專利名稱：診斷性傳染病致病原的新穎方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一個用于診斷性傳染病致病原的方法，本發(fā)明另外關(guān)于用來增殖及鑒定性傳染病致病原的聚核苷酸。
背景技術(shù)：
性傳染病(sexually transmitted diseases，STDs)是世界上一個重要的健康問題。在開發(fā)中國家，性傳染病呈現(xiàn)出一些問題，例如較高的發(fā)生率及盛行率、抗藥性的比例已到令人擔(dān)憂的程度、高比例的嚴(yán)重并發(fā)癥及與人類免疫缺乏病毒(HIV)感染的交互作用等。而針對傳統(tǒng)的傳染病，如淋病、披衣菌感染及梅毒等的診斷及治療，在這些國家中也是普遍缺乏的。
尤其發(fā)生在婦女的其它并發(fā)癥，例如骨盆發(fā)炎、子宮外孕、不孕及子宮頸癌等，都是嚴(yán)重的健康及社會問題。在大部分的發(fā)展中國家，其STDs的發(fā)生率及盛行率可能是已開發(fā)國家的二十倍以上。點(diǎn)盛行率的研究，在開發(fā)中國家已被廣泛的應(yīng)用。這樣的信息雖然有用但卻有限制，因?yàn)槠浯蟛糠质怯筛呶ｋU(xiǎn)的個人或病人所獲得，因此無法完整的呈現(xiàn)整個族群。雖然開發(fā)中國家是一個異源性的社會，但其至少有一個共同的特質(zhì)，即相較于已開發(fā)國家，在開發(fā)中國家的社會，STDs預(yù)期會發(fā)生在20歲到40歲的族群，這樣的后果在開發(fā)中國家不僅會造成STDs有較高的絕對發(fā)生率，而且在未來也可能會有惡化的情況。
STDs可再分為可治愈與不可治愈兩類，可治愈的STDs有奈瑟氏淋病雙球菌(Neisseria gonorrhoeae)、砂眼披衣菌(Chlamydia trachomatis)、鉤端螺旋體(Treponemapallidum)，及陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)的感染，而不可治愈的STDs是病毒性的來源，例如HIV、單純皰疹病毒(HSV)、人類乳突瘤病毒(HPV)及B型肝炎病毒等。
世界衛(wèi)生組織(WHO)曾負(fù)責(zé)調(diào)查STDs及HIV感染的問題，其估計(jì)成人感染STDs一年總共有3.33億的新生病例，而這些新生病例中，有一千兩百萬是梅毒，六千兩百萬是淋病，八千九百萬是披衣菌感染，以及一億七千萬的滴蟲病，這些還不包括WHO之前估計(jì)的每年三千萬的生殖器乳突瘤病毒感染及兩千萬的皰疹型感染等。在STDs中，生殖器潰瘍有相對較高的發(fā)生頻率，而在發(fā)展中國家，梅毒所造成的軟性下疳則是造成生殖器潰瘍的主要原因。STDs主要集中于東南亞及亞撒哈拉非洲地區(qū)(sub-Saharan Africa)，在1995年時，分別有大約一億五千萬及六千四百萬的新生病例。
砂眼披衣菌(C.trachomatis或CT)和奈瑟氏淋病雙球菌(N.gonorrhoeae或NG)是兩種最常見的性傳染病感染原，根據(jù)WTO的資料顯示，全球感染CT的個案每年增加四百萬到一千萬，而NG的感染則增加三至四百萬。
砂眼披衣菌(CT)是胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性菌，共有十五種血清型，分別會引起不同的疾病，其中血清型D到K會造成男女的性病，在臨床上，CT會造成淋巴肉芽腫及男女生殖系統(tǒng)的發(fā)炎，而曾感染五億人的慢性病-砂眼，則可能會造成失明，如果沒有早期的診斷和治療，CT引起的尿道炎及子宮頸炎，可能會導(dǎo)致種種的慢性發(fā)炎，例如陰道炎、輸卵管炎及骨盆發(fā)炎等，這些可能造成不孕及子宮外孕。此外，如果母親已染病的話，生產(chǎn)時可能會造成新生兒的肺部及(或)眼睛感染。
目前在臨床研究上有許多CT的診斷方法，例如細(xì)胞培養(yǎng)、直接免疫螢光抗體分析及酶免疫分析。然而，隨著技術(shù)的進(jìn)展，目前的診斷模式則是利用DNA探針直接或結(jié)合核酸擴(kuò)增并用DNA探針確認(rèn)。雖然細(xì)胞培養(yǎng)是CT診斷的標(biāo)準(zhǔn)方法，然而，使用核酸擴(kuò)增及DNA探針的結(jié)果，證明了其敏感性及特異性較傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)法好。
奈瑟氏淋病雙球菌(NG)是淋病的致病原，屬革蘭氏陰性雙球菌，會造成男性的尿道化膿發(fā)炎及腫脹，80％的感染者會有這些癥狀，且在感染后2-7天發(fā)作，如果不作治療，感染會升高，且在幾周后會出現(xiàn)攝護(hù)腺炎的癥狀。
在女性，80％的感染者沒有或僅有輕微的癥狀，初期是感染子宮頸及尿道，有20％會擴(kuò)散到輸卵管并導(dǎo)致不孕。因?yàn)楦腥镜倪^程通常沒有癥狀，因此很多帶原者會在不知不覺中散布這項(xiàng)疾病。
