專利名稱：：一種利用氧化還原電位調(diào)控厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于有機酸生產(chǎn)
技術領域：
，特別涉及一種氧化還原電位(ORP)調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法。
背景技術：
：丁二酸(SuccinicAcid)，又名琥珀酸，作為三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物之一，在生物的代謝中占有非常重要的地位，因此被廣泛應用于合成化學藥物的中間體。丁二酸主要消費市場有四個最大的市場是作為表面活性劑、清潔劑添加劑和起泡劑；第二是離子鰲合劑；第三個市場是食品行業(yè)中作為酸化劑、pH改良劑、風味物質(zhì)和抗菌劑；第四個市場是和健康有關的產(chǎn)品，包括醫(yī)藥、抗生素和維生素的生產(chǎn)，這四個市場總量每年超過四億美元。但丁二酸真正的潛力是作為大規(guī)模工業(yè)原料的應用，替代苯和石油等大宗化工原料的前景非常的廣闊。傳統(tǒng)丁二酸生產(chǎn)方法采用的是從丁烷經(jīng)順丁烯二酐通過電解法來生產(chǎn)，這種生產(chǎn)方法污染大，成本高，嚴重抑制了丁二酸這一大宗化學品的發(fā)展?jié)摿?。釆用玉米生物煉制進行丁二酸生產(chǎn)的開發(fā)，生產(chǎn)成本將有望從目前的12，000元/噸降至4，000元/噸以下，從而有利于打開大宗化學品的市場，取代很多基于苯和石化中間產(chǎn)物的商品，減少在超過250種苯基化學制品的生產(chǎn)和消費過程中所產(chǎn)生的污染，市場總量將由目前的1.8萬噸擴展至400萬噸。其中C4大宗化學品如1,4-丁二醇、四氫呋喃、Y-丁內(nèi)酯等、N-甲基吡咯烷酮的市場需求超過200億元/年，制備新型可完全生物降解塑料PBS(聚丁二酸丁二醇脂)也將成為丁二酸的重要應用領域。US5504004、US5573931、US5723322、EP0389103B1公開了丁二酸生產(chǎn)菌以及其發(fā)酵方法，這些生產(chǎn)菌株大多是從瘤胃、犬的口腔等特征厭氧生態(tài)環(huán)境中篩選出來的，在發(fā)酵過程中存在著產(chǎn)物收率較低，副產(chǎn)物較多，以及發(fā)酵周期長等問題，因此開發(fā)高效的丁二酸生產(chǎn)方法是目前亟待解決的問題。氧化還原電位(ORP)已被用作發(fā)酵過程的一種控制參數(shù)，它反映了發(fā)酵過程中全部的氧化還原過程尤其是細胞的代謝過程。發(fā)酵體系中氧化還原電位是pH值、溶解氧濃度、平衡常數(shù)和大量溶解培養(yǎng)基中物質(zhì)的氧化還原電位的綜合反映。在好氧發(fā)酵體系，可以通過控制溶解氧水平實現(xiàn)氧化還原電位的控制，這種方法已在木糖醇、檸檬酸、L-賴氨酸、重組蛋白等發(fā)酵體系中有應用。韓國專利KR175497公開了控制木糖醇發(fā)酵體系，其氧化還原電位在50100mV可提高木糖醇的產(chǎn)量；韓國專利KR9707922公開了通過改變?nèi)芙庋醯乃娇刂芁-賴氨酸發(fā)酵體系，其氧化還原電位在-110-55mV，可提高L-賴氨酸收率。由于在厭氧發(fā)酵過程中無法通過控制溶解氧來控制體系的氧化還原電位，因此，采用加入對發(fā)酵過程無抑制作用的氧化劑、還原劑，結(jié)合氧化還原電位的檢測來控制體系的氧化還原電位，可以提高厭氧發(fā)酵目標產(chǎn)物產(chǎn)量，降低副產(chǎn)物含量，縮短發(fā)酵時間。CN200410087673.7公開了一種利用氧化還原電勢調(diào)控厭氧發(fā)酵1，3-丙二醇的方法，提高了1,3-丙二醇的產(chǎn)量和產(chǎn)率，但該方法需經(jīng)歷兩段雙底物集成發(fā)酵好氧過程，ORP調(diào)控下的兩段雙底物集成發(fā)酵過渡過程，以及多次ORP調(diào)控下的兩段雙底物集成發(fā)酵厭氧過程。目前國內(nèi)外未見利用ORP直接調(diào)控厭氧發(fā)酵過程生產(chǎn)有機酸的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種利用氧化還原電位調(diào)控厭氧發(fā)酵過程生產(chǎn)丁二酸的方法，以提高目標產(chǎn)物丁二酸的產(chǎn)量，減少副產(chǎn)物產(chǎn)量，縮短發(fā)酵時間。為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一種利用氧化還原電位(ORP)調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，包括菌種活化、種子培養(yǎng)、厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸三歩驟，其特征是根據(jù)微生物厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的特性，在發(fā)酵體系中引入了ORP電極，結(jié)合對發(fā)酵過程無抑制作用的氧化劑、還原劑對發(fā)酵體系的ORP進行調(diào)節(jié)。發(fā)酵體系中加入氧化劑降低ORP，加入還原劑提高ORP，將ORP控制在最適值，以達到丁二酸的高效率生產(chǎn)。