRNA、肽、蛋白質(zhì)、抗 體或生物醫(yī)學治療分子或制劑，同時施加低強度電場網(wǎng)絡(luò)(LSEN)脈沖，使所述藥物、基因、siRNA、 shRNA、肽、蛋白質(zhì)、抗體或生物醫(yī)學治療分子或制劑 分布于肢體；該方法還包括陽電極陣列，如果腫瘤部位淺表，將陽電極陣列和陰 電極陣列置于靠近腫瘤的體表，或如果腫瘤位于四肢或肢體，則將陰電極陣列置 于腫瘤一側(cè)和將陽電極陣列置于腫瘤的另一側(cè)，用粘性材料、膠帶、凝膠或繃帶 固定電極陣列，使周邊電場跨越該腫瘤。
14、 一種通過轉(zhuǎn)染使藥物、基因、siRNA、 shRNA、肽、蛋白、抗體或生物 醫(yī)學治療分子或試劑進入關(guān)節(jié)、骨組織、關(guān)節(jié)或骨相關(guān)軟組織、或軟組織的裝置， 該裝置一般包括使藥物、基因、siRNA、 shRNA、肽、蛋白質(zhì)、抗體或生物醫(yī)學治療分子或制劑分布于整個組織的裝置；至少一個可插入或安置在所述組織中的陽電極；一個安置在靠近要轉(zhuǎn)染的整個組織周圍的陰電極陣列；和 一個向要轉(zhuǎn)染的整個組織施加低強度網(wǎng)絡(luò)電場(LSEN)的LSEN脈沖發(fā)生器。
15、 如權(quán)利要求14所述的裝置，其特征在于，所述安置在靠近要轉(zhuǎn)染的整 個組織周圍的陰電極陣列包括置于與覆蓋該組織的皮膚低電阻接觸的接觸件中 的多個陰電極。
16、 如權(quán)利要求15所述的裝置，其中，安置在與覆蓋該組織的皮膚低電阻 接觸的接觸件的多個陰電極包括使多個陰電極置于與皮膚緊密機械接觸的接觸 件中的裝置。
17、 如權(quán)利要求15所述的裝置，其中，所述置于與覆蓋該組織的皮膚低電 阻接觸的接觸件中的多個陰電極包括在皮膚與多個電極之間的導電凝膠。
18、 如權(quán)利要求16所述的裝置，其中，置于與皮膚緊密機械接觸的接觸件 中的多個陰電極包括機械壓迫多個陰電極與皮膚和維持它們之間壓力的裝置，包 括圍繞電極陣列和皮膚的折疊夾和/或膠帶。
19、 如權(quán)利要求14所述的裝置，其中，所述使藥物、基因、siRNA、 shRNA、 肽、蛋白質(zhì)、抗體或生物醫(yī)學治療分子或制劑分布于整個組織的裝置包括可插入關(guān)節(jié)囊的引導針；和安置在引導針上的或可通過引導針輸送藥物、基因、siRNA、 shRNA、肽、 蛋白質(zhì)、抗體或生物醫(yī)學治療分子或制劑進入關(guān)節(jié)囊的輸液導管。
20、 如權(quán)利要求14所述的裝置，其中，所述插入或置于組織上的至少一個 陽電極包括具有用于插入輸液導管中的陽電極末端的電線。
21、 如權(quán)利要求14所述的裝置，其中，所述安置在靠近要轉(zhuǎn)染的整個組織 周圍的陰電極陣列包括其中含有該陰電極陣列、用于覆蓋待處理的整個組織的襯墊。
22、 如權(quán)利要求14所述的裝置，其中，所述使藥物、基因、siRNA、 shRNA、 肽、蛋白質(zhì)、抗體或生物醫(yī)學治療分子或制劑分布于整個組織的裝置，包括用靜 脈泵或控制器向要轉(zhuǎn)染的整個組織連續(xù)血管內(nèi)遞送、同時施加低強度電場網(wǎng)絡(luò)(LSEN)脈沖、使藥物、基因、siRNA、 shRNA、肽、蛋白質(zhì)、抗體或生物醫(yī)學治療分子或制劑分布于肢體的裝置。
