專利名稱：：硝酸鹽轉(zhuǎn)運組分的制作方法硝酸鹽轉(zhuǎn)運組分發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域。更特別地，本發(fā)明涉及編碼植物和種子中的高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白的核酸片段。
背景技術(shù)：
：高等植物是自養(yǎng)生物，它們能夠從獲自當(dāng)?shù)丨h(huán)境的無機(jī)養(yǎng)料合成它們所有的分子成分。氮是植物細(xì)胞中存在的許多化合物的關(guān)鍵元素。其存在于分別構(gòu)成核酸和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元的磷酸核苷和氨基酸中。對作物來說，氮的可利用性是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要限制因素，在高等植物細(xì)胞中只有氧、碳和氬比氮更為豐富，這一事實證明了氮的重要性。以銨或硝酸鹽形式存在的氮很容易被高等植物吸收和同化。硝酸鹽是高等植物在正常田間條件下可利用的氮的主要來源。因此，硝酸鹽同化途徑是無機(jī)氮進(jìn)入有機(jī)化合物的主要位置(Hewitt等人(1976)PlantBiochemistry,pp633-6812，Bonner和Varner,eds.AcademicPress,NY)。盡管一些植物直接利用銨，但是在某些條件下，硝酸鹽通常是植物可利用的氮的主要形式。由根細(xì)胞攝取氮是高等植物中硝酸鹽同化途徑的第一步(Orsel等人(2002)PlantPhysiology129:886-896)。植物已經(jīng)發(fā)展了兩種不同的攝取系統(tǒng)來應(yīng)付耕作土壤中各不相同的可利用的氮。當(dāng)外部氮濃度很高時，優(yōu)先使用低親和力的硝酸鹽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，而在很低的外部濃度時就產(chǎn)生高親和力轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(HATS)。在高等植物中，已經(jīng)鑒定了兩個基因家族分別是參與低親和力轉(zhuǎn)運系統(tǒng)和HAT的NRTl和NRT2家族。硝酸鹽/亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運的復(fù)雜性被精細(xì)的調(diào)節(jié)所增強，這種調(diào)節(jié)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平低親和力和高親和力系統(tǒng)都具有明顯不同的組成型的和誘導(dǎo)型的組分。此外，硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白的一些成員需要第二種基因產(chǎn)物，即NAR2型多肽來行使功能(Tong等人(2005)ThePlantJournal41:442-450)。本申請的核普酸序列以及使用它們的方法能夠增加利用氮的效率。發(fā)明概述本發(fā)明包括編碼高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運所需多肽的分離的多核苷酸，%、85%、90%、95%、99%或100%的同一性，(b)核苷酸序列的互補序列，其中互補序列與核苷酸序列含有同樣數(shù)量的核苷酸并且是100%互補的。多肽優(yōu)選含有SEQIDNO:36或49的l基酸序列。核苷酸序列優(yōu)選含有SEQIDNO:35或48的核苷酸序列。在第一實施方案中，本發(fā)明包括分離的多核苷酸，其含有(a)編碼高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運所需多肽的核苷酸序列，其中多肽的氨基酸序列基于ClustalV方法與多肽SEQIDNO:36或49相比具有至少80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性。(b)核苷酸序列的互補序列，其中互補序列與核苷酸序列含有同樣數(shù)量的核苷酸并且是100%互補的。在第二實施方案中，本發(fā)明涉及這種分離的核苷酸序列或其互補序列，其含有至少兩個基本上對應(yīng)于SEQIDNO:50、51或52所示氨基酸序列之任意一種的基序，其中所述基序基本上是保守的亞序列。除了可被鑒別的其它例子，這種基序的例子示于SEQIDNO:50、51或52。也途。在第三實施方案中，本發(fā)明涉及這種分離的核苷酸片段的互補序轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)方面是有用的。在第四實施方案中，本發(fā)明涉及含有啟動子的分離的核酸片段，其中所述啟動子基本上由SEQIDNO:37、38、46、47、56、65、67、68、69、70、71、72、73、74、89或90所示的核香酸序列所構(gòu)成，或者所述啟動子基本上由基本上相似于并在功能上等價于SEQIDNO:37、38、46、47、56、65、67、68、69、70、71、72、73、74、89或90所示核芬酸序列的片段或亞片段所構(gòu)成。在第五實施方案中，本發(fā)明涉及重組DNA構(gòu)建體，其含有可操作地連接到至少一種調(diào)節(jié)序列的任一前述核酸片段或其互補序列或者二者之一的一部分。也感興趣的是在基因組中含有了這種重組DNA構(gòu)建體的植物、獲自這種植物的植物組織或細(xì)胞以及獲自這些植物的種子。在第六方面，本發(fā)明涉及改變植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運的方法，包括(a)用重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，該構(gòu)建體含有0第一重組DNA構(gòu)建體，其含有可操作地連接到至少一種調(diào)節(jié)序列上的編碼HAT多肽的分離的多核苷酸；以及ii)至少一種另外的重組DNA構(gòu)建體，其含有可操作地連接到至少一種調(diào)節(jié)序列上的編碼NAR多肽的分離的多核苷酸，(b)在適于表達(dá)重組DNA構(gòu)建體的條件下培養(yǎng)(a)的轉(zhuǎn)化植物；選擇具有改變了的硝酸鹽轉(zhuǎn)運的那些轉(zhuǎn)化植物。含有這些重組構(gòu)建體的谷類植物也是本發(fā)明的一部分。在第七實施方案中，本發(fā)明涉及分離核酸片段的方法，該核酸片段編碼與改變硝酸鹽轉(zhuǎn)運相關(guān)的多肽，包括(a)將SEQIDNO:36、49、55或58與其它改變植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運相關(guān)的多肽序列進(jìn)行比較；(b)鑒別步驟(a)中獲得的4種或更多種氨基酸的保守序列；(c)根據(jù)步驟(b)中鑒別的保守序列制備區(qū)域特異性核苷酸探針或寡聚體；以及(d)使用步驟(c)的核苷酸探針或寡聚體通過序列依賴的方案來分離與改變硝酸鹽轉(zhuǎn)運相關(guān)的序列。在第八實施方案中，本發(fā)明也涉及繪制與改變植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運相關(guān)的遺傳變異圖譜的方法(a)將兩種植物品種雜交；以及(b)評估步驟(a)的雜交所產(chǎn)生的子代植林中的遺傳變異，該評估是針對如下序列進(jìn)行的(i)選自SEQIDNO:35、48、54和57的核酸序列；或者(ii)編碼選自SEQIDNO:36、49、55和58的多肽的核酸序列；其中使用選自RFLP分析、SNP分析和基于PCR的分析的方法進(jìn)行評估。在第九實施方案中，本發(fā)明涉及用于獲得改變了的植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運的分子育種方法，包括(a)將兩種植物品種雜交；以及(b)評估步驟(a)的雜交所產(chǎn)生的子代植株中的遺傳變異，該評估是針對如下序列進(jìn)行的(i)選自SEQIDNO:35、48、54和57的核酸序列；或者(ii)編碼選自SEQIDNO:36、49、55和58的多肽的核酸序列；其中使用選自RFLP分析、SNP分析和基于PCR的分析的方法進(jìn)行評估。在第十實施方案中，本發(fā)明涉及改變高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白多肽在宿主細(xì)胞中的表達(dá)水平的方法，包括(a)用重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，該構(gòu)建體含有(b)編碼高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白多肽的核苷酸序列、其互補序列或者至少兩個基本上對應(yīng)于SEQIDNO:50、51或52所示氨基酸序列之任意一種的基序，其中該多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對方法與多肽SEQIDNO:36或49相比具有至少80%序列同一性，并且該多肽改變硝酸鹽轉(zhuǎn)運，其中所述基序是可操作地連接到至少一種調(diào)節(jié)序列的基本上保守的序列；和(c)在適于重組DNA構(gòu)建體表達(dá)的條件下培養(yǎng)被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其中重組DNA構(gòu)建體的表達(dá)導(dǎo)致產(chǎn)生了被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中硝酸鹽轉(zhuǎn)運所需多肽的水平改變。在第十一實施方案中，本發(fā)明涉及谷類植物，包括含有可操作地連接到至少一種調(diào)節(jié)序列上的分離的HAT多肽的第一DNA構(gòu)建體；以及至少一種含有可操作地連接到至少一種調(diào)節(jié)序列上的編碼NAR2多肽的分離的多核普酸的另外的重組DNA構(gòu)建體。本發(fā)明另外的實施方案涉及改變植物氮轉(zhuǎn)運的方法，包括(a)用重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，該構(gòu)建體含有i)第一重組DNA構(gòu)建體，其含有可操作地連接到至少一種調(diào)節(jié)序列上的編碼HAT多肽的分離的多核苷酸；ii)至少一種另外的重組DNA構(gòu)建體，其含有可操作地連接到至少一種調(diào)節(jié)序列上的編碼NAR多肽的分離的多核苷酸，(b)在適于表達(dá)重組DNA構(gòu)建體的條件下培養(yǎng)(a)的轉(zhuǎn)化植物；以及(c)選擇具有改變了的硝酸鹽轉(zhuǎn)運的那些轉(zhuǎn)化植物。本發(fā)明更多的實施方案包括具有改善的動力學(xué)參數(shù)的改組HAT變體，含有編碼這些變體的核苷酸序列的重組DNA構(gòu)建體以及在基因組中含有這些重組DNA構(gòu)建體的植物和轉(zhuǎn)化細(xì)胞。本發(fā)明也包括含有第一重組DNA構(gòu)建體和至少一種另外的重組DNA構(gòu)建體的谷類植物，第一重組DNA構(gòu)建體含有可操作地連接到至少一種調(diào)節(jié)序列的編碼改組HAT變體的核苷酸序列，另外的重組DNA構(gòu)建體含有可操作地連接到至少一種調(diào)節(jié)序列的編碼NAR多肽的分離的多核苷酸。本發(fā)明的另一實施方案提供了改變植物氮轉(zhuǎn)運的方法，包括a)用重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，該構(gòu)建體含有第一重組DNA構(gòu)建體和至少一種另外的重組DNA構(gòu)建體，第一重組DNA構(gòu)建體含有可操作地連接到至少一種調(diào)節(jié)序列的編碼改組HAT變體的核苷酸序列，另外的重組DNA構(gòu)建體含有可操作地連接到至少一種調(diào)節(jié)序列的編碼NAR多肽的分離的多核苷酸；以及b)在適于表達(dá)重組DNA構(gòu)建體的條件下培養(yǎng)(a)的轉(zhuǎn)化植物；選擇具有改變了的硝酸鹽轉(zhuǎn)運的那些轉(zhuǎn)化植物。生物學(xué)保藏下述質(zhì)粒已經(jīng)被保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，10801UniversityBoulevard,Manassas,VA20110-2209,并具有下述命名、保藏號和保藏日期。質(zhì)粒保藏號保藏日期PHP27621ATCC序列表簡述根據(jù)下述詳細(xì)的說明書以及附圖和序列表可更充分地理解發(fā)明，它們構(gòu)成本申請的一部分。圖1是栽體PHP27621的示意圖。圖2是栽體PHP27660的示意圖。圖3是載體PHP27860的示意圖。圖4是栽體PHP27280的示意圖。圖5是栽體PHP27281的示意圖。圖6是栽體PHP27282的示意圖。圖7是栽體PHP27283的示意圖。SEQIDNO:l是用于實施例3的正向引物。SEQIDNO:2是用于實施例3的反向引物。SEQIDNO:3是用于實施例3中進(jìn)行確證性BAC末端測序的T7引物。SEQIDNO:4是用于實施例3中進(jìn)行確證性BAC末端測序的SP6引物。SEQIDNO:5-33是用于覆蓋含有HAT4基因的BAC克隆bacc.pkl39.d24上的區(qū)域的測序引物。SEQIDNO:34表示玉米基因組的3924bp,其含有從BAC克隆bacc.pkl39.d24分離到的編碼高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白(HAT4)的基因的ORF(核普酸2015-3583(終止密碼))。SEQIDNO:35是SEQIDNO:34的ORF核苷酸序列的1569bp。SEQIDNO:36是由SEQIDNO:34的核苦酸2015-3580所編碼的氨基酸序列。蛋白基因組序列的推定啟動子的核苷酸1-2014延伸的2014bp:、SEQIDNO:38是從SEQIDNO:34所示的玉米高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因組序列的推定啟動子的核苷酸1001-2014延伸的1014bp。SEQIDNO:39-42是實施例4中使用的正向和反向引物。SEQIDNO:43是實施例4中使用的T3引物。SEQIDNO:44是實施例4中使用的T7引物。SEQIDNO:45表示5812bp的玉米基因組，其含有編碼高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白(HAT4)的基因的ORF(核苷酸2264-3450和5087-5357(終止密碼))。SEQIDNO:46是從SEQIDNO:45所示的玉米高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因組序列的推定啟動子的核苷酸1-2263延伸的2263bp。SEQIDNO:47是從SEQIDNO:45所示的玉米高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因組序列的推定啟動子的核苷酸1001-2263延伸的1263bp。SEQIDNO:48是從SEQIDNO:45的核苷酸2264-3450和5087-5354延伸的編碼序列的1455bp。SEQIDNO:49是由SEQIDNO:48所編碼的氨基酸序列。SEQIDNO:50是在鑒別屬于高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的基因方面有用的保守序列基序。SEQIDNO:51是在鑒別屬于高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的基因方面有用的保守序列基序。SEQIDNO:52是在鑒別屬于高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的基因方面有用的保守序列基序。SEQIDNO:53是含有編碼谷類NAR2型多肽(NAR2.l)的ORF(核苷酸757-1368(終止密碼))的序列的1561bp。SEQIDNO:54是從SEQIDNO:53的核苷酸758-1369(終止密碼)延伸的編碼序列的612bp。SEQIDNO:55是由SEQIDNO:54的核苦酸758-1366所編碼的氨基酸序列。l-756bp延伸的756bp。SEQIDNO:57是編碼NAR2型多肽(NAR2.2)的ORF(核苷酸1-594(終止密碼))的594bp。SEQIDNO:58是由SEQIDNO:57的ORF的核苷酸1-591所編碼的氨基酸序列。SEQIDNO:59是實施例6中使用的NAR2.1特異性外側(cè)引物。SEQIDNO:60是實施例6中使用的NAR2.1特異性內(nèi)側(cè)引物。SEQIDNO:61-64是用于測序NAR2.1啟動子上游區(qū)域的測序引物。SEQIDNO:65顯示了推定的NAR2.1啟動子的額外2917bp。SEQIDNO:66顯示了4498bp的完整NAR2.1基因，包括從核苷酸3655-3841延伸的內(nèi)含子。SEQIDNO:67是從SEQIDNO:66所示的NAR2.1基因組序列的推定啟動子的核苷酸1-3506延伸的3506bp。SEQIDNO:68是從SEQIDNO:66所示的NAR2.1基因組序列的推定啟動子的核苷酸1001-2014延伸的1014bp。SEQIDNO:69是從SEQIDNO:66所示的NAR2.1基因組序列的推定啟動子的核苷酸2015-3506延伸的1492bp。SEQIDNO:70是實施例14中分離到的3621bp的基因組片段。SEQIDNO:71是從SEQIDNO:70的核苷酸1-3236延伸的來自B73的推定Nar啟動子的3236bp。SEQIDNO:72是從SEQIDNO:70的核普酸1-1000延伸的來自B73的推定Nar啟動子的1000bp。SEQIDNO:73是從SEQIDNO:70的核苷酸1001-3236延伸的來自B73的推定Nar啟動子的2236bp。SEQIDNO:74是從SEQIDNO:70的核香酸2000-3236延伸的來自B73的推定Nar啟動子的1237bp。SEQIDNO:75直到78是實施例14中描述的正向和反向引物。SEQIDNO:79-84是用于測序如實施例14所述的來自B73的Nar啟動子的測序引物。SEQIDNO:85是實施例14中描述的栽體pENTR-5的序列。SEQIDNO:86是實施例16中描述的栽體PHP27621的序列。SEQIDNO:87是實施例17中描述的栽體PHP27660的序列。SEQIDNO:88是實施例17中描述的載體PHP27860的序列。SEQIDNO:89是來自B73的推定Nar啟動子的3324bp，含有SEQIDNO:70的核苷酸1-1523和1821-3324。SEQIDNO:90是從SEQIDNO:70的核苷酸2825-3325延伸的來自B73的推定Nar啟動子的500bp。SEQIDNO:91表示玉米序列的2025bp,其含有編碼分離自克隆cfp4n.pk008.p6:fis的高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白(HAT5)的基因的ORF(核苦酸250-1812(終止密碼))。SEQIDNO:92是由SEQIDNO:91的ORF所編碼的氨基酸序列。SEQIDNO:93是實施例20中描述的栽體PHP27280的序列。SEQIDNO:94是實施例20中描述的載體PHP27281的序列。SEQIDNO:95是實施例20中描述的栽體PHP27282的序列。SEQIDNO:96是實施例20中描述的栽體PHP27283的序列。的三字母代碼的定義符合NucleicAcidsResearch13:3021-3030(1985)和BiochemicalJournal219(No,2):345-373(1984)中所描述的IUPAC-IUBMB標(biāo)準(zhǔn)，通過引用將其引入本文。用于核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)的符號和格式遵守37C.F.R.§1.822中提出的規(guī)則。發(fā)明詳述本文提到的每篇參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容都通過整體引用而引入本又。