本發(fā)明所述的厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的微生物為從特征厭氧環(huán)境中篩選的丁二酸生產(chǎn)菌株，包括產(chǎn)琥珀酸放線桿菌J"/"o6ad〃w"wcc!'"oge"esNJ113(CGMCCNO.1716),產(chǎn)琥珀酸放線桿菌」c""o^"'〃wuwcd"oge"ey130Z(ATCC55618),產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌爿waero6/tw//n7/wwswccz'wfc&roc/wce/w(ATCC53488)。本發(fā)明所述的菌種活化步驟中，菌株活化的斜面培養(yǎng)基為pH6.08.0的含有糖類的能提供碳源、氮源及無機鹽的固體斜面培養(yǎng)基，斜面培養(yǎng)時將菌株在斜面培養(yǎng)基中進行平板劃線后，在厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱含有N2、C02和H2的混合氣體，溫度為304(TC，活化培養(yǎng)2448h，用于種子培養(yǎng)基接種和菌株保存。本發(fā)明所述的種子培養(yǎng)步驟中，種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基為pH6.08.0的含有糖類的能提供碳源、氮源及無機鹽的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)時將100mL血清瓶中加入種子培養(yǎng)基2080mL，通入含有N2和C02混合氣，115121"滅菌1530min，冷卻后接入斜面培養(yǎng)菌株，培養(yǎng)溫度為3040°C，搖床轉(zhuǎn)速100~300rpm，培養(yǎng)時間為1016h，用于發(fā)酵培養(yǎng)基接種。本發(fā)明所述的厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸步驟中，發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基為pH6.08.0的含有糖類的能提供碳源、氮源及無機鹽的液體培養(yǎng)基，7.5L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基體積為35L，放入滅菌ORP電極，接種量為37%(v/v)，溫度為354(TC，發(fā)酵罐通入C02，以保持發(fā)酵體系的厭氧環(huán)境，攪拌轉(zhuǎn)速在100300rpm，并利用各種碳酸鹽、氨水、NaOH、尿素、有機酸、無機酸控制發(fā)酵過程pH在6.07.4,采用氧化劑和還原劑將氧化還原電位值控制在-100mv-600mv，發(fā)酵時間為3048h。本發(fā)明所述的結(jié)合ORP電極使用的氧化劑為過氧化氫，鐵氰化鉀；結(jié)合ORP電極使用的還原劑為二硫蘇糖醇，胱氨酸，半胱氨酸，亞硫酸鈉，維生素C，維生素E，H2，富馬酸二鈉，NaHB4。本發(fā)明通過ORP電極檢測發(fā)酵過程的ORP變化，加入氧化劑和還原劑將體系的ORP控制在最適值，達到丁二酸的高效率生產(chǎn)，提高丁二酸的產(chǎn)量和產(chǎn)率，減少副產(chǎn)物的產(chǎn)生，縮短發(fā)酵時間。本發(fā)明采用氧化還原電極測定丁二酸發(fā)酵體系的ORP，并利用氧化劑、還原劑控制發(fā)酵體系的氧化還原電位值，具有重要的理論意義和應用價值。具體實施例方式以下所述實施例對本發(fā)明作了詳細說明，但對本發(fā)明沒有限制。實施例1菌種產(chǎn)琥珀酸放線桿菌爿"/"oZ^c/〃wwwo7'"oge""NJ113(CGMCCNo.1716)斜面培養(yǎng)基葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCllg/L，NaHC0310g/L，Na2HP0415g/L，KH2P044g/L，瓊月旨20g/L。種子培養(yǎng)基葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCllg/L，NaHC0310g/L，Na2HP0415g/L，KH2P044g/L，通入C02氣體2min，12rC滅菌15min，冷卻。發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖100g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L,MnCl20.05g/L，F(xiàn)eCl20甲05g/L，CaCl20.05g/L，K2HP042.0g/L，MgC0380g/L，pH7.0。7.5L發(fā)酵罐培養(yǎng)時培養(yǎng)基裝液量為4.5L。將菌株在種子斜面培養(yǎng)基中進行平板劃線后，在厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，控制培養(yǎng)箱中混合氣比例為N2:C02:H2=8:1:1，37'C培養(yǎng)36h后的菌株用接種環(huán)接一環(huán)到含有50mL種子液體培養(yǎng)基的100mL血清瓶中，轉(zhuǎn)速300rpm，37。