NG的診斷初步會使用選擇性培養(yǎng)基來篩選致病原，或用革蘭氏染色來觀察其雙球菌的形態(tài)，雖然臨床上使用培養(yǎng)的方法有很好的敏感性，但其僅適用于理想的狀況，不當(dāng)?shù)膬Υ婕斑\(yùn)送都可能造成樣品中的致病原滅失及偽陽性的結(jié)果，其中偽陽性的結(jié)果可能是由于粗糙地的取樣技術(shù)、不適當(dāng)?shù)娜硬馁|(zhì)及人體中的一些致病原抑制物質(zhì)。目前，針對奈瑟氏淋病雙球菌常用的診斷模式是包括無培養(yǎng)的核酸擴(kuò)增及DNA探針的確認(rèn)。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明簡述本發(fā)明提供了一個鑒定性傳染病不同致病原的方法，其包括(a)以一組引物同步擴(kuò)增不同致病菌的DNA片段；(b)以不同的特定探針和擴(kuò)增的DNA片段雜交；及(c)確認(rèn)雜交的產(chǎn)物。
本發(fā)明同時提供一個設(shè)計(jì)引物組的流程，以用于同步擴(kuò)增不同性傳染病致病原的DNA片段，其包括(a)在微生物的基因組中找出一段保守區(qū)域；(b)將這些微生物的保守區(qū)域的序列排列；(c)從保守區(qū)域內(nèi)找出目標(biāo)片段，其中該片段的兩端序列在這些微生物中是一樣的，且此片段中必須含有差異的序列，以用來鑒定微生物；(d)選擇目標(biāo)片段兩端的序列當(dāng)引物組；(e)定義正向及反向的引物，即正向引物在這些微生物中均為正向的引物，同樣的，反向引物在這些微生物中均為反向的引物；(f)選擇目標(biāo)片段中差異的部分當(dāng)作探針序列。本發(fā)明同時提供一組引物，用以擴(kuò)增奈瑟氏淋病雙球菌及砂眼披衣菌的DNA片段，其序列為5’-CGCGAAGAACCTTACCTGGTTTTGACATG-3’及5’-GGCAACTAATGACAAGGGTTGCGCTC-3’。本發(fā)明亦提供一個探針序列，用以鑒定擴(kuò)增后的DNA片段，其包括(a)針對砂眼披衣菌的5’-AATGTCGTTTTCCGCAAGGACATAT-3’；及(b)針對奈瑟氏淋病雙球菌的5’-CGGAGGAGTGCCTTCGGGAGCCGTA-3，。本發(fā)明更進(jìn)一步提供一個試劑盒用以檢測奈瑟氏淋病雙球菌及砂眼披衣菌，其中包含一組引物用以擴(kuò)增DNA，及一段探針序列以鑒定擴(kuò)增的DNA片段。
發(fā)明詳述用于本公開內(nèi)容及申請專利范圍之專有名詞，定義如下核苷酸是核酸的次單元體，其由磷酸、五碳糖與含氮堿基所組成，其中五碳糖在RNA的是核糖，而DNA的則是去氧核糖。此專有名詞同時包含其類似物。
核酸探針一段單股的核酸序列，可以和單股的互補(bǔ)序列結(jié)合形成雙股的分子，一段核酸探針可能是一段寡核苷酸或一個核苷酸的聚合物。
雜交核酸的兩個互補(bǔ)股結(jié)合而形成雙股分子的過程。
探針特異性為探針的特性，其能夠區(qū)別目標(biāo)及非目標(biāo)的序列。根據(jù)序列及分析條件，探針特異性可能是絕對的(例如探針可以區(qū)別目標(biāo)及非目標(biāo)生物)，或者它可以是功能性(例如探針可以在某一樣品中，區(qū)別出目標(biāo)生物與其它生物)，而根據(jù)使用的條件，探針序列可有或廣或窄的特異性。
變異區(qū)域在目標(biāo)及非目標(biāo)生物的核苷酸序列中，至少相差一個堿基的部分。
保守區(qū)域非變異的區(qū)域本發(fā)明是關(guān)于鑒定性傳染病(STD)不同致病原的方法，其包括(a)以一組引物同步擴(kuò)增不同致病原的DNA片段，(b)以不同的特異探針與擴(kuò)增后的DNA片段雜交；及(c)確認(rèn)雜交的產(chǎn)物。性傳染病的致病原是選自細(xì)菌、病毒、真菌、立克次體及披衣菌。使用本方法，可以從一個檢體中檢測出不同的致病原。
本方法僅包含一次的DNA擴(kuò)增及特異性雜交，DNA擴(kuò)增的步驟中有一組新穎的引物，此引物是從不同致病原的基因組的保守區(qū)域中所設(shè)計(jì)出來，可用于同步擴(kuò)增STDs所有致病原的DNA片段，而保守區(qū)域是選自5S rRNA基因，16S rRNA基因，23S rRNA基因，5.0S rRNA基因，5.8S rRNA基因，18S rRNA基因，28S rRNA基因，類16S RNA基因，及類23S rRNA基因。特異性雜交的步驟中包括數(shù)個特定引物，而這些特定引物是根據(jù)保守區(qū)域中的變異部分所設(shè)計(jì)出來，用以鑒定擴(kuò)增的DNA片段。
引物及探針的設(shè)計(jì)敘述如下用來擴(kuò)增性傳染病不同致病原DNA片段的引物組，其設(shè)計(jì)步驟包括(a)在不同致病原的基因組中選出一個保守區(qū)域；(b)將不同致病原中保守區(qū)域的序列排列；(c)從保守區(qū)域內(nèi)找出一個目標(biāo)片段，其中該片段的兩端序列在不同致病原中是一樣的，且此片段中必須含有不同的序列，以用來鑒定不同的致病原；(d)將目標(biāo)片段的兩端序列選為引物；(e)規(guī)定正向及反向引物，即正向引物的序列，在不同的致病原間均同為正向的引物，而反向引物的序列，在不同的致病原間均同為反向的引物；(f)將目標(biāo)片段中不同的部分選為該致病原的特異探針。
