專利名稱：：一種轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，是關(guān)于一種通過控制滲透壓轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法。
背景技術(shù)：
：1,3-丙二醇(l,3-porpanediol，簡稱1，3-PD)是一種重要的化工原料，可用作溶劑、抗凍劑或保護劑、精細化工原料以及新型聚醋一一聚對苯二甲酸丙二醇醋(PTT)和聚氨醋的單體。PTT已被證明是一種性能優(yōu)異的新型聚酯材料。現(xiàn)有的l,3-PD生產(chǎn)法有化學(xué)合成法和生物合成法。目前國際上1，3-PD的合成主要是通過化學(xué)法進行的。但是相對于化學(xué)合成法而言，生物法合成1，3-PD的條件更溫和、操作簡單、副產(chǎn)物少、更綠色環(huán)保。隨著1,3-PD需求量的日趨擴大，對于1,3-PD的生物合成法的研究已越來越受到國內(nèi)外研究人員的重視。生物合成法的主要路線是在生物催化劑的作用下將甘油轉(zhuǎn)化為1,3-PD。目前，最常用的、能將甘油轉(zhuǎn)化為1,3-PD的微生物大致包括克雷伯氏肺炎桿菌(《fefozW/")、弗氏檸檬菌(C"ra6""w)、丁酸梭狀芽孢桿菌(aoWn'&Mm)等等?，F(xiàn)在國內(nèi)生物法生產(chǎn)1,3-PD的方法包括1、劉德華等，一種發(fā)酵生產(chǎn)1，3-PD的高產(chǎn)工藝(申請?zhí)朇N200710063347.0)，該方法以中間代謝產(chǎn)物3-羥基丙醛為控制指標(biāo)來促進微生物合成1,3-PD;2、杜銘等，氧化還原電勢調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)l,3-PD方法(申請?zhí)朇N200410086573.7),該方法通過調(diào)控發(fā)酵體系的氧化還原電勢來促進微生物合成1,3-PD。
發(fā)明內(nèi)容本申請的發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，用于轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1,3-丙二醇的微生物對于滲透壓比較敏感，因此本發(fā)明的目的就在于提供一種轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)l,3-PD的方法，其通過控制發(fā)酵液的滲透壓來控制菌體的生長和1，3-PD的合成。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法，包括種子培養(yǎng)以及發(fā)酵罐發(fā)酵轉(zhuǎn)化甘油生成1,3-丙二醇，該方法在發(fā)酵過程中通過控制發(fā)酵液的滲透壓來促進菌體生長以及產(chǎn)物1,3-丙二醇的生成。根據(jù)本發(fā)明，所述控制滲透壓通過控制發(fā)酵液中鹽的濃度來實現(xiàn)，即控制的參數(shù)滲透壓由發(fā)酵液中鹽的濃度來表征。根據(jù)本發(fā)明，所述控制滲透壓的發(fā)酵過程的具體條件如下初始甘油濃度3060g/L，發(fā)酵溫度3540。C;通氣量0.52.0vvm;攪拌轉(zhuǎn)速2050rpm;在發(fā)酵過程中，通過加入NaOH溶液控制發(fā)酵液的pH值范圍在5.58.5;在發(fā)酵的各個時期，通過補加甘油溶液控制發(fā)酵液中甘油濃度在1060g/L，同時堿和轉(zhuǎn)速聯(lián)動，控制滲透壓；當(dāng)l,3-丙二醇的生產(chǎn)速率低于lg/I^h時，發(fā)酵結(jié)束。優(yōu)選的，所述發(fā)酵各個時期的具體控制方法如下010h:通過加入2mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH，當(dāng)鹽濃度高于15.0±2.0g/L后，停止加堿，降低轉(zhuǎn)速1020%;1024h:補加800g/L的甘油溶液，當(dāng)鹽濃度高于25.0±2.0g/L，改為補加600g/L甘油溶液；2430h:通過2mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH，當(dāng)鹽濃度高于30.0±2.0g/L后，停止加堿，降低轉(zhuǎn)速10~20%。