C培養(yǎng)12h后用于上述發(fā)酵培養(yǎng)基接種(7.5L發(fā)酵罐)，接種量為5%(v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速在300rpm，37'C發(fā)酵培養(yǎng)，C02通氣量為0.25vvm。將鐵氰化鉀，半胱氨酸分別配制成10g/L，2g/L的溶液，121°C，滅菌20min。通過ORP電極測定發(fā)酵體系的ORP，控制發(fā)酵體系的ORP在-350mV，當電位低于-350mV時采用10g/L鐵氰化鉀升高ORP，當電位高于-350mV時，采用2g/L半胱氨酸降低ORP，控制ORP值在-350mV士10mV，并與不控制氧化還原電位值培養(yǎng)菌株對比，發(fā)酵至葡萄糖不再變化，結(jié)果見表l。采用半胱氨酸控制氧化還原電位值在-350mV比不控制氧化還原電位時丁二酸產(chǎn)量提高了14.9%,甲酸減少了45.8%，乙酸含量減少了33.6%,發(fā)酵時間縮短了25%。表1半胱氨酸控制QRP與不控制ORP發(fā)酵結(jié)果對比<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注.-發(fā)酵結(jié)束時間為兩個小時內(nèi)糖的消耗小于1g/L判定發(fā)酵結(jié)束。實施例2菌種產(chǎn)琥珀酸放線桿菌^c"wo6ac/〃^wcc/"oge"Ml30Z(ATCC55618)斜面培養(yǎng)基葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白月東5g/L，NaCllg/L，NaHCO310g/L，Na2HP0415g/L，KH2P044g/L，瓊月旨20g/L。種子培養(yǎng)基葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L,NaCllg/L，NaHC0310g/L，Na2HP0415g/L,KH2P044g/L，通入C02氣體2min，115。C滅菌30min，冷卻。發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖80g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，MnCl20.05g/L，F(xiàn)eCl20.05g/L,CaCl20.05g/L，K2HP042.0g/L，MgC0380g/L，pH7.0。7.5L發(fā)酵罐培養(yǎng)時培養(yǎng)基裝液量為4.5L。將菌株在種子斜面培養(yǎng)基中進行平板劃線后，在厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，控制培養(yǎng)箱中混合氣比例為N2:C02:H2=8:1:1，37'C培養(yǎng)36h后的菌株用接種環(huán)接一環(huán)到含有50mL種子液體培養(yǎng)基的lOOmL血清瓶中，轉(zhuǎn)速300rpm，37。C培養(yǎng)12h后用于上述發(fā)酵培養(yǎng)基接種(7.5L發(fā)酵罐)，接種量為5%(v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速在300rpm，0)2通氣量為0.25vvm，37'C發(fā)酵培養(yǎng)，將H202、Vc分別配制成0.1%，2g/L的溶液，經(jīng)0.45um無菌濾膜過濾除菌。通過ORP電極測定發(fā)酵體系的ORP，控制發(fā)酵體系的ORP在-300mV，當電位低于-300mV時采用0.1%H202升高ORP，當電位高于-300mV時，采用2g/L的Vc降低ORP,控制ORP值在-300mV土lOmV,并與不控制ORP值培養(yǎng)菌株作對比，發(fā)酵至葡萄糖不再變化，結(jié)果見表2。采用Vc控制氧化還原電位值在-300mV比不控制氧化還原電位時丁二酸產(chǎn)量提高了14.0%，甲酸減少了32.1%,乙酸含量減少了28.9%，發(fā)酵時間縮短了17.4%。表2Vc控制ORP與不控制ORP發(fā)酵結(jié)果對比細胞干重(g/L)丁二酸(g/L)甲酸(g/L)乙酸(g/L)發(fā)酵結(jié)束時間(h)不控制ORP3.156.45.612.946控制ORP在64.33.89.238-300mV±10mV實施例3菌種產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌爿"Gera6/oyp/rz7/wwracc7'w/";pra^wcem(ATCC53488)斜面培養(yǎng)基葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白月東5g/L，NaCllg/L，NaHCO310g/L，Na2HP0415g/L，KH2P044g/L，瓊月旨20g/L.種子培養(yǎng)基葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCllg/L，NaHC0310g/L，Na2HP0415g/L，KH2P044g/L，通入C02氣體2min，115。C滅菌30min，冷卻。