術(shù)語"NAR"是指硝酸鹽同化相關(guān)基因。這些類型的基因和由它們編碼的NAR多肽是植物高親和力硝酸鹽吸收系統(tǒng)的組分。術(shù)語"HAT"與高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白可交換使用。如本文所使用的，"分離的核酸片段"與"分離的多核苷酸"可交換使用，它們是單鏈或雙鏈RNA或DNA的聚合物，任選含有合成的、非天然的或者改變了的核苷酸堿基。DNA聚合物形式的分離的核酸片段可以包括一種或多種cDNA、基因組DNA或合成DNA片段。按它們?nèi)缦碌膯巫帜该麃肀硎竞怂?通常以它們的5，-單磷酸形式存在)"A"表示腺苷酸或脫氧腺苷酸(分別用于RNA或DNA),"C"表示胞苷酸或脫氧胞苷酸，"G"表示烏普酸或脫氧鳥普酸，"U"表示尿苷酸，"T"表示脫氧胸苷酸，"R"表示噤呤(A或者G),"Y"表示嘧啶(C或T),"K，，表示G或T，"H"表示A或C或T，'T，表示次黃苷，"N"表示任意核苷酸。術(shù)語"分離的"是指這樣的物質(zhì)，諸如核酸分子和/或蛋白質(zhì)，它們是基本上游離的，或者以另外的方式除去了天然存在的環(huán)境中通常伴隨或相互作用的成分。分離的多核苷酸可以從它們天然存在的宿主細(xì)胞中多核苦^。該術(shù)語也[括重組多核苷酸和化學(xué)合成的多核苷酸:曰術(shù)語"在功能上等價的亞片段"和"功能上等價的亞片段"在本文可交換使用。這些術(shù)語是指分離的核酸片段的一部分或亞序列，無論該部分或亞序列是否編碼活性酶或功能蛋白(例如該部分或亞序列可以是編碼區(qū)和/或非編碼區(qū)的一部分，不需要編碼活性酶或功能蛋白)，都保持了改變基因表達(dá)或產(chǎn)生某種表型的能力。例如，可以將片段或亞片段用于設(shè)計重組DNA構(gòu)建體以在轉(zhuǎn)化植物中產(chǎn)生期望的表型。可以通過組DNA構(gòu)建體設(shè)計用于共抑制或反義用途，無論它是否編碼活性酶或功能蛋白。術(shù)語"同源性，，、"同源的"、"基本上相似的"和"基本對應(yīng)于"在本文可交換使用。它們是指這樣的核酸片段，其中一個或多個核苷酸堿基的改變并不影響核酸片段介導(dǎo)基因表達(dá)或產(chǎn)生某種表型的能力。這些術(shù)語也指本發(fā)明核酸片段的修飾，諸如缺失或插入一個或多個不會實質(zhì)上改變所得核酸片段相對于初始未修飾片段的功能性質(zhì)的核苷酸。因此如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的那樣，可以理解的是本發(fā)明不僅僅包括特定的例證性序列。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)可的是，本發(fā)明所包括的基本上相似的核酸序列也通過它們在中等嚴(yán)格條件(例如1xSSC,0.1%SDS,60°C)交;能力來限定，它們在:能jT是與本發(fā)明的基因或啟動子等^"。可調(diào)節(jié)嚴(yán)格條件來篩選中度相似片段直到高度相似片段，中度相似片段是諸如來自相關(guān)性較遠(yuǎn)的生物體的同源序列，高度相似片段是諸如完全相同于來自相關(guān)性較近的生物體的功能性酶的基因。雜交后的漂洗決定了嚴(yán)格條件。一組優(yōu)選條件包括一系列漂洗，開始用6xSSC、0.5%SDS于室溫漂洗15分鐘，然后用2xSSC、0.5%SDS于45。C重復(fù)漂洗30分鐘，然后用0.2xSSC、0.5%SDS于50。C重復(fù)漂洗30分鐘兩次。更優(yōu)選的一組嚴(yán)格條件包括使用更高的溫度，其中漂洗條件與上述一致，除了最后兩次0.2xSSC、0.5%SDS中漂洗30分鐘的溫度增加到60°C。另一優(yōu)選的一組高嚴(yán)格條件包括最后使用0.1xSSC、0.P/。SDS于65。C漂洗兩次。對于靶(內(nèi)源)mRNA和構(gòu)建體中與靶mRNA具有同源性的RNA區(qū)域之間的顯著相似性的程度而言，這種序列應(yīng)該至少25個核苷酸的長度，優(yōu)選至少50個核苷酸的長度，更優(yōu)選至少IOO個核苷酸的長度，更優(yōu)選至少200個核苷酸的長度，最優(yōu)選至少300個核苷酸的長度；應(yīng)該具有至少80%同一性，優(yōu)選至少85%同一性，更優(yōu)選至少90%同一性，最優(yōu)選至少95%同一性?？梢酝ㄟ^對代表本發(fā)明核酸片段的亞片段或修飾的核酸片段進(jìn)行篩選來選擇基本上相似的核酸片段，其中一個或多個核苷酸被取代、缺失和/或插入，篩選的是它們影響由植物或植物細(xì)胞中未修飾核酸片段所編碼多肽的水平的能力。例如，可構(gòu)建代表源自該核酸片段的至少30個連續(xù)核苷酸、優(yōu)選至少40個連續(xù)核苷酸、最優(yōu)選至少60個連續(xù)核苷酸的基本上相似的核酸片段，并將其引入植物或植物細(xì)胞。然后可比較段所編;的多肽的水平與未暴露于i本上相似核酸片段的植物或植物細(xì);!包中的多肽水平。相似性百分比計算，包括但不限于LASARGENE生物信息學(xué)計算套件(DNASTARInc.,Madison，WI)的Megalign程序。使用ClustalV比對方法(Higgins和Sharp(1989)CABIOS.5:151-153)來進(jìn)行序列的多重比對,采用默認(rèn)參數(shù)(GAPPENALTY=10，GAPLENGTHPENALTY=10)。使用Clustal方法進(jìn)行的用于蛋白質(zhì)序列的成對比對和同一性百分比計算的默認(rèn)參數(shù)是KTUPLE-l、GAPPENALTY=3、WINDOW=5和DIAGONALSSAVED=5。用于核酸的這些參數(shù)是KTUPLE=2、GAPPENALTY=5、W婦OW-4和DIAGONALSSAVED=4。"基因"是指表達(dá)特定蛋白質(zhì)的核酸片段，包括編碼序列之前(5'非編碼區(qū))和之后(3，非編碼區(qū))的調(diào)節(jié)序列。"天然基因，，是指天然發(fā)現(xiàn)的帶有它自身的調(diào)節(jié)序列的基因。"重組DNA構(gòu)建體"是指正常情況下并不在自然界中同時存在的核酸片段的組合。因此，重組DNA構(gòu)建體可含有源自不同來源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，或者含有源自同一編;馬序列。"外:!基因是指k常情:下并不存i于宿主生:體中的基因，但是通過基因轉(zhuǎn)移將它引入到了宿主生物體中。外來基因可含有插入非天然生物體中的天然基因，或者重組DNA構(gòu)建體。"轉(zhuǎn)基因"是已經(jīng)通過轉(zhuǎn)化過程被51入到基因組中的基因。"編碼序列"是指編碼特定氨基酸序列的DNA序列。"調(diào)節(jié)序列"是指位于編碼序列上游(5'非編碼區(qū))、內(nèi)部、或者下游(3'非編碼區(qū))的核苷酸序列，它們影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性、或者翻譯。調(diào)節(jié)序列可包括但不限于啟動子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子以及聚腺芬酸化識別序列。"啟動子"是指能夠控制編碼序列或功能RNA的表達(dá)的DNA序列。啟動子序列由近端和更遠(yuǎn)端的上游元件組成，后者經(jīng)常是指增強子。因此，"增強子"是能夠促進(jìn)啟動子活性的DNA序列，可以是啟動子的固有元件或者是插入的增強啟動子的組織特異性水平的異源元件。啟動子序列也可位于基因的轉(zhuǎn)錄部分內(nèi)和/或轉(zhuǎn)錄序列的下游。啟動子可全部來源于天然存在的不同啟動子，乃至含有合成DNA片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解的是，不同啟動子可指導(dǎo)不同組織或細(xì)胞類型中的、或處于不同發(fā)育階段的、或者反應(yīng)于不同環(huán)境條件的分離核酸片段的表達(dá)。在大多數(shù)細(xì)胞類型中、大多數(shù)時候都引起分離核酸片段表達(dá)的啟動子通常被稱為"組成型啟動子"。在植物細(xì)胞中有用的各種類型的新啟動子正在不斷被發(fā)現(xiàn)；可以在Okamuro和Goldberg所編輯的(1989)BiochemistryofPlants15:1-82中找到許多例子。進(jìn)一步公認(rèn)的是，由于大多數(shù)情況下并沒有完全限定調(diào)節(jié)序列的精確邊界，因此具有一些變異的DNA片段可能具有同樣的啟動子活性。如本文使用的，"基本上相似的和在功能上等價的啟動子亞片段"是指能夠控制編碼序列或功能RNA表達(dá)的啟動子序列的一部分或亞序列。在表達(dá)本發(fā)明的核酸片段中可能有用的啟動子的特定例子包括但不限于本申請中公開的啟動子(SEQIDNO:37、38、46、47、56、65、67、68、69、70、71、72、73、74、89或90)。"內(nèi)含子"是基因中不編碼蛋白質(zhì)序列部分的間插序列。這樣，這種序列被轉(zhuǎn)錄成RNA,但是隨后就被切除，并不被翻譯。該術(shù)語也用于被切除的RNA序列。"外顯子"是基因中被轉(zhuǎn)錄的并存在于源自該基因的成熟信使RNA中的序列部分，但是不一定是編碼最終基因產(chǎn)物的序列部分。術(shù)語"推定的核苷酸序列"是指根椐與編碼同一蛋白質(zhì)的其它DNA序列的同源性將間插序列去除后的DNA序列。術(shù)語"推定的氨基酸序列"是指根椐與由編碼同一蛋白質(zhì)的DNA序列所編碼的其它蛋白質(zhì)的同源性將間插序列去除后的DNA序列所來源的多肽序列。術(shù)語"翻譯前導(dǎo)序列"是指位于基因啟動子序列和編碼序列之間的DNA序列。翻譯前導(dǎo)序列存在于完全加工的mRNA中，位于翻譯起始序列上游。翻譯前導(dǎo)序列可影響初級轉(zhuǎn)錄物加工為mRNA、mRNA穩(wěn)定性或者翻譯效率。已經(jīng)描述過翻譯前導(dǎo)序列的例子(Turner,R.和Foster,G.D.(1995)MolecularBiotechnology3:225)。"3'非編碼序列"是指位于編碼序列下游的DNA序列，包括聚腺脊化識別序列以及編碼能夠影響mRNA加工或基因表達(dá)的調(diào)節(jié)信號的其它序列。聚腺苷化信號的特征通常是影響聚腺苷酸區(qū)域加入到mRNA前體的3，末端。不同3，非編碼序列的使用由Ingelbrechteta1.,(1989)PlantCell1:671-680進(jìn)行了舉例說明。"RNA轉(zhuǎn)錄物，，是指RNA聚合酶催化DNA序列轉(zhuǎn)錄而得到的產(chǎn)物。當(dāng)RNA轉(zhuǎn)錄物是DNA序列的完美互補拷貝時，稱之為初級轉(zhuǎn)錄物，或者它可能是源自初級轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄后加工的RNA序列，這被稱為成熟RNA。"信使RNA(mRNA)"是指沒有內(nèi)含子的RNA，可被細(xì)胞翻譯成蛋白質(zhì)。"cDNA"是指使用酶逆轉(zhuǎn)錄酶從mRNA模板合成的并與mRNA模板互補的DNA。cDNA可以是單鏈的，或者使用DNA聚合酶I的Klenow片段將其轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈形式。"有義"RNA是指包括mRNA并能在細(xì)胞中或體外被翻譯成蛋白質(zhì)的RNA轉(zhuǎn)錄物。"反義RNA"是指互補于耙初級轉(zhuǎn)錄物或mRNA的全部或一部分的、并且阻止分離的把核酸片段表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄物(美國專利No.5,107,065)。反義RNA可以與特定基因轉(zhuǎn)錄物的任何部分互補，即5，非編碼序列、3'非編碼序列、內(nèi)含子或者編碼序列。"功能RNA"是指反義RNA、核酶RNA或者其它不可被翻譯但是仍然對細(xì)胞過程有影響的RNA。術(shù)語"互補"和"反向互補"在本文中相對于mRNA轉(zhuǎn)錄物可交換使用，意味著定義信使RNA的反義RNA。術(shù)語"內(nèi)源RNA"是指由宿主基因組中存在的任何核酸序列所編碼的任何RNA，無論是天然存在的或者是非天然存在的，即由重組方法、誘變等引入的。術(shù)語"非天然存在的"意指人工的、與自然界中正常發(fā)現(xiàn)的所不一致的。術(shù)語"可操作地連接"是指將核酸序列締合在單個核酸片段上，以便一種序列的功能被其它序列調(diào)節(jié)。例如將啟動子與編碼序列可操作地連接，這時啟動子就能夠調(diào)節(jié)編碼序列的表達(dá)(即編碼序列由啟動子的轉(zhuǎn)錄控制)。編碼序列能夠以有義或反義方向被可操作地連接到調(diào)節(jié)序列上。在另一實例中，本發(fā)明的互補RNA區(qū)域可直接或間接地被可操作地連接到靶mRNA的5，端或者靶mRNA的3'端或者靶mRNA的內(nèi)部，或者第一互補區(qū)域是靶mRNA的5，端而它的互補序列在靶mRNA的3，端。如本文使用的術(shù)語"表達(dá)"是指功能性終產(chǎn)物的產(chǎn)生。分離核酸片段的表達(dá)涉及分離核酸片段的轉(zhuǎn)錄和mRNA翻譯成前體或成熟蛋白質(zhì)。"反義抑制"是指能夠抑制靶蛋白質(zhì)表達(dá)的反義RNA轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生。"共抑制"是指能夠抑制相同的或基本上相似的外來或內(nèi)源基因的表達(dá)的有義RNA轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生(美國專利No.5,231,020)。"成熟"蛋白質(zhì)是指經(jīng)過翻譯后加工的多肽；也就是已經(jīng)從中去除了初級翻譯產(chǎn)物中存在的任何前肽。"前體"蛋白質(zhì)是指mRNA的初級翻譯產(chǎn)物；也就是仍然存在前肽和肽原。前肽和肽原可以是但不限于胞內(nèi)定向信號。"穩(wěn)定轉(zhuǎn)化"是指將核酸片段轉(zhuǎn)移到宿主生物基因組中，包括核基因組和細(xì)胞器基因組兩者，產(chǎn)生在遺傳上穩(wěn)定的遺傳。與此相反，"瞬時轉(zhuǎn)化"是指將核酸片段轉(zhuǎn)移到宿主生物的細(xì)胞核或含有DNA的細(xì)胞器中，產(chǎn)生不整合或不穩(wěn)定遺傳的基因表達(dá)。含有轉(zhuǎn)化的核酸片段的宿主生物被稱為"轉(zhuǎn)基因"生物。水稻、玉米和其它單子葉植物的細(xì)胞轉(zhuǎn)化優(yōu)選方法是使用粒子加速或者"基因槍，，轉(zhuǎn)化技術(shù)(Kleinetal.，(1987)Nature(London)327:70-73;美國專利No.4,945,050)，或者使用含有轉(zhuǎn)基因的合適Ti質(zhì)粒進(jìn)行的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法(IshidaY.etal.，1996，NatureBiotech.14:745-750)。本文使用的術(shù)語"轉(zhuǎn)化"和"轉(zhuǎn)化的"是指穩(wěn)定轉(zhuǎn)化和瞬時轉(zhuǎn)化兩者。本文使用的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是現(xiàn)有技術(shù)中公知的，更全面i也4笛述于Sambrook,J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.MolecularCloning:ALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratoryPress:ColdSpringHarbor,1989(下文稱為"Sambrook")。術(shù)語"重組"是指例如通過化學(xué)合成或者通過遺傳工程技術(shù)操作分"PCR"或"聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)"是用于合成大量特定DNA片段的技術(shù)，包括一系列的重復(fù)循環(huán)(PerkinElmerCetusInstruments,Norwalk，CT)。典型地，將雙鏈DNA熱變性，在較低的溫度下將互補于靶片段的3，邊界的兩種引物退火，然后在中間溫度下進(jìn)行延伸。一組這樣的三個連續(xù)步驟被稱為循環(huán)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)("PCR")是用于成百萬倍擴(kuò)增DNA的強大技術(shù)，其通過在短期時間內(nèi)對4莫板重復(fù)復(fù)制。(Mullisetal，ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.51:263-273(1986);Erlichetal,的歐洲專利申請50,424;歐洲專利申請84，796;歐洲專利申請258,017,歐洲專利申請237，362;Mullis的歐洲專利申請201,184,Mullisetal的美國專利No.4，683,202;Erlich的美國專利No.4,582,788;以及Saikietal的美國專利No.4,683,194)。該過程利用了幾組特異的體外合成的寡核苷酸來啟動DNA合成。引物的設(shè)計依賴于期望被分析的DNA的序列。該技術(shù)通過許多循環(huán)(通常為20-50)來進(jìn)行，包括在較高溫度下使模板解鏈、使引物與模板中的互補序列退火、然后用DNA聚合酶復(fù)制模板。PCR反應(yīng)產(chǎn)物的分析通過在瓊脂糖凝膠中分離，然后經(jīng)溴乙啶染色并用UV透射進(jìn)行觀察?；蛘?，可將放射性dNTP加入PCR中以便將標(biāo)記摻入產(chǎn)物中。在這種情況下，通過將凝膠曝光于x-射線膠片來觀察PCR產(chǎn)物。放射性標(biāo)記的PCR產(chǎn)物的更多優(yōu)點在于可以定量每種擴(kuò)增產(chǎn)物的水平。術(shù)語"重組構(gòu)建體"、"表達(dá)構(gòu)建體"和"重組表達(dá)構(gòu)建體"在本文可交換使用。這些術(shù)語是指可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)方法插入到細(xì)胞基因組中的遺傳物質(zhì)的功能單元。這些構(gòu)建體可以就是它本身或者連同栽體一起使用。如果使用栽體，那么栽體的選擇取決于將用來轉(zhuǎn)化宿主植物的如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。例如，可以使用質(zhì)粒載體。技術(shù)人員將很清楚地知道，栽體上必須存在遺傳元件以便成功轉(zhuǎn)化、選擇和擴(kuò)增含有任何本發(fā)明的分離的核酸片段的宿主細(xì)胞。技術(shù)人員也將認(rèn)可的是，不同的獨立轉(zhuǎn)化事件將產(chǎn)生不同的表達(dá)水平和模式(Jonesetal.,(1985)EMBOJ.4:2411-2418;DeAlmeidaetal,，(1989)Mol.Gen.Genetics218:78-86),因此必須篩選多個事件以便獲得顯示出所期望的表達(dá)水平和才莫式的品種。這些篩選可通過DNA的Southern分析、mRNA表達(dá)的Northern分析、蛋白質(zhì)表達(dá)的Western分析或者表型分析來實現(xiàn)。以前已通過集中于在有義方向過量表達(dá)與內(nèi)源mRNA具有同源性的核酸序列而設(shè)計了植物中的共抑制構(gòu)建體，這導(dǎo)致了與過量表達(dá)序列具有同源性的所有RNA的減少(參見Vaucheretetal.(1998)PlantJ16:651-659;和Gura(2000)Nature404:804-808)。這種現(xiàn)象的整體效率是較低的，RNA減少的程度是普遍不同的。最近的研究工作已經(jīng)描述了"發(fā)夾"結(jié)構(gòu)的使用，它以互補方向摻入所有或部分的mRNA編碼序列中，導(dǎo)致所表達(dá)RNA可能的"莖-環(huán)"結(jié)構(gòu)(PCT出版物WO99/53050,1999年10月21日公開)。這增加了所回收的轉(zhuǎn)基因植物中共抑制的頻率。