23、 如權(quán)利要求14所述的裝置，其中，所述使藥物、基因、siRNA、 shRNA、 肽、蛋白質(zhì)、抗體或生物醫(yī)學治療分子或制劑分布于整個組織的裝置，包括通過 溶液、油、凝膠或藥物遞送材料同時施加低強度電場網(wǎng)絡(luò)(LSEN)脈沖向要轉(zhuǎn) 染的整個組織局部施用所述藥物、基因、siRNA、 shRNA、肽、蛋白質(zhì)、抗體或 生物醫(yī)學治療分子或制劑，使所述藥物、基因、siRNA、 shRNA、肽、蛋白質(zhì)、 抗體或生物醫(yī)學治療分子或制劑分布進入肢體的裝置。
24、 如權(quán)利要求14所述的裝置，其中，所述使藥物、基因、siRNA、 shRNA、 肽、蛋白質(zhì)、抗體或生物醫(yī)學治療分子或制劑分布于整個組織的裝置，包括通過 皮下注射局部施加藥物、基因、siRNA、 shRNA、肽、蛋白質(zhì)、抗體或生物醫(yī)學 治療分子或制劑、同時對要轉(zhuǎn)染的整個組織施加低強度電場網(wǎng)絡(luò)(LSEN)脈沖 使藥物、基因、siRNA、 shRNA、肽、蛋白質(zhì)、抗體或生物醫(yī)學治療分子或制劑 分布于肢體的裝置。
25、 如權(quán)利要求14所述的裝置，其中，所述使藥物、基因、siRNA、 shRNA、 肽、蛋白質(zhì)、抗體或生物醫(yī)學治療分子或制劑分布于整個組織的裝置，包括用膠 帶、凝膠或繃帶固定所述陰電極陣列、向要轉(zhuǎn)染的整個組織施加低強度電場網(wǎng)絡(luò)(LSEN)脈沖，局部施加藥物、基因、siRNA、 shRNA、肽、蛋白質(zhì)、抗體或生 物醫(yī)學治療分子或制劑于包括皮膚和軟組織的機體表面，使所述藥物、基因、 siRNA、 shRNA、肽、蛋白質(zhì)、抗體或生物醫(yī)學治療分子或制劑分布于肢體的裝 置。
26、 如權(quán)利要求14所述的裝置，其中，所述使藥物、基因、siRNA、 shRNA、肽、蛋白質(zhì)、抗體或生物醫(yī)學治療分子或制劑分布于整個組織的裝置，包括向要轉(zhuǎn)染的整個組織通過血管內(nèi)輸送局部施加藥物、基因、siRNA、 shRNA、肽、蛋 白質(zhì)、抗體或生物醫(yī)學治療分子或制劑，同時施加低強度電場網(wǎng)絡(luò)(LSEN)脈 沖，使所述藥物、基因、siRNA、 shRNA、肽、蛋白質(zhì)、抗體或生物醫(yī)學治療分 子或制劑分布于肢體的裝置；該裝置還包括陽電極陣列，如果腫瘤部位淺表，將 陽電極陣列和陰電極陣列置于靠近腫瘤的體表，或如果腫瘤位于四肢或肢體，則 將陰電極陣列置于腫瘤一側(cè)，陽電極陣列置于腫瘤的另一側(cè)，用粘膠帶、凝膠或 繃帶固定電極陣列使周邊電場跨越該腫瘤。
27.如權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述使藥物、基因、siRNA、 shRNA、 肽、蛋白質(zhì)、抗體或生物醫(yī)學治療分子或制劑分布于整個組織，包括分布以下組 的成員中的至少一種1) 白細胞標記，例如CD2、 CD3、 CD4、 CD5、 CD6、 CD7、 CD8、 CDlla，b,c、 CD13、 CD14、 CD18、 CD19、 CD20、 CD22、 CD23、 CD25、 CD27及其配體、 CD28及其配體B7.1,B7.2,B7.3、 CD29及其配體、CD30及其配體、CD40及其配體 gp39、 CD44、 CD45及其異構(gòu)體、Cdw52 (Campath抗原)、CD56、 CD58、 CD69、 CD72、 CD80、 CD86、 CTLA-4、 CTLA4Ig、 