發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖80g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，MnCl20.05g/L,FeCl20.05g/L，CaCl20.05g/L，K2HP042.0g/L，MgC0380g/L，pH7.0。7.5L發(fā)酵罐培養(yǎng)時培養(yǎng)基裝液量為4.5L，C02通氣量為0.6L/min，以保持發(fā)酵體系的厭氧環(huán)境。將菌株在種子斜面培養(yǎng)基中進行平板劃線后，在厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，控制培養(yǎng)箱中混合氣比例為N2:C02:H^8:1:1，40。C培養(yǎng)36h后的菌株用接種環(huán)接一環(huán)到含有50mL種子液體培養(yǎng)基的100mL血清瓶中，轉(zhuǎn)速300rpm，37。C培養(yǎng)12h后用于上述發(fā)酵培養(yǎng)基接種(7.5L發(fā)酵罐)，接種量為5%(v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速在300rpm，C02通氣量為0.25vvm，37'C發(fā)酵培養(yǎng)，將鐵氰化鉀，二硫蘇糖醇分別配制成10g/L，2g/L的溶液，121'C，滅菌20min。通過ORP電極測定發(fā)酵體系的ORP，控制發(fā)酵體系的ORP在-400mV，當電位低于-400mV時采用10g/L鐵氰化鉀升高ORP，當電位高于-400mV日寸，采用2g/L二硫蘇糖醇降低ORP,控制ORP值在-400mV士10mV,并與不控制氧化還原電位值培養(yǎng)菌株，發(fā)酵至葡萄糖不再變化，結(jié)果見表3。采用二硫蘇糖醇控制氧化還原電位值在-400mV比不控制氧化還原電位時丁二酸產(chǎn)量提高了34.6%，乙酸含量減少了42.9%，發(fā)酵時間縮短了27.3%。表3二硫蘇糖醇控制ORP與不控制ORP發(fā)酵結(jié)果對比<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例4菌種產(chǎn)琥珀酸放線桿菌爿"/"o6ac/〃w:ywcd"og^7"NJ113(CGMCCNo.1716)斜面培養(yǎng)基葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCllg/L，NaHCO310g/L，Na2HP0415g/L，KH2P044g/L，瓊月旨20g/L。種子培養(yǎng)基葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCllg/L，NaHC0310g/L，Na2HP0415g/L，KH2P044g/L，通入C02氣體2min，121°C滅菌15min，冷卻。發(fā)酵培養(yǎng)基酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，MnCl20.05g/L，F(xiàn)eCl20.05g/L，CaCl20.05g/L，K2HP042.0g/L，MgCO380g/L，糖液80g/L。糖液為玉米皮水解液，制備方法如下取干燥的玉米皮，經(jīng)機械粉碎過100目篩，加水制得混漿，玉米皮含量為16%(w/v)，加入98%濃硫酸，加入量為反應液體積的0.5%(v/v),混漿于12rC水解30min，即得糖液。7.5L發(fā)酵罐培養(yǎng)時培養(yǎng)基裝液量為4.5L。將菌株在種子斜面培養(yǎng)基中進行平板劃線后，在厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，控制培養(yǎng)箱中混合氣比例為N2:C02:Hf8:l:l，37'C培養(yǎng)36h后的菌株用接種環(huán)接一環(huán)到含有50mL種子液體培養(yǎng)基的lOOmL血清瓶中，轉(zhuǎn)速300rpm，37。C培養(yǎng)12h后用于上述發(fā)酵培養(yǎng)基接種(7.5L發(fā)酵罐)，接種量為5%(v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速在300rpm，37'C發(fā)酵培養(yǎng)，C02通氣量為0.25wm。將鐵氰化鉀，富馬酸二鈉分別配制成10g/L，2g/L的溶液，12rC，滅菌20min。通過ORP電極測定發(fā)酵體系的ORP，控制發(fā)酵體系的ORP在-200mV，當電位低于-200mV時采用10g/L鐵氰化鉀升高ORP，當電位高于-200mV時，采用2g/L富馬酸二鈉降低ORP，控制ORP值在-200mV士10mV，并與不控制ORP值培養(yǎng)菌株作對比，發(fā)酵至總糖不再變化，結(jié)果見表4。采用富馬酸二鈉控制混合糖液發(fā)酵，丁二酸產(chǎn)量提高了22.9%，甲酸減少了37.3%，乙酸含量減少了26.1%，發(fā)酵時間縮短了23%。表4富馬酸二鈉控制ORP與不控制ORP發(fā)酵結(jié)果對比<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例5菌種產(chǎn)琥珀酸放線桿菌v4"/"okd〃wwwcc/"oge恥sNJ113(CGMCCNo.1716)斜面培養(yǎng)基葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCllg/L，NaHC0310g/L，Na2HP0415g/L，KH2P044g/L,瓊月旨20g/L。