首先，從STDs的致病原中選出我們想檢測的數(shù)個致病原，例如砂眼披衣菌/奈瑟氏淋病雙球菌，砂眼披衣菌/鉤端螺旋體，或砂眼披衣菌/奈瑟氏淋病雙球菌/鉤端螺旋體，性傳染病的致病原包括細(xì)菌、病毒、真菌、立克次體及披衣菌。用生物信息軟件，如DNAsis將選出來的致病原的核酸序列排列，為節(jié)省排列時間，我們可以選擇已知帶有高保守序列的某些基因或DNA區(qū)域，例如rRNA基因。除了病毒之外，所有原核生物都有rRNA，包括5S rRNA，16S rRNA，及較大的23S rRNA，真核生物已知有5.0S，5.8S，18S及28S rRNA或類似的結(jié)構(gòu)。(使用“類16S”一詞有時是慣指發(fā)現(xiàn)于核糖體小次單位中的rRNA分子，包括18S及17S rRNA。同樣地，“類23S”及“類5S”亦慣指發(fā)現(xiàn)于核糖體大次單位中的rRNA分子。5.8S rRNA等于是類23S rRNA的5’端)。這些rRNA分子中的核苷酸序列在檢測的所有生物中是高度保守的。
盡管這些rRNA有高度的保守性，仍然可以在一些區(qū)域中發(fā)現(xiàn)序列的差異，而這些差異甚至存在于相近的物種之間，因此可以用來區(qū)分這些生物。這些rRNA基因的差異并不是隨機(jī)的遍布于基因中，而是集中于特定的區(qū)域。而保守的程度也各不相同，創(chuàng)造出遍布核糖體RNA次單位的獨(dú)特保守模式，其差異的程度及分布可以用來分析診斷探針的目標(biāo)位置。
將致病原中所選的DNA序列排列，以篩選出存在這些致病原中的保守區(qū)域，從這些篩選出的保守區(qū)域中，我們找到一個區(qū)域，其兩端序列在所選的致病原中是一樣的，而兩端之間則含有變異的區(qū)域。保守區(qū)域兩端的序列不需要完全一樣，更明確的說，一端的序列可與另一端的不同；然而，保守區(qū)域一端的序列，在所選的致病原間必需是相同的。
從保守區(qū)域的兩端，我們選擇適當(dāng)長度的核苷酸來設(shè)計(jì)引物組，包括正向及反向的引物。規(guī)定正向及反向引物，其中在一致病原的正向引物序列與另一致病源的正向引物相同，而在一致病原的反向引物序列與另一致病源的反向引物相同，根據(jù)描述的步驟，設(shè)計(jì)的引物組可以用來擴(kuò)增所有選用的致病原。
從保守區(qū)域兩端中間的變異區(qū)，我們選擇一段獨(dú)特的核苷酸片段，且此片段是特異于每一株選用的致病原，選擇此獨(dú)特核苷酸片段的適當(dāng)長度來設(shè)計(jì)探針，每一個設(shè)計(jì)的探針都高度特異于其相對的致病原，因此，當(dāng)檢體中致病原的DNA擴(kuò)增完之后，藉由特異的探針與擴(kuò)增的DNA雜交，我們可以診斷出探針特異的致病原是否存在于檢體之中。
DNA擴(kuò)增的步驟是熟知的技術(shù)，但不局限于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，TMA，滾環(huán)擴(kuò)增，基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)及鏈置換擴(kuò)增(SDA)等。熟知此技術(shù)者當(dāng)知使用某些擴(kuò)增技術(shù)時，引物可能需要修飾，例如SDA所用的引物，其5’端有額外核苷酸組成的限制內(nèi)切酶辨識位。同樣的，NASBA所使用的引物，其5’端有一段額外的核苷酸組成的RNA聚合酶激活子，因此，多核苷酸的修飾也涵蓋在本發(fā)明的范疇。
因?yàn)槭熘隧?xiàng)技術(shù)，當(dāng)選擇擴(kuò)增反應(yīng)的引物時，必須考慮某些準(zhǔn)則，例如當(dāng)一對引物用來作擴(kuò)增反應(yīng)時，其形成3’雙鏈體的可能性要最小，如此其熔鏈溫度就足以相仿于最佳的復(fù)性條件，且將非特異復(fù)性的量降到最低。
本文中，根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸是以組合提供擴(kuò)增反應(yīng)用的引物，以特異地?cái)U(kuò)增目標(biāo)核酸序列。
本發(fā)明中擴(kuò)增的方法通常包括(a)組成一個反應(yīng)混合物，其包括核酸擴(kuò)增試劑、至少一組本發(fā)明的引物，及疑含有至少一段標(biāo)地序列的檢體。以及(b)將反應(yīng)混合物置于擴(kuò)增條件中以產(chǎn)生至少一個副本的核酸序列。
上述方法的步驟(b)可以被重復(fù)任何適當(dāng)?shù)拇螖?shù)(在檢測方法步驟(c)之前)，例如以溫度循環(huán)反應(yīng)10到100次，典型的是約20至60次，更典型的是在約25至約45次。
