專利名稱：微生物的制作方法
本申請(qǐng)為申請(qǐng)?zhí)?4115663.X、申請(qǐng)日1994年9月5日、發(fā)明名稱“順式-3-羥基-L-脯氨酸的制造方法”、以及其分案申請(qǐng)的申請(qǐng)?zhí)?1137461.6、發(fā)明名稱“L-脯氨酸3位羥基化酶的制造方法”、其分案申請(qǐng)的申請(qǐng)2004100946109、發(fā)明名稱“微生物”的分案申請(qǐng)。
本發(fā)明是涉及工業(yè)上有利地制造作為醫(yī)藥品合成原料或食品添加劑的有用的順式-3-羥基-L-脯氨酸的方法以及用于該方法上的有用的新的L-脯氨酸3位羥基化酶。
作為以往的順式-3-羥基-L-脯氨酸的制造方法，化學(xué)合成方法是已經(jīng)公知的〔Journal of the American Chemical Society(J.Amer.Chem.Soc.)、843980(1962)、同書(shū)的85、2824(1963)、Nature、289、310(1981)、Journal of Organic Chemistry(J.Org.Chem.)、54、1866(1989)、Acta Chemica Scandinavica、43、290(1989)〕。
但是，在將L-脯氨酸直接在不同位置及立體選擇地羥基化后，制造順式-3-羥基-L-脯氨酸的方法中，同時(shí)利用合成化學(xué)方法及生物機(jī)能的方法，目前尚沒(méi)有報(bào)導(dǎo)。
以往的用化學(xué)合成法制造順式-3-羥基-L-脯氨酸的制造方法，由于(1)原料昂貴、(2)反應(yīng)工序長(zhǎng)、(3)分離精制工序復(fù)雜、(4)生產(chǎn)效率低等的缺點(diǎn)，所以作為工業(yè)上的制造方法未必是滿意的方法，因而，目前尋求一種工業(yè)上有利的順式-3-羥基-L-脯氨酸的制造方法。
本發(fā)明的目的在于，提供一個(gè)利用發(fā)酵法從廉價(jià)的糖源在工業(yè)上廉價(jià)生產(chǎn)出的L-脯氨酸為原料，通過(guò)直接用微生物或酶進(jìn)行羥基化處理后，以工業(yè)規(guī)模且方便地制造順式-3-羥基-L-脯氨酸的方法及用于該方法的L-脯氨酸3位羥基化酶。
按照本發(fā)明的方法，可以提供順式-3-羥基-L-脯氨酸的制造法及新的L-脯氨酸3位羥基化酶，其特征是將可在L-脯氨酸的3位上催化羥基化反應(yīng)的酶源、二價(jià)鐵離子、2-酮戊二酸及L-脯氨酸存在于水溶性介質(zhì)中，使得L-脯氨酸轉(zhuǎn)化成順式-3-羥基-L-脯氨酸，而后從該培養(yǎng)物中或該水溶性介質(zhì)中提取生成的順式-3-羥基-L-脯氨酸。
用于本發(fā)明的順式-3-羥基-L-脯氨酸制造法中的酶源，只要是在羥基化L-脯氨酸時(shí)，具有催化生成順式-3-羥基-L-脯氨酸的活性就可以，例如，微生物的培養(yǎng)物、菌體、菌體處理物、精制酶或粗酶中的任何一種均可。作為微生物的合適例子可舉出鏈霉菌(Streptomyces)屬、或者芽胞桿菌(Bacillus)屬的微生物。具體的可舉出灰色鏈霉菌(Streptomyces canus)ATCC 12647及ATCC 12646、鏈霉菌屬菌(Streptomyces sp.)TH1、芽胞桿菌屬菌(Bacillus sp.)TH2及TH3，或者這些菌株的繼代培養(yǎng)物、突變體或者衍生物等。
鏈霉菌屬菌(Streptomyces sp.)TH1是本發(fā)明者們從土壤中重新分離出的微生物。以下表示了鏈霉菌屬菌(Streptomyces sp.)TH1的菌學(xué)性質(zhì)。
關(guān)于本發(fā)明的微生物的保藏信息。
所述鏈霉菌屬菌(Streptomyces sp.)TH1在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號(hào)為CCTCC M94040。
所述芽胞桿菌屬菌(Bacillus sp.)TH2在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏編號(hào)為CCTCC M94041。
1.形態(tài)的性質(zhì)表示在表1中。
表1形態(tài)的性質(zhì)
2.培養(yǎng)的性質(zhì)
TH1株在一般使用的合成及天然培養(yǎng)基中顯示了普通的或旺盛的繁殖，基生菌絲呈淺桃色、橙色或綠褐色。根據(jù)不同培養(yǎng)基也可能產(chǎn)生茶色或者黑色的可溶性色素。
在各種培養(yǎng)基上，在28℃下進(jìn)行14天培養(yǎng)時(shí)的特征表示在表2-(1)及表2-(2)中。此外，顏色的表示是按照顏色協(xié)調(diào)手冊(cè)(Color Harmony Manual(Container Corporation of America))的顏色分類而進(jìn)行的。
表2-(1)培養(yǎng)上的性質(zhì)
表2-(2)培養(yǎng)上的性質(zhì)
3.生理學(xué)方面的性質(zhì)TH1株的生理學(xué)的性質(zhì)表示在表3中。繁殖溫度范圍是7天后的結(jié)果，其它是在28℃、2～3周后的結(jié)果。
表3生理學(xué)的性質(zhì)
4.化學(xué)分類學(xué)方面的性質(zhì)菌體中的二氨基庚二酸的旋光異構(gòu)體LL型以上，按形態(tài)是在氣菌絲上形成了螺旋狀的由10個(gè)以上胞子構(gòu)成的胞子鏈。按化學(xué)分類，細(xì)胞壁是I型(LL-二氨基庚二酸)，所以本菌株被分類為放線菌中的鏈霉菌屬。