種子培養(yǎng)基葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L,蛋白月東5g/L，NaCllg/L，NaHC0310g/L，Na2HP0415g/L，KH2P044g/L,通入C02氣體2min，121。C滅菌15min，冷卻。發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖100g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，MnCl20.05g/L，F(xiàn)eCl20.05g/L，CaCl20.05g/L，K2HP042.0g/L，MgC0380g/L，pH7.0。7.5L發(fā)酵罐培養(yǎng)時培養(yǎng)基裝液量為3L。將菌株在種子斜面培養(yǎng)基中進行平板劃線后，在厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，控制培養(yǎng)箱中混合氣比例為N2:C02:H產(chǎn)8:1:1，3(TC培養(yǎng)24h后的菌株用接種環(huán)接一環(huán)到含有20mL種子液體培養(yǎng)基的100mL血清瓶中，轉(zhuǎn)速200rpm，30。C培養(yǎng)10h后用于上述發(fā)酵培養(yǎng)基接種(7.5L發(fā)酵罐)，接種量為3%(v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速在100rpm，35t:發(fā)酵培養(yǎng)，C02通氣量為0.25vvm。將鐵氰化鉀，胱氨酸分別配制成10g/L，2g/L的溶液，12rC，滅菌20min。通過ORP電極測定發(fā)酵體系的RP,控制發(fā)酵體系的ORP在-100mV，當電位低于-100mV時采用10g/L鐵氰化鉀升高ORP，當電位高于-100mV時，采用2g/L胱氨酸降低ORP，控制ORP值在-100mV土10mV，并與不控制氧化還原電位值培養(yǎng)菌株對比，發(fā)酵至葡萄糖不再變化，結(jié)果見表5。采用胱氨酸控制氧化還原電位值在-100mV比不控制氧化還原電位時丁二酸產(chǎn)量提高了11.2%，甲酸減少了32.1%，乙酸含量減少了29.1%,發(fā)酵時間縮短了25%。表5胱氨酸控制ORP與不控制ORP發(fā)酵結(jié)果對比<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例6菌種產(chǎn)琥珀酸放線桿菌^"/"o6ac/〃Mswcc/"ogwesl30Z(ATCC55618)斜面培養(yǎng)基葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCllg/L，NaHC0310g/L，Na2HP0415g/L，KH2P044g/L，瓊脂20g/L。種子培養(yǎng)基葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCllg/L，NaHCO310g/L，Na2HP0415g/L,KH2P044g/L，通入C02氣體2min，115。C滅菌30min，冷卻。發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖100g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，MnCl20.05g/L，F(xiàn)eCl20.05g/L，CaCl20.05g/L，K2HP042.0g/L，MgC0380g/L，pH7.0。7.5L發(fā)酵罐培養(yǎng)時培養(yǎng)基裝液量為5L。將菌株在種子斜面培養(yǎng)基中進行平板劃線后，在厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，控制培養(yǎng)箱中混合氣比例為N2:C02:H^8:1:1，40'C培養(yǎng)48h后的菌株用接種環(huán)接一環(huán)到含有80mL種子液體培養(yǎng)基的100mL血清瓶中，轉(zhuǎn)速100rpm，4(TC培養(yǎng)16h后用于上述發(fā)酵培養(yǎng)基接種(7.5L發(fā)酵罐)，接種量為7%(v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速在200rpm，40。C發(fā)酵培養(yǎng)，C02通氣量為0.25vvm。將H202，亞硫酸鈉分別配制成0.1%，2g/L的溶液，經(jīng)0.45um無菌濾膜過濾除菌。通過ORP電極測定發(fā)酵體系的ORP，控制發(fā)酵體系的ORP在-100mV，當電位低于-100mV時采用0.1%H202升高ORP，當電位高于-100mV時，采用2g/L亞硫酸鈉降低ORP，控制ORP值在-100mV士lOmV，并與不控制ORP電位值培養(yǎng)菌株對比，發(fā)酵至葡萄糖不再變化，結(jié)果見表6。