核酸擴(kuò)增試劑包括已知及可能的試劑，但不局限于有至少聚合酶活性的酶、輔酶因子，例如鎂或錳、鹽、NAD及dNTP例如dATP、dGTP、dCTP及dTTP。
擴(kuò)增反應(yīng)的條件通常是促進(jìn)復(fù)性及延伸一段或更多的核酸序列，已知復(fù)性反應(yīng)取決于一些可預(yù)期的因子，包括溫度、離子強(qiáng)度、序列長度、互補(bǔ)性及序列的GC含量。例如降低反應(yīng)溫度可以促進(jìn)復(fù)性，對任何的序列而言，熔鏈溫度Tm可以用很多已知的方法估算。典型地，診斷上應(yīng)用以低于熔鏈溫度約10℃(例如2℃到8℃)為雜交溫度。離子強(qiáng)度或鹽的濃度也會影響熔鏈溫度，因?yàn)樾￡栯x子傾向于以消減磷酸二酯骨干的負(fù)電荷來穩(wěn)定雙鏈體的形成。典型的鹽類濃度視陽離子的性質(zhì)及價數(shù)而定，但熟知此技術(shù)者可很快的了解，同樣地，高G∶C含量及增加序列長度也已知會穩(wěn)定雙鏈體的形成，因?yàn)镚∶C配對有三個氫鍵而A∶T配對只有兩個，另外，因?yàn)檩^長序列有較多的氫鍵將序列抓在一起，因此，高G∶C含量及較長的序列長度會因提高熔鏈溫度而影響雜交的條件。
在選擇用來作診斷應(yīng)用的序列時，要知道其G∶C含量及長度以用來決定雜交反應(yīng)的條件，因?yàn)橐话汶x子強(qiáng)度會最適于酶活性，剩下唯一要改變的因子就是溫度。一般而言，雜交的溫度都選擇在靠近引物或探針的熔鏈溫度。因此，要得到一組特殊引物或探針的適合雜交條件，對操作此技術(shù)者是普通的技術(shù)。
如上所述，使用本發(fā)明的多核苷酸所擴(kuò)增的特異擴(kuò)增子，可以用很多已知的方法來檢測，例如在一個或多個用在擴(kuò)增反應(yīng)的引物作標(biāo)記，如此，這樣的擴(kuò)增子便可以用常用的技術(shù)直接檢測。另外，也可以用標(biāo)記過的探針來檢測，而此探針可以是擴(kuò)增反應(yīng)中的一段引物，或是異于引物但可和擴(kuò)增序列互補(bǔ)的其它多核苷酸，而這樣的探針可以加到擴(kuò)增反應(yīng)后的混和液中，經(jīng)過適當(dāng)?shù)碾s交及清洗后，標(biāo)記可用常用的方法檢測。
使用上述方法所得的擴(kuò)增產(chǎn)物，可以在擴(kuò)增反應(yīng)時或之后檢測，當(dāng)擴(kuò)增反應(yīng)完成后，可以用膠體電泳來檢測產(chǎn)物，另外，擴(kuò)增產(chǎn)物被雜交到探針，然后與反應(yīng)中的其它成份分離并使用微粒子及標(biāo)記的探針來檢測。
為方便使用，引物及探針用可檢測的成分或分子標(biāo)記。探針用磁性粒子標(biāo)記就成為磁性探針。正、反向引物可用生物活性物質(zhì)如生物素標(biāo)記。擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物可用磁性探針雜交以形成雜體混合物，此雜體混合物可被磁性物質(zhì)吸引，而可以在磁性架子中輕易的與未結(jié)合的DNA產(chǎn)物分離。此雜體混合物可以進(jìn)一步的用引物標(biāo)記來定量。例如如果引物是用生物素標(biāo)記，加入其底物-親合素，則可以用光度計(jì)來讀取發(fā)光值。
于本發(fā)明之一實(shí)施例中，使用一組新穎的引物來同步擴(kuò)增單一檢體中砂眼披衣菌及奈瑟氏淋病雙球菌的DNA片段，用來擴(kuò)增砂眼披衣菌及奈瑟氏淋病雙球菌DNA片段的引物組包括5’-CGCGAAGAACCTTACCTGGTTTTGACATG-3’及5’-GGCAACTAATGACAAGGGTTGCGCTC-3’。此引物組是由砂眼披衣菌及奈瑟氏淋病雙球菌的基因組中的保守區(qū)域所設(shè)計(jì)而來，而此保守區(qū)域中是16S rRNA基因，引物是用生物活性物質(zhì)標(biāo)記，再較佳實(shí)施例中，此物質(zhì)為生物素。
引物組的設(shè)計(jì)過程描述如下選擇16S rRNA基因，其已知是基因組中高保守的區(qū)域；將16S rRNA基因的核苷酸序列排列以篩選出保守區(qū)域；從保守區(qū)域中找出目標(biāo)片段，此片段的兩端序列在砂眼披衣菌及奈瑟氏淋病雙球菌中是相同的，而且片段中還含有變異的區(qū)域，其中的不同序列用來鑒定C.trachomatis及N.gonorrhoeae；及選擇保守區(qū)域中目標(biāo)片段兩端的適當(dāng)長度來設(shè)計(jì)引物組。引物組中包括正向引物及反向引物，定義正向及反向引物，其中從C.trachomatis來的正向引物序列與從N.gonorrhoeae來的正向引物相同，而從C.trachomatis來的反向引物序列與從N.gonorrhoeae來的反向引物相同。