另一種變異描述了植物病毒序列的使用，它指導(dǎo)鄰近的mRNA編碼序列的抑制或者"沉默"(PCT出版物WO98/36083,1998年8月20曰公開)。這兩種共抑制現(xiàn)象還沒有從機(jī)制上被闡明，盡管最近的遺傳學(xué)證據(jù)已經(jīng)開始解決這種復(fù)雜情形(Elmayanetal.(1998)PlantCell10:1747-1757)。一方面，本發(fā)明包括含有編碼高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運所需多肽的核苷酸序列的分離多核苷酸，其中多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對方法與多肽SEQIDNO:36或49相比具有至少80%、85%、90%、95%、99%或100%序列同一性。多肽也可以含有SEQIDNO:36或49,核苷酸序列可以含有SEQIDNO:35或48。本發(fā)明也包括任何前述核苷酸序列的互補序列，其中互補序列和核普酸序列由同樣數(shù)量的核普酸組成，并且是100%互補的。另一方面，本發(fā)明包括本文所描述的分離的多核苷酸(或互補序列)，其中核苷酸序列含有選自SEQIDNO:50、51和52的至少兩種、三種、四種或五種基序，其中所述基序是基本上保守的亞序列。"基序"或"亞序列"是指含有更長序列的一部分的核酸或氨基酸保守序列的短區(qū)域。例如，預(yù)期這樣的保守亞序列(例如SEQIDNO:50、51和52)對于功能來說將是重要的，并能夠用于鑒別植物高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白同源物的新同源物。預(yù)期可以在高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白同源物中發(fā)現(xiàn)一些或所有元件。也預(yù)期任意特定基序中的保守氨基酸的至少一種或兩種可以在實際的高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白同源物中是不同的。另一方面，本發(fā)明的多核苷酸或其功能上等價的亞片段在編碼高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白所需蛋白質(zhì)的核酸序列表達(dá)的反義抑制或共抑制方面是有用的，最優(yōu)選內(nèi)源高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白或外來高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因的反義抑制或共抑制。反義抑制或共抑制的方案是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的并在上文描述。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明包括分離的核酸片段，其含有(a)基本上由SEQIDNO:37、38、46、47、56、65、67、68、69、70、71、72、73、74、89或90所構(gòu)成的啟動子，或者(b)所述啟動子的基本上相似的并在功能上等價的亞片段。也感興趣的是重組DNA構(gòu)建體，其含有可操作地連接到至少一種調(diào)節(jié)序列的任何上述鑒別的分離的核酸片段或分離的多核苷酸或其互補序列或者這些片段或互補序列的部分。在基因組中含有這些重組DNA構(gòu)建體的植物、植物組織也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。轉(zhuǎn)化方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，這在上文描述。任何植物、雙子葉植物或單子葉植物都可用這些重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化。單子葉植物的例子包括但不限于玉米、小麥、水稻、高粱、小米、大麥、棕櫚、百合、六出花屬(Alstroemeria)、黑麥和燕麥。雙子葉植物的例子包括但不限于大豆、油菜、向日葵、卡諾拉(canola)、葡萄、銀膠菊、耬斗菜、棉花、煙草、豌豆、菜豆、亞麻、紅花、苜蓿。植物組織包括分化的和未分化的組織或植抹，包括但不限于根、莖、芽、葉、花粉、種子、腫瘤組織，以及各種形式的細(xì)胞和培養(yǎng)物諸如單細(xì)胞、原生質(zhì)、胚和愈傷組織。植物組織可以在才直物或器官、組織或細(xì)胞培養(yǎng)物中。另一方面，本發(fā)明包括改變植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運的方法，包括(a)用重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，該構(gòu)建體含有i)重組DNA構(gòu)建體，其含有可操作地連接到至少一種調(diào)節(jié)序列上的編碼HAT多肽的分離的多核苷酸，以及ii)至少一種另外的重組DNA構(gòu)建體，其含有可操作地連接到至少一種調(diào)節(jié)序列上的編碼NAR多肽的分離的多核苷酸。(b)在適于表達(dá)重組DNA構(gòu)建體的條件下培養(yǎng)(a)的轉(zhuǎn)化植物，并且選擇具有改變的硝酸鹽轉(zhuǎn)運的那些轉(zhuǎn)化植物。如本文所使用的，改變植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運可以引起增加的或減少的變化。來自單個的植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體或者來自各種轉(zhuǎn)化外植體的植物的再生、發(fā)育和栽培是現(xiàn)有技術(shù)中所爿^知的(Weissbach和Weissbach于MethodsforPlantMolecularBiology,(Eds.),AcademicPress,Inc.SanDiego，CA,(1988))。這種再生和生長過程典型地包括選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞、培養(yǎng)這些個體化細(xì)胞通過胚發(fā)f的通常階段直到生根的小植抹階段的步驟。轉(zhuǎn)基因胚和種子相似地再生。然后將所得到的轉(zhuǎn)基因生根小芽種植在合適的植物生長培養(yǎng)基諸如土壤中。含有外來的、外源的編碼所感興趣蛋白質(zhì)的分離核酸片段的植物的發(fā)育或再生是現(xiàn)有技術(shù)中公知的。優(yōu)選地，使再生植物自花授粉以提供純合的轉(zhuǎn)基因植物。否則，將獲自再生植物的花粉與農(nóng)業(yè)上重要品種的種子長成的植物進(jìn)行雜交。相反地，將來自這些重要品種的花粉用于授粉再生植物。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來栽培含有期望多肽的本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。有各種方法來從植物組織再生植物。特定再生方法將取決于起始植物組織和待再生的特定植物種。主要通過使用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化雙子葉植物并獲得轉(zhuǎn)基因植物的方法已經(jīng)公開了用于棉花(美國專利No.5,004,863，美國專利No.5,159,135，美國專利No.5，518，908);大豆(美國專利No.5,569,834,美國專利No.5，416，011，McCabeet.al.,BiolTechnology6:923(1988)，Christouetal.,PlantPhysiol.87:671-674(1988));蕓苔(美國專利No.5,463,174);花生(Chengetal.,PlantCellRep.15:653-657(1996),McKentlyetal.,PlantCellRep.14:699-703(1995));木瓜；以及豌豆(Grantetal.,PlantCellRep.15:254-258,(1995))。也已經(jīng)報道了使用電穿孔，特別是粒子轟擊，和農(nóng)桿菌來轉(zhuǎn)化單子葉植物。已經(jīng)在,夢(Bytebieretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)84:5354，(1987));大麥(Wan和Lemaux，PlantPhysiol104:37(1994));玉米(Rhodesetal.,Science240:204(1988)，Gordon-Kammetal.,PlantCell2:603-618(1990),Frommetal.,BiolTechnology8:833(1990),Kozieletal.,BiolTechnology11:194,(1993),Armstrongetal"CropScience35:550-557(1995));燕麥(Somersetal.,BiolTechnology10:1589(1992));野茅(Hornetal.,PlantCellRep.7:469(1988));水稻(Toriyamaetal.,TheorAppl.Genet.205:34,(1986);Partetal.，PlantMol.Biol.32:1135-1148，(1996);Abediniaetal.,Aust.J.PlantPhysiol.24:133-141(1997);Zhang和Wu,Theor.Appl.Genet.76:835(1988);Zhangetal.PlantCellRep.7:379,(1988);Battraw和Hall，PlantSci.86:191-202(1992);Christouetal.，Bio/Technology9:957(1991));黑麥(DelaPenaetal.,Nature325:274(1987));甘蔗(Bower和Birch,PlantJ.2:409(1992));牛尾覃(Wangetal.,BiolTechnology10:691(1992));以及小麥(Vasiletal.，Bio/Technology10:667(1992);美國專利No.5,631，152)中實現(xiàn)了轉(zhuǎn)化和植物再生。通過聚乙二醇處理、電穿孔或者粒子轟擊將核酸分子引入植物細(xì)胞中，已經(jīng)開發(fā)了根據(jù)瞬時表達(dá)克隆的核酸構(gòu)建體對基因表達(dá)進(jìn)行分析的方法((Marcotteetal.,Nature335:454-457(1988);Marcotteetal.,PlantCell1:523-532(1989);McCartyetal.,Cell66:895-905(1991);Hattorietal,,GenesDev.6:609-618(1992);Goffetal.，EMBOJ.9:2517-2522(1990)。瞬時表達(dá)系統(tǒng)可用于功能性解析分離的核酸片段構(gòu)建體(一般地參見Maligaetal.,MethodsinPlantMolecularBiology,ColdSpringHarborPress(1995))?？梢悦靼椎氖?，本發(fā)明的任何核酸分子都能夠與其它遺傳元件諸如載體、啟動子、增強子等一起以永久的或瞬時的方式引入植物細(xì)胞中。除了上述討論過的方法，專業(yè)人員熟悉那些描述了用于大分子(例如DNA分子、質(zhì)粒等)構(gòu)建、操作和分離，重組生物的產(chǎn)生，克隆的篩選和分離的特定條件和方法的標(biāo)準(zhǔn)資源材料，(參見例如Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress(1989);Maligaetal.,MethodsinPlantMolecularBiology,ColdSpringHarborPress(1995);Birrenetal.，GenomeAnalysis:DetectingGenes,1,ColdSpringHarbor,NewYork(1998);Birrenetal.，GenomeAnalysis:AnalyzingDNA，2，ColdSpringHarbor，NewYork(1998);PlantMolecularBiology:ALaboratoryManual,eds.Clark,Springer,NewYork(1997)。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明包括分離核酸片段的方法，該核酸片段編碼與改變植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運相關(guān)的多肽，包括(a)將SEQIDNO:36或49與其它改變植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運相關(guān)的多肽序列進(jìn)行比較；(b)鑒別步驟(a)中獲得的4種或更多種氨基酸的保守序列；(c)根據(jù)步驟(b)中鑒別的保守序列制備區(qū)域特異性核苷酸探針或寡聚體；以及(d)使用步驟(c)的核苷酸探針或寡聚體通過序列依賴的方案來分離與改變植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運相關(guān)的序列。在鑒別與改變植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運相關(guān)的其它植物序列方面有用的保:的核苷酸中找到:、、'一另一方面，本發(fā)明也包括繪制與改變植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運相關(guān)的遺傳變異圖譜的方法(a)將兩種植物品種雜交；以及(b)評估步驟(a)的雜交所產(chǎn)生的子代植株中的遺傳變異，該評估是針對如下序列進(jìn)行的(i)選自SEQIDNO:35或48的核酸序列；或者(ii)編碼選自SEQIDNO:36和49的多肽的核酸序列;其中使用選自RFLP分析、SNP分析和基于PCR的分析的方法進(jìn)行評估。另一方面，本發(fā)明包括用于獲得改變了的植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運的分子育種方法，包括(a)將兩種植物品種雜交；以及(b)評估步驟(a)的雜交所產(chǎn)生的子代植株中的遺傳變異，該評估是針對如下序列進(jìn)行的(i)選自SEQIDNO:35和48的核酸序列；或者(ii)編碼選自SEQIDNO:36和49的多肽的核酸序列其中使用選自RFLP分析、SNP分析和基于PCR的分析的方法進(jìn)行評估。術(shù)語"繪制遺傳變異圖譜"或"繪制遺傳變異性圖譜"可交換使用，定義了鑒別不同植物品系、栽培種、品種、科或者種之間分化了的遺傳區(qū)域中的DNA序列改變的過程，不管是來自天然的或誘導(dǎo)的原因。即使非常小的堿基改變而在特定基因座(基因)處產(chǎn)生的遺傳變異也能夠改變所能夠產(chǎn)生的限制酶消化片段的模式。基因型的病原性改變可能是由于所分析基因中的缺失或插入或者甚至是單個核苷酸的取代，這可能產(chǎn)生或消除限制酶識別位點。RFLP(限制性片段長度多態(tài)性)分析就利用了這一點并利用了使用相應(yīng)于感興趣的分離核酸片段的探針進(jìn)行的Southern印跡。因此，如果多態(tài)性(也就是基因或DNA片段中通常發(fā)生的變異；也可以是同一物種中幾種基因形式(等位基因)的存在)產(chǎn)生或破壞了限制性內(nèi)切酶切割位點，或者如果它導(dǎo)致了DNA的丟失或插入(例如可變核苷酸串聯(lián)重復(fù)(VNTR)多態(tài)性)，它將改變由那種限制性內(nèi)切酶消化所產(chǎn)生的DNA片段的大小或者圖謙。因此，具有變異序列的個體能方式進(jìn)4亍鑒別的多態(tài)性被稱為RFLP。RFLP已經(jīng)廣泛用于人和植物的遺傳分析(Glassberg，英國專利申請2135774;Skolnicketal,Cytogen.CellGenet.32:58-67(982);Botsteinetal,Ann.丄Hum.Genet.32:314-331(1980);Fischeretal(PCT申請WO90/13668;Uhlen,PCT申請WO90/11369)。"單核苷酸多態(tài)性'，或"SNP"的主要特征在于多態(tài)性的位點是在單個核苷酸上。SNP具有某些報道過的優(yōu)于RFLP或VNTR的優(yōu)點。首先，SNP比其它類型的多態(tài)性更穩(wěn)定。它們的自發(fā)突變率是大約lO—9(Kornberg，DNAReplication,W.H.Freeman&Co.,SanFrancisco,1980),比VNTR的突變頻率低大約1000倍(美國專利5,679,524)。第二，SNP以比RFLP和VNTR更高的頻率發(fā)生并具有更好的一致性。由于SNP由序列變異引起，對隨機(jī)基因組或cDNA分子測序就能夠鑒別新的多態(tài)性。SNP也可由缺失、點突變和插入引起。無論何種原因，任何的單堿基改變都可以是SNP。SNP更高的發(fā)生頻率意味著它們能夠比其它類型的多態(tài)性更容易被鑒別。SNP可以使用各種方法的任何一種進(jìn)行表征。這些方法包括位點的直接或間接測序，在該位點的各自的等位基因產(chǎn)生或破壞限制性位點時使用限制酶，使用等位基因特異性雜交探針，使用特異于由多態(tài)性的不同等位基因編碼或者由其它生化譯碼方式編碼的蛋白質(zhì)的抗體。SNP可通過許多方法進(jìn)行測序。兩種基本方法可以用于DNA測序，Sangeretal,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)74:5463-5467(1977)的鏈終止方法以及Maxam和Gilbert,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)74:560-564(1977)的化學(xué)降解方法。此外，單個點突變可以通過修改的PCR技術(shù)進(jìn)行檢測，諸如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)("LCR")以及PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性("PCR-SSCP")分析。PCR技術(shù)也可用于鑒別相當(dāng)少量的材料樣品中的基因表達(dá)水平，例如來自身體的組織或細(xì)胞。該技術(shù)被稱為反轉(zhuǎn)錄-PCR("RT-PCR")。術(shù)語"分子育種，，定義了育種過程期間追蹤分子標(biāo)記的過程。通常將分子標(biāo)記與所期望的表型性狀相聯(lián)系。在分離分子標(biāo)記或遺傳性狀之后，不評價表型，而是可通過培養(yǎng)更少的植物并排除表型變異的分析或肉眼觀察來加速育種過程。在這種過程中有用的分子標(biāo)記包括但不限于前面提到的在鑒別可繪制圖語的遺傳變異方面有用的任何標(biāo)記，以及任何顯示跨植物種的同線性的緊密連鎖基因。術(shù)語"同線性"是指不同生物之間染色體上的基因位置/順序的保守性。這表示在不同物種之間的同一染色體上發(fā)現(xiàn)的兩種或更多種遺傳基因座，它們可以是緊密連鎖的或者可以不是。同線性的另一術(shù)語是"基因組共線性"。本發(fā)明的核酸片段可用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，其中存在比正常情況下更高或更低水平的已公開多肽，或者在通常未發(fā)現(xiàn)所述多肽的細(xì)胞類型或發(fā)育階段中存在了所述多肽。這將具有改變氮轉(zhuǎn)運水平并在那些細(xì)胞中進(jìn)行累積的效應(yīng)。植物中缺乏氮將導(dǎo)致矮化生長，并常常導(dǎo)致纖細(xì)的和經(jīng)常是木質(zhì)的莖。在許多植物中，氮缺乏的第一信號就是缺綠癥(葉子變黃)。本發(fā)明蛋白質(zhì)的超量表達(dá)的實現(xiàn)可通過首先制備重組DNA構(gòu)建體，其中編碼區(qū)可操作地連接到能夠指導(dǎo)基因在期望的組織中、在期望的發(fā)育階段進(jìn)行表達(dá)的啟動子上。為方便起見，重組DNA構(gòu)建體可含有源自同一基因的啟動子序列和翻譯前導(dǎo)序列。也可提供編碼轉(zhuǎn)錄終止信號的3，-非編碼序列。該重組DNA構(gòu)建體也可含有一個或多個內(nèi)含子以輔助基因表達(dá)。