專利名稱：一種制備純化柚苷酶的方法及其酶制劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及柚苷酶的生產(chǎn)制備純化以及其在柑橘類產(chǎn)品的脫苦和生物轉(zhuǎn)化黃酮類化合物的應(yīng)用，具體地說是柚苷酶的制備純化方法及其在食品、藥品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
柚苷酶是由真菌產(chǎn)生的脫苦酶，作為高效生物催化劑，柚苷酶又叫做β-鼠李糖苷分子中末端非還原性的β-鼠李糖殘基分解酶，釋放出鼠李糖。柚苷酶可由黑曲霉、米曲霉、青霉菌產(chǎn)生。根據(jù)國(guó)內(nèi)外的報(bào)道，該酶可以用于桔子汁、桔子罐頭、桔子皮等的脫苦。
目前，國(guó)內(nèi)柚苷酶研究處于菌種篩選階段，未能形成工業(yè)化生產(chǎn)，而我們通過對(duì)菌種分離，經(jīng)過不斷的馴化、培育出產(chǎn)酶穩(wěn)定、酶活力高的能夠適應(yīng)工業(yè)化大生產(chǎn)的菌株。
我們根據(jù)柚苷酶的物理和化學(xué)性質(zhì)，設(shè)計(jì)和試驗(yàn)了一種新的生產(chǎn)、純化、干燥柚苷酶的方法。根據(jù)柚苷酶的專一性，研究了應(yīng)用柚苷酶生物轉(zhuǎn)化銀杏甙元黃酮。本研究表明，此酶制劑可用于許多天然植物重要活性成分的分子結(jié)構(gòu)修飾。如我們用柚苷酶將黃酮類化合物轉(zhuǎn)化為苷元型黃酮，以增加其生物利用度，來提高黃酮類的功效。試驗(yàn)證實(shí)，用柚苷酶將糖苷型黃酮生物轉(zhuǎn)化苷元型黃酮，提高黃酮類物質(zhì)的生物活性有明顯的優(yōu)勢(shì)。它具有反應(yīng)選擇性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少、無環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)。由于生物轉(zhuǎn)化可以進(jìn)行傳統(tǒng)有機(jī)合成所不能或難以進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)，有著較大的理論及實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。因此，本研究對(duì)指導(dǎo)天然活性成分的生物轉(zhuǎn)化有重要的意義?？蓮V泛的應(yīng)用于醫(yī)藥、保健食品、化妝品添加劑的生產(chǎn)，具有巨大的市場(chǎng)潛力。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種產(chǎn)酶活力更高，工藝簡(jiǎn)單、已成功的用固態(tài)發(fā)酵制備的方法生產(chǎn)純化柚苷酶的方法。
本發(fā)明為了解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一種制備純化柚苷酶的方法，其具體操作步驟如下1)采用常規(guī)微生物接種方法接種試管斜面培養(yǎng)，采用察氏固體培養(yǎng)基；移接將上述生長(zhǎng)的菌株移接到產(chǎn)孢固體培養(yǎng)基中，25-35℃，培養(yǎng)3-5天，至孢子按0.5-10.0％接種量投加到固體培養(yǎng)基中，控制碳氮比例在2-51-3.5范圍內(nèi)，加有機(jī)磷，其含量為5-8％。干基，保持濕度30-70％，溫度25-35℃，自然PH值，柚苷酶產(chǎn)生時(shí)間為40-90小時(shí)；上述菌株孢子添加到固體培養(yǎng)基中的碳為麥麩；所屬固體培養(yǎng)基中的氮為豆渣和豆餅；所述真菌菌種為黑曲霉；所述柚苷酶生產(chǎn)時(shí)間為60-90小時(shí)；柚苷酶產(chǎn)生時(shí)間最佳為72小時(shí).
將所述的柚苷酶液加入硫酸銨沉淀，控制硫酸銨飽和度為30-80％，離心干燥，制成粗酶加入3-5倍95％的乙醇沉淀.干燥溫度控制在50-60℃.