于本發(fā)明之一實(shí)施例中，用來鑒定從奈瑟氏淋病雙球菌及/或砂眼披衣菌擴(kuò)增而來的DNA片段的探針，其包括(a)5’-AATGTCGTTTTCCGCA AGGACATAT-3’對砂眼披衣菌；及(b)5’-CGGAGGAGTGCCTTCGGGAGCCGTA-3’對奈瑟氏淋病雙球菌。此探針以磁性粒子標(biāo)記。此探針是從奈瑟氏淋病雙球菌及砂眼披衣菌基因組的保守區(qū)域中的變異區(qū)域所設(shè)計(jì)而來，其中的不同DNA序列可用來鑒定奈瑟氏淋病雙球菌及砂眼披衣菌。其保守區(qū)域是在16S rRNA基因中，C.trachomatis的變異區(qū)域特異于C.trachomatis，而N.gonorrhoeae的變異區(qū)域特異于N.gonorrhoeae。所選的變異區(qū)域位于保守區(qū)域內(nèi)，而保守區(qū)域的兩端用來設(shè)計(jì)引物，因此，此變異區(qū)域可被引物組擴(kuò)增出來，選擇變異區(qū)域中的適當(dāng)序列長度來設(shè)計(jì)特異的探針。
本發(fā)明的具體實(shí)施例中，檢測奈瑟氏淋病雙球菌及砂眼披衣菌的試劑盒包括(a)用來擴(kuò)增樣品DNA的引物組，其包括5’-AATGTCGTTTTCCGCAAGGACATAT-3’及5’-CGGAGGAGTGCCTTCGGGAGCCGTA-3’；及(b)用來鑒定擴(kuò)增的DNA片段的探針，其包括5’-CGGAGGAGTGCCTTCGGGAGCCGTA-3’對奈瑟氏淋病雙球菌，及5’-AATGTCGTTTTCCGCAAGGACATAT-3’對砂眼披衣菌。此引物組可用來同時擴(kuò)增砂眼披衣菌及奈瑟氏淋病雙球菌的DNA片段，探針之一是特異于砂眼披衣菌，另一則特異于奈瑟氏淋病雙球菌。引物以生物素標(biāo)記，探針則以磁性顆粒標(biāo)記成磁性探針。試劑盒中含有一個磁性架，用來分離雜交復(fù)合體，另外含有一種酶(例如生物素)的底物，用來定量此雜交復(fù)合體。
利用此試劑盒來診斷砂眼披衣菌及/或奈瑟氏淋病雙球菌的過程描述如下從臨床上的病人或任何含有此致病菌的來源取得合適的樣本；以生物素標(biāo)記的引物擴(kuò)增目標(biāo)DNA片段；加入特異于砂眼披衣菌(或奈瑟氏淋病雙球菌)的磁性探針來雜交特異的目標(biāo)；使用磁性架來分離雜交復(fù)合體及未結(jié)合的擴(kuò)增產(chǎn)物；加入親合素—辣根過氧化物酶及其底物來確認(rèn)雜交復(fù)合體，再以光度計(jì)讀取發(fā)光值。
本發(fā)明提供了一個方便的方法來診斷STDs的致病菌，根據(jù)前述方法制備的試劑盒提供了簡單且經(jīng)濟(jì)的工具來診斷STDs的致病菌，尤其是最常見的C.trachomatis及N.gonorrhoeae。本試劑盒不僅節(jié)省檢測的時間而且顯示出高的特異性及敏感性。最有趣的是，本試劑盒可以檢測尿液及平常的臨床樣本拭子(SWAB)中的致病原。
附圖簡述

圖1是描述C.trachomatis和N.gonorrhoeae.之16SrRNA序列的排比結(jié)果，其中NG是代表N.gonorrhoeae，CT是代表C.trachomatis。
圖2是描述序列排比結(jié)果中，其保守區(qū)域的放大圖，NG是代表N.gonorrhoeae，CT是代表C.trachomatis。底線1標(biāo)示用來設(shè)計(jì)正向引物的序列。底線2標(biāo)示用來設(shè)計(jì)反向引物的序列。黑框部分則標(biāo)示出用來設(shè)計(jì)特定探針的序列。
圖3是描述N.gonorrhoeae的PCR結(jié)果，標(biāo)示在兩條泳道中間的數(shù)字(45，50，55，60，65，70)，表示PCR反應(yīng)中復(fù)性的溫度，NC是代表負(fù)控制組，以0.22μm濾器過濾后的MQ水當(dāng)PCR的模板。測試組以N.gonorrhoeae DNA當(dāng)PCR的模板。
圖4A是描述以60℃當(dāng)復(fù)性溫度的PCR結(jié)果，NC負(fù)控制組，以0.22μm濾器過濾后的MQ超純水當(dāng)PCR的模板。NG和CT則分別表示以N.gonorrhoeae和C.trachomatis的DNA當(dāng)PCR的模板。圖4B是描述PCR產(chǎn)物以特定探針雜交的結(jié)果，斜紋長條表示以NG特異的探針，而方格長條則表示用CT特異的探針。在PCR反應(yīng)中，NC是代表負(fù)控制組，PC是代表正控制組，分別以NG和CT的DNA當(dāng)模板。R-b是代表表示以生物素標(biāo)記的反向引物，F(xiàn)-b是代表表示以生物素標(biāo)記的正向引物。
圖5描述雜交的特異性，斜紋長條表示用NG特異的探針，而方格長條則是使用CT特異的探針。在雜交的模板中，NC是代表負(fù)控制組；NG是代表N.gonorrhoeae的PCR產(chǎn)物，CT是代表C.trachomatis的PCR產(chǎn)物。圖A是表示反應(yīng)時間10分鐘。圖B是表示反應(yīng)時間20分鐘。
