專利名稱：抗人可溶性血纖蛋白單克隆抗體及使用該抗體的免疫學(xué)測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及不與血纖蛋白原反應(yīng)而特異性識別于通過血纖蛋白原的凝血酶消化生成的可溶性血纖蛋白的Aα鏈C末端區(qū)域新產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)變化部位的針對可溶性血纖蛋白的單克隆抗體以及使用該抗體的免疫學(xué)測定方法，所述單克隆抗體利用若該單克隆抗體的識別部位經(jīng)纖溶酶消化從可溶性血纖蛋白上切離、則該單克隆抗體與該經(jīng)纖溶酶消化的可溶性血纖蛋白的反應(yīng)消失的特性，用于在不受可溶性血纖蛋白纖溶酶分解產(chǎn)物和穩(wěn)定化血纖蛋白纖溶酶分解產(chǎn)物的影響的情況下特異性地檢測可溶性血纖蛋白。本發(fā)明還涉及通過該免疫學(xué)測定方法測定被測試樣中的可溶性血纖蛋白來評價(jià)被測試樣的凝血亢進(jìn)狀態(tài)的方法。
背景技術(shù)：
伴隨凝血纖溶系統(tǒng)的活化而在血中出現(xiàn)的分子標(biāo)記的檢測對于播散性血管內(nèi)凝血綜合征(DIC)的早期診斷和病情的把握是很重要的。其中，作為表征初期的凝血亢進(jìn)的標(biāo)記，臨床上應(yīng)用可溶性血纖蛋白單體復(fù)合物(SFMC)。
在血管內(nèi)被活化而生成的凝血酶切斷血纖蛋白原的Aα鏈的N末端，將血纖蛋白原變?yōu)閐esAA血纖蛋白單體，再切斷Bβ鏈的N末端，生成desAABB血纖蛋白單體，生成的血纖蛋白單體與血中的血纖蛋白原等形成復(fù)合物，作為SFMC在血中循環(huán)。已知通過檢測該SFMC，可以早期預(yù)測血栓形成。
為了檢測該SFMC，目前報(bào)告了大量的特異性抗體和免疫學(xué)測定方法。例如，G.Soe等作為識別血纖蛋白與血纖蛋白原結(jié)合而成的血纖蛋白·血纖蛋白原復(fù)合物形成時在E部分產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)變化的單克隆抗體，報(bào)告了IF-43抗體。IF-43抗體的表位存在于Aα鏈的N末端側(cè)的鏈17-78的氨基酸序列。IF-43抗體具有在不與由血纖蛋白原、血纖蛋白單體、凝血酶產(chǎn)生的血纖蛋白原分解產(chǎn)物和血纖蛋白分解產(chǎn)物作用的情況下反映凝血系統(tǒng)的特征(專利文獻(xiàn)1和非專利文獻(xiàn)1)。
然而，已知使用IF-43抗體的可溶性血纖蛋白測定用試劑(IATRO SF，Iatron公司制)也作用于血纖蛋白單體的纖溶酶分解產(chǎn)物(血纖蛋白片段X、Y和E)與血纖蛋白原的反應(yīng)生成復(fù)合物和血纖蛋白單體的纖溶酶分解產(chǎn)物與血纖蛋白原的纖溶酶分解產(chǎn)物(片段X、Y或D)的反應(yīng)生成復(fù)合物(專利文獻(xiàn)2)。如上所述，IF-43抗體也作用于纖溶酶作用了的可溶性血纖蛋白，所以很難說是僅純粹地反映凝血系統(tǒng)的抗體。
還報(bào)告了識別血纖蛋白原Aα鏈被凝血酶切斷而得的N末端的氨基酸序列的抗體。U.SCHEEFERS-BORCHEL等將與血纖蛋白的N末端的氨基酸序列同樣的合成六肽(GPRVVE)進(jìn)行免疫，制成了針對可溶性血纖蛋白特異性的抗體(非專利文獻(xiàn)2)。另一方面，A.Hamano等將血纖蛋白原經(jīng)巴曲酶(Batroxobin)處理而得的血纖蛋白單體作為免疫原，得到了針對可溶性血纖蛋白特異性的抗體(專利文獻(xiàn)3和非專利文獻(xiàn)3)。
然而，因?yàn)檫@些抗體的表位為凝血酶與Aα鏈作用而生成的N末端氨基酸序列部位，所以被認(rèn)為作用于血纖蛋白單體的纖溶酶分解產(chǎn)物和它們的復(fù)合物以及作為穩(wěn)定化血纖蛋白的纖溶酶分解產(chǎn)物的XDP部分(DY、DXD等)。因此，反映凝血系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)這兩者，不能說是僅純粹地反映凝血系統(tǒng)的抗體。