采用亞硫酸鈉控制氧化還原電位值在-100mV比不控制氧化還原電位時丁二酸產(chǎn)量提高了14.1%,甲酸減少了38.9%，乙酸含量減少了30.13%,發(fā)酵時間縮短了23.4%。表6亞硫酸鈉控制ORP與不控制ORP發(fā)酵結(jié)果對比<table>complextableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例7菌禾中產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌爿""eraWcwp/W〃wwwcc/m'";prat/wcem1(ATCC53488)斜面培養(yǎng)基葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白月東5g/L，NaCllg/L，NaHCO310g/L，Na2HP0415g/L，KH2P044g/L，瓊脂20g/L。種子培養(yǎng)基葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCllg/L，薩CO"Og/L，Na2HP0415g/L，KH2P044g/L，通入C02氣體2min,115。C滅菌30min，冷卻。發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖80g/L,酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，MnCl20.05g/L，F(xiàn)eCl20.05g/L，CaCl20.05g/L，K2HP042.0g/L，MgCO380g/L，pH7.0。7.5L發(fā)酵罐培養(yǎng)時培養(yǎng)基裝液量為3L。將菌株在種子斜面培養(yǎng)基中進行平板劃線后，在厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，控制培養(yǎng)箱中混合氣比例為N2:C02:H^8:1:1，3(TC培養(yǎng)48h后的菌株用接種環(huán)接一環(huán)到含有20mL種子液體培養(yǎng)基的100mL血清瓶中，轉(zhuǎn)速300rpm，37r培養(yǎng)12h后用于上述發(fā)酵培養(yǎng)基接種(7.5L發(fā)酵罐)，接種量為7%(v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速在200rpm，C02通氣量為0.25vvm，37'C發(fā)酵培養(yǎng)，將H202、Ve分別配制成0.1%，2g/L的溶液，經(jīng)0.45um無菌濾膜過濾除菌。通過ORP電極測定發(fā)酵體系的ORP，控制發(fā)酵體系的ORP在-350mV,當電位低于-350mV時采用0.1%H202升高ORP，當電位高于-350mV時，采用2g/L的VE降低ORP，控制ORP值在-350mV土lOmV，并與不控制ORP值培養(yǎng)菌株作對比，發(fā)酵至葡萄糖不再變化，結(jié)果見表7。采用Ve控制氧化還原電位值在-350mV比不控制氧化還原電位時丁二酸產(chǎn)量提高了14.0%,甲酸減少了32.1%,乙酸含量減少了28.9%，發(fā)酵時間縮短了17.4%。表7VE控制ORP與不控制ORP發(fā)酵結(jié)果對比細胞干重(g/L)丁:二酸(g/L)甲酸(g/L)乙酸(g/L)發(fā)酵結(jié)束時間(h)不控制ORP3.156.45.612.946控制ORP在-350mV±10mV3.564.33.89.238實施例8菌禾中產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌v4"aera6/(wp/"7/wwwcc/m'c^prac/wce/wATCC53488斜面培養(yǎng)基葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCllg/L，NaHCO310g/L，Na2HP0415g/L,KH2P044g/L，瓊月旨20g/L.種子培養(yǎng)基葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白月東5g/L，NaCllg/L，NaHC0310g/L，Na2HP0415g/L，KH2P044g/L，通入(302氣體2min，121。C滅菌15min，冷去口。發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖80g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，MnCl20.05g/L，F(xiàn)eCl20.05g/L，CaCl20.05g/L，K2HP042.0g/L，MgCO380g/L，pH7.0。7.5L發(fā)酵罐培養(yǎng)時培養(yǎng)基裝液量為5L。將菌株在種子斜面培養(yǎng)基中進行平板劃線后，在厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，控制培養(yǎng)箱中混合氣比例為N2:C02:H2-8丄1，37'C培養(yǎng)24h后的菌株用接種環(huán)接一環(huán)到含有50mL種子液體培養(yǎng)基的100mL血清瓶中，轉(zhuǎn)速200ipm,40'C培養(yǎng)10h后用于上述發(fā)酵培養(yǎng)基接種(7.5L發(fā)酵罐)，接種量為7%(Wv)，攪拌轉(zhuǎn)速在100rpm，C02通氣量為0.25vvm，37。