按所述方法制備的柚苷酶應(yīng)用是將所述柚苷酶培養(yǎng)物直接作為果汁脫苦，添加到果汁中，添加量為果汁量的0.1-2‰。
按所述制備的有的柚苷酶的應(yīng)用是將所述柚苷酶培養(yǎng)物直接應(yīng)用與黃酮類化合無的生物轉(zhuǎn)化，將糖苷型黃酮生物轉(zhuǎn)化為苷元型黃酮.添加量為1‰-10‰。
本發(fā)明的高純度銀杏黃酮類化合物高效提取制備方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，所產(chǎn)生的有益效果是1)易于生產(chǎn)應(yīng)用，本發(fā)明柚苷酶用固態(tài)發(fā)酵方式制成，易于培養(yǎng)繁殖，生產(chǎn)所采用的菌種抗逆性強(qiáng)，較液體深層發(fā)酵時(shí)間提前了30小時(shí)，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便，且將酶液精制提純，增加產(chǎn)品的附加值.易于推廣。
2)具有高的產(chǎn)酶能力和轉(zhuǎn)化率，采用本發(fā)明對(duì)銀杏黃酮類化合物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，不施加高溫，高壓，屬于生物降解轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率高，體外消化率達(dá)到90％以上；具有廣譜的底物水解活性和溫度，PH值耐受能力，產(chǎn)酶活力為185200單位/克曲；分子量為72KDA；最適作用溫度40-50℃；最適PH4.0。
3)具有廣闊的應(yīng)用前景，本發(fā)明生產(chǎn)的柚苷酶可以應(yīng)用于脫除果汁中的苦味，生物轉(zhuǎn)化糖苷型黃酮.提高產(chǎn)品的利用率。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1柚苷酶的制備按如下操作1)以曲霉屬真菌為菌種，名為黑曲霉，形態(tài)特征為菌株在察氏培養(yǎng)基上，氣生菌絲生長(zhǎng)良好，棉絮狀，有突起，表面白色，背面顏色雖時(shí)間延長(zhǎng)有淺褐色變?yōu)楹稚?，孢子為褐色；采用常?guī)微生物接種方法接種試管斜面培養(yǎng)，采用察氏固體培養(yǎng)基；移接(酶生產(chǎn))將上述生長(zhǎng)的菌株移接到產(chǎn)孢固體培養(yǎng)基中，28℃，培養(yǎng)3天，至孢子產(chǎn)生所述產(chǎn)孢培養(yǎng)基采用20馬鈴薯浸出汁1000ml，葡萄糖10g，磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂1.5g，維生素B1微量，瓊脂20g，在每一個(gè)斜面試管放一張濾紙條；2)將上述菌株孢子按3％接種量投加到固體培養(yǎng)集中，所述固體培養(yǎng)集中的碳為麩皮，氮為豆渣豆餅，控制碳氮的比例為4∶3，保持濕度60％，溫度28℃，pH為自然值，72小時(shí)為叫柚苷酶產(chǎn)生高峰；將產(chǎn)生的柚苷酶用3倍水浸泡，過濾得較為澄清的酶液，將其直接添加到含有銀杏黃酮1％的溶液中，添加量為溶液的2％，能夠生物轉(zhuǎn)化銀杏黃酮為苷元型黃酮；添加到果汁中，添加量為果汁量的1％，能夠有效的脫除其苦味。
被發(fā)明轉(zhuǎn)化原理為本發(fā)明不施加高溫、高壓、將糖苷型黃酮生物轉(zhuǎn)化為苷元型黃酮，提高生物利用度；去除橘汁中的苦味。