根據(jù)本發(fā)明，所述種子培養(yǎng)包括二級種子培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明，所述方法還包括種子培養(yǎng)過程中控制種子液的滲透壓，即控制種子液中的鹽濃度，優(yōu)選的，在一、二級種子培養(yǎng)過程中鹽的濃度控制在10.020.0g/L。相比現(xiàn)有的轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1,3-PD的方法，本發(fā)明的方法的主要優(yōu)點包括產(chǎn)物濃度高，生產(chǎn)強度大，轉(zhuǎn)化率高，過程控制簡單；并且，利用本發(fā)明的方法發(fā)酵產(chǎn)生的發(fā)酵液由于鹽濃度處于較低的水平，因此后期分離、純化的難度也大大降低。圖1顯示了菌濃與(9Z)^之間關(guān)系。圖2顯示了滲透壓對菌體生長的影響。圖3顯示了實施例3的發(fā)酵過程中鹽濃度和菌體比生長速率、產(chǎn)物比生成速率的關(guān)系。圖4顯示了實施例4的發(fā)酵過程中鹽濃度和菌體比生長速率、產(chǎn)物比生成速率的關(guān)系。圖5顯示了實施例5的發(fā)酵過程中鹽濃度和菌體比生長速率、產(chǎn)物比生成速率的關(guān)系。圖6顯示了實施例6的發(fā)酵過程中鹽濃度和菌體比生長速率、產(chǎn)物比生成速率的關(guān)系。具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步詳細說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明，而非用于限定本發(fā)明的范圍。以下實施例中菌株克雷伯氏肺炎桿菌(尺；7"ew附o"/"e)As1.1639購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。斜面培養(yǎng)基的配方如下K2HP043H207g/L，(NH4)2S041g/L，KH2P042g/L,MgCl27H200.1g/L,酵母膏7g/L，微量元素各0.3mL,調(diào)整pH7.0，瓊脂2g/L。種子培養(yǎng)基的配方如下-K2HP043H207g/L，(NH4)2S041g/L，KH2P042g/L，MgCl27H200.1g/L，酵母膏7g/L，微量元素各0.3mL，調(diào)整pH7.0后加入NaCl調(diào)節(jié)鹽濃度、控制滲透壓。發(fā)酵罐培養(yǎng)基的配方如下KC10.75g/L，NaH2P041.38g/L，(NH4)2S045.35g/L,Na2S040.28g/L，MgS046H200.26g/L，擰檬酸0.42g/L，酵母粉2g/L，微量元素各0.3mL，調(diào)整pH7.0。微量元素的配方如下ZnCl234.2g/L，F(xiàn)eCl36H202.7g/L，MnCl24H2010g/L，CuCl22H200.85g/L，CoCl22H2023.8g/L，H3B030.31g/L，Na2Mo040.25g/L。測定發(fā)酵液中菌體干重的方法如下取l.OmL發(fā)酵液稀釋710倍，以去離子水為對照，在721分光光度計上于620nm讀取OZ)。取不同菌濃(即不同620nm吸光值)的菌液lOmL，經(jīng)離心收集菌體，并用去離子水洗滌二遍洗滌，將再次離心收集后的菌體于8(TC烘箱中干燥至恒重。稱量菌體作出菌體干重與6>Z)62()的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并回歸出關(guān)系式。以后菌體的干重根據(jù)測定的菌液的0￡>62()值由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸關(guān)系式計算得出。測定發(fā)酵液中1，3-丙二醇濃度的方法如下用氣相色譜儀作為檢測手段檢測，色譜型號為GC112A，色譜柱采用毛細管柱ATSE-54柱(30mx0.53mmxl.0一，色譜工作站為杭州普惠科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)的Sepu3000。采用FID氫火焰檢測器，氮氣作為載氣。柱溫12(TC，進樣器和檢測器25(TC。1,3-丙二醇的生成速率定義為每小時每升發(fā)酵液生成的1，3-丙二醇克數(shù)，單位為g/Lh。菌體比生長速率定義為單位質(zhì)量菌體，每小時生成的菌體質(zhì)量，單位為h—1。產(chǎn)物比生成速率定義為單位質(zhì)量菌體，每小時生成的產(chǎn)物質(zhì)量，單位為g/g，h。