專(zhuān)利名稱(chēng)：：Sirt1在預(yù)防、控制或治療肥胖中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物技術(shù)和醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種新的可作為預(yù)防、控制或治療肥胖的耙點(diǎn)的蛋白。
背景技術(shù)：
：目前肥胖的發(fā)病率正在逐年增加，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球目前有3億人患肥胖癥，13億人超重。肥胖是體內(nèi)脂肪堆積過(guò)多和/或分布異常的一種狀態(tài)。1997年，世界衛(wèi)生組織(WHO)將肥胖明確宣布為一種疾病。肥胖癥作為一種全身內(nèi)分泌代謝疾病，不但影響體態(tài)和活動(dòng)，而且與高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、糖尿病、癌癥、痛風(fēng)、脂肪肝、內(nèi)分泌失調(diào)、肺泡低換氣綜合征、膽囊炎等密切相關(guān)，以及抵抗力低下而易感染，故有損健康和有礙延壽。一般來(lái)說(shuō)，能量的獲得大于消耗時(shí)促進(jìn)發(fā)胖。體內(nèi)有許多調(diào)節(jié)機(jī)制促進(jìn)進(jìn)食與產(chǎn)熱，進(jìn)而調(diào)節(jié)體脂量，使人們保持正常體重。當(dāng)這些調(diào)節(jié)機(jī)制異常時(shí)，能量平衡狀態(tài)被打破，導(dǎo)致肥胖發(fā)生。經(jīng)過(guò)研究目前有近200個(gè)肥胖相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)。所述的機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面①主要作用于下丘腦的生物因子:神經(jīng)內(nèi)分泌遞質(zhì)神經(jīng)肽Y(NPY)、阿片促黑激素皮質(zhì)素原(POMC)、黑色素細(xì)胞刺激素(a-MSH)、AgRP、增食因子(orexin)、5-羥色胺、腸道分泌的腦腸肽，脂肪細(xì)胞分泌的痩素等；交感神經(jīng)、下丘腦-垂體-腎上腺軸等反饋機(jī)制均能調(diào)節(jié)機(jī)體能量平衡。②主要作用于外周脂肪細(xì)胞的調(diào)節(jié)因子有腫瘤壞死因子a、解偶聯(lián)蛋白(UCP)、還可通過(guò)激活或抑制脂肪細(xì)胞上的e3-腎上腺素受體和過(guò)氧化物酶增殖物激活受體Y(PPAR-Y)及其轉(zhuǎn)錄共激活因子(PGC-1)調(diào)節(jié)體脂目前開(kāi)發(fā)的減肥藥物分為三大類(lèi)抑制食欲的藥物、增加能量消耗的藥物和抑制腸道消化吸收的藥物。減肥西藥的研究集中在腎上腺素能藥物，該藥物直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)，起到抑制食欲減少攝食的作用；5-羥色胺受體激動(dòng)劑，這類(lèi)藥物作用于CNS的5-羥色胺受體，增加飽腹感而起到抑制食欲的作用；單胺再攝取抑制劑，西部曲明是該類(lèi)藥物的代表，它能減少攝食，增加產(chǎn)熱；脂酶抑制劑，奧利司他是該類(lèi)藥物的代表，它能抑制胰腺和胃腸中的羧基脂酶及磷脂酶A2活性，從而抑制腸道對(duì)脂肪的吸收，降低體內(nèi)脂肪儲(chǔ)存而減輕體重。然而，目前市場(chǎng)上很多減肥藥物在藥物療效和安全性方面還無(wú)法保證。目前對(duì)減肥藥的開(kāi)發(fā)主要集中在干擾中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常通路，因而極易引起副作用。因此，需要尋找新的減肥作用靶點(diǎn)，最好是通過(guò)直接作用于脂肪細(xì)胞因子來(lái)實(shí)現(xiàn)減肥。目前鑒于PfAR激動(dòng)劑的研究開(kāi)發(fā)也是減肥藥篩選的新思路，開(kāi)發(fā)了AD9677、CP-331、679等二十余種藥物，它們對(duì)P3-AR具有高度選擇性，在動(dòng)物模型中效果肯定。另外，多酚類(lèi)物質(zhì)減肥作用的研究也小有成果，現(xiàn)已經(jīng)開(kāi)發(fā)出減肥保健品茶多酚(EGCG)。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期服用茶多酚(4g/d)不僅可以減少體內(nèi)脂肪的積累，而且對(duì)促進(jìn)肝臟中脂質(zhì)的代謝都有促進(jìn)作用。但其缺點(diǎn)是作用時(shí)間長(zhǎng)。綜上所述，現(xiàn)在仍然缺少一種理想的減肥作用靶點(diǎn)以及針對(duì)該靶點(diǎn)的有效的、作用時(shí)間短、安全性好的減肥藥物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供白藜蘆醇的用途，用于提高脂肪組織或脂肪細(xì)胞中Sirtl蛋白、PGC-1蛋白、或UCP-l蛋白的表達(dá)量。本發(fā)明的另一目的在于提供一種組合物，所述的組合物含有有效量的白藜蘆醇，以及食品學(xué)或藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的另一目的在于提供Sii"tl基因或蛋白的用途，用于制備減肥的食物或藥物；或篩選減肥的食物或藥物。在本發(fā)明的第一方面，提供白藜蘆醇的用途，用于制備提高Sirtl蛋白、PGOl蛋白、或UCP-1蛋白的表達(dá)量的組合物。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述的組合物同時(shí)提高Sirtl蛋白、PGC-l蛋白、和UCP-1蛋白的表達(dá)量。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)量的提高為比正常表達(dá)量提高10%;更優(yōu)選的，比正常表達(dá)量提高20%;進(jìn)一步優(yōu)選的，比正常表達(dá)量提高30%;最優(yōu)選的，比正常表達(dá)量提高50%或更高。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的組合物含有0.01—49.9mg白藜蘆醇/劑。在本發(fā)明的第二方面，提供一種組合物，所述的組合物含有有效量的白藜蘆醇，以及食品學(xué)或藥學(xué)上可接受的載體。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的組合物為單元?jiǎng)┬?，含有白藜蘆醇0.01—49.9mg/劑。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的組合物的劑型為口服制劑，更佳地為顆粒劑、膠囊、片劑、粉末劑、口服液、混懸液、或乳劑。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的藥學(xué)上或食品上學(xué)可接受的載體或賦形劑選自填充劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、助流劑、泡騰劑、矯味劑、包覆材料、膳食制品、或緩/控釋劑。