圖6A是屬是PCR結(jié)果，圖6B是用特定探針和PCR產(chǎn)物雜交的結(jié)果。NC負(fù)控制組；以0.22μm濾器過濾后的MQ超純水當(dāng)PCR的模板。TB是代表Mycobacterium tuberculosis，SA是代表Staphylococcus aureus，HI是代表Haemophilusinfluenzae，PS是代表Streptococcus pneumonia，GP是代表Klebsiella pneumonia，KF2是代表Mycobacteriumkansasii，RGM是代表Rapid grower Mycobacterium，MAC是代表Mycobacterium avium，NG是代表N.gonorrhoeae，及CT是代表C.trachomatis。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一序列比對及引物探針?biāo)褜.trachomatis及N.gonorrhoeae的16S rRNA基因序列以DNAsis軟件分析，來篩選他們的保守區(qū)域，根據(jù)保守區(qū)域來設(shè)計(jì)引物，而探針則是根據(jù)保守區(qū)域中的特異序列來設(shè)計(jì)。
圖1為DNA排列的結(jié)果，顯示C.trachomatis及N.gonorrhoeae間有72.4％的相似性，一個從957bp到1131bp的保守區(qū)域被篩選出來，此保守區(qū)域的放大圖展示于圖2。底線1及底線2的兩個片段，在C.trachomatis及N.gonorrhoeae中是相同的，因此底線1及底線2的序列分別設(shè)計(jì)成正向(F)及反向(R)的引物。而有起伏底線的片段是各個致病原的特異性，這些片段則設(shè)計(jì)成特異探針。
實(shí)施例二臨床樣本的準(zhǔn)備拭子(SWAB)將樣本拭子放入含有2ml 1x PBS的15ml離心管，激烈震蕩一分鐘以分離附著物，然后樣本拭子以燒過的鑷子夾起，并將所有的液體從拭子中擠出來。將15ml離心管以3000rpm離心五分鐘，除去上清液后，加入100μl PCR緩沖液、Tween 20(0.45％)、及蛋白酶K，然后混合均勻；再移到1.5ml的微量離心管，置于55℃一小時，然后存放于95℃十分鐘以除去蛋白酶K的活性，最后的混合液可以直接作PCR反應(yīng)或存在-20℃中備用。
尿液從病人的前段尿液中收集約20~30ml，然后放入50ml的離心管中以12,000rpm離心三十分鐘，除去上清液。加入100μl PCR緩沖液、Tween 20(0.45％)、及蛋白酶K，然后混合均勻再移到1.5ml的微量離心管，置于55℃一小時，然后存放于95℃十分鐘以除去蛋白酶K的活性，最后的混合液可以直接作PCR反應(yīng)或存在-20℃中備用。
實(shí)施例三聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物組的序列為5’-CGCGAAGAACCTTACCTGGTTTTGACATG-3’(F) 及5’-GGCAACTAATGACAAGGGTTGCGCTC-3’(R)，50μl的PCR反應(yīng)中含有1x PCR緩沖液、1.5mM MgCl2(GeneTeks BioscienceInc.)、2μM的引物、2mM的dNTP(ProTech)、2U的Taq聚合酶及2μl的模板。其在MyCycler Thermal Cycler(Bio-Rad)的熱循環(huán)條件為94℃5分鐘，30個循環(huán)的94℃45秒、60℃30秒、及72℃30秒，最后72℃10分鐘的延伸反應(yīng)。160bp的PCR產(chǎn)物以含有1μg/ml溴化乙錠(ethidium bromide)的2％瓊脂糖(agarose gel)電泳分析。
為找出適合的復(fù)性溫度，測試了N.gonorrhoeae的DNA及六種不同的復(fù)性溫度，包括45℃、50℃、55℃、60℃、65℃及70℃等，結(jié)果如圖3所示，適合此引物組的復(fù)性溫度是廣泛的，為避免污染及非特異性的復(fù)制，選擇60℃為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的復(fù)性溫度。
實(shí)施例四雜交及訊號檢測對C.trachomatis的探針序列為5’-AATGTCGTTTTCCGCAAGGACATAT-3’，而對N.gonorrhoeae的探針序列則為5’-CGGAGGAGTGCCTTCGGGAGCCGT-3’，275μl雜交緩沖液，15μl自身結(jié)合探針(Seradyn Inc.)及10μl PCR產(chǎn)物一起加入雜交試管(Ht)，以激烈震蕩混合均勻，將Ht置于95℃干浴5分鐘，再于50℃干浴20分鐘，然后移到干浴的磁性槽，將雜交緩沖液吸除。將清洗緩沖液(預(yù)熱50℃)加到每一根試管，震蕩混合后放回磁性管靜置3~5分鐘，然后吸除清洗緩沖液，前述清洗的步驟重復(fù)一次，再將新鮮配制含有1∶4000稀釋的SA-HRP(Pierce Biotechnology，Inc.)的阻斷緩沖液加入，避光室溫靜置20分鐘。將Ht置于磁性架并把溶液吸除，加入0.5％PBST，震蕩混合后放回磁性架，再將溶液吸除，前述步驟重復(fù)一次。加入適量體積的1x PBS并震蕩混合以將磁性珠懸浮起來，再將底物(Pierce Biotechnology，Inc.)加到每一根試管，以光度計(jì)讀取發(fā)光值。