C發(fā)酵培養(yǎng)，將鐵氰化鉀，NaHB4分別配制成10g/L，2g/L的溶液，12rC，滅菌20min。通過ORP電極測定發(fā)酵體系的ORP,控制發(fā)酵體系的ORP在-600mV，當電位低于-600mV時采用10g/L鐵氰化鉀升高ORP，當電位高于-600mV時，采用2g/LNaHB4降低ORP，控制ORP值在-600mV±10mV,并與不控制ORP值培養(yǎng)菌株，發(fā)酵至葡萄糖不再變化，結(jié)果見表8。采用NaHB4控制氧化還原電位值在-600mV比不控制氧化還原電位時丁二酸產(chǎn)量提高了13.7%，甲酸減少了30.5%，乙酸含量減少了40.1%,發(fā)酵吋間縮短了24%。表8NaHB4控制ORP與不控制ORP發(fā)酵結(jié)果對比細胞干重(g/L)丁二酸(g/L)甲酸(g/L)乙酸(g/L)發(fā)酵結(jié)束時間(h)不控制ORP3.356.28.114.551控制ORP在63.95.68.6393.9-600mV±10mV實施例9菌種產(chǎn)琥珀酸放線桿菌X"f"o6an7/w;yracdMOge"e:yl30Z(ATCC55618)斜面培養(yǎng)基葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L,蛋白胨5g/L，NaCllg/L，NaHC0310g/L，Na2HP0415g/L，KH2P044g/L，瓊月旨20g/L。種子培養(yǎng)基葡萄糖10g/L,酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，NaCllg/L，NaHC0310g/L，Na2HP0415g/L，KH2P044g/L，通入C02氣體2min，121。C滅菌15min，冷卻。發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖80g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，MnCl20.05g/L，F(xiàn)eCl20.05g/L，CaCl20.05g/L，K2HP042.0g/L'MgCO380g/L，pH7.0。7.5L發(fā)酵罐培養(yǎng)時培養(yǎng)基裝液量為4.5L。將菌株在種子斜面培養(yǎng)基中進行平板劃線后，在厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，控制培養(yǎng)箱中混合氣比例為N2:C02:H2=8:1:1，37'C培養(yǎng)36h后的菌株用接種環(huán)接一環(huán)到含有50mL種子液體培養(yǎng)基的lOOmL血清瓶中，轉(zhuǎn)速300ipm，37'C培養(yǎng)12h后用于上述發(fā)酵培養(yǎng)基接種(7.5L發(fā)酵罐)，接種量為5%(v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速在300rpm，C02通氣量為0.25vvm，37。C發(fā)酵培養(yǎng)，將}1202配制成0.1%的溶液，經(jīng)0.45um無菌濾膜過濾除菌。通過ORP電極測定發(fā)酵體系的ORP，控制發(fā)酵體系的ORP在-100mV，當電位低于-600mV時采用0.1%H2O2升高ORP，當電位高于-600mV時，通入經(jīng)0.45um無菌濾膜過濾除菌的H2降低ORP，控制ORP值在-600mV±10mV，并與不控制ORP值培養(yǎng)菌株作對比，發(fā)酵至葡萄糖不再變化，結(jié)果見表9。釆用H2控制氧化還原電位值在-600mV比不控制氧化還原電位時丁二酸產(chǎn)量提高了12.8%,甲酸減少了26.3%，乙酸含量減少了22.1%，發(fā)酵時間縮短了19.6%。表9H2控制ORP與不控制ORP發(fā)酵結(jié)果對比<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>權(quán)利要求1.一種利用氧化還原電位(ORP)調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，包括菌種活化、種子培養(yǎng)、厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸三步驟，其特征在于根據(jù)微生物厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的特性，在發(fā)酵體系中引入了ORP電極，結(jié)合氧化劑、還原劑對發(fā)酵體系的ORP進行調(diào)節(jié)，以提高目標產(chǎn)物丁二酸的產(chǎn)量，減少副產(chǎn)物產(chǎn)量，縮短發(fā)酵時間。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用氧化還原電位(ORP)調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于所述的厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的微生物為從特征厭氧環(huán)境中篩選的丁二酸生產(chǎn)菌株。