然后可制備含有該重組DNA構(gòu)建體的質(zhì)粒栽體。質(zhì)粒栽體的選擇取決于將用于轉(zhuǎn)化宿主植物的方法。技術(shù)人員很清楚地知道，為了成功轉(zhuǎn)化、選擇和增殖含有重組DNA構(gòu)建體的宿主細(xì)胞，質(zhì)粒載體上必須存在的遺傳元件。技術(shù)人員也將認(rèn)可的是，不同的獨立轉(zhuǎn)化事件將產(chǎn)生不同的表達(dá)水平和模式(Jones等人(1985)EMBOJ.4:2411-2418;DeAlmeida等人(1989)Mol.Gen.Genetics218:78-86),因此必須篩選多個事件以便獲得顯示出期望表達(dá)水平和模式的品系。這種篩選可通過DNA的Southern分析、mRNA的Northern分析、蛋白質(zhì)表達(dá)的Western分析或表型分析來實現(xiàn)。對于一些應(yīng)用來說，將本發(fā)明的多肽導(dǎo)入不同細(xì)胞區(qū)室或者促進(jìn)它從細(xì)胞中分泌出來可能是有用的。因此可以預(yù)見，上述重組DNA構(gòu)建體可通過改變編碼序列而補充，使其編碼本發(fā)明的多肽以及合適的胞內(nèi)靶向序列，諸如增加的轉(zhuǎn)運序列(Keegstra(1989)Cell56:247-253)、信號序列或編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的序列(Chrispeels(1991)Ann.Rev.PlantPhys.PlantMol.Biol.42:21-53)、或者核定位信號(Raikhel(1992)PlantPhys.l00:1627-1632),和/或去除目前已經(jīng)存在的靶向序列。盡管引用的參考文獻(xiàn)給出了每一種這些序列的例子，但是這個列表不是窮舉的，更多有用的靶向信號可能在將來被發(fā)現(xiàn)。也可以期望的是，為了一些應(yīng)用而在植物中減少或消除編碼本發(fā)明的多肽的基因的表達(dá)。為實現(xiàn)這一點，可通過將編碼那種多肽的基因或基因片段連接到植物啟動子序列上來構(gòu)建重組DNA構(gòu)建體，其設(shè)計來共抑制本發(fā)明的多肽?；蛘?，可通過將基因或基因片段反向連接到啟動子序列上來構(gòu)建重組DNA構(gòu)建體，其設(shè)計來表達(dá)全部或一部分本發(fā)明的核酸片段的反義RNA。可通過轉(zhuǎn)化將共抑制或反義重組DNA構(gòu)建體引入植物中，其中相應(yīng)內(nèi)源基因的表達(dá)就被減少或消除。勝過傳統(tǒng)植物育種方^的明顯優(yōu)勢。可通過反義抑制或共抑制而特異性抑制一種或多種基因的表達(dá)，從而產(chǎn)生植物表型的變化(美國專利No.5,190,931，5,107,065和5,283,323)。反義或共抑制構(gòu)建體將作為基因活性的顯性失活調(diào)節(jié)基因。而常規(guī)突變能夠產(chǎn)生基因活性的負(fù)調(diào)節(jié)，這些效應(yīng)很可能是隱性的。從育種前景來看，用轉(zhuǎn)基因方法提供的顯性失活調(diào)節(jié)可能是有優(yōu)勢的。此外，通過使用組織特異性啟動子將特定表型的表達(dá)限制在植物繁殖組織中的能力可以賦予相對于常規(guī)突變的農(nóng)業(yè)上的優(yōu)勢，常規(guī)突變可能在通常表達(dá)突變基因的所有組織中都具有影響。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道，要特別考慮到與反義或共抑制技術(shù)的使用相關(guān)的事項，以便減少特定基因的表達(dá)。例如，有義或反義基因表達(dá)的適當(dāng)水平可能需要使用不同的重組DNA構(gòu)建體，它們利用技術(shù)人員已知的不同調(diào)節(jié)元件。一旦通過上述方法之一獲得了轉(zhuǎn)基因植物，就必須要篩選那些最有效地顯示出期望表型的個體轉(zhuǎn)基因。因此，技術(shù)人員將開發(fā)篩選大量轉(zhuǎn)化體的方法。這些篩選的性質(zhì)將通常根據(jù)實際原因來選擇，并不是本發(fā)明的固有部分。例如，我們可以使用特異于被抑制基因所編碼的蛋白質(zhì)的抗體通過尋找基因表達(dá)的變化來進(jìn)行篩選，或者我們可以建立特異性測定酶活性的分析方法。優(yōu)選方法將是能夠迅速處理大量樣品的方法，因為大量轉(zhuǎn)化體沒有預(yù)期表型將是期望的。本發(fā)明的多肽(或其部分)可以在異源宿主細(xì)胞中生產(chǎn)，特別是在微生物宿主細(xì)胞中，可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法將其用于制備這些蛋白質(zhì)的抗體?？贵w對于在細(xì)胞中原位檢測或者在細(xì)胞提取物中體外檢測本發(fā)明的多肽來說是有用的。用于生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的優(yōu)選異源宿主細(xì)胞是微生物宿主。含有指導(dǎo)外來蛋白高水平表達(dá)的調(diào)節(jié)序列的微生物表達(dá)系統(tǒng)和表達(dá)栽體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。任意之一都可用于構(gòu)建生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的重組DNA構(gòu)建體。然后將該重組DNA構(gòu)建體經(jīng)轉(zhuǎn)化而引入到適當(dāng)?shù)奈⑸镏幸蕴峁┧幋a的銨轉(zhuǎn)運蛋白的高水平表達(dá)。提供了在細(xì)菌宿主中高水平表達(dá)本發(fā)明的多肽的栽體的例子(實施例7)。另外，本發(fā)明的多肽可用作靶以促進(jìn)設(shè)計和/或識別可以用作除草劑的那些酶的抑制劑。這是理想的，因為本文描述的多肽催化氮攝取的各個步驟。因此，本文描述的一種或多種酶活性的抑制可能導(dǎo)致植物生長的抑制。這樣，本發(fā)明的多肽對于新除草劑的發(fā)現(xiàn)和設(shè)計來說可能是合適的。遺傳圖譜和物理圖譜，這^^針是基J的一部分，或者用作這些:因所連鎖的性狀的標(biāo)記。為開發(fā)帶有期望表型的品系，這些信息在植物育種中可能是有用的。例如，本發(fā)明的核酸片段可用作限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)記。限制性消化的植物基因組DNA的Southern印跡(Maniatis)可以用本發(fā)明的核酸片段探查。然后使用計算機(jī)程序諸如MapMaker(Lander等人(1987)Genomics1:174-181)將所得到的帶圖樣進(jìn)行遺傳分析以便構(gòu)建遺傳圖譜。此外，本發(fā)明的核酸片段也可用于探查含有限制性內(nèi)切酶處理的基因組DNA的Southern印跡，這些基因組DNA是代表所定義的遺傳雜交的親本和子代的一系列個體的基因組DNA。記錄DNA多態(tài)性的分離并用于計算本發(fā)明核酸序列在此前使用該群體獲得的遺傳圖譜中的位置(Botstein等人(1980)Am.J.Hum.Genet.32:314-331)。源自植物基因的探針的生產(chǎn)和使用在遺傳圖鐠中的用途描述于BernatzkyandTanksley(1986)PlantMol.Biol.Reporter4(1):37-41。許多出版物描述了使用上面概述的方法或其修改方法獲得的特定cDNA克隆的遺傳圖鐠。例如，F(xiàn)2互交群體、回交群體、隨機(jī)配對群體、近等基因系以及其它系列的個體可用于繪制圖鐠。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。源自本發(fā)明核酸序列的核酸探針也可用于繪制物理圖譜(也就是序列在物；里圖i脊上的4立置；參見Hoheisel等人In:NonmammalianGenomicAnalysis:APracticalGuide,Academicpress1996,pp.319-346以及本文引用的參考文獻(xiàn))。在另一實施方案中，源自本發(fā)明核酸序列的核酸探針可用于繪制直接熒光原位雜交(FISH)圖譜(Trask(1991)TrendsGenet.7:149-154)。盡管目前繪制FISH圖語的方法喜歡使用較大的克隆(幾KB到幾百KB;參見Laan等人(1995)GenomeResearch5:13-20),但是靈敏度的改善可以使得能夠使用更短的探針進(jìn)行FISH圖鐠繪制?？梢允褂帽景l(fā)明的核酸序列進(jìn)行各種基于核酸擴(kuò)增的遺傳圖鐠和物理圖譜繪制方法。例子包括等位基因特異性擴(kuò)增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med.11:95-96)、PCR擴(kuò)增片段多態(tài)性(CAPS;Sheffield等人(1993)Genomics16:325-332)、等位基因特異性連接(Landegren等人(1988)Science241:1077-1080)、核苷酸延伸反應(yīng)(Sokolov(1990)NucleicAcidRes.18:3671)、放射性雜交圖語繪制(Walter等人(1997)NatureGenetics7:22-28)以及HappyMapping圖語繪制(DearandCook(1989)NucleicAcidRes.17:6795-6807)。對于這些方法來說，核酸片段序列是用來設(shè)計和產(chǎn)生用于擴(kuò)增反應(yīng)或引物延伸反應(yīng)中的引物對。這些引物的設(shè)計是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。在采用基于PCR的遺傳圖譜繪制方法中，鑒別繪圖雜交的親本在相應(yīng)于本發(fā)明核酸序列的區(qū)域之間的DNA序列差異可能是必要的。然而，對于繪圖方法來說這通常是不必要的。可以鑒別本發(fā)明cDNA克隆功能突變表型的丟失，其通過靶基因破壞程序或者通過鑒別包含在帶有所有可能基因的突變的玉米群體中的這些基因的特定突變體(BallingerandBenzer(1989)Proc.Natl.AcadSciUSA86:9402-9406;Koes等人(1995)Proc.Natl.Acad.SciUSA92:8149-8153;Bensen等人(1995)PlantCell7:75-84)。后一種方法可以按兩種方式實現(xiàn)。第一，可將本發(fā)明核酸片段的短片段，連同由植物群體制備的DNA上的突變標(biāo)記序列《I物一起用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)程序中，所述植物群體中已經(jīng)引入了突變體轉(zhuǎn)座子或者一些其它的引起突變的DNA元件(參見Bensen，同上)。帶有這些引物的特定cDNA片段的擴(kuò)增表明了編碼本發(fā)明多肽的植物基因之中或其附近插入了突變標(biāo)記元件?；蛘?，可將本發(fā)明的核酸片段用作針對突變?nèi)后w所產(chǎn)生的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交探針，其中使用突變標(biāo)記引物連同任意基因組位點引物，諸如錨定在限制酶位點的合成銜接子。用兩種方法之一，都可鑒別和獲得含有編碼本發(fā)明多肽的內(nèi)源基因的突變的植物。然后可將該突變植物用于確定或證實本文公開的所述多肽的天然功能?？墒褂肨USC突變?nèi)后w來證實高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白和高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運所需多肽的功能。用于玉米的性狀實用系統(tǒng)(TUSC)是采用遺傳和分子技術(shù)來促進(jìn)玉米中的基因功能研究的方法。研究基因功能就意味著基因序列是已知的，因此該方法是反過來起作用的從序列到表型。這種類型的應(yīng)用被稱為"反向遺傳學(xué)"，與"正向"方法(諸如轉(zhuǎn)座子標(biāo)記)形成對比，后者是設(shè)計來鑒別和分離負(fù)責(zé)特定性狀(表型)的基因。PioneerHi-BredInternational,Inc.有來自大約42,000種單株Fl植物的玉米基因組DNA的專門收藏(玉米的反向遺傳學(xué)(Reveresegeneticsformaize);Meeley，RandBriggs,S，1995，MaizeGenetCoop.Newslett.69:67,82)。每種這些個體的基因組都含有轉(zhuǎn)座元件家族，即增變基因(Mu)的多個拷貝。Mu家族是高度誘變的；在活性元件Mu-DR存在下，這些元件在整個基因組中轉(zhuǎn)座，插入到基因區(qū)域，經(jīng)常破壞基因功能。通過收集來自大量個體(42，000)的基因組DNA,Pioneer已經(jīng)組裝了誘變玉米基因組的文庫。Mu插入事件主要是雜合的；考慮大多數(shù)插入突變的隱性性質(zhì)，F(xiàn)l植物看起來是野生型的。將每個植物自花授精產(chǎn)生F2種子，采集種子。產(chǎn)生F2子代的過程中，插入的突變以孟德爾模式分離，因此對于研究突變等位基因?qū)Ρ硇偷挠绊懯怯杏玫?。許多實驗室已經(jīng)成功運用TUSC系統(tǒng)鑒別了各種基因的功能(玉米Anl基因的克隆和表征(CloningandcharacterizationofthemaizeAnlgene)，Bensen,RJ等人,1995,PlantCell7:75-84;C-功能活性在玉米花發(fā)育中的多樣性(DiversificationofC-functionactivityinmaizeflowerdevelopment),Mena,M等人，1996，Science274:1537-1540;禾本科中的化學(xué)性植物防舉卩才/L制的分沖斤(Analysisofachemicalplantdefensemechanismingrasses),Frey,M等人，1997，Science277:696-699;通過APETALA2樣基因總狀小穗1控制玉米小穗分生組織的命運(ThecontrolofmaizespikeletmeristemfatebytheAPETALA2-likegeneIndeterminatespikelet1),Chuck,G,Meeley,RB,和Hake,S,1998,Genes&Development12:1145-1154;葉綠體類囊體膜的形成和正常的葉綠體基因表達(dá)都需要SecY同源物(ASecYhomologueisrequiredfortheelaborationofthechloroplastthylakoidmembraneandfornormalchloroplastgeneexpression),Roy,LM和Barkan,A.,1998,J.CellBiol.141:1-11)。由多樣性產(chǎn)生方法或循環(huán)序列重組("RSR")方法(諸如DNA改組(DNAshuffling))產(chǎn)生的多核普酸序列是本發(fā)明的特征。使用本文描述的核酸進(jìn)行的突變和重組方法是本發(fā)明的特征。例如，本發(fā)明的一種方法包括用一種或多種另外的核苷酸如上和如下所述循環(huán)重組一種或多種核苷酸序列。重組步驟任選在體內(nèi)(invivo)、離體(exvivo)、用計算機(jī)(insilico)或者在體外(invitro)進(jìn)行。該多樣性產(chǎn)生或循環(huán)順序重組產(chǎn)生了至少一個重組修飾的HAT多核苷酸的文庫。由該文庫成員編碼的多肽包括在本發(fā)明中。各種多樣性產(chǎn)生程序的描述可以在下面的出版物和本文引用的參考文獻(xiàn)中找到，包括多基因改組和用于產(chǎn)生編碼多種酶結(jié)構(gòu)域的修飾核酸序列的方法Soong,N.等人(2000)"病毒的分子增殖"NatGenet25(4):436-39;Stemmer,等人(1999)"用于把向和其它臨床性質(zhì)的病毒的分子增殖"TumorTargeting4:1-4;Ness等人(l999)"枯草桿菌蛋白酶亞基因組序列的DNA改組"NatureBiotechnology17:893-896;Chang等人(1999)"使用DNA家族改組進(jìn)行的細(xì)胞因子進(jìn)化"NatureBiotechnology17:793-797;Minshull和Stemmer(1999)"通過分子增殖進(jìn)行的蛋白質(zhì)進(jìn)化"CurrentOpinioninChemicalBiology3:284-290;Christians等人(1999)"使用DNA家族改組進(jìn)行的用于AZT磷酸化的胸香激酶的定向進(jìn)化"NatureBiotechnology17:259-264;Crameri等人(1998)"來自不同物種基因家族的DNA改組加速了定向進(jìn)化"Nature391:288-291;Crameri等人(1997)"通過DNA改組進(jìn)行的砷酸鹽解毒途徑的分子進(jìn)化"NatureBiotechnology15:436-438;Zhang等人(1997)"通過DNA改組和篩選進(jìn)行的來自半乳糖苷酶的有效巖藻糖苷酶的定向進(jìn)化'，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:4504-4509;Patten等人(1997)"DNA改組在藥物和疫苗中的應(yīng)用"CurrentOpinioninBiotechnology8:724-733;Crameri等人(1996)"通過DNA改組進(jìn)行的抗體-噬菌體文庫的構(gòu)建和進(jìn)化"NatureMedicine2:100-103;Crameri等人(1996)"通過使用DNA改組的分子進(jìn)化改進(jìn)綠色熒光蛋白"NatureBiotechnology14:315-319;Gates等人(1996)"通過在lac阻遏物'頭段二聚體，上的展示從肽文庫中親和性選擇分離配體"JournalofMolecularBiology255:373-386;Stemmer(1996)"有性PCR和組裝PCR"于分子生物學(xué)百科全書，VCHPublishers,NewYork,pp.447-457;Crameri和Stemmer(1995)"組合式多重盒式誘變產(chǎn)生了突變體和野生型盒的全部排列"BioTechniques18:194-195;Stemmer等人，(1995)"來自大量寡脫氧核糖-核糖核苷酸的基因和完整質(zhì)粒的一步組裝"Gene,164:49-53;Stemmer(1995)"分子計算進(jìn)化"Science270:1510;Stemmer(1995)"尋找序列空間"Bio/Technology13:549-553;Stemmer(1994)"通過DNA改組進(jìn)行的體外蛋白質(zhì)快速進(jìn)化"Nature370:389-391;以及Stemmer(1994)"通過隨機(jī)斷裂和重組裝進(jìn)行的DNA改組用于分子進(jìn)化的體外重組"Proc.Natl.Acad.Sd.USA91:10747-10751。