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，含有白藜蘆醇0.01-4.9mg/劑；更優(yōu)選的，含有白藜蘆醇0.05—4.0mg/劑；進(jìn)一步優(yōu)選的，含有白藜蘆醇0.1—3.0mg/劑；最優(yōu)選的，含有白藜蘆醇0.2—2.0mg/劑；比如，可含有白藜蘆醇0.5mg/劑，0.8mg/劑，1.0mg/劑，1.5mg/劑，1.8mg/劑，或2.0mg/劑。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，含有白藜蘆醇6-49.9mg/劑；更優(yōu)選的，含有白藜蘆醇8—45mg/劑；進(jìn)一步優(yōu)選的，含有白藜蘆醇12—35mg/劑；進(jìn)一步更優(yōu)選的，含有白藜蘆醇15—30mg/劑；最優(yōu)選的，含有白藜蘆醇18—25mg/劑；比如，可含有白藜蘆醇20mg/劑，22mg/齊IJ，24mg/劑，或25mg/劑。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，每天服用1劑、2劑、或3劑本發(fā)明組合物。在本發(fā)明的第三方面，提供所述的組合物的用途，其特征在于，用于提高Sirtl蛋白、PGC-l蛋白、或UCP-l蛋白的表達(dá)量。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的組合物用于同時(shí)提高Sirtl蛋白、PGC-1蛋白、和UCP-1蛋白的表達(dá)量。在本發(fā)明的第四方面，提供一種減肥的方法，給予受試者有效量的白藜蘆醇。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，給予受試者0.01—49.9mg/劑的白藜蘆醇。在本發(fā)明的第五方面，提供一種Sirtl基因或蛋白的用途，用于(i)制備預(yù)防、控制或治療肥胖或肥胖相關(guān)疾病的食物或藥物；或(ii)篩選預(yù)防、控制或治療肥胖或肥胖相關(guān)疾病的食物或藥物。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的肥胖相關(guān)疾病包括但不限于體內(nèi)脂肪積累導(dǎo)致的疾病、糖尿病、脂肪肝、肝臟肥大、脂質(zhì)代謝異常等。在本發(fā)明的第六方面，提供一種篩選增加Sirtl蛋白表達(dá)的物質(zhì)(進(jìn)而作為減肥候選物質(zhì))方法，包括步驟(a)在測(cè)試組中，向表達(dá)Sirtl蛋白的體系中添加待篩選的候選物，并檢測(cè)Sirtl蛋白的表達(dá)情況；(b)將步驟(a)測(cè)試組中Sirtl蛋白的表達(dá)情況與添加所述候選物的對(duì)照組中Sirtl蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行比較，如果測(cè)試組中Sirtl蛋白的表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上多于(優(yōu)選明顯多于，比如多10%,更優(yōu)選地多20%，最優(yōu)選的多30%或更多)對(duì)照組，就表明該候選物是增加Sirtl蛋白表達(dá)的物質(zhì)。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)Sirtl蛋白的體系為細(xì)胞，動(dòng)物模型、或溶液體系。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。圖1顯示了白藜蘆醇(RV)對(duì)小鼠體重的影響。其中，低脂表示低脂肪詞料對(duì)照組；高脂表示高脂肪飼料對(duì)照組；RV(L)表示白藜蘆醇給藥濃度為2.5mg/kg/d;RV(H)表示白藜蘆醇給藥濃度為25mg/kg/d。圖2顯示了高脂組小鼠與高脂+低劑量白藜蘆醇組小鼠的對(duì)比照片。圖3顯示了HPLC檢測(cè)反式或順式白藜蘆醇含量示意圖，并且隨著天數(shù)的不同而不同。圖4顯示了低劑量和高劑量的反式白藜蘆醇含量的量化統(tǒng)計(jì)比較。圖5顯示了低脂組、高脂組、高脂低劑量白藜蘆醇組和高脂高劑量白藜蘆醇組小鼠體內(nèi)脂肪含量的變化。圖6顯示了低脂組、高脂組、高脂低劑量白藜蘆醇組和高脂高劑量白藜蘆醇組小鼠體內(nèi)脂肪率的變化。圖7顯示了高脂組、高脂低劑量白藜蘆醇組小鼠的腹部解剖圖，可見(jiàn)高脂低劑量白藜蘆醇組小鼠的白色脂肪組織明顯比高脂對(duì)照組有明顯減少。圖8顯示了在高倍鏡(X200)下觀察褐色脂肪(BAT)切片，可見(jiàn)高脂白藜蘆醇干預(yù)組小鼠脂肪細(xì)胞比高脂組明顯變小。圖9顯示了在高倍鏡(X200)下觀察腹部脂肪(IWAT)切片，顯示高脂且白藜蘆醇干預(yù)組小鼠的脂肪細(xì)胞比高脂組明顯變小。圖IO顯示了在高倍鏡(X200)下觀察附睪脂肪(EWAT)切片，顯示高脂且白藜盧醇干預(yù)組小鼠的脂肪細(xì)胞比高脂組明顯變小。圖ll顯示了低脂組、高脂組、高脂低劑量白藜蘆醇組和高脂高劑量白藜蘆醇組小鼠能量攝入量的比較。圖12顯示了正常狀態(tài)下低脂組、高脂組、高脂低劑量白藜蘆醇組小鼠的體溫變化。圖13顯示了饑餓狀態(tài)下低脂組、高脂組、高脂低劑量白藜蘆醇組的小鼠體溫變化。圖14顯示了低脂組、高脂組、高脂低劑量白藜蘆醇組小鼠的褐色脂肪細(xì)胞線(xiàn)粒體電鏡圖(X8400倍)。圖15顯示了低脂組、高脂組、高脂低劑量白藜蘆醇組小鼠的白色脂肪細(xì)胞線(xiàn)粒體電鏡圖(X8400倍)。圖16顯示了低脂組、高脂組、高脂低劑量白藜蘆醇組小鼠的褐色脂肪線(xiàn)粒體面積統(tǒng)計(jì)。圖17顯示了低脂組、高脂組、高脂低劑量白藜盧醇組小鼠的白色脂肪線(xiàn)粒體面積統(tǒng)計(jì)。圖18顯示了小鼠脂肪組織中，SIRT1、PGC-1、PTP-1B和UCP1蛋白的表達(dá)情況。圖19顯示了低脂組、高脂組、高脂低劑量白藜蘆醇組、高脂高劑量白藜蘆醇組小鼠的脂肪組織中，SIRT1、PGC-1、PTP-1B和UCP1蛋白的灰度的統(tǒng)計(jì)。圖20顯示了3T3-L1細(xì)胞中，SIRT1、PGC-l蛋白的變化。圖21顯示了原代脂肪細(xì)胞中，SIRT1、PGC-1蛋白的變化。具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠顯著地提高脂肪組織或脂肪細(xì)胞中Sirtl(sirtuin1)蛋白、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體Y共激活因子-1(PGC-1)蛋白、和解偶聯(lián)蛋白-1(UCP-l蛋白)的表達(dá)量。此外，本發(fā)明人還首次發(fā)現(xiàn)，低劑量的白藜蘆醇就可顯著提高Sirtl蛋白、PGC-1蛋白、或UCP-1蛋白的表達(dá)量，進(jìn)而提供良好的減肥效果，并且低劑量的效果明顯好于高劑量?；诖送瓿闪吮景l(fā)明。白黎盧醇(Resveratrol，Res)，化學(xué)名稱(chēng)為芪三酚(3，4，，5，-三羥基芪)，分子式CmH,203，分子量228.25，反式白黎蘆醇(有活性)如式(I)所示，順式白黎蘆醇(無(wú)活性)如式(II)所示。目前己知有70多種植物中含有白藜蘆醇，其中在葡萄、花生、桑椹以及中藥虎帳中含量特別豐富。