圖4A所展示的是N.gonorrhoeae和C.trachomatis的PCR產(chǎn)物，這兩種致病原的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物大約160bp，而且沒有其它的條帶在電泳凝膠上。圖4B所展示的是雜交的結(jié)果，其只有在含有目標(biāo)DNA的樣本中出現(xiàn)明顯的訊號。
實(shí)施例五兩個特異探針間無交叉作用圖4展示出NG特異的探針只會辨識N.gonorrhoeae的PCR產(chǎn)物，而不會識別C.trachomatis的PCR產(chǎn)物。而CT特異的探針只會辨識C.trachomatis的PCR產(chǎn)物，而不會識別N.gonorrhoeae的PCR產(chǎn)物。不管反應(yīng)時間是10分鐘或20分鐘，都可檢測到明顯的訊號。
實(shí)施例六檢測系統(tǒng)的特異性引物組(引物F及R)及兩個特異探針(CT探針及NG探針)被用來建立一個檢測系統(tǒng)，為分析此試劑盒的特異性，選取八株細(xì)菌來作檢測，包括Mycobacterium tuberculosis，Staphylococcus aureus，Haemophilus influenzae，Streptococcus pneumoniae，Klebsiella pneumoniae，Mycobacterium kansasii，Rapid grower Mycobacterium及Mycobacterium avium.。這些細(xì)菌株的DNA用來當(dāng)PCR的模板，所得到的產(chǎn)物用這兩個特異探針來作雜交，圖6(A)展示PCR產(chǎn)物，本系統(tǒng)中的引物組可在這些細(xì)菌株中擴(kuò)增特異的DNA片段，進(jìn)一步的探針確認(rèn)結(jié)果則展示于圖6(B)，CT探針只會和C.trachomatis的PCR產(chǎn)物反應(yīng)，而NG探針則只和N.gonorrhoeae的PCR產(chǎn)物反應(yīng)。測試的八株細(xì)菌則呈現(xiàn)不明顯的雜交結(jié)果，因此，雜交的結(jié)果證明了本檢測系統(tǒng)的特異性。
序列表<110>亞洲基因科技股份有限公司<120>診斷性傳染病致病原的新穎方法<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>SEQUENCE ID NO 1<211>29<212>DNA<213>人造序列<220>正向引物<221>Primer_bind<400>1CGCGAAGAAC CTTACCTGGT TTTGACATG29<210>SEQUENCE ID NO 2<211>27
<212>DNA<213>人造序列<220>反向引物<221>Primer_bind<400>2GGCAACTAAT GACAAGGGTT GCGCTC27<210>SEQUENCE ID NO 3<211>27<212>DNA<213>人造序列<220>砂眼披衣菌的專一性探針<221>Primer_bind<400>3AATGTCGTTT TCCGCAAGGA CATAT27
<210>SEQUENCE ID NO 4<211>27<212>DNA<213>人造序列<220>奈瑟氏淋病雙球菌的專一性探針<221>Primer_bind<400>4CGGAGGAGTGCCTTCGGGAGCCGTA2權(quán)利要求
1.一種鑒定不同性傳染病致病原的方法，其包括(a)以一組引物同步擴(kuò)增不同致病菌的DNA片段；(b)以不同的特異探針和擴(kuò)增的DNA片段雜交；及(c)確認(rèn)雜交的產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中性傳染病的致病原是選自下列群組包括細(xì)菌、病毒、真菌、立克次體或披衣菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中引物組是從不同致病原的基因組的保守區(qū)域中所設(shè)計(jì)出來。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中保守區(qū)域是選自下列群組包括5Sr RNA基因，16S rRNA基因，23S rRNA基因，5.0S rRNA基因，5.8S rRNA基因，18S rRNA基因，28S rRNA基因，類16S RNA基因，或類23S rRNA基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中特異的探針是由權(quán)利要求3的保守區(qū)域中的變異區(qū)域所設(shè)計(jì)出來。