LFA-1和TCR或它們的突變體，例 如LEA29Y;粘附分子抑制制，例如LFA-1拮抗劑、ICAM-1或-3拮抗劑、VCAM-4 拮抗劑或VLA-4拮抗劑；或化學治療劑；2) 組織相容性抗原，例如MHC I類或II類、Lewis Y抗原、Slex、 Sley、 Slea、 和Selb;3) 粘附分子，包括整合素，例如VLA-1 、 VLA-2、 VLA-3、 VLA-4、 VLA-5、 VLA-6、 LFA-1、 Mae-l、 aV卩3、和p150， 95;4) 選擇素，例如L-選擇素、E-選擇素、和P-選擇素及它們的對應(yīng)受體 VCAM-1、 ICAM-1、 ICAM-2、和LFA-3;5) 白介素，例如IL-1、 IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-7、 IL國8、 IL國9、 IL-IO、 IL-ll、 IL-12、 IL-13、 IL-14、和IL-15;6) 白介素受體，例如IL隱1R、 IL陽2R、 IL-3R、 IL陽4R、 IL-5R、 IL-6R、 IL隱7R、 IL陽8R、 IL-9R、 IL陽10R、 IL國11R、 IL-12R、 IL-13R、 IL-14R和IL-15R;7) 趨化因子，例如PF4、RANTES、MIPla、MCPl、IP-10、ENA-78、NAP國2、 Gro-a、 Gro-卩、禾口IL-8;8) 生長因子，例如TNFa、 TGF卩、TSH、 VEGF/VPF、 PTHrP、 EGF家族、 FGF、 PDGF家族、內(nèi)皮素、纖維化(Rsub.sF.sub.-l)、層粘連蛋白、和胃泌素釋放肽(GRP);9) 生長因子受體，例如TNFaR、 RGF(3R、 SHR、 VEGFR/VPFR、 FGFR、 EGFR、 PTHrPR、 PDGFR家族、EPO-R、 GCSF-R和其它造血因子受體；10) 干擾素受體，例如IFN-aR、 IFN-(5R、和IFN.sub.YR;11) 免疫球蛋白(Ig)及其受體，例如IGE、 FceRI、和FceRII;12) 腫瘤抗原，例如her2-neu、粘液素、CEA和內(nèi)皮唾(液)酸蛋白；13) 變態(tài)原，例如房塵螨抗原、lolpl (grass)抗原、和漆酚；14) 病毒蛋白，例如CMV糖蛋白B、 H、禾卩gCIII、 HIV-1被膜糖蛋白、RSV 被膜糖蛋白、HSV被膜糖蛋白、EBV被膜糖蛋白、VZV被膜糖蛋白、HPV被膜糖 蛋白、肝炎家族表面抗原；15) 毒素，例如假單胞菌內(nèi)毒素和骨橋蛋白/尿橋蛋白、蛇毒、蜘蛛毒和蜂毒；16) 血液因子，例如補體C3b、補體C5a、補體C5b-9、 Rh因子、纖維蛋白 原、血纖維蛋白和髓磷脂相關(guān)生長抑制劑；17) 酶，例如膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白、膜結(jié)合基質(zhì)金屬蛋白酶、和谷氨酸脫羧 酶；和18) 雜抗原，包括神經(jīng)節(jié)苷脂GD3、神經(jīng)節(jié)苷脂GM2、 LMP1、 LMP2、嗜 酸性粒細胞主要堿性蛋白、PTHrp、嗜酸性粒細胞陽離子蛋白、pANCA、 Amadori 蛋白、IV型膠原、糖基化脂、nu-干擾素、A7、 P-糖蛋白和Fas (AFO-l)及氧化-LDL;19) 鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，例如環(huán)孢霉素A或FK506;20) mTOR抑制劑，例如雷帕霉素、40-O-(2-羥乙基)-雷帕霉素、CCI779、 ABT578或AP23573;21) 具免疫抑制性能的子囊霉素，例如ABT-281、 ASM981;22) 皮質(zhì)激素；環(huán)磷酰胺；咪唑硫嘌呤；甲氨喋呤；來氟米特；咪唑立賓； 霉酚酸；霉酚酸酯；15-2-脫氧鏈霉胺及其免疫抑制性同源物、類似物或衍生物；23) 凋亡基因；或24) 各組成員的任何組合。