它是一種活性非黃酮類(lèi)多酚化合物，呈白色針狀晶體，難溶于水，能溶于乙醇、乙酸乙酯，丙酮等極性強(qiáng)的溶劑中；以游離態(tài)(順式、反式)和糖苷結(jié)合態(tài)(順式、反式)兩種形式存在，反式白藜蘆醇在光照條件下容易變成順式白藜蘆醇。因此，可將白藜蘆醇或含有白藜蘆醇的制劑裝在具有避光作用的容器中，比如棕色瓶中。迄今為止的研究表明，白藜蘆醇具有抗腫瘤、抗氧化、抗心血管疾病、抗細(xì)菌、抗炎、抑制血小板凝集、調(diào)節(jié)免疫、化學(xué)預(yù)防等作用。白藜蘆醇可以降低血清中膽固醇及甘油三酯的含量。但是，白藜蘆醇的以往的研究集中于降低心血管疾病發(fā)病率、抗腫瘤、抗氧化等方面的研究，目前還沒(méi)有其關(guān)于減肥方面的研究報(bào)道。且由于它是一種天然植物中含有的物質(zhì)，因此安全性高。本發(fā)明證實(shí)了白藜蘆醇具有良好的減肥效果，因此其可以作為一種安全可靠的減肥制品。在本發(fā)明中，對(duì)于制備白藜蘆醇的方法沒(méi)有特別的限制，比如其可以提取自植物，或者可以采用化學(xué)合成的方法來(lái)制備。一種優(yōu)選的方法是從植物中提取白藜蘆醇，所述的植物包括但不限于葡萄、花生、桑椹、或中藥虎杖。為了研究白藜戸醇的減肥效果，本發(fā)明人首先利用高脂食物誘導(dǎo)肥胖小鼠，建立肥胖模型。通過(guò)給水口服方式用白藜蘆醇對(duì)肥胖鼠進(jìn)行干預(yù)。經(jīng)過(guò)喂養(yǎng)后，對(duì)給藥組與高脂肪對(duì)照組進(jìn)行外形、體重、生理生化等指標(biāo)的比較，驗(yàn)證白藜盧醇的減肥效果。進(jìn)一步地，本發(fā)明人還研究了白藜蘆醇減肥的機(jī)制。首先驗(yàn)證白藜蘆醇干預(yù)后的小鼠體重減輕的部位為脂肪組織，之后在能量攝入和能量消耗兩方面進(jìn)行了減肥效果的研究。排除了減肥作用是由于抑制食欲而引發(fā)后，進(jìn)一步通過(guò)檢測(cè)體溫的變化，發(fā)現(xiàn)給藥后的小鼠產(chǎn)熱增加。繼而通過(guò)檢測(cè)脂肪組織中產(chǎn)能細(xì)胞器線(xiàn)粒體的增加、生熱相關(guān)蛋白的變化進(jìn)一步驗(yàn)證了小鼠產(chǎn)熱確實(shí)有所增加。根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)白藜蘆醇通過(guò)促進(jìn)脂肪組織中Sirtl、PGC-1、UCP1蛋白表達(dá)，提高小鼠產(chǎn)熱，加快能量消耗，提高脂肪代謝率，從而達(dá)到減肥的效果。因此，本發(fā)明提供了白藜蘆醇的用途，用于提高脂肪組織或脂肪細(xì)胞中Sirtl蛋白、PGC-l蛋白、或UCP-l蛋白的表達(dá)量。本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以提高脂肪組織或脂肪細(xì)胞中Sirtl蛋白、PGC-1蛋白、或UCP-1蛋白的表達(dá)量。而Sirtl蛋白、PGC-1蛋白、或UCP-1蛋白是脂肪代謝相關(guān)的蛋白，因此，白藜蘆醇可通過(guò)提高這些蛋白的表達(dá)來(lái)促進(jìn)脂肪的代謝，從而達(dá)到減肥的目的。在本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，白藜蘆醇能夠同時(shí)提高Sirtl蛋白、PGC-1蛋白、和UCP-l蛋白的表達(dá)量。在本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，白藜蘆醇通過(guò)提高Sirtl蛋白的表達(dá)，從而增加了PGOl蛋白的表達(dá)，從而引起動(dòng)物產(chǎn)熱增加，達(dá)到減肥的效果。本發(fā)明還提供了一種組合物，所述的組合物含有有效量的白藜蘆醇，以及食品學(xué)或藥學(xué)上可接受的載體。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"含有"或"包括"包括了"包含"、"基本上由......構(gòu)成"、和"由......構(gòu)成"。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的"或"食品學(xué)上可接受的"的成分是適用于人和/或動(dòng)物而無(wú)過(guò)度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"有效量"是指可對(duì)人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動(dòng)物所接受的量。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的載體"指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語(yǔ)指這樣一些藥劑載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒(méi)有過(guò)分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟矢口的。在Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的賦形劑的充分討論。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、助流劑、泡騰劑、潤(rùn)濕劑或乳化劑、矯味劑、pH緩沖物質(zhì)等。本發(fā)明的組合物中，白藜蘆醇也可以以"生理學(xué)可接受的鹽"或"生理學(xué)可接受的酸或堿衍生的鹽"形式使用。此外，還可以使用含有白藜蘆醇的提取物或混合物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"本發(fā)明的組合物"包括藥物組合物、食物組合物和/或膳食添加劑。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"單元?jiǎng)┬?是指為了服用方便，將本發(fā)明的組合物制備成單次服用所需的劑型，包括但不限于各種固體劑(如片劑)、液體劑、膠囊劑、緩釋劑。所述的單元?jiǎng)┬椭泻袑?duì)于提高Sirtl蛋白、PGC-1蛋白、或UCP-l蛋白的表達(dá)量有效的本發(fā)明的組合物；或者含有對(duì)于減肥有效的本發(fā)明的組合物。本發(fā)明中，當(dāng)將所述的組合物制備成單元?jiǎng)┬蜁r(shí)，含有白藜蘆醇0.01—49.9mg/劑；在本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，含有白藜蘆醇0.01-4.9mg/劑；更優(yōu)選的，含有白藜蘆醇0.05—4.0mg/劑；進(jìn)一步優(yōu)選的，含有白藜戸醇0.1—3.0mg/劑；最優(yōu)選的，含有白藜蘆醇0.2—2.0mg/劑；比如，可含有白藜蘆醇0.5mg/劑，0.8mg/劑，1.0mg/齊U，1.5mg/劑，1.8mg/劑，或2.0mg/劑。在本發(fā)明的另一種優(yōu)選方式中，所述的單元?jiǎng)┬秃邪邹继J醇6-49.9mg/劑；更優(yōu)選的，含有白藜蘆醇8—45mg/劑；進(jìn)一步優(yōu)選的，含有白藜戸醇12—35mg/劑；進(jìn)一步更優(yōu)選的，含有白藜蘆醇15—30mg/劑；最優(yōu)選的，含有白藜蘆醇18—25mg/劑；比如，可含有白藜蘆醇20mg/劑，22mg/劑，24mg/劑，或25mg/劑。