將本菌株命名為鏈霉菌屬菌(Streptomyce ssp.)TH1，按照布達(dá)佩斯條約，平成5年9月1日寄存在工業(yè)技術(shù)院生物工程技術(shù)研究所，寄存號(hào)為FERM BP-4399。
芽胞桿菌屬菌(Bacillus sp.)TH2及TH3是本發(fā)明者從土壤中分離出的微生物。以下表示兩菌株的菌學(xué)性質(zhì)。
細(xì)胞的大小，TH2是1.5～1.8×3～4μm、TH3是1.2～1.5×3.5～4μm，DNA的堿基組成(G+C mol％)，TH2是36.46％、TH3是37.74％。此外，2株菌均具有以下的性質(zhì)。
1.形態(tài)的性質(zhì)TH2及TH3的形態(tài)的性質(zhì)示于表4。
表4形態(tài)性質(zhì)
2.培養(yǎng)方面的性質(zhì)在各種培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)14天后的繁殖及顏色特征表示在表5中。此外，顏色的表示是按照(Color Harmony Manual(Container Corporation of America))顏色分類進(jìn)行的。
表5培養(yǎng)方面的性質(zhì)
3.生理學(xué)性質(zhì)TH2及TH3的生理學(xué)性質(zhì)示于表6-(1)及表6-(2)中。
表6-(1)生理學(xué)性質(zhì)
(W弱)
表6-(2)酸及氣體的生成
+生成，-不生成
4.其它各種性質(zhì)表示在表7中，化學(xué)分類學(xué)性質(zhì)表示在表8中。
表7其它的各種性質(zhì)
+有，-無(wú)表8化學(xué)分類的性質(zhì)
將具有以上菌學(xué)性質(zhì)的菌與Bergey’s手冊(cè)(Bergey’s Manualof Systematic Bacteriology，Vol.2，1986年)上記載的相對(duì)應(yīng)。
從以上結(jié)果可以鑒定2個(gè)菌株均屬于芽胞桿菌(Bacillus)屬的細(xì)菌，分別命名為芽胞桿菌屬(Bacillus sp.)TH2、芽胞桿菌屬(Bacillus sp.)TH3，并根據(jù)布達(dá)佩斯條約平成5年9月1日寄存在工業(yè)技術(shù)院生物工程技術(shù)研究所，寄存號(hào)分別為FERM BP-4397及FERM BP-4398。
培養(yǎng)這些微生物的培養(yǎng)基，只要是含有可使微生物同化的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽類等，并能高效地培養(yǎng)具有以下催化活性的微生物的培養(yǎng)基，即具有使L-脯氨酸羥基化后，生成順式-3-羥基-L-脯氨酸反應(yīng)的催化活性的話，無(wú)論是天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基都可以。
作為碳源，只要是可使各種微生物同化的話都可以，例如可使用葡萄糖、果糖、蔗糖以及含有這些組分的糖蜜、淀粉或淀粉加水分解物等的碳水化合物、醋酸、丙酸等有機(jī)酸、乙醇、丙醇等的醇類。
作為氮源可以使用氨、氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、磷酸銨等的各種無(wú)機(jī)酸和有機(jī)酸的銨鹽、其它含氮化合物以及胨、肉浸汁、酵母浸汁、玉米淀粉汁(コ-ンスチ-プリカ-)、酪蛋白加水分解物、大豆渣子及大豆渣加水分解物、各種發(fā)酵菌體及其消化物等。
作為無(wú)機(jī)物可使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。
培養(yǎng)可在振蕩培養(yǎng)或者深部通氣攪拌培養(yǎng)等的需氧條件下進(jìn)行。培養(yǎng)的溫度是15-37℃，培養(yǎng)時(shí)間通常是16-96小時(shí)。
培養(yǎng)中的pH保持在5.0-9.0。pH的調(diào)節(jié)，可用無(wú)機(jī)或者有機(jī)的酸、堿溶液、尿素、碳酸鈣、氨等進(jìn)行調(diào)節(jié)。
作為菌體處理物可舉出菌體的干燥物、冷凍干燥物、表面活性劑和/或有機(jī)溶劑處理物、酶處理物、超聲波處理物、機(jī)械磨碎處理物、溶劑處理物、菌體的蛋白餾分、菌體及菌體處理物的固定化物等。另外也可以使用由該菌體萃取出的具有羥基化酶活性的酶，這些酶的精制標(biāo)樣、固定化物等。
另外，也可以使用從該菌體萃取得到的具有催化從L-脯氨酸向順式-3-羥基-L-脯氨酸的羥基化反應(yīng)活性的酶，這些酶的精制標(biāo)樣、固定物等。作為具有該活性的酶源可以舉出顯示下述(1)-(11)的理化性質(zhì)的L-脯氨酸3位羥基化酶。
該酶是具有(1)-(11)理化性質(zhì)的新的L-脯氨酸3位羥基化酶。
(1)作用及基質(zhì)特異性在2-酮戊二酸及二價(jià)鐵離子的存在下，與游離的L-脯氨酸作用后可生成順式-3-羥基-L-脯氨酸。
(2)最佳pH在30℃下，進(jìn)行20分鐘反應(yīng)，具有pH6.5-7.5的最佳pH。
(3)pH的穩(wěn)定性在4℃，進(jìn)行23小時(shí)處理，在pH 6.5-8.0的范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。