此外，還報(bào)告了與由血纖蛋白原的Aα鏈的鏈148-161的氨基酸序列構(gòu)成的肽反應(yīng)的單克隆抗體(專利文獻(xiàn)4)。該抗體的識別部位不存在于被纖溶酶消化的Aα鏈C末端側(cè)，所以被認(rèn)為與可溶性血纖蛋白的纖溶酶分解產(chǎn)物和穩(wěn)定化血纖蛋白的纖溶酶分解產(chǎn)物反應(yīng)，很難說是僅純粹地反映凝血系統(tǒng)的抗體。
如上所述，針對于由凝血系統(tǒng)的亢進(jìn)生成的可溶性血纖蛋白的以往的抗體大多同時識別由纖溶系統(tǒng)的作用而產(chǎn)生的可溶性血纖蛋白的纖溶酶分解產(chǎn)物和穩(wěn)定化血纖蛋白的纖溶酶分解產(chǎn)物，還未發(fā)現(xiàn)特異性識別纖溶酶未作用的可溶性血纖蛋白的抗體，純粹地反映凝血系統(tǒng)的測定方法也未有報(bào)告。
專利文獻(xiàn)1國際公開第95/012617號文本專利文獻(xiàn)2日本專利特開2004-53359公報(bào)專利文獻(xiàn)3國際公開第98/59047號文本專利文獻(xiàn)4日本專利特開平2-028197公報(bào)非專利文獻(xiàn)1G.Soe等，Blood.88，2109-2117，1996.
非專利文獻(xiàn)2U.SCHEEFERS-BORCHEL等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82，7091-7095，1985.
非專利文獻(xiàn)3A.Hamano等，Clinica Chimica Acta.318，25-32，2002.
發(fā)明的揭示因此，本發(fā)明的目的在于提供可以僅特異性地測定反映初期的凝血亢進(jìn)、纖溶酶未作用的可溶性血纖蛋白的單克隆抗體，可產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤，使用該單克隆抗體的可溶性血纖蛋白的免疫學(xué)測定方法，以及通過該免疫學(xué)測定方法測定被測試樣中的可溶性血纖蛋白來評價(jià)被測試樣的凝血亢進(jìn)狀態(tài)的方法。
本發(fā)明人為了解決上述課題而認(rèn)真研究后，發(fā)現(xiàn)了特異性識別于通過血纖蛋白原的凝血酶消化生成的可溶性血纖蛋白的Aα鏈C末端區(qū)域新產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)變化部位的針對可溶性血纖蛋白的單克隆抗體，若可溶性血纖蛋白被纖溶酶消化，則該抗體的識別部位被切離，從而該抗體的作用消失。此外，發(fā)現(xiàn)如果使用該抗體，則可以特異性地測定血漿中的纖溶酶未作用的可溶性血纖蛋白，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明提供針對可溶性血纖蛋白的單克隆抗體，所述抗體特異性識別于通過血纖蛋白原的凝血酶消化生成的可溶性血纖蛋白的Aα鏈C末端區(qū)域新產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)變化部位，如果可溶性血纖蛋白被纖溶酶消化則該部位被切離。
此外，本發(fā)明提供產(chǎn)生上述單克隆抗體的雜交瘤。
此外，本發(fā)明提供試樣中的可溶性血纖蛋白的免疫學(xué)測定方法，其特征在于，使上述單克隆抗體與被測試樣反應(yīng)。
此外，本發(fā)明提供含有上述單克隆抗體的可溶性血纖蛋白測定試劑。
另外，本發(fā)明提供通過上述免疫學(xué)測定方法測定被測試樣中的可溶性血纖蛋白，從而評價(jià)被測試樣的凝血亢進(jìn)狀態(tài)的方法。
如果采用本發(fā)明的單克隆抗體，則可以在不識別可溶性血纖蛋白的纖溶酶分解產(chǎn)物和穩(wěn)定化血纖蛋白的纖溶酶分解產(chǎn)物的情況下，特異性識別纖溶酶未作用的可溶性血纖蛋白。因此，通過使用本發(fā)明的單克隆抗體，可以高靈敏度且迅速地對凝血形成的初期階段進(jìn)行測定。
附圖的簡單說明

圖1為實(shí)施例3中實(shí)施的對于J2-23抗體對在還原條件下經(jīng)處理的血纖蛋白原的反應(yīng)性的分析的圖(ACBB染色，B蛋白質(zhì)印跡)。