所述的組合物每天服用的劑量在1-5劑為宜；優(yōu)選的為1劑、2劑、或3劑；最優(yōu)選的，每天服用的劑量為l劑。上述劑量可根據(jù)體重進(jìn)行適當(dāng)增減。本發(fā)明的組合物可直接用于預(yù)防、緩解或治療肥胖，或可與其它藥物或膳食添加劑共同使用。本發(fā)明還提供了一種Sirtl基因或蛋白的用途，用于制備減肥的食物或藥物；或篩選減肥的食物或藥物。在本發(fā)明的一種方式中，可釆用通過(guò)基因工程手段制備的重組的Sirtl基因或蛋白。本發(fā)明也可采用經(jīng)修飾或改良的Sirtl基因或蛋白，比如，可采用為了促進(jìn)其半衰期、有效性、代謝、和/或蛋白的效力而加以修飾或改良的Sirtl蛋白。所述經(jīng)過(guò)修飾或改良的Sirtl蛋白可以是一種共軛物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述經(jīng)過(guò)修飾或改良的Sirtl蛋白可以是與天然存在的Sirtl蛋白具有較小的共同點(diǎn)，但也能預(yù)防、控制或治療哺乳動(dòng)物的肥胖，且不會(huì)帶來(lái)其它不良影響或毒性。也就是說(shuō)，任何不影響Sirtl基因或蛋白的生物活性的變化形式都可用于本發(fā)明中。在本發(fā)明一種方式中，可將所述的Sirtl蛋白直接給藥于哺乳動(dòng)物(比如人)，或者，可將編碼Sirtl蛋白的基因通過(guò)常規(guī)的方法克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中，將所述的載體導(dǎo)入到可表達(dá)所述Sirtl蛋白的細(xì)胞中，使所述的細(xì)胞表達(dá)Sirtl蛋白。優(yōu)選的，可將編碼Sirtl蛋白的基因或攜帶所述基因的載體通過(guò)常規(guī)的方法引入到靶細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)Sirtl蛋白的表達(dá)。所述的靶細(xì)胞包括但不限于脂肪細(xì)胞、前脂細(xì)胞等。由于本發(fā)明人第一次將Sirtl蛋白表達(dá)的升高與肥胖相關(guān)聯(lián)，因此，本發(fā)明還提供了一種篩選增加Sirtl蛋白表達(dá)的物質(zhì)方法，即建立Sirtl蛋白表達(dá)系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中加入候選物質(zhì)，判斷候選物質(zhì)對(duì)于Sirtl蛋白表達(dá)量的影響。如果Sirtl蛋白的表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上多于對(duì)照組，就表明該候選物是增加Sirtl蛋白表達(dá)的物質(zhì)。所述物質(zhì)可作為一種有潛力的減肥藥物。因此，本發(fā)明還包括通過(guò)所述篩選方法獲得的增加Sirtl蛋白表達(dá)的物質(zhì)。本發(fā)明還提供了一種減肥的方法，給予受試者有效量的白藜蘆醇。在本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，給予受試者白藜蘆醇的量為0.01—4.9mg/60kg體重/天；更優(yōu)選的，給予受試者白藜蘆醇的量為0.05—4.0mg/60kg體重/天；進(jìn)一步更優(yōu)選的，給予受試者白藜蘆醇的量為0.1—3.0mg/60kg體重沃；最優(yōu)選的，給予受試者白藜蘆醇的量為0.2—2.0mg/60kg體重/天；比如，每劑可給予受試者白藜蘆醇的量為0.5mg/60kg體重/天、0.8mg/60kg體重/天、l.Omg/60kg體重/天、或1.5mg/60kg體重/天。在一天中，可以將所述的量單次給予或多次給予。在本發(fā)明的另一種優(yōu)選方式中，給予受試者白藜蘆醇的量為6—49.9mg/60kg體重/天；更優(yōu)選的，給予受試者白藜蘆醇的量為8—45mg/60kg體重/天；進(jìn)一步更優(yōu)選的，給予受試者白藜蘆醇的量為12—35mg/60kg體重/天；最優(yōu)選的，給予受試者白藜蘆醇的量為15—30mg/60kg體重/天；比如，每劑可給予受試者白藜蘆醇的量為20mg/60kg體重/天、22mg/60kg體重/天、或24mg/60kg體重/天。在一天中，可以將所述的量單次給予或多次給予。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于-(1)首次提出并證實(shí)白藜蘆醇可用于減肥，發(fā)現(xiàn)低劑量的白藜蘆醇就具有良好的減肥效果，并且低劑量的效果明顯好于高劑量。(2)首次提出SIRT1可以作為預(yù)防、控制或治療肥胖的靶蛋白，白藜蘆醇可以上調(diào)SIRT1蛋白的表達(dá)水平。(3)由于白藜蘆醇是一種非常昂貴的物質(zhì)，因此，本發(fā)明的低劑量的白藜蘆醇大大降低了減肥藥物或減肥食品的成本。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另行定義，文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例l白藜蘆醇的配制采用的白藜蘆醇原料購(gòu)自Sigma公司，商品號(hào)R5010。1.配制用于后續(xù)試驗(yàn)的25mg/L白藜蘆醇溶液將25mg白藜戸醇配制于1L的潔凈水中。2.配制用于后續(xù)試驗(yàn)的250mg/L白藜蘆醇溶液將250mg白藜戶(hù)醇配制于1L的潔凈水中。3.配制用于人類(lèi)的白藜盧醇的食物組合物、保健品或藥物組合物。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>采用常規(guī)的配制組合物的方法配制上述的白藜蘆醇的食物組合物或藥物組合物。實(shí)施例2白藜蘆醇的減肥作用本實(shí)施例的目的是要驗(yàn)證白藜蘆醇的減肥效果，因此本發(fā)明人建立了肥胖鼠模型，一般用于實(shí)驗(yàn)研究的肥胖動(dòng)物模型按照病因主要分為5類(lèi)遺傳性肥胖、營(yíng)養(yǎng)性肥胖、缺少活動(dòng)性肥胖、內(nèi)分泌性肥胖和下丘腦性肥胖模型。在人類(lèi)，肥胖患者多為單純性肥胖(約占肥胖人群總數(shù)的95%)，而目前所建立的遺傳性肥胖模型如ob/ob，db/db，fa/fa等基因突變的動(dòng)物模型在人類(lèi)僅有個(gè)例報(bào)道，本實(shí)施例通過(guò)建立營(yíng)養(yǎng)性肥胖小鼠模型以模擬人類(lèi)肥胖的主要模式，從而對(duì)單純性肥胖的藥物治療進(jìn)行研究。首先利用高脂食物誘導(dǎo)肥胖小鼠，建立肥胖模型。通過(guò)給水口服方式用白藜蘆醇對(duì)肥胖鼠進(jìn)行干預(yù)。經(jīng)過(guò)18周喂養(yǎng)后，對(duì)給藥組與高脂肪對(duì)照組進(jìn)行外形、體重、生理生化等指標(biāo)的比較，驗(yàn)證白藜蘆醇的減肥效果。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性C57BL/6J小鼠，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)。