實施例1、種子培養(yǎng)挑取克雷伯氏肺炎桿菌(尺/7"e"wom'^)As1.1639的單菌落，接種于斜面培養(yǎng)基上，斜面培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度37'C，培養(yǎng)12h。一級種子培養(yǎng)條件采用厭氧培養(yǎng)，1000mL三角瓶，裝液量200mL，培養(yǎng)溫度37'C,加入NaCl控制培養(yǎng)液中的鹽濃度在10.020.0g/L，搖床轉(zhuǎn)速200rpm,培養(yǎng)12h。二級種子培養(yǎng)條件采用厭氧培養(yǎng)，500L發(fā)酵罐(鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司)，裝液量300L，接種量5%，培養(yǎng)溫度37。C，加入NaCl控制培養(yǎng)液中的鹽濃度在10.020.0g/L，轉(zhuǎn)速40rpm，培養(yǎng)12h。實施例2、滲透壓對菌體生長的影響通過對發(fā)酵液中人為添加NaCl，增加發(fā)酵液中鹽濃度、滲透壓的方法，我們研究了滲透壓對菌體濃度的影響。按照實施例1的方法獲得種子液，接入5r^的發(fā)酵罐中(發(fā)酵液裝液量3m3),分別在發(fā)酵液中加入不同濃度的NaCl(0、2、4、6g/L)，按常規(guī)方法進行發(fā)酵，每隔2小時取樣，測定菌體干重，以菌體干重對發(fā)酵時間作圖，結(jié)果如圖2所示。由圖2的結(jié)果可見，滲透壓對菌體生長的影響非常明顯，滲透壓越高，對菌體生長的抑制作用越明顯。以最高菌濃為例，2g/L、4g/L、6g/L分別只有對照組的94n/。、86%、60%。實施例3、轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1，3-PD根據(jù)實施例2的結(jié)果，通過控制發(fā)酵液的滲透壓來調(diào)控菌體的生長以及產(chǎn)物1,3-PD的生成。按照實施例1的方法獲得種子液，接入5r^的發(fā)酵罐中(發(fā)酵液裝液量3m3)，按照如下所示的工藝條件控制發(fā)酵過程。初始甘油濃度60g/L，發(fā)酵溫度35'C;通氣量1.0wm;攪拌轉(zhuǎn)速20rpm;在發(fā)酵過程中通過加入NaOH溶液控制pH值為5.58.5。在發(fā)酵的各個時期通過補入不同濃度甘油溶液控制甘油濃度在1060g/L，與此同時堿和轉(zhuǎn)速聯(lián)動，控制滲透壓。具體的，發(fā)酵過程中的工藝條件如下010h:通過加入2mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH,當(dāng)鹽濃度高于15.0±2.0g/L后，停止加堿，降低轉(zhuǎn)速1020%;1024h:補加800g/L的甘油溶液，當(dāng)鹽濃度高于25.0土2.0g/L，改為補加600g/L甘油溶液；2430h:通過2mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH，當(dāng)鹽濃度高于30.0±2.0g/L后，停止加堿，降低轉(zhuǎn)速1020%。發(fā)酵過程中每隔2小時取樣，測定發(fā)酵液中的菌體濃度以及l(fā),3-丙二醇的濃度，并根據(jù)發(fā)酵液中加入鹽的量計算鹽濃度，將數(shù)據(jù)處理后以鹽濃度、菌體比生長速率、產(chǎn)物比生成速率對發(fā)酵時間作圖，結(jié)果如圖3所示。實施例4、轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1，3-PD根據(jù)實施例2的結(jié)果，通過控制發(fā)酵液的滲透壓來調(diào)控菌體的生長以及產(chǎn)物1，3-PD的生成。按照實施例1的方法獲得種子液，接入5mS的發(fā)酵罐中(發(fā)酵液裝液量3m3)，按照如下所示的工藝條件控制發(fā)酵過程。初始甘油濃度40g/L，發(fā)酵溫度37'C;通氣量0.5vvm;攪拌轉(zhuǎn)速30rpm;在發(fā)酵過程中通過加入NaOH溶液控制pH值為5.58.5。在發(fā)酵的各個時期通過補入不同濃度甘油溶液控制甘油濃度在1060g/L，與此同時堿和轉(zhuǎn)速聯(lián)動，控制滲透壓。具體的，發(fā)酵過程中的工藝條件如下010h:通過加入2mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH，當(dāng)鹽濃度高于15.0±2.0g/L后，停止加堿，降低轉(zhuǎn)速1020%;1024h:補加800g/L的甘油溶液，當(dāng)鹽濃度高于25.0士2.0g/L，改為補加600g/L甘油溶液；2430h:通過2mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH，當(dāng)鹽濃度高于30.0±2.0g/L后，停止加堿，降低轉(zhuǎn)速1020%。