圖2為實(shí)施例4中實(shí)施的對于J2-23抗體對經(jīng)纖溶酶消化的血纖蛋白原的各消化片段的反應(yīng)性采用蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行分析，對于反應(yīng)的消化片段通過CBB進(jìn)行了蛋白質(zhì)染色的電泳圖。
圖3為表示6種合成肽和本發(fā)明單克隆抗體的競爭性抑制的圖。
圖4為實(shí)施例6中實(shí)施分析而得到的表示可溶性血纖蛋白和LTIA試劑的反應(yīng)性的圖。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式本說明書中，“可溶性血纖蛋白”是指血纖蛋白單體(desAA血纖蛋白單體和desAABB血纖蛋白單體)以及血纖蛋白單體復(fù)合物(血纖蛋白聚合物、血纖蛋白單體·血纖蛋白原復(fù)合物、血纖蛋白單體·FDP復(fù)合物以及血纖蛋白單體與其它生物體中的蛋白質(zhì)的復(fù)合物)。
本發(fā)明的單克隆抗體所具有的特征為，作用于上述可溶性血纖蛋白，而不作用于血纖蛋白原、血纖蛋白單體的纖溶酶分解產(chǎn)物和穩(wěn)定化血纖蛋白的纖溶酶分解產(chǎn)物。
此外，本發(fā)明的單克隆抗體的表位存在于在通過血纖蛋白原的凝血酶消化生成的可溶性血纖蛋白的Aα鏈C末端區(qū)域新產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)變化部位，該部位通過可溶性血纖蛋白的纖溶酶消化而被切離。對于經(jīng)纖溶酶消化的可溶性血纖蛋白，單克隆抗體的識別作用消失。具體來說，該表位存在于在血纖蛋白原經(jīng)纖溶酶消化后生成的片段中位于血纖蛋白原Aα鏈上的C末端片段的以Aα鏈的第425位的氨基酸為N末端的分子量約16KDa的消化片段肽中。
更具體來說，該表位存在于該具有血纖蛋白原Aα鏈的第502-521位的氨基酸序列的多肽中。本發(fā)明的單克隆抗體只要識別該具有血纖蛋白原Aα鏈的第502-521位的氨基酸序列的多肽即可，沒有特別限定。
如上所述，目前未發(fā)現(xiàn)不與血纖蛋白本身反應(yīng)、表位存在于在通過血纖蛋白原的凝血酶消化生成的可溶性血纖蛋白的Aα鏈C末端區(qū)域新產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)變化部位且該部位通過可溶性血纖蛋白的纖溶酶消化而被切離的單克隆抗體，本發(fā)明的單克隆抗體是新的。雖然對于可溶性血纖蛋白的Aα的C末端部位的結(jié)構(gòu)變化，目前沒有明確的報(bào)告，但根據(jù)Y.I.Veklich等的報(bào)告(J Bio Chem，1993；268，13577-13585)，被纖溶酶從Aα鏈切離的片段為以Aα鏈的氨基酸序列第220位為N末端的分子量40Kda的消化片段。由此可知，本發(fā)明的單克隆抗體的識別部位包含于被纖溶酶切離的片段。此外，該報(bào)告中，血纖蛋白的存在形態(tài)通過電子顯微鏡被揭示。存在2條的血纖蛋白原的Aα的C末端區(qū)域在中性條件下結(jié)合于中央的E結(jié)構(gòu)域，如果血纖肽經(jīng)凝血酶消化而被切斷，則結(jié)合于E結(jié)構(gòu)域的Aα鏈的C末端區(qū)域解離。由于該解離產(chǎn)生Aα鏈的C末端區(qū)域的結(jié)構(gòu)變化，本發(fā)明的單克隆抗體特異性識別該結(jié)構(gòu)變化部位。
本發(fā)明的單克隆抗體可以如下進(jìn)行制作。
作為所用的免疫原，較好是生成的血纖蛋白單體或可溶性血纖蛋白，也可以使用僅受到了凝血酶作用(未受到纖溶酶作用)的血纖蛋白原或經(jīng)巴曲酶處理的血纖蛋白原等。血纖蛋白單體可以按照例如U.SCHEEFERS-BORCHEL等的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82，7091-7095，1985.]進(jìn)行調(diào)制。具體來說，desAA血纖蛋白單體可以通過使巴曲酶與血纖蛋白原溶液作用，用尿素或酸將生成的血纖蛋白凝塊可溶化而獲得；desAABB血纖蛋白單體可以通過使凝血酶與血纖蛋白原溶液作用，用尿素或酸將生成的血纖蛋白凝塊可溶化而獲得。此外，也可以通過在使巴曲酶或凝血酶與血纖蛋白原作用時以非常少的量進(jìn)行處理，直接使用不生成凝塊的條件下的處理液。另外，還可以使用使纖溶酶與血纖蛋白原作用而被切離的Aα鏈的C末端片段，或者可以合成與Aα鏈的C末端片段的一部分同樣序列的多肽、較好是前述502-521位的多肽，使用該合成肽。
