專利名稱：一種快速篩選牛奶類液體樣中抗菌藥物殘留的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及抗菌藥物殘留檢測分析技術領域，具體地說屬于一種利用細 菌的生長受到被檢樣品中殘留的抗菌藥物抑制而快速篩選牛奶類液體樣品中 抗菌藥物殘留的方法。
背景技術：
抗菌藥物殘留一直是困擾食品安全的嚴重問題，奶牛養(yǎng)殖場廣泛應用抗 菌藥物治療各種感染性疾病因而容易造成牛奶中的藥物殘留。現(xiàn)在用于檢測 牛奶中抗菌藥物的方法主要有高效液相色譜法、液相-質譜聯(lián)用分析法、氣相 -質譜聯(lián)用分析法、薄層色譜法等色譜方法。這些色譜方法存在的主要缺陷是: 需要專業(yè)儀器設備；樣品預處理程序繁瑣；操作過程復雜；耗時冗長；需要 專業(yè)培訓的技術人員進行操作；干擾因素多；分析儀器昂貴；在基層難以普 及， 一般只適用于實驗室檢測；檢測費用高。免疫學檢測法也用于抗菌藥物 在牛奶中的殘留檢測，但一種試劑盒一般只能檢測一種抗菌藥物、易受干擾 而出假陽性，耗材成本高。
微生物法檢測抗菌藥物殘留是根據(jù)抗菌藥物對微生物的生理機能、代謝 的抑制作用，來定性或定量確定樣品中藥物殘留，具有快速、敏感、廉價等 優(yōu)點。目前，牛奶等液體樣的抗菌藥物殘留微生物檢測法主要有氯化三苯基 四氮唑法，并已列入國家標準。但該方法的具體操作過程中，加入檢測牛奶 中的嗜熱鏈球菌的數(shù)量會對檢測結果影響很大，會產生假陰性或假陽性結 果，同時其檢測時間也較長，好事費力。因此，開發(fā)廉價、敏感度高、能快 速檢測牛奶等液體樣品，且非專業(yè)人員可操作，結果可信的微生物法殘留檢
測篩選方法成為急需解決的問題。 發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術在推廣使用過程中存在的上述缺陷，提 供一種不需要特定大型分析儀器設備，具有靈敏度高、可信度高、使用方法 簡單的篩選方法，使其能有效降低牛奶等液體樣品中抗菌藥物殘留的檢測成 本，減輕需檢測單位的負擔，適于基層推廣。本發(fā)明的目的通過以下技術方案實現(xiàn)一種快速篩選牛奶類液體樣中抗菌藥物殘留的方法，特點是它包括制 備檢測用液體培養(yǎng)基、制備含有細菌芽孢和酸堿指示劑的瓊脂培養(yǎng)基檢測管 及篩選，其具體步驟如下(1) 、制備檢測用液體培養(yǎng)基取0.6% 1.5%蛋白胨、0. 4% 1.0%胰蛋白胨、0. 15% 0. 4%牛肉浸膏、 0. 4% 0. 8%葡萄糖、0% 1.0%酵母浸高、1.0% 2. 0%氯化鈉、1.0% 2. 0%牛 奶粉，加去離子水補足總體積為100%，混勻后每lOOOmL前述溶液再添加含 0. 5。/。氯化鈣、0.25%氯化鈉、0. 25%氯化鉀的無機鹽溶液20 40mL， 6 p g/mL 的甲氧芐氨嘧啶溶液30 60mL，混勻后調pH為6.8 7.6，在115'C滅菌30 分鐘，冷卻后在0 4"C保存?zhèn)溆谩?2) 、制備含有細菌芽孢和酸堿指示劑的瓊脂培養(yǎng)基檢測管 a、制作芽孢率達85%以上的芽孢菌液芽孢桿菌在含有1%胰蛋白胨、0.5%酵母浸膏、0.2% K2HP04， pH 7.2的液 體培養(yǎng)基中55。C培養(yǎng)18 20h，然后轉種于含O. 2 0. 3%牛肉浸膏、0. 4 0. 5% 蛋白胨、0. 3 0. 4%酵母浸膏、50 200mg/L的MnCl2. 4H20、 2%瓊脂，pH7. 2的 固體培養(yǎng)基50 60'C培養(yǎng)3 7天；芽孢染色鏡檢，當芽孢率在85%以上時，用 4r無菌去離子水洗下并置于9(TC水浴鍋中加熱滅活20分鐘；5000rpm離心20 分鐘，棄去上清液，滅菌去離子水重新漂浮，重復離心洗漆兩次。