發(fā)酵過程中每隔2小時取樣，測定發(fā)酵液中的菌體濃度以及l(fā),3-丙二醇的濃度，并根據(jù)發(fā)酵液中加入鹽的量計算鹽濃度，將數(shù)據(jù)處理后以鹽濃度、菌體比生長速率、產(chǎn)物比生成速率對發(fā)酵時間作圖，結(jié)果如圖4所示。實施例5、轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1,3-PD根據(jù)實施例2的結(jié)果，通過控制發(fā)酵液的滲透壓來調(diào)控菌體的生長以及產(chǎn)物1,3-PD的生成。按照實施例1的方法獲得種子液，接入5n^的發(fā)酵罐中(發(fā)酵液裝液量3m3)，按照如下所示的工藝條件控制發(fā)酵過程。初始甘油濃度50g/L，發(fā)酵溫度38'C;通氣量2.0wm;攪拌轉(zhuǎn)速40rpm;在發(fā)酵過程中通過加入NaOH溶液控制pH值為5.58.5。在發(fā)酵的各個時期通過補入不同濃度甘油溶液控制甘油濃度在1060g/L，與此同時堿和轉(zhuǎn)速聯(lián)動，控制滲透壓。具體的，發(fā)酵過程中的工藝條件如下-010h:通過加入2mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH，當(dāng)鹽濃度高于15.0±2.0g/L后，停止加堿，降低轉(zhuǎn)速1020%;1024h:補加800g/L的甘油溶液，當(dāng)鹽濃度高于25.0土2.0g/L，改為補加600g/L甘油溶液；2430h:通過2mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH，當(dāng)鹽濃度高于30.0±2.0g/L后，停止加堿，降低轉(zhuǎn)速1020%。發(fā)酵過程中每隔2小時取樣，測定發(fā)酵液中的菌體濃度以及l(fā),3-丙二醇的濃度，并根據(jù)發(fā)酵液中加入鹽的量計算鹽濃度，將數(shù)據(jù)處理后以鹽濃度、菌體比生長速率、產(chǎn)物比生成速率對發(fā)酵時間作圖，結(jié)果如圖5所示。實施例6、轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1,3-PD根據(jù)實施例2的結(jié)果，通過控制發(fā)酵液的滲透壓來調(diào)控菌體的生長以及產(chǎn)物1,3-PD的生成。按照實施例1的方法獲得種子液，接入5t^的發(fā)酵罐中(發(fā)酵液裝液量3m3)，按照如下所示的工藝條件控制發(fā)酵過程。初始甘油濃度30g/L，發(fā)酵溫度4(TC;通氣量1.0vvm;攪拌轉(zhuǎn)速50rpm;在發(fā)酵過程中通過加入NaOH溶液控制pH值為5.58.5。在發(fā)酵的各個時期通過補入不同濃度甘油溶液控制甘油濃度在1060g/L，與此同時堿和轉(zhuǎn)速聯(lián)動，控制滲透壓。具體的，發(fā)酵過程中的工藝條件如下010h:通過加入2mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH，當(dāng)鹽濃度高于15.0士2.0g/L后，停止加堿，降低轉(zhuǎn)速1020%;1024h:補加800g/L的甘油溶液，當(dāng)鹽濃度高于25.0土2.0g/L,改為補加600g/L甘油溶液；2430h:通過2mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH，當(dāng)鹽濃度高于30.0±2.0g/L后，停止加堿，降低轉(zhuǎn)速1020%。發(fā)酵過程中每隔2小時取樣，測定發(fā)酵液中的菌體濃度以及l(fā),3-丙二醇的濃度，并根據(jù)發(fā)酵液中加入鹽的量計算鹽濃度，將數(shù)據(jù)處理后以鹽濃度、菌體比生長速率、產(chǎn)物比生成速率對發(fā)酵時間作圖，結(jié)果如圖6所示。將實施例3—6的結(jié)果歸納整理，其中包括產(chǎn)物1，3-丙二醇的濃度、轉(zhuǎn)化率以及生產(chǎn)強度，結(jié)果如表l所示。