對免疫所用的動物沒有特別限定，例如可以例舉小鼠、大鼠等。免疫可以按照常規(guī)手法實(shí)施。例如，在動物的皮下、皮內(nèi)、腹腔等給予使免疫原懸浮于通常的緩沖液或生理鹽水中而得的懸浮液或者免疫原與弗氏完全佐劑等佐劑的混合物進(jìn)行短時刺激后，根據(jù)需要反復(fù)進(jìn)行同樣的操作。抗原的用量根據(jù)投與途徑、動物種類適當(dāng)確定，但通常的用量較好是每次10μg～1mg左右。
細(xì)胞融合所用的免疫細(xì)胞較好是最后一次免疫的3～4天后摘出的脾臟細(xì)胞。此外，作為與前述免疫細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞，較好是已經(jīng)確立的公知的各種細(xì)胞株，例如可以例舉小鼠中的NS1(P3/NSI/I-Ag4-1)[Eur.j.Immunol.6511-519(1976)]、SP2/O-Ag14[《自然》，276269(1978)]、P3-X63-Ag8.653[J.Immunol.1231548(1979)]、P3-X63-Ag8U.1[Curr.Top.Microbiol.Immunol.811(1978)]等，大鼠中的Y3-Ag1.2.3[《自然》，277131-133(1979)]、YB2/O(YB2/3HL/P2.G11.16Ag.20)[Methods Enzymol.73B1(1981)]等。
細(xì)胞融合中，可以使用通常所用的聚乙二醇(PEG)、仙臺病毒(HVJ)等。細(xì)胞融合的手法與常規(guī)方法同樣，例如在骨髓細(xì)胞與相對于骨髓細(xì)胞約1～10倍的免疫細(xì)胞的混合細(xì)胞團(tuán)中以30～60％的濃度滴入平均分子量1000～6000的聚乙二醇，進(jìn)行混合。雜交瘤的選擇使用常規(guī)的選擇培養(yǎng)基，例如HAT培養(yǎng)基(含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基)。使用以HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的雜交瘤，通過常規(guī)的極限稀釋法進(jìn)行作為目標(biāo)的抗體產(chǎn)生株的篩選和單克隆化即可。
作為目標(biāo)的抗體產(chǎn)生株可以通過以例如ELISA法、RIA法等選擇產(chǎn)生與未受纖溶酶的作用的可溶性血纖蛋白特異性反應(yīng)而不與血纖蛋白原、血纖蛋白單體的纖溶酶分解產(chǎn)物和穩(wěn)定化血纖蛋白的纖溶酶分解產(chǎn)物反應(yīng)的抗體的雜交瘤而獲得。
具體來說，先將培養(yǎng)上清中的單克隆抗體通過抗小鼠IgG抗體等固定化，使含有可溶性血纖蛋白和血纖蛋白原的試樣與之反應(yīng)。接著，使以酶等標(biāo)記了的抗血纖蛋白原抗體與之反應(yīng)，選擇僅與可溶性血纖蛋白反應(yīng)且不與血纖蛋白原反應(yīng)的單克隆抗體。然后，選擇不與作為纖溶酶分解產(chǎn)物的血纖蛋白片段X、Y或E和穩(wěn)定化血纖蛋白分解產(chǎn)物(XDP)反應(yīng)的單克隆抗體。由此，制成表位存在于被纖溶酶切離的片段的單克隆抗體即可。
該單克隆抗體可以通過按照常法培養(yǎng)雜交瘤后從培養(yǎng)上清分離的方法、將前述雜交瘤投與到對其具有適應(yīng)性的哺乳類動物中后以腹水形式回收的方法來制造。
通過在以往任意的免疫學(xué)測定方法中使用本發(fā)明的單克隆抗體，可以特異地測定人體液中未受到纖溶酶的作用的可溶性血纖蛋白。