(4)最佳溫度在pH 7.0，反應(yīng)15分鐘，具有35-40℃的最佳溫度。
(5)溫度的穩(wěn)定性在pH 7.5、50℃下，處理30分鐘后，失活。
(6)阻礙劑用Zn++、Cu++、Co++及Ba++的金屬離子及乙二胺四乙酸(EDTA)進(jìn)行阻礙。
(7)活化活化時(shí)，不需要輔酶，向反應(yīng)液中添加L-抗壞血酸可以促進(jìn)反應(yīng)。
(8)Km值在100mM的N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)緩沖液(pH7.0)中含有5mM L-抗壞血酸、1mM硫酸亞鐵及酶標(biāo)準(zhǔn)樣品的反應(yīng)液中測(cè)得的，對(duì)于L-脯氨酸的Km值是0.49mM，對(duì)于2-酮戊二酸的Km值是0.11mM。
(9)等電點(diǎn)用Phast系統(tǒng)(Phast system；弗爾瑪西亞公司制)測(cè)定的等電點(diǎn)是4.3。
(10)分子量用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳法測(cè)定時(shí)，是35,000±5,000。
(11)N末端氨基酸序列具有用序列號(hào)1表示的N末端氨基酸序列。
(N末端)1 MetCysSerHisIleLeuGlyArgIIeGlu11LeuAspGlnGluArgLeuGlyArgAspLeu21GluTyrLeuAlaThrValProThrVal這些酶源在反應(yīng)液中的酶活性量是根據(jù)使用的基質(zhì)量等確定的，一般是1.0-10,000,000U/l、優(yōu)選的是1,000-2,000,000U/l。使用微生物的菌體及菌體處理物時(shí)，其濃度，通常以濕菌體計(jì)為1-300g/l。
用于反應(yīng)的L-脯氨酸的濃度是1mM-2M。
反應(yīng)時(shí)，需要二價(jià)鐵離子，通常使用1-100mM。作為使用的二價(jià)鐵離子，只要所含的二價(jià)鐵不阻礙反應(yīng)，使用任何種類的都可以。例如可舉出硫酸亞鐵等的硫化物、氯化亞鐵等的氯化物，碳酸亞鐵等之外，檸檬酸鹽、乳酸鹽、富馬酸鹽等之類的有機(jī)酸鹽。
另外，在反應(yīng)中需要2-酮戊二酸，可以向反應(yīng)液中添加酮戊二酸或也可以使用通過(guò)所用菌體及菌體處理物具有的代謝活性可轉(zhuǎn)換成2-酮戊二酸的化合物。這樣的化合物可舉出葡萄糖類的糖質(zhì)、谷氨酸、琥珀酸等。這些化合物可單獨(dú)使用，也可數(shù)種并用。
作為水溶性介質(zhì)，可舉出水、磷酸鹽、碳酸鹽、醋酸鹽、硼酸鹽、檸檬酸鹽、三羥甲基氨基甲烷等緩沖液(TRIS)、甲醇、乙醇等的醇類、醋酸乙酯等的酯類、丙酮等的酮類、乙酰胺等的酰胺類等。
反應(yīng)可在具有使L-脯氨酸羥基化后，可以生成順式-3-羥基-L-脯氨酸反應(yīng)的催化活性的上述微生物的培養(yǎng)物中進(jìn)行，也可以使用從該培養(yǎng)物分離出的菌體或者該菌體的處理物或者用精制酶和粗酶，在水介質(zhì)中進(jìn)行。
反應(yīng)通常是在溫度15-50℃、pH 6.0-9.0條件下，進(jìn)行1-96小時(shí)。
必要時(shí)，在菌體處理或反應(yīng)時(shí)，添加表面活性劑和有機(jī)溶劑。
作為表面活性劑可舉出聚氧化乙烯·硬脂酰胺(如萘明(ナイシ-ン)S-215、日本油脂社制等)、十六烷基三甲基銨·溴化物、陽(yáng)離子FB、陽(yáng)離子F2-40E等的陽(yáng)離子表面活性劑、油酰胺硫酸鈉、NureXT AB、臘披索爾(ラビゾ-ル)80等的陽(yáng)離子表面活性劑、聚氧化乙烯山梨糖醇酐·單硬脂酸酯(如，非離子ST 221)等兩性表面活性劑、其它叔胺PB、六癸基二甲胺等，只要是促進(jìn)反應(yīng)任何的都可以使用。使用的濃度通常為0.1-50mg/ml，優(yōu)選1-20mg/ml的濃度。
作為有機(jī)溶劑可以使用甲苯、二甲苯、脂肪醇、苯、醋酸乙酯等。使用的濃度通常是0.1-50μl/ml，優(yōu)選1-20μl/ml。
作為從培養(yǎng)物中或水溶性介質(zhì)中回收順式-3-羥基-L-脯氨酸的方法，可以使用離子交換樹(shù)脂等的柱色譜或結(jié)晶法等的通常分離方法。被回收的順式-3-羥基-L-脯氨酸可用13C-NMR譜、1H-NMR譜、質(zhì)譜、比旋光度等通常的分析手段確認(rèn)其結(jié)構(gòu)。
以下，說(shuō)明本發(fā)明的順式-3-羥基-L-脯氨酸的制取方法。
這種酶的制取方法是首先培養(yǎng)具有生產(chǎn)L-脯氨酸3位羥基化酶能力的微生物，在培養(yǎng)物中生成積蓄了L-脯氨酸3位羥基化酶，從該培養(yǎng)物中提取L-脯氨酸3位羥基化酶而得到。
只要是具有生產(chǎn)L-脯氨酸3位羥基化酶的微生物，無(wú)論是野生株、或其繼代培養(yǎng)物、突變體、誘變體等任何一種微生物都可以使用。適宜的例子有屬于鏈霉菌(Streptomyces)屬或芽胞桿菌(Bacillus)屬，而且具有生產(chǎn)L-脯氨酸3位羥基化酶能力的微生物。具體的可舉出上述的灰色鏈霉菌(Streptomyces canus)ATCC12647及ATCC 12646、鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)TH1、芽胞桿菌屬(Bacillus sp.)TH2及TH3、或者這些菌株的繼代培養(yǎng)物、突變體或誘變體。