飼料配方低脂肪含量飼料脂肪4.3gm%(10kcal%);高脂肪含量飼料脂肪24gm%(45kcal%)。1.髙脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠模型的建立32只小鼠按照體重隨機(jī)分為四組①低脂對(duì)照組8只，平均體重18.65g;②高脂對(duì)照組8只，平均體重18.31g;③高脂低濃度給藥組8只，平均體重18.99g;④高脂高濃度給藥組8只，平均體重18.46g。四組小鼠平行飼養(yǎng)。小鼠三周斷奶后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，均給予普通飼料。適應(yīng)環(huán)境一周后按照下述給水和喂食方法飼養(yǎng)。低脂對(duì)照組給予低脂飼料、潔凈水，能夠自由取食、飲水。高脂對(duì)照組及高脂給藥組均給予高脂飼料，高脂對(duì)照組的飲水給予潔凈水，高脂低濃度給藥組的飲水給予含白藜蘆醇25mg/L的潔凈水、高脂高濃度給藥組的飲水給予含白藜蘆醇250mg/L的潔凈水。每組動(dòng)物均可以自由取食、飲水。實(shí)驗(yàn)室溫度2125T:，相對(duì)濕度4070%，晝夜比12:12。每周三次投食，記錄投食量和撤食量，每周稱(chēng)體重一次，并記錄。喂養(yǎng)18周。2.干預(yù)用藥白藜蘆醇分子式(:14仏203，購(gòu)自sigma公司，批號(hào)R5010。干預(yù)劑量及方法低濃度2.5mg/kg/d，高濃度25mg/kg/d各干預(yù)組小鼠將藥物溶于適量純凈水(每只小鼠日攝水量約為3mL)。采用自然飲水口服給藥方法，經(jīng)過(guò)HPLC檢測(cè)驗(yàn)證，兩天換藥一次，可以保持藥效不失活。對(duì)照組小鼠僅給予潔凈水。3.動(dòng)物取血及組織樣品采集實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁食12小時(shí)，實(shí)驗(yàn)時(shí)首先稱(chēng)量動(dòng)物體重，測(cè)量肛門(mén)體溫；依照體重值注射適量戊巴比妥鈉(40mg/kg)，待麻醉后取血lmL/只，血樣離心(14000rpm，10min，4。C)取血清，每份血清各分兩管，一部分用于測(cè)量血脂等生化指標(biāo)，一部分-8(TC保存用于測(cè)胰島素含量；之后解剖腹腔，灌注生理鹽水剝離四組小鼠的腹部白色脂肪組織(IWAT)、附睪脂肪組織(EWAT)、褐色脂肪組織(BAT)，生理鹽水沖洗后將各組織塊分為兩份，一份用于冰凍切片的組織固定準(zhǔn)備切片，另一份直接液氮速凍后-8(TC保存。4.冰凍切片將所取小塊脂肪組織分別用4y。多聚甲醛(PFA)固定，PBS沖洗后依次用10%、20%、30%濃度的蔗糖溶液脫水，最后經(jīng)OCT包埋后凍存準(zhǔn)備進(jìn)行切片。切片厚度為5uM，切片后晾干、蘇木精伊紅(HE)染色，每個(gè)標(biāo)本取2-4張切片，在200倍顯微鏡下觀察視野中脂肪細(xì)胞的大小。結(jié)果1.白藜蘆醇可抑制高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠體重增加本實(shí)施例參考國(guó)內(nèi)外報(bào)道的高脂、高能詞料喂養(yǎng)小鼠(參見(jiàn)Hildebrandt，A.L.等，AntiobesityeffectsofchroniccannabinoidCBlreceptorantagonisttreatmentindiet-inducedobesemice.EuropeanJournalofPharmacology2003.462:125-132;或Chen,L等，Nyomba.GlucoseIntoleranceandResistinExpressioninRatOffspringExposedtoEthanolinUtero:ModulationbyPostnatalHigh-FatDiet.Endocrinology.2003,144:500-508;或Bagnasco,M.等，LeptinExpressionInHypothalamicPvnReversesDietaryObesityAndHyperinsulinemiaButStimulatesGhrelin.ObesRes.2003.11:1463-1470)。按照實(shí)驗(yàn)方法所述飼養(yǎng)18周，得到體重變化曲線(xiàn)如圖l所示。從高脂對(duì)照組和高脂低濃度給藥組中各取得體重接近組內(nèi)平均體重的小鼠拍照，結(jié)果如圖2，可以看到外形上的變化。由圖l可以看出，低脂對(duì)照和高脂對(duì)照組相比，喂養(yǎng)四周后體重有明顯差異，說(shuō)明模型建立是成功的。而高脂對(duì)照組與給藥組相比，喂養(yǎng)10周時(shí)低濃度組開(kāi)始出現(xiàn)顯著性差異(P〈0.05):高脂肪對(duì)照組平均體重增加14.83克，低濃度給藥組增加10.63克；此時(shí)，高濃度給藥組體重增加12.39克，和高脂肪對(duì)照組無(wú)明顯差異。低脂對(duì)照組中平均體重增加7.71克。高濃度給藥組在喂養(yǎng)14周時(shí)開(kāi)始有顯著性差異高脂肪對(duì)照組平均體重增加17.69克，高濃度給藥組體重增加13.79克；此時(shí)，低濃度給藥組增加13.50。低脂對(duì)照組中平均體重增加7.71克。由此說(shuō)明，白藜盧醇具有良好的減肥效果，并且低劑量的減肥效果好于高劑量。2.白藜盧醇的給藥方式可以有效減緩其變性白藜蘆醇是一種見(jiàn)光易變性的多酚類(lèi)化合物，其有效形式為反式結(jié)構(gòu)(trans-resveratrol)，當(dāng)反式結(jié)構(gòu)的白藜蘆醇受光照10小時(shí)后，80%都變性為順式結(jié)構(gòu)(cis-resveratrol)，而順式結(jié)構(gòu)沒(méi)有藥力效果。因此，本發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)中對(duì)白藜盧醇的處理方式進(jìn)行檢測(cè)。采用鋁箔包裹裝有含白藜蘆醇的飲用水，然后通過(guò)飲用水給藥。本發(fā)明人通過(guò)HPLC的方法檢測(cè)經(jīng)過(guò)避光處理的白藜蘆醇在第2天和第3天的有效成分。結(jié)果如圖3，圖4。圖3所示HPLC測(cè)定結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)條件下，經(jīng)過(guò)避光處理后的白藜蘆醇可以減緩反式結(jié)構(gòu)變?yōu)轫樖浇Y(jié)構(gòu)的速度。圖4的量化統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇分別放置2天和3天后，低濃度白藜蘆醇中反式結(jié)構(gòu)的殘余量仍高達(dá)97.68%和95.41%，與原液濃度相比沒(méi)有顯著性差異；高濃度白藜蘆醇中的殘余量也達(dá)到92.06%和74.73%，與原液濃度的比值分別出現(xiàn)顯著性差異，*P<0.05，**P<0.01。由此說(shuō)明，試驗(yàn)中對(duì)白藜蘆醇的處理是有效的，可以保證實(shí)驗(yàn)的可靠性。3.