例如，在以ELISA法測定的情況下，可以將經(jīng)純化的可溶性血纖蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品通過如下的方法對可溶性血纖蛋白進(jìn)行定量。即，可以在固定了本發(fā)明的單克隆抗體的ELISA板上添加經(jīng)稀釋的試樣使其反應(yīng)后，使酶標(biāo)了的抗血纖蛋白原多克隆抗體與之反應(yīng)，根據(jù)顯色后的吸光度變化對存在于試樣中的未受到纖溶酶的作用的可溶性血纖蛋白進(jìn)行特異性的定量。以LTIA測定的情況下，可以將經(jīng)純化的可溶性血纖蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品通過如下的方法對可溶性血纖蛋白進(jìn)行定量。即，通過使本發(fā)明的單克隆抗體的至少1種于作為不溶性載體的膠乳粒子上敏化，使其與試樣接觸，抗體敏化膠乳粒子之間通過試樣中的可溶性血纖蛋白交聯(lián)而產(chǎn)生凝集，因此可以根據(jù)該凝集度的變化對該可溶性血纖蛋白進(jìn)行特異性的定量。作為試樣，只要是含有可溶性血纖蛋白的人體液即可，沒有特別限定，例如可以例舉血液、尿等。
作為LTIA法等中的抗體敏化膠乳粒子的膠乳粒子，只要是在利用膠乳凝集反應(yīng)的免疫學(xué)凝集反應(yīng)和抗凝反應(yīng)中通常所用的微粒載體即可，沒有特別限定，較好是可在工業(yè)領(lǐng)域大量生產(chǎn)的有機(jī)類微粒。作為這樣的有機(jī)類微粒，例如可以例舉苯乙烯、氯乙烯、丙烯腈、乙酸乙烯酯、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯等乙烯基類單體的均聚物或共聚物，苯乙烯-丁二烯共聚物、甲基丙烯酸甲酯-丁二烯共聚物等丁二烯類共聚物等。此外，可優(yōu)選使用在這樣的有機(jī)類微粒上結(jié)合了羧基、伯氨基、氨基甲?；⒘u基、醛基等官能團(tuán)的反應(yīng)性有機(jī)類微粒。上述的膠乳粒子中，從抗原或抗體的吸附性良好、可長期穩(wěn)定地保持生物學(xué)活性的角度考慮，較好是聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物等聚苯乙烯類膠乳粒子。
對膠乳粒子的形狀沒有特別限定，但其平均粒徑較好是膠乳粒子表面的蛋白質(zhì)與測定對象物質(zhì)的凝集反應(yīng)而產(chǎn)生凝集體足以通過肉眼或光學(xué)方法檢出的大小。平均粒徑較好是0.02～1.6μm，特別好是0.03～0.5μm。
作為于膠乳粒子上敏化本發(fā)明的單克隆抗體的方法，沒有特別限定，可以使用公知的方法。例如，可以例舉使其物理吸附于膠乳粒子表面的方法，于具有官能團(tuán)的膠乳粒子表面通過共價(jià)鍵、免疫結(jié)合進(jìn)行敏化的方法等。
本發(fā)明的可溶性血纖蛋白測定試劑中，除了敏化了本發(fā)明的單克隆抗體的膠乳粒子之外，也可以適當(dāng)添加BSA、蔗糖等穩(wěn)定劑或疊氮化鈉等防腐劑。還可以在本發(fā)明的可溶性血纖蛋白測定試劑中再組合入稀釋劑而制成膠乳凝集反應(yīng)用試劑盒。該稀釋劑中可以根據(jù)需要添加上述的穩(wěn)定劑或防腐劑。
實(shí)施例以下，例舉實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行具體說明，但本發(fā)明的范圍并不限定于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1單克隆抗體的調(diào)制(1)雜交瘤的調(diào)制對溶解于PBS的人純化血纖蛋白原進(jìn)行巴曲酶處理，將生成的可溶性血纖蛋白作為免疫原。將該免疫原與弗氏完全佐劑(GIBCO公司制)1比1混合乳化，以1周的間隔在6周齡的雌BALB/C小鼠的皮下給予0.1mg/0.1mL的乳液6次后，在最后一次免疫的3天后摘出脾臟。將由摘出的脾臟得到的脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/O-Ag14以6比1的比例混合，在50％聚乙二醇1540(和光純藥工業(yè)公司制)的存在下進(jìn)行細(xì)胞融合。細(xì)胞融合中，作為脾臟細(xì)胞以2.5×106/mL的濃度懸浮于HAT培養(yǎng)基，在96孔培養(yǎng)板(CORNING公司制)中分別每孔注入0.2mL。將其在5％CO2的培養(yǎng)箱中于37℃進(jìn)行培養(yǎng)，大約2周后，對于產(chǎn)生了雜交瘤的孔的培養(yǎng)上清按照如下的ELISA法篩選有可能產(chǎn)生針對可溶性血纖蛋白的抗體的株。