培養(yǎng)這樣微生物的培養(yǎng)基，只要含有可同化微生物的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽類等，并且有效地培養(yǎng)具有生成L-脯氨酸3位羥基化酶能力的微生物，無(wú)論天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基都可以使用。
作為碳源可以使用各種可同化微生物的碳源，如葡萄糖、果糖、蔗糖、含有這些糖類的糖蜜、淀粉或者淀粉加水分解物等的碳水化合物、醋酸、丙酸等的有機(jī)酸、乙醇、丙醇等的醇類。
作為氮源可以使用氨、氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、磷酸銨等的各種無(wú)機(jī)酸和有機(jī)酸銨鹽、其它的含氮化合物以及胨、肉汁、酵母汁、玉米淀粉汁、酪蛋白加水分解物、大豆渣及大豆渣子加水分解物、各種發(fā)酵菌體及其消化物等。
作為無(wú)機(jī)物，可使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。
培養(yǎng)可在振蕩培養(yǎng)或者深部通氣攪拌培養(yǎng)等的需氧條件下進(jìn)行。培養(yǎng)的溫度是15-37℃，培養(yǎng)時(shí)間通常是16-96小時(shí)。
培養(yǎng)中的pH保持在5.0-9.0的調(diào)節(jié)，可用無(wú)機(jī)或者有機(jī)的酸、堿溶液、尿素、碳酸鈣、氨等進(jìn)行調(diào)節(jié)。
在培養(yǎng)時(shí)，根據(jù)需要也可添加L-脯氨酸。
在這樣得到的菌體中是否生成了L-脯氨酸3位羥基化酶，可通過(guò)向培養(yǎng)物中或在含有該菌體或菌體處理物的適合于酶反應(yīng)的水性介質(zhì)中加入L-脯氨酸、二價(jià)鐵離子及2-酮戊二酸，進(jìn)而需要時(shí)，添加表面活性劑和有機(jī)溶劑觀察是否使L-脯氨酸轉(zhuǎn)化成順式-3-羥基-L-脯氨酸而加以確定。
用此反應(yīng)來(lái)確認(rèn)順式-3-羥基-L-脯氨酸的生成，在菌體中確認(rèn)其生成的L-脯氨酸3位羥基化酶的活性，可用以下的方法測(cè)定。酶的活性，可用在下述測(cè)定條件下，把1分鐘內(nèi)生成1nmol的順式-3-羥基-L-脯氨酸的活性作為1個(gè)單位(U)來(lái)表示。
在含有5mM L-脯氨酸、5mM 2-酮戊二酸、1mM硫酸亞鐵及5mM L-抗壞血酸的100mM的TES緩沖溶液(pH7.0)中，添加酶標(biāo)品，合計(jì)100μl，在35℃下反應(yīng)10分鐘。在100℃下，加熱反應(yīng)液2分鐘，停止反應(yīng)后，用高速液相色譜定量測(cè)定在反應(yīng)液中生成的順式-3-羥基-L-脯氨酸。
定量時(shí)，只要是可以定量測(cè)定順式-3-羥基-L-脯氨酸的方法，采用任何的方法都可以。例如可舉出通常使用的高速液相色譜的后置柱衍生化法或者預(yù)先使用NBD氯化物(7-氯-4-硝基苯并-2-氧-1，3-二唑)使反應(yīng)液中的目的化合物NBD衍生化，將其放在使用高速液相色譜的逆相色譜上分離NBD衍生物后，使用熒光(激勵(lì)波長(zhǎng)503nm、熒光波長(zhǎng)541nm)進(jìn)行定量的方法(前置柱衍生物化法)等。再者，用前置柱衍生物化法的鑒定可以按照烏利姆·J.林德布拉特及羅伯特·F·狄蓋爾曼等人的方法〔(Analytical Biochemistry)、138、390、(1984)〕上的方法進(jìn)行。
從培養(yǎng)液離析精制酶時(shí)，可采用通常的酶的離析、精制法。例如，離心分離營(yíng)養(yǎng)液并集菌后，通過(guò)超聲波破碎和法式擠壓機(jī)、曼特高林機(jī)(マントンガウリン)、動(dòng)力磨等的機(jī)械破碎，得到無(wú)細(xì)胞提取液。將得到的離心沉淀后的上清液，通過(guò)進(jìn)行如用硫銨等的鹽析、DEAE(二乙胺乙基)-瓊脂糖等陰離子交換色譜層析、丁基纖維素、苯基纖維素等疏水性的色譜層析、使用分子篩的凝膠過(guò)濾法、等電點(diǎn)電泳等的電泳法等，可得到精制酶標(biāo)樣。得到酶標(biāo)樣的理化特征，可用通常酶學(xué)的方法鑒定。
用這種方法得到的L-脯氨酸3位羥基化酶具有下述(1)-(11)的理化性質(zhì)。
(1)作用及基質(zhì)特異性在2-酮戊二酸及二價(jià)鐵離子的存在下，作用在游離的L-脯氨酸后，可生成順式-3-羥基-L-脯氨酸。
(2)最佳pH在30℃下，反應(yīng)20分鐘時(shí)，具有最佳pH6.5-7.5。
(3)pH穩(wěn)定性在4℃下，進(jìn)行23小時(shí)處理，在pH6.5-8.0的范圍保持穩(wěn)定。
(4)最佳溫度在pH7.0、反應(yīng)15分鐘時(shí)，具有最佳溫度35-40℃。
(5)溫度穩(wěn)定性在pH7.5、50℃下處理30分鐘失活。
(6)阻礙劑由于Zn++、Cu++、Co++及Ba++的金屬離子及EDTA可受到阻礙。
(7)活化活化時(shí)，無(wú)必要使用輔酶。向反應(yīng)液中添加L-抗壞血酸可促進(jìn)反應(yīng)。