白藜蘆醇通過(guò)抑制脂肪的積累達(dá)到防治肥胖的效果本發(fā)明人還進(jìn)一步檢測(cè)了小鼠體重減輕是由哪個(gè)或哪些組織的重量減輕引起的，以及減少的成份是脂肪、其它器官還是體液。本發(fā)明人利用核磁共振儀檢測(cè)了活體小鼠體內(nèi)脂肪含量的變化。結(jié)果如圖5，圖6所示。由圖5和圖6可見(jiàn)，與高脂對(duì)照組與低脂對(duì)照組相比，脂肪含量有顯著性的增加，再次證明實(shí)驗(yàn)中建立的肥胖小鼠模型是可靠的。低濃度給藥組與高脂對(duì)照組相比，脂肪含量減少約5g，且有顯著性差異(P〈0.01)。結(jié)合圖l顯示體重的變化可以看出，低濃度給藥組的體重變化量較高脂對(duì)照組大約也是5g左右。提示白藜蘆醇的體重減輕部位是在脂肪組織，證實(shí)了它的減肥效果。圖6所示的脂肪率的變化趨勢(shì)與圖5所示的脂肪含量變化趨勢(shì)相同。此外，喂養(yǎng)18周后，進(jìn)行腹部解剖發(fā)現(xiàn)，腹部脂肪以及內(nèi)臟大網(wǎng)膜脂肪都有明顯減少，其他組織器官未見(jiàn)明顯變化，如圖7所示。由圖7可見(jiàn)，低濃度給藥組的白色脂肪組織明顯較高脂對(duì)照組有明顯減少，為了進(jìn)一步確認(rèn)脂肪細(xì)胞是否發(fā)生變化，進(jìn)一步作了白色脂肪組織和褐色脂肪組織的冰凍切片HE染色，高倍鏡(X200倍)下觀察腹部脂肪(IWAT)、附睪脂肪(EWAT)、褐色脂肪(BAT)細(xì)胞數(shù)目和體積的變化，結(jié)果如圖8、圖9、圖10所示。圖8、圖9、圖10中不同組間脂肪細(xì)胞的大小和數(shù)目存在明顯差異(HEX200)，高脂對(duì)照組的大型脂肪細(xì)胞數(shù)明顯多于低脂對(duì)照組，小型及中型細(xì)胞少；白藜蘆醇的高、低兩濃度給藥組中觀察到的肥胖小鼠大型脂肪細(xì)胞數(shù)明顯減少，小型和中型細(xì)胞數(shù)增加；低濃度變化趨勢(shì)與高濃度相同，且比高濃度的變化更顯著。與前面關(guān)于脂肪含量測(cè)定結(jié)果相符。此外，本發(fā)明人還采用了比2.5mg/kg/d更低劑量(如1.0mg/kg/d、L5rag/kg/d)的白藜蘆醇試驗(yàn)肥胖小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低劑量的白藜蘆醇具有良好的降脂、減肥的作用。本實(shí)施例中，選用斷奶后的C57BL/6J小鼠分別用高脂飼料喂養(yǎng)三組和低脂飼料喂養(yǎng)一組，其中白藜蘆醇(高、低兩種濃度分別采用給水口服的方式)干預(yù)其中兩組高脂喂養(yǎng)組。通過(guò)十八周的喂養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇干預(yù)后可降低肥胖小鼠體重，而通過(guò)對(duì)脂肪含量的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，減重的部位就是脂肪組織，且從脂肪細(xì)胞的冰凍切片圖可以看出，脂肪細(xì)胞大小也有顯著變化。同時(shí)，白藜蘆醇干預(yù)后對(duì)血清總膽固醇、血清低密度脂蛋白等指標(biāo)均有明顯的影響，以上結(jié)果均顯示出白藜盧醇有較好的減肥作用。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，白藜蘆醇的干預(yù)濃度為2.5mg/kg/d或該濃度以下時(shí)對(duì)于鼠的減肥效果較好。根據(jù)一般的換算規(guī)律，換算為人用量，則服用藥量為約在0.1-15mg/60kg/d。與以往報(bào)道的減肥藥物茶多酚、脂酶抑制劑CT-II等比較而言，白藜戸醇可以通過(guò)較少的使用量達(dá)到減肥效果(其中，茶多酚(EGCG)減月巴齊lj量為4g/d(JonesJR等，DeletionofPPARgammainadiposetissuesofmiceprotectsagainsthighfatdiet-inducedobesityandinsulinresistance.PNAS.2005，102(17):6207-12);脂酶抑制劑CT-II減肥劑量為50g/d(MYamamoto.Anti-obesityeffectsoflipaseinhibitorCT-II，anextractfromedibleherbs,NomameHerba，onratsfedahigh-fatdiet.Internationaljournalofobesity.2000,24:758-764);大麻的CBl受體抑制劑Rimonabant的減肥劑量為0.5g/d(B.Poirier等，Theanti-obesityeffectofrimonabantisassociatedwithanimprovedserumlipidprofile.Diabetes,obesityandmetabolism.2005,7:65-72))。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)小鼠服用白藜蘆醇后除以上檢測(cè)指標(biāo)變化外，其它表型均未發(fā)現(xiàn)不正常，由此證實(shí)白藜蘆醇濃度安全性的假設(shè)即白藜蘆醇來(lái)源于植物中，是一種天然化合物，產(chǎn)生副作用的可能性很低。目前常用的減肥藥副作用較大、治療周期長(zhǎng)、減肥效果一般(一般減重不超過(guò)體重的5%)而且價(jià)格昂貴，所以白藜蘆醇作為一種新型的副作用小、服用劑量低(因而可有效降低成本)的減肥藥，有很廣闊的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)前景。試驗(yàn)中白藜蘆醇干預(yù)濃度選用兩種，其中低濃度為在自然狀態(tài)下水溶液中的溶解值，高濃度為10倍于低濃度的濃度。從試驗(yàn)結(jié)果上看，低濃度的減肥效果反而優(yōu)于高濃度，如體重變化、脂肪含量、脂肪細(xì)胞大小等。從而證實(shí)藥物效果并非濃度越大越好。隨著年齡增加，人類(lèi)體內(nèi)的總體脂量及相對(duì)脂量增加，肥胖的發(fā)病率增高。在本實(shí)施例中，從造模開(kāi)始到小鼠處死共18周，隨著鼠齡的增加，高脂對(duì)照組小鼠發(fā)生肥胖的趨勢(shì)也逐漸增加，因此在肥胖的發(fā)病過(guò)程中，年齡也是一個(gè)不可忽視的因素。白藜蘆醇的干預(yù)可以抑制高脂肪飲食誘導(dǎo)產(chǎn)生的肥胖，但隨著鼠齡的增長(zhǎng)，體重仍會(huì)繼續(xù)增加，但增加幅度較高脂肪對(duì)照組有明顯減緩。實(shí)施例3白藜戸醇減肥機(jī)理通過(guò)體內(nèi)和體外試驗(yàn)對(duì)白藜戸醇的減肥機(jī)理進(jìn)行初步研究。肥胖是由于能量攝入與消耗不平衡所導(dǎo)致的，因此本實(shí)施例主要集中在白藜蘆醇干預(yù)后的小鼠在能量攝入和消耗的變化。通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)觀察能量攝入、產(chǎn)熱、線(xiàn)粒體變化以及體內(nèi)體外試驗(yàn)檢測(cè)產(chǎn)能相關(guān)蛋白PGC-1和UCP1的變化，結(jié)果表明，白藜蘆醇的減肥作用不是通過(guò)影響能量攝入，而是通過(guò)增加SIRT1、PGC-1或UCP1的表達(dá)，進(jìn)而提高能量消耗而實(shí)現(xiàn)的。