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中，所述分布以下組的成員組成的至少一種基因、蛋白質(zhì)或抗體，包括將這些成分作為單一活性成分給藥，或作為其它 藥物、免疫抑制劑或免疫調(diào)節(jié)劑或其它抗炎癥藥物的輔佐劑聯(lián)合給藥，用于治療 或預(yù)防同種異體或異種移植急性或慢性排斥或炎癥或自身免疫疾病，或作為化學 治療劑或作為抗惡性細胞增殖劑，其中化學治療劑包括以下各組物質(zhì)的成員 I芳香酶抑制劑，II微管活化劑、烷化劑、抗腫瘤抗代謝藥物或鉑化合物，III能靶向/減少蛋白質(zhì)或脂質(zhì)激酶的活性，或蛋白質(zhì)或脂質(zhì)磷酸酶活性的化 合物，及抗血管生成化合物或誘導細胞分化過程的化合物， IV緩激肽1受體或血管緊張素II拮抗劑，V環(huán)氧化酶抑制劑、二磷酸鹽、組蛋白脫酰基酶抑制劑、類肝素酶抑制劑(預(yù)防硫酸類肝素降解)，例如PI-889,—種生物學應(yīng)答調(diào)節(jié)劑，優(yōu)選淋巴因子或 干擾素，例如干擾素、quadrature、遍在蛋白抑制劑、或能阻斷抗細胞凋亡途徑的 抑制劑，VI Ras癌基因同種型抑制劑，如H-Ras、 K-Ras或N-Ras，或法尼基轉(zhuǎn)移酶抑 制劑，例如L-744、 832或DK8G557，VII端粒酶抑制劑，例如端粒轉(zhuǎn)移抑制素(telomestatin)，VIII蛋白酶抑制劑、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑、甲硫氨酸氨基肽酶抑制劑，例 如bengamide或其衍生物，或蛋白質(zhì)體抑制劑，例如PS-341，和/或IX mTOR抑制劑，或X各組成員的任何組合。
29.如權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述使藥物、基因、siRNA、 shRNA、 肽、蛋白質(zhì)、抗體或生物醫(yī)學治療分子或制劑分布于整個組織，包括使所述藥物、 基因、siRNA、 shRNA、肽、蛋白質(zhì)、抗體或其它生物醫(yī)學治療分子或制劑的抑 制劑、增強劑、激動劑、拮抗劑、調(diào)節(jié)劑、調(diào)控劑、修飾劑、或監(jiān)測劑分布于整 個組織。
全文摘要
本發(fā)明的說明性實施方式包括四種優(yōu)選實施方式1)向關(guān)節(jié)及其相關(guān)軟組織的遞送骨基因、蛋白質(zhì)和藥物的方法和裝置；2)向四肢遞送基因、蛋白質(zhì)和藥物的方法和裝置；3)向皮膚和軟組織遞送基因、蛋白質(zhì)和藥物的方法和裝置；和/或4)向軟組織腫瘤遞送基因、蛋白和藥物的方法和裝置。
文檔編號C12N15/87GK101506370SQ200780000069
公開日2009年8月12日 申請日期2007年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月10日
發(fā)明者沈路一 申請人:加利福尼亞州大學董事會