(8)Km值在100mM的TES緩沖溶液(pH7.0)中，含有L-抗壞血酸、1mM硫酸亞鐵及酶標(biāo)樣的反應(yīng)液中進(jìn)行測(cè)定的對(duì)于L-脯氨酸的Km值是0.49，對(duì)于2-酮戊二酸的Km值是0.11mM。
(9)等電點(diǎn)用Phast(Phast system；フルマミア社制)系統(tǒng)測(cè)定的等電點(diǎn)是4.3。
(10)分子量用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳法測(cè)定時(shí)是35,000±5,000。
(11)N末端氨基酸序列具有用序列號(hào)1表示的N末端氨基酸。
以下說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施例。
實(shí)施例1順式-3-羥基-L-脯氨酸的生成將SR3培養(yǎng)基〔含有葡萄糖1.0％、可溶性淀粉1.0％、酵母浸汁0.5％、胰胨0.5％、肉浸汁0.3％及磷酸鎂0.05％，用6N NaOH調(diào)節(jié)成pH 7.2的培養(yǎng)基〕，分別以10ml注入到試管(直徑25mm×200mm)中，在120℃下，殺菌20分鐘。在此培養(yǎng)基上用一鉑環(huán)移植在HT瓊脂平板培養(yǎng)基上〔含可溶性淀粉1％、NZ胺0.2％、酵母浸汁0.1％、肉浸汁0.1％及瓊脂1.5％，用6N NaOH調(diào)到pH7.2后，在120℃下，殺菌20分鐘的培養(yǎng)基〕繁殖的鏈霉菌(Strep-tomyces sp.)TH1，并在28℃下振蕩培養(yǎng)2天，作為種培養(yǎng)液使用。將本種培養(yǎng)液進(jìn)而分注到2升的三角燒瓶中，移植到在120℃下進(jìn)行20分鐘殺菌了的200ml的SR3培養(yǎng)基上，在28℃下振蕩培養(yǎng)2天。將此培養(yǎng)液無(wú)菌地接種到在5升的發(fā)酵缸中分注了2升的DF3培養(yǎng)基上〔含有可溶性淀粉5％、玉米淀粉汁3.0％、磷酸二氫鉀0.05％、硫酸鎂7水鹽0.05％及碳酸鈣0.5％，用6N NaOH調(diào)節(jié)為pH 7.0的培養(yǎng)基〕，并在700rpm、1vvm的條件下于28℃，培養(yǎng)2天。培養(yǎng)中不調(diào)節(jié)pH值。將得到的培養(yǎng)液用15000×g、4℃下離心分離10分鐘，每1升培養(yǎng)液得到75g濕菌體。在4℃下，用生理鹽水洗滌濕菌體，離心后至使用時(shí)為止要冷凍保持在-80℃下。
將得到的濕菌體1.0g懸浮在10ml的反應(yīng)液(a)中〔在含有5mM L-脯氨酸、5mM 2-酮戊二酸、5mM L-抗壞血酸及1mM硫酸亞鐵的100mM TES緩沖液(pH 7.5)中添加1.4％(v/v)奈明(ナイミ-ン)溶液而制成的(其奈明溶液是將4g奈明S-21J(日本油脂株式會(huì)社制)溶解在10ml二甲苯中的溶液)〕進(jìn)行懸浮，而后在30℃下，反應(yīng)5小時(shí)。
反應(yīng)后，從菌體反應(yīng)液離心除去菌體，對(duì)于上清液中生成的順式-3-羥基-L-脯氨酸進(jìn)行分析。
分析是在高速液相色譜上，使用后置柱衍生物化法，在以下的條件下分析。檢測(cè)是將目的化合物從柱中洗脫出后，在線上NBD衍生物化，使用NBD衍生物的熒光進(jìn)行的。
高速液相色譜分析條件〔1〕裝置島津制作所制高速液相色譜色譜紙束(chromatopack)CR6A系統(tǒng)控制器SCL-6B自動(dòng)注射器SIL-6B送液泵LC-6A柱烘箱CTO-6A化學(xué)反應(yīng)槽CRB-6A熒光檢測(cè)器RF-550A
〔2〕使用柱SUMCHIRAL OA5000(株式會(huì)社住化分析中心制)(直徑4.5mm×250mm)〔3〕分析條件1)移動(dòng)相1mM硫酸銅水溶液2)移動(dòng)相流速1.0ml/分3)柱溫度38℃4)緩沖液0.3M硼酸緩沖液(pH 9.6)25mM EDTA5)緩沖液流速0.2ml/分6)NBD氯化物溶液0.5g/l甲醇溶液7)上述溶液的流速0.5ml/分8)反應(yīng)溫度 60℃9)反應(yīng)時(shí)間 約3分10)檢測(cè)波長(zhǎng) 激勵(lì)波長(zhǎng)503nm熒光波長(zhǎng)541nm11)試樣 10μl其結(jié)果，在反應(yīng)液中生成了910μM(119mg/l)的順式-3-羥基-L-脯氨酸。
實(shí)施例2
順式-3-羥基-L-脯氨酸的精制將實(shí)施例1得到的濕菌體100g懸浮在1升的反應(yīng)液(a)中，在2升的燒杯中，邊攪拌，邊在30℃下反應(yīng)5小時(shí)。