關(guān)于各種多樣性產(chǎn)生方法的補充細(xì)節(jié)可以在以下美國專利、PCT公開物和EPO公開物中找到美國專利No.5,605,793，授予Stemmer(1997年2月15日)，"體外重組方法，，；美國專利No.5,811,238,授予Stemmer等人(1998年9月22日)，"用于通過反復(fù)選擇和重組來產(chǎn)生具有期望特征的多核苷酸的方法，，；美國專利No.5，830，721，授予Stemmer等人(1998年11月3曰)，"通過隨機(jī)斷裂和重組裝進(jìn)行的DNA誘變"；美國專利No.5,834，252，授予Stemmer等人(1998年11月10日)，"末端互補聚合酶反應(yīng)"；美國專利No.5,837,458,授予Minshull等人(1998年11月17日)，"用于細(xì)胞^U射工程的方法和組合物"；Stemmer和Crameri的W095/22625,"通過隨機(jī)斷裂和重組裝進(jìn)行的誘變"；Stemmer和Lipschutz的WO96/33207，"末端互補聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)"；Stemmer和Crameri的WO97/20078,"用于通過反復(fù)選擇和重組來產(chǎn)生具有期望特征的多核苷酸的方法"；Minshull和Stemmer的WO97/35966,"用于細(xì)胞代謝工程的方法和組合物，，；Punnonen等人的WO99/41402,"遺傳學(xué)疫苗載體的耙向，，；Punnonen等人的WO99/41383,"抗原庫免疫"；Punnonen等人的WO99/41369,"遺傳學(xué)疫苗栽體工程，，；Punnonen等人的WO99/41368,"遺傳學(xué)疫苗免疫調(diào)節(jié)性的優(yōu)化"；Stemmer和Crameri的EP752008,"通過隨4幾斷裂和重組裝進(jìn)行的DNA誘變"；Stemmer的EP0932670,"通過循環(huán)順序重組來進(jìn)化細(xì)胞DNA攝取"；Stemmer等人的WO99/23107,"通過病毒基因組改組修飾病毒向性和宿主范圍，，；Apt等人的WO99/21979"人類乳頭瘤病毒栽體"；delCardayre等人的WO98/31837,"通過循環(huán)順序重組進(jìn)行的完整細(xì)胞和生物的進(jìn)化"；Patten和Stemmer的WO98/27230,"用于多肽工程的方法和組合物"；Stemmer等人的WO98/13487,"用于通過循環(huán)順序改組和選擇來優(yōu)化基因治療的方法"；WO00/00632，"用于產(chǎn)生高度多樣文庫的方法"；WO00/09679,"用于獲得體外重組多核苷酸序列庫和所得序列的方法"；Arnold等人的WO98/42832,"使用隨機(jī)或規(guī)定引物重組多核苷酸序列"；Arnold等人的WO99/29902，"用于產(chǎn)生多核普酸和多肽序列的方法"；Vind的WO98/41653,"用于構(gòu)建DNA文庫的體外方法"；Borchert等人的WO98/41622,"用于使用DNA改組構(gòu)建文庫的方法"；Pati和Zarling的WO98/42727，"使用同源重組進(jìn)行的序列改變"；Patten等人的WOOO/18906,"密碼子改變的基因的改組"；delCardayre等人的WO00/04190,"通過循環(huán)重組進(jìn)行的完整細(xì)胞和生物的進(jìn)化，，；Crameri等人的WO00/42561,"寡核苷酸介導(dǎo)的核酸重組"；Selifonov和Stemmer的WO00/42559，"用于進(jìn)化模擬的提供數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)的方法"；Selifonov等人的WO00/42560,"用于制備具有期望特征的字符串、多核苷酸和多肽的方法"；Welch等人的WO01/23401,"將改變密碼子的寡核苷酸合成用于合成性改組"以及Affholter的WO01/64864，"單鏈核酸;^莫板介導(dǎo)的重組和核酸片段分離，，。某些美國申請?zhí)峁┝岁P(guān)于各種多樣性產(chǎn)生方法的補充細(xì)節(jié)，包括Patten等人于1999年9月28日提出申請的"密碼子改變基因的改組"(USSN09/407,800);delCardayre等人于1998年7月15日(USSN09/166,188)和1999年7月15日(美國專利No.6,379,964)提出申請的"通過循環(huán)順序重組進(jìn)行的完整細(xì)胞和生物的進(jìn)化，，；Crameri等人于1999年9月28日提出申請的"寡核苷酸介導(dǎo)的核酸重組"(美國專利No.6，376,246);Crameri等人于2000年1月18日提出申請的"寡核苷酸介導(dǎo)的核酸重組"(WO00/42561);Welch等人于1999年9月28日提出申請的"用于合成性改組的基于密碼子的寡核苷酸合成的用途"(美國專利No.6,436,675);Selifonov等人于2000年1月18日提出申請的"用于制備具有期望特征的字符串、多核苷酸和多肽的方法"(WO00/42560);Selifonov等人于2000年7月18日提出申請的"用于制備具有期望特征的字符串、多核苷酸和多肽的方法"(USSN09/618,579);Selifonov和Stemmer于2000年1月18日提出申請的"用于進(jìn)化模擬的提供數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)的方法"(WOOO/42559);以及Affholter的"單鏈核酸模板介導(dǎo)的重組和核酸片段分離"(USSN60/186,482,2000年3月2日提出申請)。也可使用合成重組方法，其中在PCR或連接反應(yīng)中合成并重組裝相應(yīng)于感興趣的靶的寡核苷酸，其包括相應(yīng)于多于一種的親本核酸的寡核苷酸，從而產(chǎn)生新的重組核酸?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)核苷酸添加方法制備寡核苷酸或者可通過例如三核苷酸合成方法制備。有關(guān)這些方法的細(xì)節(jié)可在上文提到的參考文獻(xiàn)中找到，包括例如Crameri等人的WO00/42561,"寡核苷酸介導(dǎo)的核酸重組"；Welch等人的WO01/23401，"用于合成性改組的密碼子改變的寡核普酸合成的用途"；Selifonov等人的WO00/42560，"用于制備具有期望特征的字符串、多核苷酸和多肽的方法"；以及Selifonov和Stemmer的WO00/42559,"用于進(jìn)化模擬的提供數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)的方法"?？梢詫嵤┯嬎銠C(jī)(insilico)重組方法，其中在計算機(jī)中使用遺傳算法來重組相應(yīng)于同源(乃至非同源的)核酸的序列串。任選將所得重組序列串通過核酸合成轉(zhuǎn)化成核酸，其相應(yīng)于例如與寡核苷酸合成基因重組裝技術(shù)一致的重組序列。該方法能夠產(chǎn)生隨機(jī)的、部分隨機(jī)的或者設(shè)計的變體。關(guān)于計算機(jī)(insilico)重組的許多細(xì)節(jié)，包括遺傳算法的使用、計算機(jī)系統(tǒng)中的遺傳運算符等等、結(jié)合相應(yīng)核酸(和/或蛋白質(zhì))的產(chǎn)生、以及設(shè)計的核酸和/或蛋白質(zhì)的組合(例如根據(jù)跨接部位選擇)以及設(shè)計的、偽隨機(jī)的或隨機(jī)的重組方法，描述于Selifonov等人的WO00/42560,"用于制備具有期望特征的字符串、多核苷酸和多肽的方法"以及Selifonov和Stemmer的WO00/42559，"用于進(jìn)化沖莫擬的提供數(shù)椐結(jié)構(gòu)的方法"。關(guān)于計算機(jī)(insilico)重組方法的詳盡細(xì)節(jié)可在這些申請中找到。該方法通常適用于本發(fā)明來提供計算機(jī)中(insilico)核酸序列的重組和/或編碼各種代謝途徑(諸如，例如類胡蘿卜素生物合成途徑、ectoine生物合成途徑、多羥基鏈烷酸酯生物合成途徑、芳香聚酮生物合成途徑等等)中涉及的蛋白質(zhì)的基因融合構(gòu)建體和/或相應(yīng)核酸或蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。用于產(chǎn)生修飾多核苷酸的許多上述方法產(chǎn)生了親本序列的大量不同變體。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案中，使用修飾技術(shù)(例如一些改組形式)來產(chǎn)生變體庫，然后篩選編碼一些期望功能屬性諸如改善的HAT活性的修飾多核苷酸或修飾多核苷酸合并物?？杀缓Y選的示范性酶學(xué)活性包括但不限于催化速率(通常用動力學(xué)常數(shù)例如kw和Km來表征)、底物特異性以及對底物、產(chǎn)物或其它分子(例如抑制劑或活化劑)的活化或抑制敏感性以及當(dāng)結(jié)合位點被底物飽和時的酶反應(yīng)最大速度(Vmax)。實施例在下面的實施例中進(jìn)一步限定本發(fā)明，其中所有的部分和百分比都是以重量計，溫度是攝氏度，除非特別聲明。應(yīng)該明白這些實施例僅僅是作為例證給出的，盡管它們指示了發(fā)明的優(yōu)選實施方案。根據(jù)上述探討和這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定本發(fā)明的必要特征，在不脫離其精神和范圍時能夠作出發(fā)明的各種改變和修改以使它適應(yīng)不同用途和條件。實施例1cDNA文庫的組成；cDNA克隆的分離和測序制備了代表來自各種玉米組織的mRNA的cDNA文庫。文庫的特征描述于表1中?？赏ㄟ^許多現(xiàn)有方法的任一種來制備cDNA文庫。例如，可首先根據(jù)廠商說明書(StratageneCloningSystems,LaJolla,CA)在Uni-ZAPTMXR載體中制備cDNA文庫，以便將cDNA引入到質(zhì)粒載體中。才艮據(jù)Stratagene提供的說明書將Uni-ZAPTMXR文庫轉(zhuǎn)變?yōu)橘|(zhì)粒文庫。一旦轉(zhuǎn)變，cDNA插入物就將被包含在質(zhì)粒栽體pBluescript中。此外，使用T4DNA連接酶(NewEnglandBiolabs)、接著根據(jù)廠商說明書(G舊COBRLProducts)轉(zhuǎn)染到DH10B細(xì)胞中，可將cDNA直接引入到預(yù)先切割的BluescriptIISK(+)載體(Stratagene)中。一旦cDNA插入物在質(zhì)粒載體中，就可/人含有重組pBluescript質(zhì)粒的隨枳4兆選的細(xì)菌菌落中制備質(zhì)粒DNA，或者使用特異于所插入cDNA序列側(cè)翼的載體序列的引物經(jīng)由聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增插入的cDNA序列。在染料-引物測序反應(yīng)中對擴(kuò)增的插入DNA或質(zhì)粒DNA進(jìn)行測序以產(chǎn)生部分的cDNA序列(表達(dá)序列標(biāo)志或"EST";參見Adams等人，(1991)Science252:1651-1656)。使用PerkinElmerModel377熒光測序儀分析所得EST。表1含有NAR2樣序列的來自玉米的cDNA文庫和克隆<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>實施例2cDNA克隆的鑒別通過實施BLAST(基本局部比對檢索工具；Altschul等人(1993)J.Mol.Biol.215:403-410)來鑒別編碼與硝酸鹽轉(zhuǎn)運相關(guān)的組分的cDNA克??；示于表1中。通過實施BLAST(基本局部比對檢索工具；Altschul等人(1993)J.Mol.Biol.215:403-410)可鑒別編碼轉(zhuǎn)運蛋白或與硝酸鹽轉(zhuǎn)運相關(guān)的組分的cDNA克??；搜索與BLAST"nr"數(shù)據(jù)庫中含有的序列的相似性(包括所有非冗余GenBankCDS翻譯，源自三維結(jié)構(gòu)Brookhaven蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的序列，SWISS-PROT蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫、EMBL和DDBJ數(shù)據(jù)庫的最后的主要釋放結(jié)果)?？墒褂脟⑸锛夹g(shù)信息中心(NCBI)提供的BLASTN算法分析所獲得的cDNA序列與"nr"數(shù)據(jù)庫中所含有的所有可公開獲得DNA序列的相似性。可將DNA序列全部符合讀碼框地翻譯，使用NCBI提供的BLASTX算法(Gish和States(1993)NatureGenetics3:266-272)比較它與"nr"數(shù)據(jù)庫中所含有的所有可公開獲得蛋白質(zhì)序列的相似性。為方便起見，將僅僅通過BLAST計算概率而觀察到的cDNA序列與所搜索數(shù)據(jù)庫中所含序列的匹配的P-值(概率)在本文中報道為"pLog"值，它代表所報道P-值的負(fù)對數(shù)。因此，pLog值越大，cDNA序列與BLAST"命中結(jié)果"代表同源蛋白質(zhì)的可能性就越大。玉米高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白(HAT4和HAT5)的鑒別和測序為鑒別HAT同源物，使用公開的HAT基因(GenBank登錄號AY129953)來篩選Iowa州立大學(xué)MAGI2.31版玉米基因組集合。使用BLAST在ISUMAGI集合中鑒別到了部分克隆，即MAGI17514，它在核苷酸水平顯示了85%的同一性，似乎是以前未鑒別的HAT。將該序列用來篩選GenbankGSS數(shù)據(jù)集，鑒別到了一些另外的MAGI序列同源物；這些同源物在序列上添加了大約0.5kb。GSS數(shù)據(jù)集由通用識別編號33941728、34245424、32105143、34245411、34082540和33992813所示序列組成。該集合的翻譯產(chǎn)物覆蓋基因的大約二分之一，其位于3，末端。它完全缺少基因的5，端那一半。為分離到全長HAT4序列，使用PCR篩選來自兩種BAC文庫的BAC克隆，該BAC文庫源自玉米B73自交系。以前已經(jīng)通過部分消化基因組DNA構(gòu)建了文庫，插入pCUGI(Tomkins,J.P.,etal.2002,玉米的高覆蓋率細(xì)菌人工染色體文庫的構(gòu)建和表征,CropScience42:928-933)和pTARBAC(pTARBAC2.1文庫，Osoegawa，K.,etal,新的玉米、牛、馬和斑馬Bac文庫的構(gòu)建，植物和動物基因組會議錄,2001)的BamHI和EcoRI位點中。為促進(jìn)基于PCR的篩選，從AmpliconExpress(AmpliconExpress,161ONEEastgateBlvdPullman,WA99163)那里要求了一組36個四維超級庫。每個超級庫都是在獨立培養(yǎng)、分離和合并4608個克隆后得到的，總共超過165,000個排成陣列的BAC克隆。將超級庫進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后在瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行片段加減確定。設(shè)計PCR引物擴(kuò)增位于Tigr集合IDAZM4_32787上的HAT同源物終止密碼子下游289bp處的495-bp的片段，其與從上述MAGI和GSS數(shù)據(jù)庫組裝的序列相同。用5ng模板DNA在包括5HotstarTaq聚合酶混合物(Qiagen)和5pmol正向和反向引物(分別是SEQIDNO:l和SEQIDNO:2)的10pL反應(yīng)液中進(jìn)行PCR反應(yīng)。循環(huán)條件是初始變性步驟95°C15分鐘，接著是35個循環(huán)的95。C30秒、60°C30秒和72°C1分鐘。在由更低復(fù)雜性的組合庫所構(gòu)成的基質(zhì)平板上進(jìn)行第二輪PCR，該組合庫源自代表陽性庫的克隆。這減少了特定克隆的陽性。鑒別到兩種克隆，即bacc.pkl39.d24和bacc.pkl42.b21并經(jīng)PCR分析證實。將克隆bacc.pkl39.d24用于隨后的工作。使用修改的堿裂解方法從過夜的250ml2xYT+氯霉素(cloramphenicol)培養(yǎng)物中分離來自克隆bacc.pkl39.d24的BACDNA。通過離心收集細(xì)胞，重懸浮于20m的10mMEDTA，然后通過輕柔加入40ml的0.2NNaOH/1%SDS進(jìn)行裂解，用30ml冷的3M乙酸鉀(pH4.8)中和。通過在4。C下15000xg離心15分鐘去除細(xì)胞碎片，接著通過Miracloth過濾。用0.7體積異丙醇沉淀上清液中的DNA,重懸浮在9ml的50mMTris/50mMEDTA中，與4.5ml的7.5M乙酸鉀混合，置于-7(TC，解凍，3500xg下離心20分鐘。倒出上清液，用乙醇沉淀，重懸浮在0.7ml的50mMTris/50mMEDTA中。加入不含DNA酶的RNA酶A至終濃度150pg/ml，37。C溫育1小時，接著進(jìn)行苯酚氯仿萃取和乙醇沉淀。將最終得到的DNA重懸浮在總共400pl的不含核酸酶的無菌水中。使用CHEF-MapperIII(Bio-Rad)經(jīng)脈沖場凝膠電泳估計DNA插入片段大小、數(shù)量和質(zhì)量。為證實BAC和測序，使用T7(SEQIDNO:3)和SP6(SEQIDNO:4)引物，使用下面描述的測序條件。獲得雙鏈的、沿HAT4基因的連續(xù)序列信息的總體策略是通過從已知的由PCR鑒別引物限定的"開始"序列進(jìn)行步移，這在以前已經(jīng)描述過。使用BACbacc.pkl39.d24DNA作為模板。根據(jù)廠商說明書在ABI3730毛細(xì)管測序儀中進(jìn)行測序。測序反應(yīng)液由2pL的BigDyeV3.1終止子混合物(AppliedBiosystems)、2pL的稀釋緩沖液(600mMTrisHClpH9.0，15mMMgCl2)、20pmol引物和大約1pg模板DNA組成，反應(yīng)液終體積20iliL。循環(huán)條件是初始變性步驟95°C5分鐘，接著是99個循環(huán)的95。C30秒、58°C30秒和64"C4分鐘。一些4艮難讀取的區(qū)域必須使用特殊的循環(huán)和反應(yīng)條件進(jìn)行重新測序。通過乙醇沉淀去除過量的終止子。根據(jù)Phred/Phrap軟件(Ewing等人(1998)GenomeRes.8:186-194;Ewing等人(1998)GenomeRes.8:175-185)進(jìn)行跟蹤評估、堿基調(diào)用(basecalling)和組裝。使用Consed(Gordon等人(1998)GenomeRes.8:195-202)進(jìn)行組裝分析。在每次測序步移步驟之后，在末端設(shè)計引物，避免與其它基因和DNA重復(fù)區(qū)具有高同源性的區(qū)域。使用BLAST程序(基本局部比對檢索工具；Altschul等人(1993)J.Mol.Biol.215:403-410)對gss、TIGR4.0、非冗余序列、EST和蛋白質(zhì)數(shù)椐庫(Altschul等人1990)進(jìn)行同源性檢索。使用栽體N丁I進(jìn)行引物設(shè)計，引物由MWGBiotech商業(yè)合成。設(shè)計、測試并使用引物(SEQIDNO:5直到SEQIDNO:33)來覆蓋包括HAT基因在內(nèi)的區(qū)域。SEQIDNO:34描述了含有HAT4基因的基因組序列。SEQIDNO:35和SEQIDNO:36分別描述了玉米HAT4的編碼核芬酸和氨基酸序列。SEQIDNO:37和38顯示了HAT4基因的2014bp和1014bp的推定啟動子序列。通過對公開HAT的同源性blast檢索鑒別到了HAT-5家族。一種3，克隆cco1n.pk072.i13與MAGI—56254具有同源性，看起來代表了完整序列。TIGR組裝AZM4—2103與MAGI克隆相當(dāng)一致。使用該克隆重新對含有氮誘導(dǎo)文庫的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blast檢索，鑒別到了克隆cfp4n.pk008.p6。對該克隆測序，其含有完整的HAT5基因序列(SEQIDNO:91和92)。實施例4另外的玉米高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白(HAT7)的鑒別和測序使用公開的HAT基因(HAT1，Genbank登錄號AY129953)經(jīng)Blast檢索Genbank玉米基因組調(diào)查序列(GSS)和玉米基因組組裝(Iowa州立大學(xué)MAGI和Tigr)以設(shè)法鑒別AY129953的旁系同源物(paralog)。與HAT4基因(實施例3)—起，還有其它更遠(yuǎn)的同源物，包括相應(yīng)于AZM4—79242的MAGI—65216,AZM4—79242含有比MAGI—65216稍微更多的序列信息。這兩種克隆都不含起始曱石克氨酸。當(dāng)與AY129953相比時，AZM4—79246的另一個命中結(jié)果顯示了相似的同一性百分比。