3.根據(jù)權(quán)利2所述的利用氧化還原電位(ORP)調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于所述的從特征厭氧環(huán)境中篩選出丁二酸生產(chǎn)菌株為產(chǎn)琥珀酸放線桿菌y4cri"o6ac/〃w^wcc/"ogw^NJ113(CGMCCNO.1716)，產(chǎn)琥珀酸放線桿菌^c"力o6ac/〃Mswcc/"ogen^l30Z(ATCC55618),產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌^4waera6/as/7z>77/wwracc/m'"》raafwceAW(ATCC53488)。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用氧化還原電位(ORP)調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于所述的菌株活化的斜面培養(yǎng)基為pH6.08.0的含有糖類的能提供碳源、氮源及無機鹽的固體斜面培養(yǎng)基，斜面培養(yǎng)時將菌株在斜面培養(yǎng)基中進行平板劃線后，在厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱含有N2、C02和H2的混合氣體，溫度為304(TC，活化培養(yǎng)2448h,用于種子培養(yǎng)基接種和菌株保存。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用氧化還原電位(ORP)調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于所述的種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基為pH6.08.0的含有糖類的能提供碳源、氮源及無機鹽的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)時將100mL血清瓶中加入種子培養(yǎng)基2080mL，通入含有N2和C(V混合氣，115121。C滅菌1530min，冷卻后接入斜面培養(yǎng)菌株，培養(yǎng)溫度為304(TC，搖床轉(zhuǎn)速100300rpm，培養(yǎng)時間為1016h，用于發(fā)酵培養(yǎng)基接種。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用氧化還原電位(ORP)調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基為pH6.08.0的含有糖類的能提供碳源、氮源及無機鹽的液體培養(yǎng)基，7.5L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基體積為35L，放入滅菌ORP電極，接種量為37%(v/v)，溫度為3540'C，發(fā)酵罐通AC02,以保持發(fā)酵體系的厭氧環(huán)境，攪拌轉(zhuǎn)速在100300rpm，發(fā)酵過程控制pH在6.07.4，采用氧化劑和還原劑將氧化還原電位值控制在-100mv-600mv，發(fā)酵時間為3048h。7.根據(jù)權(quán)利要求1和6所述的利用氧化還原電位(ORP)調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于所述的結(jié)合ORP電極使用的氧化劑為過氧化氫，鐵氰化鉀。8.根據(jù)權(quán)利要求1和6所述的利用氧化還原電位(ORP)調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，其特征在于所述的結(jié)合ORP電極使用的還原劑為二硫蘇糖醇，胱氨酸，半胱氨酸，亞硫酸鈉，維生素C，維生素E，H2,富馬酸二鈉，NaHB4。全文摘要本發(fā)明公開了一種利用氧化還原電位(ORP)調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法，包括菌種活化、種子培養(yǎng)、厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸三步驟。本發(fā)明根據(jù)微生物厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的特性，在發(fā)酵體系中引入了ORP電極，結(jié)合對發(fā)酵過程無抑制作用的氧化劑、還原劑對發(fā)酵體系的ORP進行調(diào)節(jié)。發(fā)酵體系中加入氧化劑降低ORP，加入還原劑提高ORP，將ORP控制在最適值，以達到丁二酸的高效率生產(chǎn)，提高了丁二酸的產(chǎn)量和產(chǎn)率，減少了副產(chǎn)物的產(chǎn)生，縮短了發(fā)酵時間。文檔編號C12P7/46GK101182555SQ200710190909公開日2008年5月21日申請日期2007年12月3日優(yōu)先權(quán)日2007年12月3日發(fā)明者昊吳,岷姜,建李,歐陽平凱,王益娜,陳可泉,萍韋申請人:南京工業(yè)大學