反應(yīng)后，對(duì)于從菌體反應(yīng)液離心除去菌體的上清液中生成的順式-3-羥基-L-脯氨酸進(jìn)行分析，其結(jié)果，反應(yīng)液中生成了809μM(106mg/l)的順式-3-羥基-L-脯氨酸。將反應(yīng)上清液調(diào)節(jié)pH為4.5后使其通過(guò)裝有200ml迪阿翁離子交換樹(shù)脂SKIB(NH4+型、三菱化成社制)的塔內(nèi)。在減壓下濃縮出含有順式-3-羥基-L-脯氨酸餾分后，通過(guò)含有迪阿翁離子交換樹(shù)脂PA412(OH-型、三菱化成社制)20ml的塔。減壓濃縮含有順式-3-羥基-L-脯氨酸餾分后，使pH值調(diào)節(jié)到9.6后，加入10％體積的鄰苯二甲醛溶液(0.075g/ml乙醇溶液)及2％體積的β-巰基乙醇溶液(10％v/v水溶液)，在60℃下，保持5分鐘，使夾雜的直鏈(一級(jí))氨基酸進(jìn)行鄰位苯二甲醛化。再通過(guò)含有10ml的分離珠離子交換樹(shù)脂SP207(三菱化成社制)，分離鄰位苯二甲醛化的夾雜一級(jí)氨基酸和順式-3-羥基-L-脯氨酸。減壓濃縮含有順式-3-羥基-L-脯氨酸餾分后，再次通入含有20ml迪阿翁離子交換樹(shù)脂PA412(OH-型、三菱化成社制)的塔中，得到含有順式-3-羥基-L-脯氨酸的餾分。干燥此餾分，得到順式-3-羥基-L-脯氨酸的白色結(jié)晶68mg(收率63％)。
上述化合物的理化性質(zhì)如下。
比旋光度〔α〕D21＝-93.4°(C＝0.503、H2O)FAB-質(zhì)譜132(M+H)+13C-NMR譜(D2O、125MHz)ppm33.9、44.5、68.3、71.6、171.31H-NMR譜(D2O、500MHz)ppm2.18(1H)、2.27(1H)、3.52(1H)、3.62(1H)、4.18(1H)、4.77(1H)上述的用比旋光度、質(zhì)譜測(cè)定的分子量、1H-NMR譜、13C-NMR譜等的分析結(jié)果，與文獻(xiàn)記載的數(shù)值是相一致的〔the Jour-nal of Biological Chemistry(J.Biol.Chem.)、241、1300(1966)〕〔Journal of Antibiotics、45、824(1992)〕及按照文獻(xiàn)記載的方法合成的化學(xué)合成順式-3-羥基-L-脯氨酸〔(Liebigs Ann.Chem)、1881、(1979)〕〔四面體(Tetrahedron)、42、2421、(1986)〕。
實(shí)施例3順式-3-羥基-L-脯氨酸的生成使用灰色鏈霉菌(Streptomyces canus)ATCC 12647及ATCC12646、芽胞桿菌屬(Bacillus sp.)TH2及TH3進(jìn)行L-脯氨酸的羥基化。
將SR3培養(yǎng)基〔含有葡萄糖1.0％、可溶性淀粉1.0％、酵母浸汁0.5％，胰蛋白胨0.5％，肉浸汁0.3％以及磷酸鎂0.05％，并用6N NaOH調(diào)節(jié)至pH 7.2的培養(yǎng)基〕，各以10ml分注到試管(直徑25mm×200mm)中，在120℃下，進(jìn)行20分鐘殺菌。而后用一鉑環(huán)將生長(zhǎng)在HT瓊脂培養(yǎng)基上的各菌株移植在此培養(yǎng)基上，在28℃、振蕩培養(yǎng)1天，作為種培養(yǎng)液使用。
另一方面，將Df4培養(yǎng)基〔含有甘油2.5％、葡萄糖2.5％、大豆粉1.5％、磷酸二氫鉀0.05％、硫酸鎂7水合鹽0.05％、碳酸鈣0.5％，并用6N NaOH調(diào)節(jié)pH為7.0的培養(yǎng)基〕，各以10ml分注到試管(直徑25mm×200mm)中，在120℃下，殺菌20分鐘。在此培養(yǎng)基上無(wú)菌地接種種培養(yǎng)液1ml，在28℃下，振蕩培養(yǎng)1天。得到的培養(yǎng)液2ml用15000×g、4℃下離心分離10分鐘。而后用80mM TES緩沖液(pH7.5)洗滌得到的菌體后，離心分離。把得到的濕菌體懸浮在1ml的反應(yīng)液(a)中，在30℃下，進(jìn)行3小時(shí)反應(yīng)。
其結(jié)果，在反應(yīng)液中分別生成了242μM、202μM、318μM、141μM的順式-3-羥基-L-脯氨酸。
實(shí)施例4順式-3-羥基-L-脯氨酸的生成將芽胞桿菌屬菌(Bacillus，sp)TH2及TH3使用添加了L-脯氨酸1g/l的Df2培養(yǎng)基〔含有可溶性淀粉5％、干燥酵母1.5％、磷酸二氫鉀0.05％、硫酸鎂7水合鹽0.05％、碳酸鈣0.5％，用6NNaOH調(diào)節(jié)為pH7.0的培養(yǎng)基〕代替Df4培養(yǎng)基，與實(shí)施例3同樣地進(jìn)行1天種培養(yǎng)，在Df2培養(yǎng)基上進(jìn)行1天培養(yǎng)。其結(jié)果，在培養(yǎng)液的上清液中生成TH2株745μM(97.6mg/l)、TH3株327μM(42.8mg/l)的順式-3-羥基-L-脯氨酸。
實(shí)施例5L-脯氨酸3位羥基化酶的離析精制(1)無(wú)細(xì)胞提取液的配制將由實(shí)施例2得到的冷凍菌體30g溶解后，在冰冷下懸浮在200ml的緩沖液(A)中〔含有1mM二硫蘇糖醇(DTT)、0.2mMEDTA、0.1％(V/V)吐溫(Tween 20)及10％(V/V)甘油的20mM哌嗪緩沖液(用6N HCl調(diào)節(jié)pH為5.3)〕，在冰冷下，用超聲波破碎懸浮液中的菌體，在4℃下，用30000×g進(jìn)行30分鐘離心后得到上清液。
以后的操作均在冰冷乃至4℃下進(jìn)行。
(2)用柱色譜進(jìn)行離析及精制(2)-1.酸處理將由上述工序得到的上清液的pH用6N鹽酸調(diào)節(jié)到4.5后，用15,000×g，進(jìn)行30分鐘離心、分離除去生成的沉淀，得到上清液。
(2)-2.RESOURCE Q柱色譜(I)將由上述工序得到的上清液，通過(guò)裝有用緩沖液(A)進(jìn)行平衡的弗爾瑪西亞社制的RESOURCE Q柱(RESOURCETMQ，6ml)的柱。用緩沖液(A)洗滌后，用在緩沖液(A)中制定的從0-0.3M間的食鹽直線濃度梯度溶液，洗脫出含該酶的餾分。