結(jié)果參數(shù)較現(xiàn)有技術(shù)中液體深層發(fā)酵時(shí)間提前了30小時(shí)，產(chǎn)酶活力為138000單位/克曲；分子量為39Kda；最適作用溫度40℃；最適pH4.0發(fā)酵周期3天，為固態(tài)發(fā)酵；使用本發(fā)明所述柚苷酶作為黃酮類化合物生物轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化因子，具有底物水解活性提高和反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn)。
實(shí)施例2與實(shí)施例1不同之處在于柚苷酶的固體發(fā)酵步驟2)中將所屬菌株孢子按3％接種量投加到固體培養(yǎng)集中，所述培養(yǎng)基中碳為麥麩，氮為豆餅和豆餅粉，控制碳氮的比例為2∶1，保持濕度30％，溫度25℃，pH為自然值，60小時(shí)柚苷酶產(chǎn)生；將產(chǎn)生的柚苷酶培養(yǎng)物用水浸透，過濾，濾液作為橘汁的脫苦劑，添加量為橘汁的0.1‰-2‰。
采用本發(fā)明制備柚苷酶作為橘汁的脫苦劑，增重效果顯著。
實(shí)施例3與實(shí)施例1不同之處在于柚苷酶發(fā)酵制備步驟2)中將所述菌株孢子按5％接種量投加到固體培養(yǎng)基中，所述固體培養(yǎng)基中碳為麥麩，氮為豆餅和豆餅粉，控制碳氮比例為5∶4，保持濕度70％，溫度32℃，pH為自然值，90小時(shí)柚苷酶產(chǎn)生；將產(chǎn)生的柚苷酶用水侵泡，加硫酸銨沉淀，控制飽和度為60％，制成純酶制劑，作為橘汁的脫苦劑，添加量為橘汁的百萬分之幾的量。
實(shí)施例4酶水解將銀杏黃酮苷轉(zhuǎn)化成銀杏苷元型黃酮通過操縱生物轉(zhuǎn)化條件，將含銀杏黃酮類化合物24％的中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成含有不同組成的槲皮苷/山奈素/異鼠李素的產(chǎn)物。
將24％銀杏黃酮的提取物用于酶轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。將5g銀杏黃酮產(chǎn)物分散于500ml水中(固體∶液體＝1∶100)。將分散體加熱到42℃并調(diào)節(jié)pH至4。然后將分散體在40℃平衡，接著加入純化后的柚苷酶粉。
柚苷酶制品含有2300單位柚苷酶活性。在該實(shí)驗(yàn)中使用每克銀杏黃酮66mg柚苷酶的劑量。酶溫度保持在40℃，溶液pH調(diào)節(jié)至4.0，持續(xù)攪拌適當(dāng)?shù)臅r(shí)間長(zhǎng)度。一旦溫育時(shí)間完成，通過調(diào)節(jié)溶液的pH至2.5然后持續(xù)攪拌下將溫度加熱到80℃10分鐘使酶失活，將溶液冷卻至室溫，并調(diào)節(jié)pH至7。通過噴霧干燥，冷凍干燥或其它適宜的方法將酶轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物干燥。
表1總結(jié)了制備含有各種槲皮素/山奈酚/異鼠李素組成的產(chǎn)物所需的實(shí)驗(yàn)條件。為了方便的原因，描述的起始材料是外購(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)銀杏葉提取物，可將銀杏葉提取物均勻溶解于純化水中，應(yīng)用酶轉(zhuǎn)化。實(shí)施與常規(guī)酶處理相同的方法后，對(duì)照(沒有酶)中類黃酮化合物組成(槲皮素/山奈酚/異鼠李素)保持不變，這表明轉(zhuǎn)化柚苷酶的作用導(dǎo)致。
表1使用柚苷酶對(duì)黃酮類化合物的酶法轉(zhuǎn)化
本發(fā)明提供了從將銀杏黃酮生物轉(zhuǎn)化成為銀杏苷元型黃酮(槲皮素、山奈酚、異鼠李素)的組合物。本發(fā)明的產(chǎn)物可以用于保健食品、營(yíng)養(yǎng)藥、藥物、化妝品和其他市場(chǎng)的添加劑。
實(shí)施例5使用柚苷酶脫除橘類的苦味.