最后的沉 降物用4'C無菌去離子水漂浮，細菌計數(shù)后得芽孢菌液。b、 酸堿指示劑與瓊脂混合，加入去離子水，使酸堿指示劑和瓊脂濃度分 別達到50 100ug/mL和1.5 2。/。，混勻調pH7. 0 7. 2，并115'C滅菌30分鐘。c、 滅菌完畢后使瓊脂冷卻至55 75。C時，迅速加入已計數(shù)的芽孢菌液， 使芽孢含量達1X106 cfu/mL lX108cfu/mL，立即充分混勻并分裝于豎直狀 態(tài)的無菌管中；每支管加入50 400uL瓊脂，使管內瓊脂厚度達O. 2 0. 6厘米，豎直狀態(tài)自然凝固后密封并于o 4t:冷藏備用。(3)、篩選用移液管I將50 200uL牛奶類液體樣加入到含有細菌芽孢和酸堿指 示劑的瓊脂培養(yǎng)基檢測管，再用移液管II向瓊脂培養(yǎng)基檢測管加入50 200 uL檢測用液體培養(yǎng)基，將瓊脂培養(yǎng)基檢測管豎直置于55"C 7(TC培養(yǎng) 1. 5 4小時后，根據(jù)瓊脂培養(yǎng)基檢測管內固體瓊脂培養(yǎng)基顏色變化的性質及 程度篩選出含有抗菌藥物殘留的樣品。所述芽孢菌液為嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌芽孢菌液。 所述酸堿指示劑為溴甲酚紫、溴甲酚藍或溴甲酚紅指示劑。所述無菌管是內徑為0. 3 1. 5厘米、高度為1. 0 3. 0厘米的透明圓柱 形聚苯乙烯塑料管或容積為0. 5 1. OmL透明帶蓋尖底離心管。本發(fā)明的檢測原理為在沒有抗菌藥物等抑制細菌芽孢生長的物質存在 時，芽孢在充足的營養(yǎng)，適當?shù)臏囟?、濕度等條件下能迅速生長繁殖，進而
使培養(yǎng)基變成酸性，這一現(xiàn)象可用酸堿指示劑顯色指示(呈黃色)；當牛奶等液體樣品中殘留有抗菌藥物時，芽孢的生長和繁殖受到抑制，芽孢雖然在充 足的營養(yǎng)，適當?shù)臏囟取穸鹊葪l件下卻不能迅速生長繁殖，進而培養(yǎng)基也 不會變成酸性，酸堿指示劑也不會改變顏色(呈紫色)，因而可檢測牛奶等液 體樣品中是否有抗菌藥物，并且培養(yǎng)后指示劑的顏色變化的深度與抗菌藥物 的濃度呈一定的反向相關性，紫色越深，抗菌藥物殘留濃度越高。本發(fā)明對純牛奶中青霉素殘留的靈敏度在2 3ng/mL之間，耗時在3小時以內。本發(fā)明具有以下特點1、主要試劑均以工作液形式提供，檢驗方法方 便易行；2、對輔助設備要求低，特別適合于奶站等基層使用；3、對抗菌藥 物檢測譜廣，特異性高、靈敏度高、準確度好，檢測純牛奶中青霉素殘留的 靈敏度在2 3ng/mL之間，低于國家最高殘留限量標準，符合殘留檢測要求； 4、樣品幾乎不需要前處理，肌肉、肝臟等組織可通過壓榨等方式取組織液檢 測；5、能在2 4小時內完成檢測，快速、省時；6、陽性樣品測試結果可在 55。C 7(TC保存1.5 3小時或更長，在4。C保存30天以上。將為牛奶等液 體樣品中抗菌藥物殘留的監(jiān)控提供有力保障。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡明本發(fā)明。 實施例l牛奶樣的篩選(1)、制備檢測用液體培養(yǎng)基取1.0%蛋白胨、0.7%胰蛋白胨、0.2%牛肉浸膏、0. 7%葡萄糖、1.5%氯化 鈉、1.5%牛奶粉，加去離子水補足總體積為100mL，混勻后再添加含0.5%氯 化鈣、0. 25%氯化鈉、0. 25%氯化鉀的無機鹽溶液2. 