首先，將各培養(yǎng)上清中的IgG通過山羊抗小鼠IgG(Fc)抗體(JACKSON公司制)固相化于微孔板(NUNC公司制)上。使可溶性血纖蛋白和血纖蛋白原，血纖蛋白X、Y、E，穩(wěn)定化血纖蛋白分解產(chǎn)物(XDP)與其反應(yīng)。然后，使過氧化物酶標(biāo)記的抗血纖蛋白原兔多克隆抗體(DAKO公司制)與之反應(yīng)后，加入含鄰苯二胺(東京化成公司制)的過氧化物酶底物溶液使之顯色，加入1.5N硫酸停止顯色后，通過微量板閱讀儀(Microplate Reader)(吸光度492nm)進(jìn)行測定，選擇對可溶性血纖蛋白表現(xiàn)出高反應(yīng)性而未對血纖蛋白原、血纖蛋白X、Y、E和穩(wěn)定化血纖蛋白分解產(chǎn)物(XDP)表現(xiàn)出反應(yīng)性的株。將該雜交瘤進(jìn)行采用極限稀釋法的克隆，確立了1種抗可溶性血纖蛋白單克隆抗體產(chǎn)生雜交瘤(J2-23)。該雜交瘤以FERM BP-10172的保藏編號于2004年12月3日被保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心( 305-8566日本茨城縣筑波市東1-1-1中央第6)。另外，以下的記載中，將由雜交瘤(J2-23)分泌的抗可溶性血纖蛋白單克隆抗體稱為J2-23抗體。
(2)單克隆抗體的調(diào)制對2周前預(yù)先在腹腔內(nèi)注射了0.5mL降植烷的12周齡的雌BALB/C小鼠向腹腔內(nèi)以細(xì)胞數(shù)0.5×106個的量投與以上得到的雜交瘤。約14天后采取腹水，離心處理而得到上清。將上清與等量的吸附用緩沖液(3mol/L NaCl-1.5mol/L甘氨酸-NaOH，pH8.5)混合后，進(jìn)行過濾。將該濾液通過用吸附用緩沖液平衡了的蛋白質(zhì)A柱(Pharmacia公司制)而使抗體吸附于柱后，用0.1mol/L檸檬酸緩沖液(pH3.0)從柱上洗脫，純化抗可溶性血纖蛋白單克隆抗體(J2-23抗體)。
實(shí)施例2抗可溶性血纖蛋白單克隆抗體(J2-23抗體)的免疫球蛋白類型和特異性的鑒定(1)通過ELISA法(ZYMED公司制)鑒定了J2-23抗體的免疫球蛋白類型，結(jié)果為IgG1、κ輕鏈。
將J2-23抗體用PBS調(diào)整至5μg/mL的濃度后，以50μL/孔加入到96孔ELISA板(NUNC公司制)中，在4℃孵育一夜。將板用PBS清洗3次后，以100μL/孔加入封閉液(含1％BSA的PBS)，封閉1小時。去除封閉液后，以50μL/孔加入用封閉液稀釋了的表1所示的各種抗原，在室溫下孵育1小時。用封閉液清洗3次后，加入過氧化物酶標(biāo)記的抗血纖蛋白原兔多克隆抗體，在室溫下孵育1小時。再用封閉液清洗3次后，以50μL/孔加入實(shí)施例1的過氧化物酶底物溶液。10分鐘后，以50μL/孔加入1.5N硫酸，測定492nm處的吸光度。
表1中，血纖蛋白原(以下也記作Fbg)是將Sigma公司制的純化品通過凝膠過濾法進(jìn)一步純化后使用。desAA血纖蛋白單體(以下也記作desAAFbn)和desAABB血纖蛋白單體(以下也記作desAABBFbn)是將使巴曲酶或凝血酶分別與經(jīng)純化的Fbg作用后生成的凝塊用酸可溶化而調(diào)制。另外，desAAFbn-Fbg復(fù)合物和desAABBFbn-Fbg復(fù)合物是將酸可溶化desAAFbn和desAABBFbn分別添加到Fbg溶液中，將通過復(fù)合物形成而高分子化的部分以凝膠過濾法分離而調(diào)制。Fbg片段X和Y都使用市售品(國際バイオ公司)。血纖蛋白片段X和Y是將前述Fbg片段X和Y進(jìn)行凝血酶處理而制成血纖蛋白片段X和Y。Fbg片段E、血纖蛋白片段E、D二聚物(DD)和D單體(D)使用市售品(國際バイオ公司)。含DD/E的XDP部分是使纖溶酶作用于血纖蛋白塊，將消化產(chǎn)物以凝膠過濾分離后，將高分子部分作為XDP部分。
結(jié)果示于表1。表1中，“+”表示通過夾心式ELISA法反應(yīng)，“-”表示未反應(yīng)。


由表1可知，本發(fā)明的單克隆抗體(J2-23抗體)對于各種液相的抗原，與desAAFbn、desAAFbn-Fbg復(fù)合物、desAABBFbn和desAABBFbn-Fbg復(fù)合物反應(yīng)，與未處理的Fbg、纖溶酶的血纖蛋白原分解產(chǎn)物(FbgDP，即血纖蛋白原片段X、血纖蛋白原Y、血纖蛋白原E和D)及血纖蛋白分解產(chǎn)物(FbnDP，即血纖蛋白片段X、血纖蛋白片段Y、血纖蛋白片段E、含DD/E的XDP部分、DD)不反應(yīng)。