(2)-3.RESOURCE Q柱色譜(II)將由上述工序得到的活性餾分用緩沖液(B)〔含有1mMDTT、0.2mM EDTA及10％(V/V)甘油的20mM TES緩沖液(pH調(diào)節(jié)為7.5)〕稀釋3倍后，通過(guò)裝有用緩沖液(B)平衡的弗爾瑪西亞社制的RESOURCE Q柱(RESOURCETMQ，1ml)的塔。用緩沖液(B)洗滌后，使用在緩沖液(B)中制定的從0-0.3M間的食鹽線性濃度梯度溶液，洗脫出含該酶的餾分。
(2)-4.苯基瓊脂糖色譜在上述工序得到的活性餾分中，添加、溶解食鹽，使食鹽濃度達(dá)到2M，并使其通過(guò)裝有用含2M食鹽的緩沖液(B)平衡的苯基瓊脂糖柱(Phenyl Sepharose HP Hiload，1ml)的塔。用含2M食鹽緩沖液(B)洗滌后，使用含0.1％(V/V)吐溫20(Tween 20)緩沖液(B)洗脫出含該酶的餾分。
(2)-5.RESOURCE Q柱色譜(III)對(duì)于上述工序得到的活性餾分，使用以緩沖液(A)平衡的弗爾瑪西亞社制PD-10柱脫鹽后，通過(guò)裝有用緩沖液(A)平衡的弗爾瑪西亞社制的RESOURCE Q柱(RESOURCETMQ，1ml)的塔。用緩沖液(A)洗滌后，使用在緩沖液(A)中制得的從0-0.3M間的食鹽的直線濃度梯度溶液，洗脫出含該酶的餾分。
(2)-6.RESOURCE Q柱色譜(IV)
將由上述工序得到的活性餾分，用含0.1％(V/V)吐溫20(Tween 20)的緩沖液(B)稀釋3倍后，通過(guò)裝有用緩沖液(B)平衡的弗爾瑪西亞社制的柱(RESOURCETMQ，1ml)的柱。用緩沖液(B)洗滌后，使用在緩沖液(B)中制得的從0-0.3M間的食鹽直線濃度梯度溶液，洗脫出含該酶的餾分。
L-脯氨酸3位羥基化酶的離析及精制的概要總結(jié)在表9中表9L-脯氨酸3位羥基化酶的離析及精制的概要
實(shí)施例6L-脯氨酸3位羥基化酶的性質(zhì)(1)電泳分析用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳法(使用ATTO社制聚丙烯酰胺PAGEL NPU-12.5L及BIORAD社制分子量標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE Molecular Weight Standard Broad Range)分析實(shí)施例5得到的精制酶標(biāo)樣。其結(jié)果，明顯地看出該酶是由分子量35000±5000大致均一的亞單位構(gòu)成的。
(2)關(guān)于酶反應(yīng)的性質(zhì)使用以下的反應(yīng)液，通過(guò)進(jìn)行反應(yīng)成分基質(zhì)省略試驗(yàn)(Omis-sion test)及添加物試驗(yàn)研究L-脯氨酸3位羥基化酶反應(yīng)的必需化合物、促進(jìn)化合物、阻礙化合物。
基本反應(yīng)液組成是含有5mM L-脯氨酸、5mM 2-酮戊二酸、1mM硫酸亞鐵、5mM L-抗壞血酸及酶標(biāo)樣的100mM的TES緩沖液(pH 7.0)，總計(jì)液量為100μl。通過(guò)添加酶開(kāi)始反應(yīng)，在35℃下反應(yīng)10分鐘。反應(yīng)液在100℃下加熱2分鐘，停止反應(yīng)后，按照前置柱衍生物化法，使用高速液相色譜定量在反應(yīng)液中生成的順式-3-羥基-L-脯氨酸。向100μl反應(yīng)液中添加0.3M硼酸緩沖液(pH 10.7)100μl、10％(V/V)巰基乙醇水溶液4μl及5％(W/V)鄰苯二甲醛的乙醇溶液16μl，在60℃下放置30秒。進(jìn)而加入2％(W/V)NBD氯化物的乙醇溶液50μl，在60℃下反應(yīng)40分鐘。加入1N鹽酸30μl停止反應(yīng)后，通過(guò)離心、過(guò)濾除去沉淀后，用高速液相色譜進(jìn)行分析，定量生成的順式-3-羥基-L-脯氨酸。
在以下條件進(jìn)行高速液相色譜分析移動(dòng)相10mM檸檬酸(pH4.0)/甲醇＝3/1(V/V)流速1ml/分柱YMC Pack ODS AQ-312(YMC社制、6×150mm)柱溫度50℃檢測(cè)熒光檢測(cè)、激勵(lì)波長(zhǎng)503nm、熒光波長(zhǎng)541nm從其結(jié)果可看出，在L-脯氨酸3位羥基化時(shí)，L-脯氨酸、2-酮戊二酸、Fe++離子是必需的，L-抗壞血酸有促進(jìn)反應(yīng)的作用，另外，Zn++、Cu++、Co++及Ba++離子及EDTA的添加可阻礙反應(yīng)。
其結(jié)果表示在表10中。
表10酶反應(yīng)成分的研究
1)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)液成分是含有5mM L-脯氨酸、5mM 2-酮戊二酸、1mM硫酸亞鐵、5mM L-抗壞血酸及酶標(biāo)樣的100mM TES緩沖液，pH是7.0，液量總計(jì)100μl。反應(yīng)是在35℃下進(jìn)行10分鐘。
2)添加物(+)，在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)液中添加以表中+表示的化合物進(jìn)行反應(yīng)。無(wú)添加(-)，從標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)液中除去以表中-表示的化合物進(jìn)行反應(yīng)，表中表示的濃度是反應(yīng)液的濃度。