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性C57BL/6J小鼠32只，3周齡，體重1619克，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)。主要儀器AL104型電子天平，Mettler公司DT-1TB型電子體溫計(jì)，上海華辰醫(yī)用儀表有限公司LKB-I型超薄切片機(jī)，LEICA公司CM-120透射電鏡，PHILIPS公司主要試劑白藜蘆醇購(gòu)自Sigma公司，商品號(hào)R5010一抗Anti-PGC-l(H-300)，購(gòu)自SANTACRUZ公司，貨號(hào)sc-13067Anti-UCP1，購(gòu)自CHEMICON公司，貨號(hào)AB3038Anti-PTP-1B，購(gòu)自UPSTATE公司，貨號(hào)07-088Anti-Sirtl，購(gòu)自UPSTATE公司，貨號(hào)05-707二抗Anti-Mouse、Anti-Rabbit,購(gòu)自Jackson公司主要方法1.攝能統(tǒng)計(jì)每周三次投食，記錄投食量與撤食量以計(jì)算攝食量，根據(jù)食物熱量含量可換算出攝能量。2.體溫的測(cè)定體溫計(jì)測(cè)量肛溫，測(cè)定方法如MasakiT等，Peripheral,butnotcentral,administrationofadiponectinreducesvisceraladiposityandupregulatestheexpressionofuncouplingproteininagoutiyellow(Ay/a)obesemice.Diabetes.2003,52(9):2266-73中的相關(guān)方法。3.電鏡觀察線(xiàn)粒體實(shí)驗(yàn)方法參考《細(xì)胞試驗(yàn)指南》，科學(xué)出版社，黃培堂等譯(2003)中第1161-1194頁(yè)所述的方法。4.Western檢測(cè)蛋白含量實(shí)驗(yàn)方法參考《抗體技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版社，沈關(guān)心、龔非力等譯(2002)中第161-184頁(yè)所述的方法。結(jié)果1.小鼠能量攝入與消耗的檢測(cè)(1)白藜戸醇不影響小鼠能量的攝入營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能量的吸收、儲(chǔ)存和消耗構(gòu)成了一個(gè)十分復(fù)雜的體內(nèi)平衡系統(tǒng)，從而保持相對(duì)恒定的能量?jī)?chǔ)備和體重。當(dāng)能量攝入大于能量消耗即產(chǎn)生脂肪堆積，引起肥胖。因此，首先本發(fā)明人通過(guò)記錄小鼠攝食量，比較四組實(shí)驗(yàn)小鼠的能量攝入情況，見(jiàn)圖11。如圖11所示，實(shí)驗(yàn)觀察小鼠試驗(yàn)后14周能量攝入情況。通過(guò)將14周的攝能累計(jì)進(jìn)行比較，可以看到低脂對(duì)照組的攝能量少于高脂飼料喂養(yǎng)的三組。高脂對(duì)照組與給藥組相比攝能量幾乎相同。說(shuō)明給藥干預(yù)并未影響小鼠飲食及攝能情況。(2)白藜蘆醇增加小鼠的產(chǎn)熱由于減肥的同時(shí)不影響能量攝入，那么必定與增加能量消耗有關(guān)。因此實(shí)驗(yàn)繼續(xù)對(duì)小鼠產(chǎn)熱能力進(jìn)行了檢測(cè)，采用測(cè)量體溫的方法測(cè)試產(chǎn)熱變化。結(jié)果如圖12、圖13所示。圖12中檢測(cè)了小鼠在正常狀態(tài)下的體溫，柱狀圖可以看出低脂對(duì)照組和高脂對(duì)照組的體溫相差不大；給藥組體溫較高脂對(duì)照組升高約0.8°C，有顯著性變化(P<0.02)。進(jìn)一步檢測(cè)白藜蘆醇干預(yù)后對(duì)適應(yīng)性產(chǎn)熱的影響，試驗(yàn)中將小鼠禁食12小時(shí)如圖13所示，檢測(cè)體溫發(fā)現(xiàn)，四組小鼠的體溫比照正常狀態(tài)時(shí)均有所下降。其中高脂對(duì)照組比低濃度給藥組的體溫大約低rC(P〈0.02)。結(jié)果顯示白藜蘆醇干預(yù)后小鼠的產(chǎn)熱較對(duì)照組有顯著性增加，此外還增加了適應(yīng)性產(chǎn)熱。提示其減肥作用是通過(guò)增加能量消耗產(chǎn)生減肥效果。結(jié)合前面發(fā)現(xiàn)減肥作用位置在脂肪組織，因此下面試驗(yàn)觀察小鼠脂肪細(xì)胞中提供能量的細(xì)胞器一一線(xiàn)粒體的變化。(3)白藜蘆醇干預(yù)后小鼠線(xiàn)粒體增多電鏡觀察小鼠白色脂肪和褐色脂肪細(xì)胞中線(xiàn)粒體的變化，如圖14、圖15。統(tǒng)計(jì)視野中線(xiàn)粒體所占面積比例，作柱狀圖量化線(xiàn)粒體體積的變化，如圖16、圖17所示。從電鏡照片觀察可見(jiàn)，褐色脂肪和白色脂肪在各組間的變化趨勢(shì)相同。低脂肪對(duì)照組線(xiàn)粒體數(shù)目多、總面積大，而高脂對(duì)照組的線(xiàn)粒體數(shù)目少，總面積小，同時(shí)脂滴面積及數(shù)目較低脂對(duì)照組有明顯增加，與冰凍切片結(jié)果相符。低濃度給藥組的線(xiàn)粒體數(shù)目比低脂對(duì)照組少，但比高脂對(duì)照組明顯增多。統(tǒng)計(jì)線(xiàn)粒體面積可見(jiàn)，白藜蘆醇低濃度干預(yù)后的給藥組，褐色脂肪線(xiàn)粒體的面積較高脂對(duì)照組增加一倍(P〈0.05),白色脂肪線(xiàn)粒體面積增加約一倍(P〈0.05)。結(jié)果提示，給藥后的小鼠脂肪細(xì)胞中的產(chǎn)能細(xì)胞器一一線(xiàn)粒體有顯著增加，進(jìn)一步證明了白藜蘆醇可能增加高脂肪飼養(yǎng)小鼠的產(chǎn)能功能。2.檢測(cè)與產(chǎn)能相關(guān)蛋白的變化(1)白藜蘆醇促進(jìn)脂肪組織產(chǎn)能蛋白的表達(dá)肥胖從根本上講是能量相對(duì)攝入量與能量消耗間平衡失調(diào)的結(jié)果。造成機(jī)體能量失調(diào)的原因非常復(fù)雜，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個(gè)與肥胖相關(guān)的基因，目前研究熱點(diǎn)集中在PGC-1、UCP1等蛋白。本試驗(yàn)為進(jìn)一步探討產(chǎn)能可能的分子機(jī)制，檢測(cè)了脂肪組織中很多相關(guān)蛋白表達(dá)。如圖18所示。圖18中用Western檢測(cè)四組小鼠脂肪組織中Sirtl、PGC-1、UCP1、PTP-IB蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇干預(yù)后Sirtl、PGC-1、UCP1的表達(dá)較高脂對(duì)照組有升高，統(tǒng)計(jì)條帶灰度可以量化比較條帶灰度的變化，如圖19所示Sirtl、PGC-1、UCP1在給藥組的表達(dá)較高脂對(duì)照組變化P〈0.05。結(jié)果提示白藜蘆醇干預(yù)后的小鼠可以增加與生熱相關(guān)蛋白的表達(dá)，這是它的減肥效果通路。