AZM4—79246編碼核苷酸2264-2266處的起始曱疏氨酸，和大約lIO個氨基酸的編碼序列。進(jìn)一步的鑒定顯示出這兩個組裝具有共同的克隆匹配，即來自Tigr曱基化篩選文庫的OGUKX93和OGUCS47。因此可以假定AZM4—79242和AZM4—79246編碼同樣的基因但是沒有序列重疊。為恢復(fù)全長序列，進(jìn)行PCR時使用兩種不同的正向引物和兩種不同的反向引物(分別是SEQIDNO:39、40和41、42),分別在5，末端和3，末端帶有T3(SEQIDNO:43)和T7延伸(SEQIDNO:44)。使用來自八種玉米自交系(B73、Co159、G丁H9、Mo17、T218、Oh43和W23)的DNA作為模板進(jìn)行HotStartPCR,退火溫度58。C。將所有32種PCR反應(yīng)產(chǎn)物在瓊脂糖1xTBE凝膠上電泳、切下并凈化，使用本領(lǐng)域才支術(shù)人員已知的方法在ABI毛細(xì)管測序儀上測序。比對序列，恢復(fù)丟失的序列信息。完整的HAT基因核苷酸序列示于SEQIDNO:45。SEQIDNO:46和47描述了HAT7基因2263bp和1263bp的推定啟動子序列，SEQIDNO:48和49分別描述了玉米HAT7的編碼核苷酸和氨基酸序列。實施例5編碼高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白的多肽的表征表2數(shù)據(jù)表示示于SEQIDNO:36和49的氨基酸序列與水稻序列(NCBI通用識別號No.34913806和50904699)的同一性百分比計算結(jié)果。表2由編碼高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白(HAT)的同源多肽的cDNA克隆的核苷酸序列所推定的氨基酸序列的同一性百分比同一性百分比SEQIDNO._34913806_50904699_3638.075.34978.239.4使用LASERGENE生物信息學(xué)計算套件(DNASTARInc.,Madison，WI)的Megalign程序進(jìn)行序列比對和同一性百分比計算。使用Clustal比對方法(Higgins和Sharp(1989)CABIOS,5:151-153)進(jìn)行序列的多重比對，其中采用默認(rèn)參數(shù)(GAPPENALTY=10、GAPLENGTHPENALTY=10)。使用Clustal方法進(jìn)行的成對比對的默認(rèn)參數(shù)是KTUPLE=1、GAPPENALTY=3、WINDOW-5和DIAGONALSSAVED=5。序列比對和BLAST得分以及概率表明含有本發(fā)明cDNA克隆的核酸片段編碼玉米高親和力氮轉(zhuǎn)運蛋白。實施例6玉米氮轉(zhuǎn)運相關(guān)基因(NAR2-1&NAR2-2)的鑒別和測序研究了來自實施例1和表2所描述的玉米根文庫cnrlc的blast命中結(jié)果，顯示了許多氮轉(zhuǎn)運相關(guān)基因。用關(guān)鍵詞諸如硝酸鹽、氮和轉(zhuǎn)運蛋白來檢索blast命中結(jié)果。其中的少數(shù)幾個與NCBI登錄號CAC36942即高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白的推定組分(NAR2基因)具有同源性。使用CAC36942序列作為查詢序列，玉米EST的TblastN檢索產(chǎn)生了許多來自不同玉米文庫的重要命中結(jié)果。通過比對全長查詢序列和blast命中結(jié)果鑒別到了最5'的克隆。來自cnrlc文庫(cnrlc.pk003.m9.f)的克隆顯示了位于CAC36942起始甲硫氨酸相同區(qū)域的甲硫氨酸。該克隆也顯示了曱疏氨酸上游的符合讀碼框的終止密碼子。將該克隆進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的全長插入片段測序(FIS)，含有NAR2.1的971bp，跨越SEQIDNO:53的核香酸591到1561。SEQIDNO:53顯示了NAR2.1基因的1561bp序列，這是由獲自克隆cnrlc.pk003.m9.f:fis的序列信息和Tigr序列AZM4—81138組裝的。SEQIDNO:54和55分別顯示NAR2.1基因的編碼核苷酸和氬基酸序列。SEQIDNO:56顯示NAR2.1的756bp的推定啟動子。使用CAC36942作為查詢序列也顯示了不同的NAR2同源物cbn2.pk0042.g4。該克隆也具有起始甲硫氨酸，但是由于EST序列的質(zhì)量，與CAC36942的同源性較短。通過使用cbn2.pk0042.g4作為查詢序列來檢索Tigr玉米基因組組裝，鑒別到了該家族成員的完全版本(Tigr克隆AZM4—1475)。SEQIDNO:57和58分別顯示NAR2.2(Tigr克隆AZM4—1475)的編碼核苷酸和氮基酸序列。NAR2.1啟動子分離通過進(jìn)行GenomeWalkerDNA步移(BDBiosciences)將NAR2.1啟動子的序列信息進(jìn)一步延伸到上游。該方法采用PCR來促進(jìn)克隆已知序列相鄰的未知基因組DNA序列。首先，用留下平端的不同的限制酶消化未知基因組DNA庫。將每個庫連接到銜接子上以建立GenomeWalke,M文庫。獲得了八個不同的玉米HG11文庫。用不同的限制酶Stul、EcoRV、Pmll、PvuII、Scal、Dral、Smal和Pmel消化這些文庫。然后每個文庫進(jìn)行兩輪嵌套式PCR擴(kuò)增。第一輪使用內(nèi)側(cè)接頭引物(API,試劑盒自帶)和NAR2.1特異性外側(cè)引物(SEQIDNO:59)。使用Advantage⑧-GC基因組聚合酶混合物(BDBiosciences)在50pL反應(yīng)液中進(jìn)行PCR，其中含有1^L1文庫DNA、0.5pL的每種引物(10)、4dNTP(2.5mM)、2.2pLMg(OAc)2、10pL15xGC基因組PCR反應(yīng)緩沖液、10pLGC-Melt(5M)、20.8ddH20和1pLAdvantage-GC基因組聚合酶。循環(huán)條件如下7個循環(huán)的94。C變性25秒和72。C退火/延伸6分鐘，接著是32個循環(huán)的94°C變性25秒和67°C退火/延伸6分鐘，通過67。C退火/延伸7分鐘終止。然后將初級PCR產(chǎn)物1:50稀釋，將1^L用作第二輪PCR的模板，其使用與第一輪相同的PCR設(shè)置。第二輪引物是內(nèi)側(cè)銜接子引物(AP2，試劑盒自帶)和NAR2.1特異性內(nèi)側(cè)引物(SEQIDNO:60)。第二輪的循環(huán)條件如下5個循環(huán)的94'C變性25秒和72。C退火/延伸6分鐘，接著是25個循環(huán)的94'C變性25秒和67。C退火/延伸6分鐘，通過67°C退火/延伸7分鐘終止。在Stul文庫中觀察到了主要的PCR產(chǎn)物(大約3kb)。從凝膠上切下這個條帶，使用Qiaquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)純化，連接到pGEM-TEasy栽體(Promega)上。20pL的連接反應(yīng)液如下10的2x快速連接緩沖液、1pL的pGEM-TEasy栽體(50ng)、1的T4DNA連接酶(3Weiss單位L)和8的插入DNA(13ngL)。將反應(yīng)液在4。C溫育過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到MaxEfficiencyDH10B(Invitrogen)感受態(tài)細(xì)胞中。將lpL的連接物加入到20^L細(xì)胞中，置于水上30分鐘。42。C熱激細(xì)胞45秒，然后再次置于水上2分鐘。將細(xì)胞加入到1mL的SOC中，置于振蕩器上于250rpm、37。C振蕩l小時。然后將100細(xì)胞鋪板到含有氨節(jié)青霉素、IPTG和X-Gal的LB培養(yǎng)基上供藍(lán)/白選擇之用。只獲得一個白色菌落。使用PlasmidMini試劑盒(Qiagen)純化質(zhì)粒DNA。使用標(biāo)準(zhǔn)引物(SP6和T7)和自定義引物(SEQIDNO:61、62、63和64)測序代表NAR2上游啟動子區(qū)域的質(zhì)粒插入片段。SEQIDNO:65顯示了另外的2917bp的推定NAR2.1啟動子的序列。完整NAR2.1基因的序列示于SEQIDNO:66。實施例7本申請多肽的表達(dá)模式經(jīng)由LynxMPSSBrenneretal(2000)ProcNatlAcadSciUSA97:1665-70)的方法分析了高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白(HAT)和高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運所需其它多肽(NAR)的表達(dá)模式。如經(jīng)由LynxMPSS(Brenneretal(2000)ProcNatlAcadSciUSA97:1665-70)研究的，NAR2.1和HATl基因的表達(dá)模式在超過200個文庫之間都是相似的。它們都僅4義在才艮組織的皮層套(corticalcylinder)中表達(dá)并相似地是由硝酸鹽誘導(dǎo)的，表明這兩種基因的多肽產(chǎn)物形成了玉米根中硝酸鹽轉(zhuǎn)運的功能復(fù)合物。玉米中NAR2.1和HAT-1的組織特異性表達(dá):在來自包括整個玉米植林的不同組織的210個文庫中，NAR2.1和HAT-1都只在才艮文庫中表達(dá)。這表明每種這些基因的根特異性的功能。玉米組織中NAR2.1和HAT-1的表達(dá)分析。對不同組織文庫的MPSS標(biāo)志豐度求平均值。每種組織文庫的數(shù)量是花藥為3;穗為15;仁為44;葉為39;花粉為1;根為36;須為9;莖為19;以及雄穗為14。硝酸鹽攝取的誘導(dǎo)和在玉米根中的定位:在源自自交系A(chǔ)63的根文庫中，NAR2.1和HAT-1兩者的表達(dá)都相似地由硝酸鹽談導(dǎo)。玉米在水中的紙巻中生長7天后，采集所獲得的黃化幼苗的根，平行進(jìn)行不同處理。將新鮮采集的根保持在水上作為對照。在含有不同養(yǎng)分的通氣溶液中培養(yǎng)根不同長短的時間，然后或者快速在液氮中水凍并貯藏在-80。C直到用于表達(dá)分析，或者保存在水中的兩層濕紙巾之間用于進(jìn)一步操作。將已經(jīng)在硝酸鹽中處理過四小時的一批根手工解剖成皮層套和中柱。NAR2.1和HAT-1表達(dá)對不同養(yǎng)分處理的反應(yīng)。將根在含有1mM硝酸鹽(0.5mMKN03和0.25mMCa(N03)2)或者1mM氯化物(0.5mMKC1和0.25mMCaCl2)的培養(yǎng)基中處理半小時或者四小時。將已經(jīng)用硝酸鹽處理4小時的一批根分離成皮層套和中柱并進(jìn)行MPSS。當(dāng)與在氯化物溶液中溫育的平行對照根相比，來自玉米的NAR2.1和HAT-1基因兩者在溫育培養(yǎng)基中都顯示出相似的對硝酸鹽(N)的反應(yīng)，隨時間逐漸增加。這兩種基因也都幾乎全部位于皮層套中而不在中柱中。它們對硝酸鹽的相似反應(yīng)和它們的定位強有力地表明這些基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物在玉米根中產(chǎn)生了功能性硝酸鹽轉(zhuǎn)運復(fù)合物。NAR2.1在伊利諾斯高蛋白(IHP)和伊利諾斯低蛋白(ILP)玉米品系中表達(dá)的相反調(diào)節(jié):IHP和ILP是源自玉米群體的兩組品系，是對谷物蛋白在高和低谷物蛋白方向進(jìn)行約100年趨異選擇之后獲得的(Uribelarrea等人，2004)。IHP谷物含有〉20%的蛋白質(zhì)，而ILP谷物含有<5%。在各種處理之后對這兩種品系的根進(jìn)行LynxMPSS?；蛘邔⒏冀K保留在硝酸鹽溶液中硝酸鹽饑餓兩小時，或者在兩小時饑々我之后放在硝酸鹽溶液中。IHP中的NAR2.1象A63—樣反應(yīng)硝酸鹽處理，而ILP顯示了相反的反應(yīng)。考慮到ILP中的這種基因在硝酸鹽饑餓的根中的表達(dá)水平是與保留在硝酸鹽中的IHP根相似的，這些結(jié)果就暗示在兩種方向上反應(yīng)硝酸鹽的機(jī)制在玉米中是確實存在的。然而，如IHP和具有約10%正常谷物蛋白的自交系A(chǔ)63之間的相似反應(yīng)所顯示的，看起來已經(jīng)選擇了陽性反應(yīng)機(jī)制。只有IHP含有HAT1序列標(biāo)志并顯示與NAR2.1相似的表達(dá)模式，進(jìn)一步支持了上述暗示，即NAR2.1和HAT1形成了玉米根中的功能復(fù)合物。A63中的其它HAT基因的表達(dá):HAT4G只在四種均源自根組織的文庫中以〉10ppm表達(dá)。因此，該基因看起來是根特異性的。HAT7在冷處理幼苗和三種葉文庫中表達(dá)，暗示該基因可能編碼從木質(zhì)部質(zhì)外體攝取硝酸鹽到葉細(xì)胞中的蛋白質(zhì)。預(yù)期本申請的HAT序列與NAR序列形成功能性硝酸鹽轉(zhuǎn)運復(fù)合物。實施例8使用TUSC突變?nèi)后w證實高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白和高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運所需多肽的功能高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因座的全長基因組序列可用來設(shè)計引物，用于篩選TUSC群體中的Mu插入突變體(美國專利No.5,962,764，1999年10月5日出版)?？捎没蛱禺愋砸锖Y選合并的TUSC群體。可從該篩選中回收并表征玉米高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白和高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運所需多肽的等位基因。而且，本申請序列的功能可通過補充研究來證實。實施例9單子葉植物細(xì)胞中重組DNA構(gòu)建體的表達(dá)可構(gòu)建含有編碼本發(fā)明多肽的cDNA,其相對于位于cDNA片段5，的玉米27kD玉米醇溶蛋白啟動子和位于cDNA片段3，的10kD玉米醇溶蛋白3，末端來說是有義方向的。通過使用合適的寡核苷酸引物對cDNA克隆進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)可產(chǎn)生該基因的cDNA片段?？蓪⒖寺∥稽c(NcoI或Smal)引入到寡核苷酸中以提供DNA片段插入如下所述的已消化載體pML103時的合適方向。然后在標(biāo)準(zhǔn)PCR中進(jìn)行擴(kuò)增。然后用限制酶NcoI和Smal消化擴(kuò)增的DNA，在瓊脂糖凝膠上分級分離。可從凝膠上分離合適條帶，與質(zhì)粒pML103的4.9kbNcol-Smal片段連接。質(zhì)粒pML103已根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，10801UniversityBlvd.,Manassas，VA20110-2209)，具有保藏號ATCC97366。PML103的DNA片段含有玉米27kD玉米醇溶蛋白基因的1.05kbSall-Ncol啟動子片段和來自栽體pGem9Zf(+)(Promega)中10kD玉米醇溶蛋白基因3，末端的0.96kbSmal-Sall片段。栽體和插入DNA可在15'C連接過夜，基本上按照Maniatis中所述。然后可將已連接的DNA用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-Blue(EpicurianColiXL-1Blue;Stratagene)。可通過質(zhì)粒DNA的限制酶消化和使用雙脫氧鏈終止方法(SequenaseTMDNA測序試劑盒；U.S.Biochemical)的有限核苷酸序列分析來篩選細(xì)菌轉(zhuǎn)化子。所得質(zhì)粒構(gòu)建體將含有重組DNA構(gòu)建體，其按5，到3，方向編碼27kD玉米醇溶蛋白啟動子、編碼本發(fā)明多肽的cDNA片段以及10kD的玉米醇溶蛋白3，區(qū)域。然后可將上述重組DNA構(gòu)建體通過下面的方法引入到玉米細(xì)胞中?？蓪⑽闯墒煊衩着邚脑醋宰越挥衩紫礖99和LH132的雜交的發(fā)育中的穎果切開。在授粉后10到1天當(dāng)胚.0到1.5mm長時分離胚。然后將胚軸側(cè)向下進(jìn)行放置，與瓊脂糖固化的N6培養(yǎng)基(Chu等人(1975)Sci.Sin.Peking18:659-668)接觸。將胚于27。C保持在暗處。從這些未成熟胚的盾片增殖由未分化細(xì)胞團(tuán)構(gòu)成的脆性成胚愈傷組織，在胚柄結(jié)構(gòu)上生有體細(xì)胞原胚狀體和胚狀體?？蓪⒎蛛x自初代外植體的成胚愈傷組織培養(yǎng)在N6培養(yǎng)基上，每2到3周在該培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)?？蓪①|(zhì)粒p35S/Ac(獲自Dr.PeterEckes,HoechstAg,Frankfurt,Germany)用于轉(zhuǎn)化實驗以提供選擇標(biāo)記。該質(zhì)粒含有Pat基因(參見歐洲專利公開0242236)，其編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)。酶PAT賦予對除草劑谷氨酰胺合成酶抑制劑諸如膦絲菌素的抗性。p35S/Ac中的pat基因受控于來自花椰菜花葉病毒的35S啟動子(Oddl等人(1985)Nature313:810-812)和來自根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒T-DNA的胭脂堿合酶基因的3'區(qū)域。粒子轟擊方法(Klein等人(1987)Nature327:70-73)可用于將基因轉(zhuǎn)移到愈傷組織培養(yǎng)細(xì)胞中。根據(jù)該方法，使用下面的技術(shù)以DNA包被金粒子(直徑lpm)。將10Mg質(zhì)粒DNA加入到50ML金粒子懸浮液中(每mL60mg)。將氯化4丐(2.5M溶液50yL)和亞精胺游離堿(1.0m溶液20ml)加入到粒子上。在加入這些溶液期間渦旋懸浮液。IO分鐘后，短暫離心管子(15,000rpm,5秒)，去除上清液。將粒子重懸浮在200mL無水乙醇中，再次離心并去除上清液。再次進(jìn)行乙醇漂洗，將粒子重懸浮在終體積30jliL的乙醇中?？蓪NA包被的金粒子等分試樣(5卩L)放在KaptonTM飛盤(Bio-RadLabs)中心。然后用BiolisticPDS-1000/He(Bio-RadInstruments,HerculesCA;M尋沭立子加速進(jìn)入到玉米組織中，其中使用1000psi的氦壓力、0.5cm的間隙距離和1.0cm的飛行距離。對于轟擊而言，將成胚組織放在瓊脂固化的N6培養(yǎng)基上的濾紙上。將組織布置成薄菌莒，覆蓋直徑約5cm的圓形區(qū)域?？蓪⒑薪M織的培養(yǎng)jiL置于距離停止屏大約8cm的PDS-1000/He室內(nèi)。然后將室內(nèi)空氣抽真空到28英寸汞柱的真空度。使用爆破膜以氦沖擊波加速宏觀栽體(macrocarrier)，當(dāng)激波管內(nèi)的He壓力達(dá)到1000psi時該爆破膜發(fā)生爆破。轟擊七天之后，可將組織轉(zhuǎn)移到含有草銨膦(每升2mg)且不含酪蛋白或脯氨酸的N6培養(yǎng)基中。組織在該培養(yǎng)基上繼續(xù)緩慢生長。再過2周之后，可將組織轉(zhuǎn)移到含有草銨膦的新鮮N6培養(yǎng)基中。6周后，在含有補加草銨膦的培養(yǎng)基的一些平板上可鑒別到活躍生長愈傷組織的大約直徑1cm的區(qū)域。這些愈傷組織在選擇培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)時可以繼續(xù)生長。可從轉(zhuǎn)基因愈傷組織再生植物，其通過首先將組織團(tuán)轉(zhuǎn)移到補充了每升0.2mg2，4-D的N6培養(yǎng)基中。兩周之后，可將組織轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基(Fromm等人(1990)Bio/Technology8:833-839)中。實施例10雙子葉植物細(xì)月包中重組DNA構(gòu)建體的表達(dá)包含啟動子和來自編碼菜豆(Phaseolusvulgaris)(Doyle等人(1986)J.Biol.Chem.261:9228-9238)的種子貯存蛋白，即菜豆球蛋白o(hù)c亞基的發(fā)明的多肽。