3)活性，以標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)液的活性作為100表示其相對(duì)值。
(3)最佳pH在L-脯氨酸3位羥基化酶活性測(cè)定法中，用下述緩沖液置換反應(yīng)液中的緩沖液成分，進(jìn)行反應(yīng)，即pH 5.5-6.0時(shí)，用MES〔2-(N-嗎啉)乙磺酸〕緩沖液、pH6.5-7.5時(shí)，用PIPES〔哌嗪-N，N’-雙(2-乙磺酸)〕緩沖液、pH7.0-8.0時(shí)，用TES緩沖液、pH8.0-9.0時(shí)，用TAPS〔N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸)〕緩沖液進(jìn)行反應(yīng)的結(jié)果，pH為6.5-7.5時(shí)顯示了最高活性的80％以上。其結(jié)果表示在表11中。
表11反應(yīng)的最佳pH
1)活性是對(duì)最高活性作為100時(shí)的相對(duì)活性(4)pH穩(wěn)定性緩沖液(B)中的本發(fā)明的酶液用100mM緩沖液〔pH 5.5-6.5時(shí)，用MES緩沖液、pH 6.1-7.5時(shí)，用PIPES緩沖液、pH 7.0-8.0時(shí)，用TES緩沖液、pH 8.0-9.0時(shí)，用TAPS緩沖液〕稀釋3倍，在4℃，保持23小時(shí)后，測(cè)定活性。pH范圍保持在6.5-8.0范圍的酶具有保持前面的活性的80％以上的活性，說(shuō)明pH在6.5-8.0的范圍內(nèi)活性保持穩(wěn)定。
(5)最佳溫度在測(cè)定L-脯氨酸3位羥基化酶的活性時(shí)，在15-50℃的溫度范圍內(nèi)，進(jìn)行15分鐘反應(yīng)，其結(jié)果顯示出在35-40℃時(shí)，有最高活性的80％以上的活性。結(jié)果表示在表12中。
表12反應(yīng)的最佳溫度
1)活性是以最高活性為100時(shí)的相對(duì)活性表示的(6)溫度的穩(wěn)定性將本發(fā)明的酶在緩沖液(B)中，在0-60℃的溫度范圍內(nèi)保持30分鐘后，測(cè)定其活性。結(jié)果表明，本發(fā)明酶在50℃下，處理30分鐘完全失活。
(7)Km值在含有100mM TES緩沖液(pH 7.0)、1mM硫酸亞鐵、5mML-抗壞血酸及酶標(biāo)樣反應(yīng)液中測(cè)定，對(duì)于L-脯氨酸的Km值是0.49mM，對(duì)于2-酮戊二酸Km值是0.11mM。
(8)等電點(diǎn)用Phast系統(tǒng)(Phast system；弗爾瑪西亞社制)測(cè)定等電點(diǎn)的結(jié)果，等電點(diǎn)是4.3。
(9)N末端氨基酸序列使用Protein sequencer model PPSQ-10(島津制作所社制)分析本發(fā)明酶蛋白的N末端氨基酸序列，得到以下結(jié)果(N末端)1 MetCysSerHisIIeLeuGlyArgIIeGlu11LeuAspGlnGluArgLeuGlyArgAspLeu21GluTyrLeuAlaThrValProThrVal(序列號(hào)1)實(shí)施例7L-脯氨酸的羥基化使用實(shí)施例5得到的精制酶標(biāo)樣進(jìn)行L-脯氨酸的羥基化。
使用含有20mM 2-酮戊二酸、20mM L-脯氨酸、5mM L-抗壞血酸、1mM硫酸亞鐵及106U的精制酶標(biāo)樣的200mM TES緩沖液(pH 7.0)100μl，在35℃反應(yīng)30分鐘。其結(jié)果，在反應(yīng)液中生成18mM(2.4g/l)的順式-3-羥基-L-脯氨酸。
序列表序列號(hào)1序列長(zhǎng)度 29序列類型 氨基酸拓譜學(xué)直鏈狀序列的種類肽起源 鏈霉菌屬(Streptomyces sp)株名 TH1(FERM BP-4399)序列Met Cys Ser His IIe Leu Gly Arg IIe Glu Leu Asp Gln Glu Arg Leu Gly1 5 10 15Arg Asp Leu Glu Tyr Leu Ala Thr Val Pro Thr Val20 25根據(jù)本發(fā)明，可以提供對(duì)于用發(fā)酵法從糖源工業(yè)性地生產(chǎn)的L-脯氨酸，通過(guò)微生物或酶的直接羥基化，在工業(yè)上有效地制造順式-3-羥基-L-脯氨酸的方法以及用于該方法的有用的新的L-脯氨酸羥基化酶。
權(quán)利要求
1.保藏編號(hào)為CCTCC M94041的芽胞桿菌屬菌(Bacillus sp.)TH2菌株。
全文摘要
本發(fā)明提供一種微生物，該微生物具有催化從L－脯氨酸生成順式－3－羥基－L－脯氨酸的反應(yīng)的活性，并屬于芽胞桿菌屬(Bacillus)。
文檔編號(hào)C12R1/07GK1990855SQ200610164019
公開(kāi)日2007年7月4日 申請(qǐng)日期1994年9月5日 優(yōu)先權(quán)日1993年9月7日
發(fā)明者尾崎明夫, 森英郎, 柴崎剛, 安藤勝?gòu)? 落合惠子, 千葉繁, 宇於崎洋一 申請(qǐng)人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會(huì)社