5mL， 6 u g/mL的甲氧芐氨 嘧啶溶液4mL，混勻后調pH為7.2，在115。C滅菌30分鐘，冷卻后在0 4°C 保存?zhèn)溆谩?2) 、制備含有細菌芽孢和酸堿指示劑的瓊脂培養(yǎng)基檢測管a、 制作芽孢率達85%以上的芽孢菌液將嗜熱芽孢桿菌在含有1%胰蛋白胨、0. 5%酵母浸膏、0. 2% K2HP04， pH 7. 2 的液體培養(yǎng)基中55'C培養(yǎng)18h，然后轉種于含0.3%牛肉浸膏、0.5%蛋白胨、 0. 4%酵母浸膏、200mg/L的MnCl2. 4H20、 2%瓊脂，pH7. 2的固體培養(yǎng)基55。C培 養(yǎng)5天。芽孢染色鏡檢，當芽孢率在85%以上時，用4。C無菌去離子水洗下并 置于90'C水浴鍋中加熱滅活20分鐘。5000rpm離心20分鐘，棄去上清液， 滅菌去離子水重新漂浮，重復離心洗滌兩次。最后的沉降物用4'C無菌去離 子水漂浮，細菌計數(shù)后得到嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢菌液。b、 將溴甲酚紫與瓊脂混合，加入去離子水100mL，使溴甲酚紫和瓊脂濃 度分別達到80 u g/mL和1. 5%，混勻調pH7. 0，并115。C滅菌30分鐘。c、 滅菌完畢后使瓊脂冷卻至65'C時加入己計數(shù)的芽孢液，使芽孢含量 達lX107cfu/mL左右，立即充分混勻并分裝于豎直的內徑為0.8厘米、高為 1.5厘米的透明圓柱形聚苯乙烯塑料管。每支管加入150uL瓊脂，使管內瓊 脂厚度達0.3厘米，自然凝固，密封并于0 4'C冷藏備用。(3) 、牛奶樣品的篩選篩選前所有試劑應保存在(TC 4nC，使用時應讓其自然回溫到室溫，使 用完畢后應及時保存在0'C 4'C。同時，篩選用的恒溫裝置應提前設定并到達64土rc。第1步將水浴鍋或其它恒溫裝置如沙浴鍋設定為64士rC; 第2步取一支檢測管，將牛奶樣品搖勻，用移液管I吸取牛奶至指定 刻度(100iiL)加入檢測管中； 第3步將檢測用液體培養(yǎng)基搖勻，用移液管II吸取檢測用液體培養(yǎng)基 至指定刻度(50liL)，加入檢測管中；第4步另取兩支檢測管，分別按第2、 3步重復加樣(一般一個牛奶 樣品使用三支檢測管)；第5步立即將檢測管豎直放入64士rc水浴鍋(注意不能讓檢測管傾覆)培養(yǎng)并開始計時；第6步培養(yǎng)2.5小時后立即取出檢測管，并與比色卡片對照。若三支 檢測管內培養(yǎng)基顏色全部變?yōu)辄S色可判定為陰性；若三支檢測管內培養(yǎng)基顏 色全部變?yōu)槿孔仙卸殛栃?；若其中兩支檢測管內培養(yǎng)基顏色全部變?yōu)?黃色可判定為陰性；若其中兩支檢測管內培養(yǎng)基顏色全部變?yōu)樽仙膳卸?陽性。第7步紀錄結果并妥善處理檢測管在篩選中也可將去離子水代替牛奶作為陰性對照，將含有4ng/mL的青 霉素溶液作為陽性對照。 實施例2其它樣品的篩選肉、肝臟、腎臟等組織可經過稱量后壓榨取汁并加適量磷酸鹽緩沖液調 pH至7.0;飼料，血清、蜂蜜、尿等樣品如果必要的話，對不同的動物樣品， 加入不同的緩沖液，以控制pH。其它操作步驟同實施例l。
權利要求