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>現(xiàn)有的轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，如劉德華等"一種發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PD的高產(chǎn)工藝"(申請?zhí)朇N200710063347.0)，其產(chǎn)物1，3-PD的濃度大致可以達到6080g/L，轉(zhuǎn)化率0.450.5mol/mol，生產(chǎn)強度0.861.14g/Lh。由表l的結(jié)果可見，與現(xiàn)有的方法相比，本發(fā)明的通過調(diào)節(jié)發(fā)酵液中滲透壓來促進菌體生長以及產(chǎn)物l,3-PD的生成的方法，不僅能夠使過程控制簡單，而且產(chǎn)物濃度高，生產(chǎn)強度大，轉(zhuǎn)化率高。權(quán)利要求1、一種轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，包括種子培養(yǎng)以及發(fā)酵罐發(fā)酵轉(zhuǎn)化甘油生成1，3-丙二醇，其特征在于，該方法在發(fā)酵過程中通過控制發(fā)酵液的滲透壓來促進菌體生長以及產(chǎn)物1，3-丙二醇的生成。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述控制發(fā)酵液的滲透壓是控制發(fā)酵液中的鹽濃度。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述控制滲透壓的發(fā)酵過程的具體條件如下初始甘油濃度3060g/L，發(fā)酵溫度3540'C;通氣量0.52.0vvm;攪拌轉(zhuǎn)速2050rpm;在發(fā)酵過程中，通過加入NaOH溶液控制發(fā)酵液的pH值范圍在5.58.5;在發(fā)酵的各個時期，通過補加甘油溶液控制發(fā)酵液中甘油濃度在1060g/L，同時堿和轉(zhuǎn)速聯(lián)動，控制滲透壓；當(dāng)l,3-丙二醇的生產(chǎn)速率低于lg/L'h時，發(fā)酵結(jié)束。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵各個時期的具體控制方法如下010h:通過加入2mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH，當(dāng)鹽濃度高于15.0±2.0g/L后，停止加堿，降低轉(zhuǎn)速1020%;1024h:補加800g/L的甘油溶液，當(dāng)鹽濃度高于25.0±2.0g/L,改為補加600g/L甘油溶液；2430h:通過2mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH，當(dāng)鹽濃度高于30.0±2.0g/L后，停止加堿，降低轉(zhuǎn)速1020%。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)包括二級種子培養(yǎng)。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)采用厭氧培養(yǎng)。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括種子培養(yǎng)過程中控制種子液的滲透壓來調(diào)節(jié)菌體的生長。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述控制種子液的滲透壓是控制種子液中的鹽濃度。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，,其特征在于，所述種子液的鹽濃度控制在10.020.0g/L。全文摘要本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，包括種子培養(yǎng)以及發(fā)酵罐發(fā)酵轉(zhuǎn)化甘油生成1，3-丙二醇，該方法在發(fā)酵過程中通過控制發(fā)酵液的滲透壓來促進菌體生長以及產(chǎn)物1，3-丙二醇的生成。采用本發(fā)明的方法生成1，3-丙二醇，不僅產(chǎn)物濃度高，生產(chǎn)強度大，轉(zhuǎn)化率高，過程控制簡單；并且發(fā)酵產(chǎn)生的發(fā)酵液由于鹽濃度處于較低的水平，因此可以大大降低后期分離、純化的難度。文檔編號C12P7/02GK101182552SQ20071004812公開日2008年5月21日申請日期2007年11月13日優(yōu)先權(quán)日2007年11月13日發(fā)明者剛劉,劉必成,劉朋波,孫海燕,女宓,衡宮,徐佳杰,陶春平申請人:華東理工大學(xué)