菜豆球蛋白盒包括菜豆球蛋白翻譯起始密碼子上游(5')的大約500核苷酸和翻譯終止密碼子下游(3')的大約1650核苷酸。在5'和3，區(qū)域之間的是獨特的限制性內(nèi)切酶位點NcoI(包括ATG翻譯起始密碼子)、Smal、KpnI和XbaI。整個盒的兩側(cè)是Hindm位點?？赏ㄟ^使用合適的寡核苷酸引物用cDNA克隆的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來產(chǎn)生該基因的cDNA片段?？蓪⒖寺∥稽c引入寡核苷酸以提供DNA片段插入表達(dá)載體時的合適方向。然后如上所述進(jìn)行擴(kuò)增，將分離到的片段插入攜帶有種子表達(dá)盒的pUC18栽體中。導(dǎo)體細(xì)胞胚，可將從大豆栽培種A2872的表面消毒的未成熟種子上切下的長3-5mm的子葉于26。C的光照或黑暗條件下培養(yǎng)在合適的瓊脂培養(yǎng)基上6-10周。然后切下可產(chǎn)生次生胚的體細(xì)胞胚，置于合適的液體培養(yǎng)基中。在對繁殖了早期球形期胚的體細(xì)胞胚進(jìn)行重復(fù)選擇后，如下所述維持懸浮液?？蓪⒋蠖钩膳邞腋∨囵B(yǎng)物維持在旋轉(zhuǎn)振蕩器上的35mL液體培養(yǎng)基中，150rpm、于26。C按照16:8小時的晝/夜時間表使用熒光燈。每兩周對培養(yǎng)物進(jìn)行繼代培養(yǎng)，其是通過將大約35mg的組織接種到35mL的液體培養(yǎng)基中。然后可通過基因槍轟擊方法(Klein等人(1987)Nature(London)327:70-73,美國專利No.4,945,050)轉(zhuǎn)化大豆成胚懸浮培養(yǎng)物。可使用DuPomBiolisticTMpDS1000/HE設(shè)備(氦氣改型)進(jìn)行這些轉(zhuǎn)化。可用于促進(jìn)大豆轉(zhuǎn)化的可選擇標(biāo)記基因是包括花椰菜花葉病毒35S啟動子(Odell等人(1985)Nature313:810-812)、質(zhì)粒pJR225的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(來自大腸桿菌;Gritz等人(1983)Gene25:179-188)和根癌農(nóng)桿菌的丁i質(zhì)粒T-DNA的胭脂堿合酶基因3，區(qū)的重組DNA構(gòu)建體。含有菜豆球蛋白5，區(qū)、編碼本發(fā)明多肽的片段和菜豆球蛋白3，區(qū)的種子表達(dá)盒可作為限制性片段分離。然后將該片段插入到攜帶有標(biāo)記基因的載體的獨特限制性位點中。向60mg/mL的lMm金粒子懸浮液50jaL中加入(按順序)5juLDNA(ljug/mL)、20pL亞精胺(0.1M)和50mLCaCl2(2.5M)。然后攪拌粒子制劑三分鐘，在微量離心機(jī)中旋轉(zhuǎn)10秒，去除上清液。然后在400jjL70o/q乙醇中漂洗DNA包被的粒子一次，重懸浮在40mL的無水乙醇中。可將DNA/粒子懸浮液超聲處理三次，每次一秒。然后將5mL的DNA包被的金粒子加樣到每個宏觀栽體盤上。將大約300-400mg的兩周時間的懸浮培養(yǎng)物置于空的60x15mm的培養(yǎng)皿中，用移液管去除組織上的殘余液體。對于每次轉(zhuǎn)化實驗，通常轟擊5-10個平板的組織。膜爆破壓設(shè)定在1100psi,將室內(nèi)抽真空到28英寸汞柱的真空度。將組織放在距離阻滯屏大約3.5英寸之處，轟擊三次。轟擊之后，可將組織分成兩半，放回液體中如上所述進(jìn)行培養(yǎng)。轟擊后五到七天，可將液體培養(yǎng)基用新鮮培養(yǎng)基交換，轟擊后十一到十二天，用含有50mg/mL潮霉素的新鮮培養(yǎng)基更換。該選擇培養(yǎng)基可每周更換。轟擊后七到八周，可觀察到綠色的轉(zhuǎn)化組織從未轉(zhuǎn)化的壞死成胚團(tuán)中長出。切下分離到的綠色組織，接種到單獨的燒瓶中以產(chǎn)生新的、無性繁殖的、轉(zhuǎn)化的成胚懸浮培養(yǎng)物。每種新品系可作為獨立的轉(zhuǎn)化品系進(jìn)行處理。然后將這些懸浮液繼代培養(yǎng)，作為未成熟胚團(tuán)培養(yǎng)，或者通過各個體細(xì)胞胚的成熟和萌發(fā)而再生為完整植林。實施例11微生物細(xì)胞中重組DNA構(gòu)建體的表達(dá)可將編碼本發(fā)明多肽的cDNA插入到T7大腸桿菌表達(dá)栽體pBT430中。該載體是采用噬菌體T7RNA聚合酶/T7啟動子系統(tǒng)的pET-3a(Rosenberg等人(1987)Gene56:125-135)的衍生物。質(zhì)粒pBT430的構(gòu)建通過首先在其原始位置破壞pET-3a中的EcoRI和HindIII位點。將含有EcoRI和HindIII位點的寡核苷酸銜接子插入到pET-3a的BamHI位點。這樣就產(chǎn)生了帶有額外獨特克隆位點以將基因插入表達(dá)栽體的pET-3aM。然后，使用寡核苷酸指導(dǎo)的誘變將翻譯起始位置處的NdeI位點轉(zhuǎn)變成NcoI位點。將這個區(qū)域中的pET-3aM的DNA序列5'-CATATGG轉(zhuǎn)變成pBT430中的5'-CCCATGG?？蓪⒑衏DNA的質(zhì)粒DNA進(jìn)4亍適當(dāng)消化以釋放編碼蛋白質(zhì)的核酸片段。然后可在1%NuSieveGTGTM低熔點瓊脂糖凝膠(FMC)上純化該片段。緩沖液和瓊脂糖含有10pg/ml溴乙錠以使DNA片段顯色。然后根據(jù)廠商說明用GELase(EpicentreTechnologies)消化可從瓊脂糖凝膠上純化片段，乙醇沉淀，干燥并重懸浮在20juL水中。可使用T4DNA連接酶(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)將合適的寡核苷酸銜接子連接到片段上。如上所述使用低熔點瓊脂糖可從過量接頭中純化到含有已連接的銜接子的片段。如上所述消化載體pBT430，用堿性磷酸酶(NEB)脫磷酸，用苯酚/氯仿脫蛋白。然后可將制備好的載體pBT430和片段在16。C下連接15小時，接著轉(zhuǎn)化到DH5電感受態(tài)細(xì)胞(GIBCOBRL)中。可在含有LB培養(yǎng)基和100(ug/mL氨千青霉素的瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化子。然后通過限制酶分析對含有編碼本發(fā)明多肽的基因的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行相對于T7啟動子正確定向的篩選。為了高水平表達(dá)，可將帶有相對于T7啟動子正確定向的cDNA插入片段的質(zhì)粒克隆轉(zhuǎn)化到大腸桿菌林BL21(DE3)(Studieretal.(1986)丄Mol.Biol.189:113-130)中。將培養(yǎng)物在含有氨千青霉素(IOOmg/L)的LB培養(yǎng)基中于25。C下生長。在600nm處的光密度大約為1時，可將IPTG(異丙基-P-疏代半乳糖苷，即誘導(dǎo)劑)加入到終濃度0.4mM,可在25。C繼續(xù)培養(yǎng)3小時。然后通過離心收集細(xì)胞，重懸浮在50pL含有O.lmMDT丁和0.2mM苯甲基磺酰氟的50mMTris-HCl(pH8.0)中。可加入少量1mm玻璃珠，然后將混合物用微探針超聲波儀超聲處理3次，每次大約5秒。離心混合物，確定上清液中的蛋白質(zhì)濃度。可將來自培養(yǎng)物可溶部分的lMg蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離。可觀察到凝膠上在預(yù)期分子量處遷移的蛋白質(zhì)條帶。實施例12才艮癌農(nóng)桿菌LBA4404的電穿孔將電穿孔感受態(tài)細(xì)胞(40jaL)諸如根癌農(nóng)桿菌LBA440(含有PHP1052)在水上解凍(20-30分鐘)。PHP10523含有用于T-DNA轉(zhuǎn)移的VIR基因、農(nóng)桿菌低拷貝數(shù)質(zhì)粒復(fù)制起點、四環(huán)素抗性基因和用于體內(nèi)DNA雙分子重組的Cos位點。PHP10523進(jìn)一步描述于實施例17中。同時將電穿孔比色皿在冰上冷卻。將電穿孔儀的設(shè)定值調(diào)節(jié)到2.1kV。將DNA試樣(在低鹽緩沖液或雙蒸水中的0.5親本DNA,濃度0.2pg-l.Opg)與解凍的根癌農(nóng)桿菌LBA4404細(xì)胞混合，同時在水上靜置。將混合物轉(zhuǎn)移到電穿孔比色皿底部，靜置在冰上卜2分鐘。通過按壓"脈沖"按鈕兩次(理想地可達(dá)到4.0毫秒的脈沖)將細(xì)胞進(jìn)行電穿孑L(Eppendorf電穿孔儀2510)。隨后將0.5mL的室溫2xYT培養(yǎng)基(或SOC培養(yǎng)基)加入到培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)移到15mL的帶保護(hù)帽的管子(例如FalconTM管)中。將細(xì)胞在28-30。C、200-250rpm溫育3小時。將250|liL的等分試樣涂布在含有YM培養(yǎng)基和50pg/mL壯觀霉素的平板上，在28-30。C溫育三天。為增加轉(zhuǎn)化子的數(shù)量，可進(jìn)行兩個任選的步驟之一選擇1:用30)LiL的15mg/mL利福平覆蓋平板。LBA4404具有對利福平的染色體抗性基因。這種附加的選擇排除了使用LBA4404感受態(tài)細(xì)胞的更差制劑所觀察到的一些污染克隆。選擇2:進(jìn)行兩次平行電穿孔以補償較差的電感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化子的鑒別挑選四個獨立克隆，在含有AB基本培養(yǎng)基和50ng/mL壯觀霉素的平板上劃線培養(yǎng)以分離單個克隆。平板在28。C培養(yǎng)兩到三天。挑選每個推定的共整合物的單個克隆，用4mL的10g/L細(xì)菌蛋白胨、10g/L酵母提取物、5g/L氯化鈉和50mg/L壯觀霉素進(jìn)行接種。將混合物在28。C振蕩溫育24小時。使用QiagenMiniprep和任選的緩沖液PB漂洗從4mL培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒DNA。以30pL洗脫DNA。如上所述4吏用2jiL的等分試樣來電穿孔20)LiL的DH10b+20>xL雙蒸水?？扇芜x使用15|iiL等分的試樣來轉(zhuǎn)化75-100pL的InvitrogenLibraryEfficiencyDH5a。將細(xì)胞涂布在含有LB培養(yǎng)基和50|ug/mL壯觀霉素的平板上，在37。C溫育過夜。對每種推定的共整合物挑選三到四個獨立克隆，接種4mL的2xYT培養(yǎng)基(10g/L細(xì)菌蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化鈉)，其中含有50ng/mL壯觀霉素。將細(xì)胞在37。C振蕩溫育過夜。接著，使用QIAprepMiniprep，任選使用緩沖液PB漂洗，從4mL培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒DNA(以50pL洗脫)。使用8pL用于Sail消化(使用親本DNA和PHP10523作為對照)。對帶有正確Sail消化模式的代表了2個推定的共整合物的4個質(zhì)粒進(jìn)行三種另外的消化，其使用限制酶BamHI、EcoRI和HindIII進(jìn)行(使用親本DNA和PHP10523作為對照)。推薦電子凝膠用于比較。實施例13使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米基本上按照Zhao等人在Meth.Mol.Biol.318:315-323(2006)中所述進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化(也參見Zhao等人，Mol.Breed.8:323-333(2001)和1999年11月9日授權(quán)的美國專利No.5，981，840,通過引用引入本文)。轉(zhuǎn)化過程涉及細(xì)菌接種、共培養(yǎng)、休眠、選擇和植物再生。1.未成熟胚制備從穎果上切下未成熟玉米胚，放在含有2mLPHI-A培養(yǎng)基的2mL微型管中。2.農(nóng)桿菌感染和未成熟胚的共培養(yǎng)2.i感染步驟用1mL微量移液管去除(l)的PHI-A培養(yǎng)基，加入lmL農(nóng)桿菌懸浮液(包括但不限于實施例7中描述的農(nóng)桿菌)。輕輕倒轉(zhuǎn)管子進(jìn)行混合?；旌衔镌谑覝販赜?分鐘。2.2共培養(yǎng)步驟用1mL微量移液管從感染步驟中去除農(nóng)桿菌懸浮液。使用無菌刮刀將胚從管中刮下，轉(zhuǎn)移到100x15mm培養(yǎng)皿中的PHI-B培養(yǎng)基平板上。在培養(yǎng)基表面上將胚軸朝下來定向胚。帶有胚的平板在20。C下于暗處培養(yǎng)三天。在共培養(yǎng)階段中可使用L-半胱氨酸。使用標(biāo)準(zhǔn)二元栽體，補充100-400mg/LL-半胱氨酸的共培養(yǎng)培養(yǎng)基對于回收穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因品系來說是關(guān)鍵性的。3.推定的轉(zhuǎn)基因事件的選擇轉(zhuǎn)樣10個胚到100x15mm培養(yǎng)皿中的每個PHI-D培養(yǎng)基平板上，保持方向，用石蠟?zāi)?parafilm)密封培養(yǎng)皿。平板在28。C下于暗處進(jìn)行培養(yǎng)。象淺黃色胚組織一樣，活躍生長的推定事件預(yù)期在六到八周后可見。不產(chǎn)生事件的胚可能是褐色的和壞死的，明顯沒有什么脆性組織生長。將推定的轉(zhuǎn)基因胚組織以兩到三周的間隔繼代培養(yǎng)到新鮮的PHI-D平板上，這取決于生長速度。對事件進(jìn)行記錄。4.TO植物的再生將PHI-D培養(yǎng)基上繁殖的胚組織繼代培養(yǎng)到100x25mm培養(yǎng)皿中的PHI-E培養(yǎng)基(體細(xì)胞胚成熟培養(yǎng)基)上，28。C于暗處溫育大約十到十八天，直到體細(xì)胞胚成熟。將帶有明確盾片和胚芽鞘的單株成熟體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到PHI-F胚萌芽培養(yǎng)基上，28'C于光照(大約80來自冷白熒光燈或等效熒光燈)下培養(yǎng)。七到十天后，使用標(biāo)準(zhǔn)園藝學(xué)方法將大約10cm高的再生植物盆栽在園藝混合料中并煉苗。植物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基1.PHI-A:4g/LCHU基礎(chǔ)鹽，1.0mL/L1000xEriksson維生素混合物，0.5mg/L維生素Bl'HCl,1.5mg/L2，4-D,0.69g/LL-脯氨酸，68.5g/L蔗糖，36g/L葡萄糖，pH5.2。加入100pM乙酰丁香酮(過濾消毒)。2.PHI-B:不含葡萄糖的PHI-A，增加2，4-D到2mg/L，減少蔗糖到30g/L，補充0.85mg/L硝酸銀(過濾消毒)，3.0g/LGelrite,100pM乙酰丁香酮(過濾消毒)，pH5.8。3.PHI-C:不含Gelrite⑧和乙酰丁香酮的PHI-B,減少2,4陽D到1.5mg/L，補充8.0g/L瓊脂、0.5g/L2-[N-嗎啉代]乙烷-磺酸(MES)緩沖液、100mg/L羧芐青霉素(過濾消毒)。4.PHI-D:PHI-C補充3mg/L雙丙氨膦(過濾消毒)。5.PHI-E:4.3g/L的Murashige和Skoog(MS)鹽(Gibco,BRL11117-074)，0.5mg/L煙酸,0.1mg/L維生素BlHC1，0.5mg/L維生素B6.HC1,2.0mg/L甘氨酸，0.1g/L肌醇，0.5mg/L玉米素(Sigma,Cat.No.Z-0164),1mg/L吲味乙酸(IAA)，26.4ng/L脫落酸(ABA),60g/L蔗糖，3mg/L雙丙氨膦9過濾消毒)，100mg/L羧千青霉素(過濾消毒)，8g/L瓊脂，pH5.6。6.PHI-F:不含玉米素、IAA、ABA的PHI-E;減少蔗糖到40g/L;用1.5g/LGelrite⑧替換瓊脂；pH5.6。可從轉(zhuǎn)基因愈傷組織中再生植物，其通過首先將組織團(tuán)轉(zhuǎn)移到補充了每升0.2mg2，4-D的N6培養(yǎng)基中。兩周之后可將組織轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基(F腿m等人，Bio/Technology8:833-839(1990))中。轉(zhuǎn)基因TO植物可被再生，確定它們的表型?？刹杉絋l種子。此外，可將含有已證實的擬南芥基因的重組DNA構(gòu)建體引入到精選的玉米自交系中，或者通過直接轉(zhuǎn)化，或者通過從分離的轉(zhuǎn)化品系中漸滲。限制;和氮不li制條件下4"產(chǎn)量提高和/或穩(wěn)定性。、、隨后可進(jìn)行產(chǎn)量分析以確定含有已證實的擬南芥前導(dǎo)基因的植物在與不含已證實的擬南芥前導(dǎo)基因的對照(或參照)植物相比之時，是否具有產(chǎn)量性能方面的改善(在氮限制的或氮不限制的條件下)。含有已證實的擬南芥前導(dǎo)基因的植物在氮限制的條件下將具有相對于對照植物更少的產(chǎn)量損失，優(yōu)選少50%的產(chǎn)量損失，或者在氮不限制的條件下將具有相對于對照植物增加的產(chǎn)量。實施例14對化合物抑制硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白活性的能力進(jìn)行評估可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方法生產(chǎn)本文描述的多肽。這些方法包括但不限于如實施例11中所述的在細(xì)菌中表達(dá)，或者在真核細(xì)胞培養(yǎng)物中在植物中(inplanta)表達(dá)，以及使用在合適感染的生物或細(xì)胞系中的病毒表達(dá)栽體。本發(fā)明的多肽可表達(dá)為蛋白質(zhì)的如體內(nèi)觀察到的成熟形式，或者表達(dá)為共價連接到各種酶、蛋白質(zhì)或親和標(biāo)志上的融合蛋白。常見的融合蛋白配偶體包括谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶("GST")、硫氧還蛋白("Trx，，)、麥芽糖結(jié)合蛋白以及C末端和/或N末端六組氨酸多肽("(HisV，)?？稍谌诤衔稽c用蛋白酶識別位點修飾融合蛋白以便能夠通過蛋白酶消化分開融合配偶體以產(chǎn)生完整的成熟酶。這些蛋白酶的例子包括凝血酶、腸激酶和因子Xa。然而，特異性切割連接融合蛋白和酶的肽的任何蛋白酶都能夠使用。如果需要，可采用蛋白質(zhì)純化領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的許多分離技術(shù)純化本發(fā)明的多肽。這些方法的例子包括但不限于勻漿、過濾、離心、熱變性、硫酸銨沉淀、脫鹽、pH沉淀、離子交換層析、疏水作用層析和親和層析，其中親和配體代表底物、底物類似物或抑制劑。當(dāng)本發(fā)明多肽表達(dá)為融合蛋白時，純化方案可包括使用特異于結(jié)合到所表達(dá)的酶上的融合蛋白標(biāo)志的親和樹脂，或者使用含有特異于酶的配體的親和樹脂。例如，本發(fā)明多肽可表達(dá)為偶聯(lián)到硫氧還蛋白C末端的融合蛋白。此外，可將(His、肽設(shè)計到融合硫氧還蛋白部分的N末端上以提供親和純化的額外可能。其它合適的親和樹脂可以通過將合適的配體連接到任何合適樹脂諸如Sepharose-4B上來合成。在備選技術(shù)方案中，可使用二疏蘇糖醇洗脫硫氧還蛋白融合蛋白；然而，洗脫可以使用其它相互作用以取代樹脂中的硫氧還蛋白的試劑來完成。這些試劑包括P-巰基乙醇或其它還原巰基。如果需要，可通過如上所迷的傳統(tǒng)方法對洗脫的融合蛋白進(jìn)行進(jìn)一步純化。硫氧還蛋白融合蛋白和酶的蛋白水解切割的完成可在純化融合蛋白之后進(jìn)行，或者在蛋白質(zhì)仍然結(jié)合在ThioBond親和樹脂或其它樹脂上之時進(jìn)行。粗酶、部分純化的或者純化的酶，單獨或者作為融合蛋白，都可用在分析方法中來評估化合物抑制本文公開的本發(fā)明多肽的酶促激活的能力。