即白藜蘆醇通過(guò)激活Sirtl，從而增加了PGC-1的表達(dá)。PGC-1表達(dá)的增加在脂肪組織中可以促進(jìn)解偶聯(lián)蛋白UCP1的表達(dá)，從而引起動(dòng)物產(chǎn)熱增加達(dá)到減肥的效果。(2)脂肪細(xì)胞中與生熱相關(guān)的蛋白變化為在細(xì)胞水平上進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)的設(shè)想，試驗(yàn)選用了3T3-L1前體脂肪細(xì)胞和原代培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞，檢測(cè)白藜蘆醇刺激后Sirtl、PGC-1的變化，如圖20和圖21所示。如圖所示，3T3-LI前體脂肪細(xì)胞和原代培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞在不同濃度白藜蘆醇刺激后，Sirtl和PGC-1蛋白表達(dá)量有相同的變化趨勢(shì)隨白藜蘆醇的加入蛋白表達(dá)增多，在O.luM濃度時(shí)蛋白表達(dá)達(dá)到峰值；繼續(xù)加大濃度到luM時(shí)，蛋白表達(dá)量急劇減少，甚至低于對(duì)照細(xì)胞中的表達(dá)量。根據(jù)常規(guī)的方法，將0.luM的濃度換算成人體(約60kg)的用量，則白藜蘆醇的用量約在1.0mg-2mg之間效果較佳，可見(jiàn)低劑量的白藜蘆醇通過(guò)促進(jìn)Sirtl的表達(dá)，可達(dá)到良好的減肥效果。由此說(shuō)明，白藜蘆醇干預(yù)脂肪細(xì)胞在一定濃度范圍內(nèi)可以使Sirtl和PGC-1的表達(dá)量同步增加；同時(shí)并非濃度越大蛋白表達(dá)越多，低劑量效果反而更佳。本實(shí)施例以高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠為基礎(chǔ)，驗(yàn)證白藜蘆醇的減肥效果。通過(guò)實(shí)施例2證實(shí)白藜蘆醇在減輕體重、抑制脂肪積累、以及改善胰島素敏感型等方面有作用。與以往報(bào)道有關(guān)白藜蘆醇可以防止心血管疾病等報(bào)道相吻合。本實(shí)施例集中討論白藜蘆醇減肥作用的原因，一般來(lái)講肥胖主要是由于能量攝入與能量消耗的不平衡引起的，因此本實(shí)施例主要檢査了白藜蘆醇干預(yù)后對(duì)能量攝入和消耗的影響。結(jié)果如圖ll所示，白藜蘆醇并不影響能量的攝入，若不影響能量攝入的同時(shí)還能產(chǎn)生體重減輕的現(xiàn)象則必然涉及到能量消耗的增多。為了驗(yàn)證上述論點(diǎn)，繼續(xù)檢測(cè)正常狀態(tài)和饑餓條件下小鼠體溫的變化，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇干預(yù)后的小鼠產(chǎn)熱增加，同時(shí)，觀察電鏡下脂肪細(xì)胞中線(xiàn)粒體的變化，發(fā)現(xiàn)其數(shù)目及體積也有顯著的增加，因此提示白藜蘆醇的減肥作用是通過(guò)誘導(dǎo)線(xiàn)粒體的生物合成增加而達(dá)到增加產(chǎn)熱效果的。進(jìn)一步研究白藜蘆醇可能作用的靶蛋白時(shí)，選擇了與產(chǎn)熱相關(guān)的PGC-1、UCP1蛋白進(jìn)行研究，WesternBlot實(shí)驗(yàn)證明脂肪組織中Sirtl、PGC-1、UCPl蛋白表達(dá)在受到白藜蘆醇刺激后有明顯增加。根據(jù)以往報(bào)道PGC-1在脂肪組織中的作用是促進(jìn)線(xiàn)粒體的生物合成，且有增加產(chǎn)熱和UCPl表達(dá)量的作用，此外，Sirtl和PGC-1在肝臟組織中曾經(jīng)被證明有相互作用。因此提示白藜蘆醇通過(guò)促進(jìn)脂肪組織中Sirtl、PGC-1、UCPl蛋白表達(dá)，以提高產(chǎn)熱，增加能量消耗，提高代謝率，從而起到減肥效果。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。權(quán)利要求1.白藜蘆醇的用途，其特征在于，用于制備提高Sirt1蛋白、PGC-1蛋白、或UCP-1蛋白的表達(dá)量的組合物。2.如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述組合物同時(shí)提高Sirtl蛋白、PGC-1蛋白、和UCP-l蛋白的表達(dá)量。3.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的組合物含有0.01—49.9mg/劑白藜戸醇。4.一種組合物，其特征在于，所述的組合物含有0.01—49.9mg/劑的白藜蘆醇，以及食品學(xué)或藥學(xué)上可接受的載體。5.如權(quán)利要求4所述的組合物，其特征在于，含有白藜蘆醇0.01—4.9mg/劑。6.如權(quán)利要求4所述的組合物，其特征在于，含有白藜蘆醇6—49.9mg/劑。7.權(quán)利要求4-6任一所述的組合物的用途，其特征在于，用于提高Sirtl蛋白、PGC-1蛋白、或UCP-l蛋白的表達(dá)量；或用于制備預(yù)防、控制或治療肥胖或肥胖相關(guān)疾病的食物或藥物。8.如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述組合物同時(shí)提高Sirtl蛋白、PGC-l蛋白、和UCP-l蛋白的表達(dá)量。9.一種Sirtl基因或蛋白的用途，其特征在于，用于(i)制備預(yù)防、控制或治療肥胖或肥胖相關(guān)疾病的食物或藥物；或(ii)篩選預(yù)防、控制或治療肥胖或肥胖相關(guān)疾病的食物或藥物。10.—種篩選增加Sirtl蛋白表達(dá)的物質(zhì)方法，其特征在于，包括步驟(a)在測(cè)試組中，向表達(dá)Sirtl蛋白的體系中添加待篩選的候選物，并檢測(cè)Sirtl蛋白的表達(dá)情況；(b)將步驟(a)測(cè)試組中Sir11蛋白的表達(dá)情況與添加所述候選物的對(duì)照組中Sirtl蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行比較，如果測(cè)試組中Sirtl蛋白的表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上多于對(duì)照組，就表明該猴選物是增加Sirtl蛋白表達(dá)的物質(zhì)。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了白藜蘆醇的用途，用于提高脂肪組織或脂肪細(xì)胞中Sirt1蛋白、PGC-1蛋白、或UCP-1蛋白的表達(dá)量。本發(fā)明還公開(kāi)了一種含有白藜蘆醇的組合物。本發(fā)明首次提出并證實(shí)白藜蘆醇可用于減肥。并且首次提出SIRT1可以作為預(yù)防、控制或治療肥胖的靶蛋白，白藜蘆醇可以上調(diào)SIRT1蛋白的表達(dá)水平。文檔編號(hào)A23L1/30GK101095665SQ200610028219公開(kāi)日2008年1月2日申請(qǐng)日期2006年6月27日優(yōu)先權(quán)日2006年6月27日發(fā)明者史香林,芳張,翟琦巍申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院