取無核橘汁過濾清液，分別加入不同量的柚苷酶，在40℃下pH值為4.0反應(yīng)1.0和2.0小時(shí)測(cè)定值，結(jié)果見表2。
表2不同加酶量對(duì)橘汁脫苦的影響
苦，艸稍苦，+基本不苦反應(yīng)條件控制在時(shí)間為2個(gè)小時(shí)，溫度為40℃，pH值為4.0本發(fā)明提供了將橘汁脫苦的方法以及最佳條件。本發(fā)明可以明顯改善橘汁類產(chǎn)品的品質(zhì)，提高其風(fēng)味，降低了同等方法脫除苦味的成本?？梢詮V泛的應(yīng)用于相關(guān)企業(yè)的產(chǎn)品深加工，具有廣闊的市場(chǎng)前景。
前面的描述備考慮為僅用于舉例闡明本發(fā)明的原理。此外，由于本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易實(shí)施許多改變和修改，故不打算將本發(fā)明限制在所顯示和描述的精確結(jié)構(gòu)和實(shí)施方法中，因此，結(jié)構(gòu)或?qū)嵤┓椒ㄖ锌梢圆扇〉乃羞@些適宜的改變和修改都將落在所要求的本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種制備純化柚苷酶的方法，其特征在于按如下步驟操作1)采用常規(guī)微生物接種方法接種試管斜面培養(yǎng)，采用察式固體培養(yǎng)基；接種將上述生長(zhǎng)的菌株移接到產(chǎn)孢固體培養(yǎng)基中，25-35℃，培養(yǎng)3-5天，至孢子產(chǎn)生；步驟1)以真菌為菌種；2)將所述菌株孢子按0.5-10％接種量投加到固體培養(yǎng)基中，控制碳氮比例在2-5∶1-3.5范圍內(nèi)，保持濕度為30-70％，溫度25-35℃，自然PH值，柚苷酶的產(chǎn)生時(shí)間為40-90小時(shí)；提取，加料重的2-5倍純化水，過濾離心的清液；純化采取鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法結(jié)合的方法，提純柚苷酶，鹽析，硫酸銨飽和度為30-80％，有機(jī)溶劑沉淀，有機(jī)溶劑濃度為40-90％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備純化柚苷酶的方法，其特征在于所屬菌株孢子添加到固體培養(yǎng)基中的接種投加量為1-5％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備純化柚苷酶的方法，其特征在于所屬保持濕度為50-60％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備純化柚苷酶的方法，其特征在于所屬固體培養(yǎng)集中的碳為麥糠或麥麩；氮為豆餅或豆渣。
5.按根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備純化柚苷酶的方法，其特征在于所述真菌菌種為曲霉中的黑曲霉。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備純化柚苷酶的方法，其特征在于所述柚苷酶生產(chǎn)時(shí)間為60-90小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備純化柚苷酶的方法，其特征在于所述柚苷酶提取，加料重的2-5倍純化水，過濾離心的清液；純化采取鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法結(jié)合的方法，提純柚苷酶；鹽析硫酸銨飽和度為30-80％，有機(jī)溶劑沉淀有機(jī)溶劑濃度為40-90％。
8.一種如權(quán)利要求1所述的制備純化柚苷酶的酶制劑的應(yīng)用，其特征在于將柚苷酶應(yīng)用于脫苦及天然藥物中黃酮類化合物生物轉(zhuǎn)化。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備純化柚苷酶的酶制劑的應(yīng)用，其特征在于將所述柚苷酶純化后的純酶直接添加到壓榨后的柑橘類果汁中能有效的脫除其中的苦味，添加量為果汁量的0.1‰-2‰。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備純化柚苷酶的酶制劑的應(yīng)用，其特征在于將所述柚苷酶純化后的純酶直接添加到黃酮類化合物水溶液中，酶的添加量為所含糖苷型黃酮量的1‰-10‰，在溫度為30-50℃，PH為3-5，時(shí)間為4-24小時(shí)反應(yīng).能夠?qū)⑻擒招忘S酮生物轉(zhuǎn)化為苷元型黃酮，轉(zhuǎn)化率在30-80％。
全文摘要
本發(fā)明公開一種制備純化柚苷酶的方法及其酶制劑的應(yīng)用，其制備方法按如下步驟操作1)采用常規(guī)微生物接種方法接種試管斜面培養(yǎng)，采用察式固體培養(yǎng)基接種，將上述生長(zhǎng)的菌株移接到產(chǎn)孢固體培養(yǎng)基中，25－32℃，培養(yǎng)3－5天，至孢子產(chǎn)生；步驟1)以真菌為菌種，步驟2)將所述菌株孢子按0.5－10％接種量投加到固體培養(yǎng)基中，控制碳氮比例在2－5∶1－3.5范圍內(nèi)，保持濕度為30－70％，溫度25－35℃，自然pH值，柚苷酶的產(chǎn)生時(shí)間為40－90小時(shí)；提取，加料重的2－5倍純化水，過濾離心的清液；純化采取鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法結(jié)合的方法，提純柚苷酶。鹽析，硫酸銨飽和度為30－80％，有機(jī)溶劑沉淀，有機(jī)溶劑濃度為40－90％；柚苷酶產(chǎn)品作為柑橘類產(chǎn)品的脫苦劑和天然藥物中黃酮類化合物的苷元轉(zhuǎn)化劑，具有廣泛的用途。本發(fā)明產(chǎn)柚苷酶的活力高，能廣泛的應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A23L2/52GK101092611SQ200610068680
公開日2007年12月26日 申請(qǐng)日期2006年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月8日
發(fā)明者顏廷和 申請(qǐng)人:顏廷和