實(shí)施例3抗可溶性血纖蛋白單克隆抗體(J2-23抗體)的特異性的鑒定(2)將實(shí)施例2中評價(jià)的各種抗原在非還原條件下SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，用含3％脫脂乳的PBST(含0.05％Tween20的PBS)封閉1小時后，使作為一級抗體的單克隆抗體(J2-23抗體)、作為二級抗體的過氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體(Biosource international公司制)與之反應(yīng)。將PVDF膜用PBST清洗后，加入二氨基聯(lián)苯胺作為底物，使其顯色。其結(jié)果為，確認(rèn)除desAAFbn和desAABBFbn以外，也與Fbg反應(yīng)，未發(fā)現(xiàn)與各種FbgDP反應(yīng)。另外，將Fbg在還原條件下處理，實(shí)施了同樣的操作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Aα鏈有強(qiáng)烈反應(yīng)(圖1)。
由以上的結(jié)果可知，本發(fā)明的單克隆抗體(J2-23抗體)的表位不出現(xiàn)于液相中的未變性的Fbg中，通過使Fbg變性，出現(xiàn)在Fbg的Aα鏈上。因?yàn)镴2-23抗體不與各種FbgDP反應(yīng)，所以判明該部位存在于纖溶酶作用于可溶性血纖蛋白后被切離的片段上。
實(shí)施例4抗可溶性血纖蛋白單克隆抗體(J2-23抗體)的表位分析(1)以實(shí)施例3中得到的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，通過如下的方法分析Aα鏈上的表位位置。在將純化Fbg用10mmol/L Tris緩沖液(pH8.0)以10mg/mL溶解得到的溶液中以0.2單位/mL的最終濃度添加纖溶酶(クロモジエニツクス公司制)，在37℃使其消化30分鐘。然后，以500單位/mL的最終濃度加入抑肽酶(三菱ウエルフア一マ公司制)，使纖溶酶失活。將該消化液進(jìn)行還原處理后，以SDS-PAGE 15-25％進(jìn)行分離后，轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，進(jìn)行CBB染色，并且與上述實(shí)施例3同樣地使用本發(fā)明的單克隆抗體(J2-23抗體)進(jìn)行免疫印跡分析。
其結(jié)果為，確認(rèn)約16kDa的與J2-23抗體反應(yīng)的消化片段(圖2的箭頭的條帶)。切出被CBB染色的該消化片段，考察N末端氨基酸序列，結(jié)果為以Fbg Aα鏈的第425位為N末端的序列(TGKEKVTS)。
該序列在Fbg通過纖溶酶消化變化為Fbg-X時位于被切離的片段中，所以判明本發(fā)明的單克隆抗體的表位在Fbg的Aα鏈上，而且存在于被纖溶酶消化而切離的Aα鏈的C末端區(qū)域。另外，判明本發(fā)明的抗體的表位存在于該纖溶酶消化片段內(nèi)Aα鏈的第425位以后。對纖溶酶消化Aα鏈C末端片段表現(xiàn)出反應(yīng)性的針對可溶性血纖蛋白的抗體是以往不為人知的新抗體。
實(shí)施例5抗可溶性血纖蛋白單克隆抗體(J2-23抗體)的表位分析(2)以實(shí)施例4中得到的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，通過如下的方法進(jìn)一步分析Aα鏈上的表位位置。
基于Doolittle等的方法(《生物化學(xué)》1997，161703)，從Fbg分離純化Aα鏈。將純化A α鏈用內(nèi)切蛋白酶Asp-N(Sigma公司制)消化后，與實(shí)施例4同樣地進(jìn)行免疫印跡分析。
其結(jié)果為，在7～8kDa確認(rèn)消化片段，考察了該消化片段的N末端氨基酸序列，結(jié)果為以Fbg Aα鏈的第502位為N末端的序列(DTAST)。由該消化片段的分子量和Asp-N的剪切部位位于天門冬氨酸的氨基側(cè)這一點(diǎn)進(jìn)行推測，推測為第502～573位的肽。