6.一個設(shè)計(jì)不同性傳染病致病原DNA片段引物組的步驟，其包括(a)在不同致病原的基因組中選出一個保守區(qū)域；(b)將不同致病原中保守區(qū)域的序列排列；(c)從保守區(qū)域內(nèi)找出一個目標(biāo)片段，其中該片段的兩端序列在不同致病原中是一樣的，且此片段中必須含有不同的序列，以用來鑒定不同的致病原；(d)將目標(biāo)片段的兩端序列選為引物；(e)定義正向及反向引物，其中正向引物的序列，在不同的致病原間均同為正向的引物，而反向引物的序列，在不同的致病原間均同為反向的引物；及(f)將目標(biāo)片段中不同的部分選為該致病原的特異探針。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的步驟，其中步驟(b)的排列，是使用生物信息軟件DNAsis。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的步驟，其中性傳染病的致病原是選自下列群組包括細(xì)菌、病毒、真菌、立克次體或披衣菌。
9.一組引物，用以擴(kuò)增砂眼披衣菌(Chlamydiatrachomatis)及奈瑟氏淋病雙球菌(Neisseria gonorrhoeae)的DNA片段，其包括5’-CGCGAAGAACCTTACCTGGTTTTGACATG-3’及5’-GGCAACTAATGACAAGGGTTGCGCTC-3’。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的引物組，其是由砂眼披衣菌及奈瑟氏淋病雙球菌的基因組中的保守區(qū)域所設(shè)計(jì)而來。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的引物組，其中該保守區(qū)域是由16SrRNA基因而來。
12.根據(jù)權(quán)利要求9的引物組，該引物是用生物活性物質(zhì)標(biāo)記。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的引物組，其中生物活性物質(zhì)是生物素。
14.一個用來鑒定從砂眼披衣菌及/或奈瑟氏淋病雙球菌擴(kuò)增而來的DNA片段的探針，其由下列序列組成(a)5’-AATGTCGTTTTCCGCAAGGACATAT-3’對砂眼披衣菌；及(b)5’-CGGAGGAGTGCCTTCGGGAGCCGTA-3’對奈瑟氏淋病雙球菌。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的探針，該探針是從砂眼披衣菌及奈瑟氏淋病雙球菌基因組的保守區(qū)域中的變異區(qū)域所設(shè)計(jì)而來，其中的不同DNA序列可用來鑒定奈瑟氏淋病雙球菌及砂眼披衣菌。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的探針，其中該保守區(qū)域是由16SrRNA基因而來。
17.根據(jù)權(quán)利要求14的探針，其以磁性顆粒標(biāo)記。
18.一個檢測砂眼披衣菌及奈瑟氏淋病雙球菌的試劑盒，其包括(a)用來擴(kuò)增樣品DNA的引物組，其包括5’-AATGTCGTTTTCCGCAAGGACATAT-3’及5’-CGGAGGAGTGCCTTCGGGAGCCGTA-3’；及(b)用來鑒定擴(kuò)增的DNA片段的探針，包括5’-AATGTCGTTTTCCGCAAGGACATAT-3’對砂眼披衣菌及5’-CGGAGGAGTGCCTTCGGGAGCCGTA-3’對奈瑟氏淋病雙球菌。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的試劑盒，其中該引物是用生物活性物質(zhì)標(biāo)記。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的試劑盒，其中該生物活性物質(zhì)是生物素。
21.根據(jù)權(quán)利要求18的試劑盒，其中該探針是以磁性顆粒標(biāo)記。
22.根據(jù)權(quán)利要求18的試劑盒，其另包括一個磁性架。
23.根據(jù)權(quán)利要求18的試劑盒，其另包括一種酶底物，用以定量雜交復(fù)合體。
全文摘要
本發(fā)明關(guān)于一個新穎的方法，從一個檢體中診斷出性傳染病的不同致病原，本方法包括使用一引物組同步擴(kuò)增不同致病原的DNA片段，并以特異的探針鑒定擴(kuò)增的DNA片段。本發(fā)明同時提供引物組及探針的設(shè)計(jì)步驟。本發(fā)明進(jìn)一步提供診斷奈瑟氏淋病雙球菌及砂眼披衣菌的試劑盒。
文檔編號C12Q1/04GK101092645SQ20061008675
公開日2007年12月26日 申請日期2006年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月24日
發(fā)明者周錦生 申請人:亞洲基因科技股份有限公司