1、一種快速篩選牛奶類液體樣中抗菌藥物殘留的方法，其特征在于它包括制備檢測用液體培養(yǎng)基、制備含有細菌芽孢和酸堿指示劑的瓊脂培養(yǎng)基檢測管及篩選，其具體步驟如下(1)、制備檢測用液體培養(yǎng)基取0.6％～1.5％蛋白胨、0.4％～1.0％胰蛋白胨、0.15％～0.4％牛肉浸膏、0.4％～0.8％葡萄糖、0％～1.0％酵母浸膏、1.0％～2.0％氯化鈉、1.0％～2.0％牛奶粉，加入去離子水，補足總體積為100％；混勻后每1000mL前述溶液再添加含0.5％氯化鈣、0.25％氯化鈉、0.25％氯化鉀的無機鹽溶液20～40mL，6μg/mL的甲氧芐氨嘧啶溶液30～60mL；再次混勻后調pH為6.8～7.6，在115℃滅菌30分鐘，冷卻后在0～4℃保存?zhèn)溆茫?2)、制備含有細菌芽孢和酸堿指示劑的瓊脂培養(yǎng)基檢測管a、制作芽孢率達85％以上的芽孢菌液；b、將酸堿指示劑與瓊脂混合，加入去離子水，使酸堿指示劑和瓊脂濃度分別達到50～100μg/mL和1.5～2％，混勻調pH7.0～7.2，并115℃滅菌30分鐘；c、滅菌完畢后，在b步驟仍處在融化狀態(tài)時使其冷卻至55～75℃，并迅速加入步驟a的芽孢菌液，充分混勻后立即分裝于處于豎直狀態(tài)的無菌管中，每支管加入50～400μL瓊脂，使管內瓊脂厚度達0.2～0.6厘米，豎直狀態(tài)自然凝固后密封并于0～4℃冷藏備用；(3)、篩選用移液管I將50～200μL牛奶類液體樣加入到含有細菌芽孢和酸堿指示劑的瓊脂培養(yǎng)基檢測管，再用移液管II向瓊脂培養(yǎng)基檢測管加入50～200μL檢測用液體培養(yǎng)基，將瓊脂培養(yǎng)基檢測管豎直置于55℃～70℃培養(yǎng)1.5～4小時后，根據(jù)瓊脂培養(yǎng)基檢測管內固體瓊脂培養(yǎng)基顏色變化的性質及程度篩選出含有抗菌藥物殘留的樣品。
2、 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述芽孢菌液為嗜熱脂肪芽 孢桿菌或枯草芽孢桿菌芽孢菌液。
3、 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述酸堿指示劑為溴甲酚紫、 溴甲酚藍或溴甲酚紅指示劑。
4、 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述無菌管是內徑為0.3 1. 5厘米、高度為1. 0 3. O厘米的透明圓柱形聚苯乙烯塑料管或容積為0. 5 l.OmL透明帶蓋尖底離心管。
5、 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述芽孢菌液濃度為1 X 106 cfu/mL lX108cfu/mL。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速篩選牛奶類液體樣中抗菌藥物殘留的方法，它包括制備檢測用芽孢菌液，制備含有工作菌和指示劑的瓊脂培養(yǎng)基檢測管，制備檢測用液體培養(yǎng)基；利用抗菌藥物能抑制對它敏感的細菌生長或繁殖的原理，用定量移液管吸取被檢液體樣滴加入瓊脂培養(yǎng)基檢測管中并加入檢測用液體培養(yǎng)基，在一定溫度條件下處于豎直狀態(tài)培養(yǎng)一定時間，根據(jù)檢測管內固體瓊脂培養(yǎng)基顏色的變化的性質和程度判斷樣品中是否含有抗菌藥物殘留。與現(xiàn)有技術比較，本發(fā)明具有檢測方法快捷簡便、干擾小、檢測譜廣、靈敏度高、準確度高、穩(wěn)定性好等特點，適用于牛奶類液體樣農產品中抗菌藥物殘留的高通量快速篩選檢測。
文檔編號C12Q1/18GK101131362SQ20071004660
公開日2008年2月27日 申請日期2007年9月29日 優(yōu)先權日2007年9月29日
發(fā)明者張麗芳, 張可煜, 王霄旸, 薛飛群, 裘敏琪, 費陳忠, 鄭文麗 申請人:中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所