分析方法可在提供最佳酶學(xué)活性的公知實驗條件下進(jìn)行。文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了能夠快速篩選硝酸鹽轉(zhuǎn)運活性的分析方法，包括但不限于測定富含15N的硝酸鹽攝取到表達(dá)蛋白質(zhì)的非洲爪蟾卵母細(xì)胞中的分析方法(Tong等人，ThePlantJ.(2005)41:442-450)。實施例15通過基因改組擴(kuò)大高等植物HAT的線性硝酸鹽攝取范圍已知HAT具有低的Km(在10到100jiM范圍)和低的Vmax(Doddema等人,Kinetics.Physiol.Plant.(1979)45:332-338,Meharg等人,(1995)J.Membr.Biol.145:49-66,Touraine等人，PlantPhysiol.(1997)114:137-144，Liu等人，PlantCell.(1999)11(5):865-874)。因此，一旦硝酸鹽濃度達(dá)到高于HAT的Km大約2到3倍的水平時，HAT的攝取速度就保持不變。最相關(guān)的田間硝酸鹽濃度在典型的現(xiàn)代玉米農(nóng)田上是大約2到5mM。在這個濃度范圍內(nèi)，HAT的攝取速度是充分飽和的。HAT的硝酸鹽攝取從很低到相關(guān)田間濃度的延伸將使得玉米作物能夠充分利用可利用的硝酸鹽來更好的生長和生產(chǎn)。這種轉(zhuǎn)運蛋白也將使得作物植物能夠保持較低硝酸鹽輸入情況下的正常攝取效率，這是通過它在相對較低硝酸鹽濃度下快速攝取能力的增強而實現(xiàn)的?？墒褂酶鞣N基因改組方法(StemmetWP，PNAS(1994)91:10747-10751,Crameri等人，Nature(1998)391:288-291,Ness等人，NatureBiotech.(1999)17:893-896)來產(chǎn)生不同類型的改組HAT文庫。例如，可通過單基因和家族基因改組來產(chǎn)生文庫。附加的多樣性可通過攜帶氨基酸突變的摻入的寡聚體來引入。改組HAT文庫可在異源宿主諸如酵母、大腸桿菌和綠藻之一中功能性表達(dá)。優(yōu)選地，宿主缺少除內(nèi)源性或被引入的硝酸鹽還原酶之外的硝酸鹽同化途徑。功能性表達(dá)的改組體的硝酸鹽攝取速度可通過HPLC或其它分析手段直接測定分析培養(yǎng)基中的硝酸鹽消耗或者通過測定同一細(xì)胞中硝酸鹽還原酶產(chǎn)生的亞硝酸鹽來分析。亞硝酸鹽濃度可通過比色分析(諸如使用Greiss試劑)或者前肽分析手段(HPLC)很容易地確定。從各種改組文庫中篩選的推定命中結(jié)果的進(jìn)一步表征可通過對不同濃度硝酸鹽的攝取速度測定來獲得。這種分析將提供攝取動力學(xué)參數(shù)Km和Vmax。然后可將已證實具有改善性質(zhì)的命中結(jié)果進(jìn)行再改組以產(chǎn)生第二輪改組文庫，可使用上述篩選流程來鑒別第二輪命中結(jié)果。這個過程可一直重復(fù)，直到鑒別到滿足期望動力學(xué)性質(zhì)的幾種改組變體。實施例16來自玉米B73自交系的Nar啟動子的分離、克隆和測序攜帶Nar基因的BAC克隆的鑒別通過PCR篩選源自玉米B71自交系的BAC文庫，其中分別使用SEQIDNO:75和76所迷正向和反向引物。循環(huán)條件是95。C的初始活化步驟15分鐘，接著是35個循環(huán)的94。C1分鐘、6(TC1分鐘和72°C1分鐘。最后的延伸是72'CIO分鐘。獲得377bp的產(chǎn)物。BAC克隆ZMMBBb0521al被確定攜帶了Nar基因。^久玉米B73自交系克隆Nar啟動子通過PCR克隆Nar啟動子，其中分別使用SEQIDNO:77和78所述的帶有BamHI和HindIII限制酶位點的正向和反向引物。將濃度各自為IOpM的1Ml引物混合物、濃度為2.5mM的4p1DNTP、10m15xHF緩沖液和33.5ih1H2O以及0.5m1Phuskm高保真DNA聚合酶(Finnzymes)加入到來自BAC克隆ZMMBBb0521al的1Ml稀釋(1:100)的BACDNA中。循環(huán)條件是98°C的初始活化步驟30秒，接著是35個循環(huán)的98°C10秒、63°C30秒和72。C1分鐘。最后的延伸是72'C10分鐘。獲得3621bp的產(chǎn)物。使用QiaquickTM凝膠提取試劑盒(Qiagen)凝膠純化3621bp產(chǎn)物，用88m1洗脫緩沖液洗脫。將10Ml的緩沖液E(Promega)以及限制酶BamHI和HindIII各1Ml(每種10U/Ml)加入到純化的條帶中。分析混合物在37。C溫育3小時，用QiaquickTMPCR純化試劑盒(Qiagen)提純。用BamHI和HindIII消化pENTR-5'載體(SEQIDNO:85),脫磷酸化。使用Epicentre快速連接試劑盒將純化的PCR條帶插入到制備好的pENTR-5，載體中。連接反應(yīng)混合物含有1.5pL緩沖液(10x)、1.5>LATP(10x)、lpL連接酶、lpLpENTR-5，栽體(約10ng/^LBamHI/Hind111/脫磷酸化的載體)、1^L啟動子插入片段(約30ng)和9pLH20。使連接反應(yīng)在室溫進(jìn)行15分鐘，通過將混合物在70'C溫育5分鐘終止反應(yīng)。轉(zhuǎn)化到細(xì)菌中并對插入片段進(jìn)行PCR篩選將pL連接混合物加入到20卩L電感受態(tài)細(xì)月包(DH10BElectroMax-Invitrogen)中，用GibcoBRL細(xì)胞穿孔儀將混合物電穿孔，然后加入1mLSOC培養(yǎng)基，混合物在37。C于振蕩器中培養(yǎng)1小時。將150細(xì)胞在帶有卡那霉素選擇的LB平板上鋪板，于37'C培養(yǎng)過夜。挑選12個克隆，加入30pLLB培養(yǎng)基。使用PCR篩選克隆。將5pLHotTaq2x主混合物(Qiagen)、1pL(10mM引物混合物，SEQIDNO:77和78)和3pLdH20加入到1pL菌落DNA(克隆/30|iiLLB)中。循環(huán)條件是95。C初始活化15分鐘，接著是35個循環(huán)的95°C50秒、55t:50秒和72'C4分鐘。最后的延伸是72。C10分鐘。插入片段測序使用SEQIDNO:79-84中所述的測序引物對攜帶插入片^R的DNA進(jìn)行測序。插入片段的序列示于SEQIDNO:70。攜帶3621bp插入片段的載體構(gòu)建體被命名為PHP2762，其示于SEQIDNO:86和圖1中。實施例17測試轉(zhuǎn)基因玉米和擬南芥中的NAR啟動子使用InvitrogenTM的gatewayLR克隆酶技術(shù)進(jìn)行MultiSiteGatewayLR重組反應(yīng)以產(chǎn)生玉米NAR啟動子::GUS::PINII、UBI::MO-PAT::PINII和LTP2::DS-REDPINIIJT二元載體(PHP27660,SEQIDNO:87和圖2)。載體PHP27660含有以下表達(dá)盒1.泛素啟動子::MO-PAT::PINII終止子盒，表達(dá)用于轉(zhuǎn)化過程期間的選擇的PAT除草劑抗性基因。2.LTP2啟動子::DS-RED2::PinlILTP2終止子盒，表達(dá)用于種子分選的DS-RED顏色標(biāo)i己基因。3.NAR啟動子::GUS::PINIINAR終止子盒，表達(dá)由玉米NAR啟動子控制的GUS基因。使用實施例16中所述的方案將栽體PHP27660電穿孔到含有PHP10523的LBA4404農(nóng)桿菌細(xì)胞中，通過電穿孔產(chǎn)生了最終的共整合載體PHP27860(SEQIDNO:88和圖3),然后將其用于實施例17所述的基于農(nóng)桿菌的玉米轉(zhuǎn)化。對TO轉(zhuǎn)基因植物取樣檢測GUS表達(dá)。獨立地，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)花序浸漬方法將同一栽體(PHP27860)也用于擬南芥轉(zhuǎn)化。通過在Tl幼苗上噴灑除草劑草銨膦來篩選轉(zhuǎn)基因品系。對除草劑抗性的Tl植物取樣檢測GUS表達(dá)。在不同時間點包括出苗期和成熟期從轉(zhuǎn)基因植物上采集葉和根組織樣品。將新鮮采集的組織樣品切成小片以輔助GUS染色液的滲透。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案(JeffersonRA,KavanaghTA，BevanMW.1987GUS融合P-葡糖醛酸糖芬酶作為高等植物中敏感的和通用的基因融合標(biāo)記，EMBOJ.6(13):3901-3907)進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，在37。C溫育過夜。在轉(zhuǎn)基因玉米和擬南齊組織中未觀察到顯著的啟動子活性。實施例18測試外源連接序列對轉(zhuǎn)基因玉米和擬南芥中NAR啟動子的影響Gateway克隆系統(tǒng)在組分之間留下了"足印"序列的短片段，特別是NAR啟動子和GUS編碼區(qū)之間的21-bpATT-B1片段。已經(jīng)表明在某些情況下這將削弱乃至消除啟動子活性。這可能與基本啟動子元件和起始密碼子之間的物理距離有關(guān)。為確定引入ATT-B1位點是否不利地影響NAR啟動子，用常規(guī)克隆方法也就是不用Gateway系統(tǒng)構(gòu)建了含有玉米NAR啟動子::GUS::PINII盒的構(gòu)建體。經(jīng)基于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因玉米植林，按照實施例17中所迷采集不同組織樣品進(jìn)行GUS表達(dá)研究。實施例19測試缺失系列中的玉米NAR啟動子NAR基因具有硝酸鹽可誘導(dǎo)的以及根特異性的表達(dá)模式。為確定決定NAR啟動子活性和特異性的片段，構(gòu)建了一系列含有連接到GUS和PINII末端序列上的截短的NAR啟動子片段的構(gòu)建體，如實施例17和18中對全長啟動子所進(jìn)行的測試那樣進(jìn)行測試。使用BLASTN(基本局部比對檢索工具；Altschul等人(1993)J.Mol.Biol.215:403-410),可鑒別到NAR啟動子內(nèi)可能對增強或抑制啟動子活性來說很重要的序列。NAR啟動子大約1.5到1.9kb的序列顯示了與另一種基因和轉(zhuǎn)座子元件的同源性。因此如SEQIDNO:89所示的該片段的缺失將預(yù)期增加關(guān)于NAR啟動子活性的信息。此外，如SEQIDNO:71、72、73、74和90所示的減少啟動子長度的截短也可以如實施例17和18中對全長啟動子所進(jìn)4亍的測試同樣的方式進(jìn)行測試?？赏ㄟ^4吏用源自PCR中3.6kbNAR啟動子序列的引物來制備另外的啟動子亞片段。實施例20使用HAT和NAR序列及其組合來評估玉米中的硝酸鹽攝取制備如下玉米表達(dá)構(gòu)建體來評估玉米中的硝酸鹽轉(zhuǎn)運PHP27280(SEQIDNO:93和圖4)、PHP27281(SEQIDNO:94和圖5)、PHP27282(SEQIDNO:95和圖6)和PHP27283(SEQIDNO:96和圖7)。將制備含有HAT序列以及HAT和Nar序列的組合的另外的構(gòu)建體，并測試它們改變硝酸鹽轉(zhuǎn)運的能力。將評估T0、Tl和后代在1mM硝酸鹽條件下的改變的生物量和總穗重。權(quán)利要求1.分離的多核苷酸，其含有:(a)編碼高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白多肽的核苷酸序列，其中多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對方法與SEQIDNO:36或49相比具有至少80％序列同一性；或者(b)核苷酸序列的互補序列，其中互補序列與核苷酸序列由同樣數(shù)量的核苷酸組成并且是100％互補的。2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對方法與SEQIDNO:36、49或92相比具有至少85%的序列同一性。3.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對方法與SEQIDNO:36、49或92相比具有至少90%的序列同一性。4.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對方法與SEQIDNO:36、49或92相比具有至少95%的序列同一性。5.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中多肽的氨基酸序列基于ClustalV比對方法與SEQIDNO:36、49或92相比具有至少99%的序列同一性。6.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中多肽的氨基酸序列含有SEQIDNO:36、49或92之一。7.權(quán)利要求l的多核苷酸，其中核苷酸序列含有SEQIDNO:35或48之一。8.權(quán)利要求1的分離的多核苷酸，其中核苷酸序列含有至少兩個選自SEQIDNO:50、51和52的基序。9.分離的核酸片段，其含有基本上由SEQIDNO:37、38、46、47、56、65、67、68、69、70、71、72、73、74、89或90組成的啟動子或者含有所述啟動子的基本上相似的且功能上等價的亞片段。10.重組DNA構(gòu)建體，其含有權(quán)利要求1的編碼HAT變體的分離的多核苷酸或其功能上等價的亞片段，可操作地連接到至少一種調(diào)節(jié)序列上。11.權(quán)利要求10的重組DNA構(gòu)建體，其中所述調(diào)節(jié)序列含有權(quán)利要求9的啟動子。12.在基因組中含有權(quán)利要求10的重組DNA構(gòu)建體的植物。13.從權(quán)利要求12的植物獲得的種子。14.權(quán)利要求12的植物，其中所述植物選自水稻、玉米、高粱、小米、黑麥、大豆、卡諾拉、小麥、大麥、燕麥、菜豆和堅果。15.在基因組中含有權(quán)利要求IO的重組DNA構(gòu)建體的植物細(xì)胞。16.含有權(quán)利要求15的植物細(xì)胞的植物組織。17.分離編碼改變植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運的多肽的核酸片段的方法，其包括(a)將SEQIDNO:36、49、55或58與其它改變植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運的多肽序列進(jìn)行比較；(b)鑒別步驟(a)中獲得的4種或更多種氨基酸的保守序列；(c)根據(jù)步驟(b)中鑒別的保守序列制備區(qū)域特異性核苷酸探針或寡聚體；以及(d)使用步驟(c)的核苷酸探針或寡聚體通過序列依賴的方案來分離改變植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運的序列。18.繪制與改變植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運相關(guān)的遺傳變異圖譜的方法，其包括..(a)將兩種植物品種雜交；以及(b)評估步驟(a)的雜交所產(chǎn)生的子代植抹中的遺傳變異，該評估是針對如下序列進(jìn)行的(i)選自SEQIDNO:35、48、54或57的核酸序列；或者(ii)編碼選自SEQIDNO:36、49、55或58的多肽的核酸序列；其中使用選自RFLP分析、SNP分析和基于PCR的分析的方法進(jìn)行評估。19.改變植物硝酸鹽轉(zhuǎn)運的分子育種方法，其包括(a)將兩種植物品種雜交；以及(b)評估步驟(a)的雜交所產(chǎn)生的子代植抹中的遺傳變異，該評估是針對如下序列進(jìn)行的(i)選自SEQIDNO:35、48、54或57的核酸序列；或者(ii)編碼選自SEQIDNO:36、49、55或58的多肽的核酸序列；其中使用選自RFLP分析、SNP分析和基于PCR的分析的方法進(jìn)行評估。20.玉米植林，其含有(a)第一重組DNA構(gòu)建體，其含有可操作地連接到至少一種調(diào)節(jié)序列上的編碼HAT多肽的分離的多核苷酸；以及(b)至少一種另外的重組DNA構(gòu)建體，其含有可操作地連接到至少一種調(diào)節(jié)序列上的編碼NAR多肽的分離的多核苷酸。21.改變植物氮轉(zhuǎn)運的方法，其包括(a)用重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，該構(gòu)建體含有(i)第一重組DNA構(gòu)建體，其含有可操作地連接到至少一種調(diào)節(jié)序列上的編碼HAT多肽的分離的多核苷酸；以及ii)至少一種另外的重組DNA構(gòu)建體，其含有可操作地連接到至少一種調(diào)節(jié)序列上的編碼NAR多肽的分離的多核苷酸，(b)在適于表達(dá)重組DNA構(gòu)建體的條件下培養(yǎng)(a)的轉(zhuǎn)化植物；以及(c)選擇具有改變了的硝酸鹽轉(zhuǎn)運的那些轉(zhuǎn)化植物。22.植物改組的HAT變體，與野生型HAT相比具有改變了的硝酸鹽攝取動力學(xué)性質(zhì)。23.權(quán)利要求22的HAT變體，其中變體具有0.5到2mM硝酸鹽的Km范圍。24.權(quán)利要求22的HAT變體，其中變體具有相比于野生型HAT至少高2到10倍的Vmax。25.權(quán)利要求22的HAT變體，其中變體具有0.5到2mM硝酸鹽的Km范圍，并具有相比于野生型HAT至少高2到10倍的Vmax。26.重組DNA構(gòu)建體，其含有編碼權(quán)利要求22、23、24或25任一項的HAT變體的分離的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地連接到至少一種調(diào)節(jié)序列上。27.重組DNA構(gòu)建體，其含有編碼權(quán)利要求22、23、24或25任一項的HAT變體的分離的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地連接到至少一種調(diào)節(jié)序列上，其中所述調(diào)節(jié)序列含有權(quán)利要求9的啟動子。28.在基因組中含有權(quán)利要求26或27的重組DNA構(gòu)建體的植物。29.從權(quán)利要求28的植物獲得的種子。30.權(quán)利要求28的植物，其中所述植物選自水稻、玉米、高粱、小米、黑麥、大豆、卡諾拉、小麥、大麥、燕麥、菜豆和堅果。31.在基因組中含有權(quán)利要求26或27的重組DNA構(gòu)建體的植物細(xì)胞。32.含有權(quán)利要求31的植物細(xì)胞的植物組織。33.玉米植抹，其含有(a)第一重組DNA構(gòu)建體，其含有權(quán)利要求25或26的重組DNA構(gòu)建體；以及(b)至少一種另外的重組DNA構(gòu)建體，其含有可操作地連接到至少一種調(diào)節(jié)序列上的編碼NAR多肽的分離的多核苷酸。34.改變植物氮轉(zhuǎn)運的方法，其包括a)用重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，該構(gòu)建體含有i)第一重組DNA構(gòu)建體，其含有權(quán)利要求26或27的重組DNA構(gòu)建體；以及ii)至少一種另外的重組DNA構(gòu)建體，其含有可操作地連接到至少一種調(diào)節(jié)序列上的編碼NAR多肽的分離的多核苷酸，(b)在適于表達(dá)重組DNA構(gòu)建體的條件下培養(yǎng)步驟(a)的轉(zhuǎn)化植物；以及(c)選擇具有改變了的硝酸鹽轉(zhuǎn)運的那些轉(zhuǎn)化植物。全文摘要本發(fā)明涉及編碼高親和力硝酸鹽轉(zhuǎn)運組分的分離的核酸片段。本發(fā)明也涉及有義方向或反義方向的編碼所有或部分硝酸鹽轉(zhuǎn)運組分的重組DNA構(gòu)建體的構(gòu)建，其中重組DNA構(gòu)建體的表達(dá)可以改變轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞中的硝酸鹽轉(zhuǎn)運組分的水平。文檔編號C12N15/82GK101395275SQ200680038354公開日2009年3月25日申請日期2006年8月15日優(yōu)先權(quán)日2005年8月15日發(fā)明者D·盧塞爾特,H·P·赫爾希,H·王,K·S·杜加,K·芬格勒,L·劉,S·M·艾倫,V·拉卡,X·牛申請人:納幕爾杜邦公司;先鋒高級育種國際公司