接著，從第502開始合成6種相當(dāng)于上述消化片段的氨基酸序列的肽(AA502-521、AA512-531、AA522-541、AA532-551、AA542-561、AA552-571)，通過如下的方法進(jìn)一步確定本發(fā)明的單克隆抗體(J2-23抗體)的表位。
首先，將山羊抗小鼠I gG(Fc)抗體用PBS調(diào)整至5μg/mL的濃度后，以50μL/孔加入微孔板中，在4℃孵育一夜。將板用PBST(含0.05％的Tween20的PBS)清洗3次后，以100μL/孔加入封閉液(BSA-PBST)，在室溫下孵育1小時。用PBST清洗3次后，將本發(fā)明的單克隆抗體(J2-23抗體)用BSA-PBST調(diào)整至0.2μg/mL的濃度，以50μL/孔加入，在室溫下孵育1小時。用PBST清洗3次后，以25μL/孔加入用BSA-PBST稀釋至0～100μg/mL的各合成肽，在室溫下孵育30分鐘。接著，將后述實(shí)施例6中調(diào)制的可溶性血纖蛋白用BSA-PBST調(diào)整至1μg/mL后，以25μL/孔加入，在室溫下孵育1小時。用PBST清洗3次后，以50μL/孔加入用BSA-PBST稀釋至5000倍的HRP-兔抗人血纖蛋白原抗體(DAKO公司制)，在室溫下孵育1小時。用PBST清洗3次后，以50μL/孔加入實(shí)施例1的過氧化物酶底物溶液。10分鐘后，以50μL/孔加入1.5N硫酸，測定492nm處的吸光度。
其結(jié)果示于圖3。6種合成肽中，僅AA502-521確認(rèn)競爭性抑制反應(yīng)，所以確認(rèn)本發(fā)明的單克隆抗體(J2-23抗體)的表位識別Fbg的Aα鏈的第502～521位的氨基酸序列。這表示凝血酶與Fbg作用后生成的可溶性血纖蛋白的Aα鏈C末端區(qū)域至少第502～521位附近的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，可以說本發(fā)明的單克隆抗體(J2-23抗體)是特異性識別該結(jié)構(gòu)變化的對于可溶性血纖蛋白特異的抗體。
實(shí)施例6使用膠乳凝集反應(yīng)(LTIA)的可溶性血纖蛋白的測定(1)抗體敏化膠乳的調(diào)制將單克隆抗體(J2-23抗體)用20mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5)稀釋至0.7mg/mL而得的抗體液與1％膠乳溶液(粒徑0.2μm，積水化學(xué)工業(yè)公司制)等量混合，在4℃攪拌約2小時。然后，加入等量的1％BSA，攪拌1小時后，進(jìn)行離心(100000×g，5分鐘)處理。將沉淀的膠乳用含0.5％BSA的5mmol/L MOPS(pH7.0)懸浮，得到抗體敏化膠乳。
(2)可溶性血纖蛋白的調(diào)制與實(shí)施例2同樣地，調(diào)制酸可溶性desAAFbn或desAABBFbn，分別在人檸檬酸血漿中以0～50μg/mL的最終濃度進(jìn)行添加，將所得的混合物作為可溶性血纖蛋白。
(3)可溶性血纖蛋白的測定調(diào)制含0.4％BSA和0.5mol/L氯化鈉的30mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.5)(第1試劑)，使用以上調(diào)制的抗體敏化膠乳(第2試劑)，通過生物化學(xué)自動分析裝置日立7170型進(jìn)行測定。在自動分析裝置內(nèi)的37℃的反應(yīng)池內(nèi)添加3μL以上調(diào)制的可溶性血纖蛋白和100μL第1試劑，添加第1試劑5分鐘后，添加100μL第2試劑，進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)5分鐘。接著，以570nm的主波長和800nm的副波長測定點(diǎn)(point)18～34之間的反應(yīng)前后的吸光度變化(圖4)。確認(rèn)了對應(yīng)于添加的desAAFbn或desAABBFbn的濃度的吸光度變化，所以確認(rèn)通過使用本發(fā)明的單克隆抗體，能夠測定血中的可溶性血纖蛋白的量。
權(quán)利要求
1.針對可溶性血纖蛋白的單克隆抗體，其特征在于，特異性識別于通過血纖蛋白原的凝血酶消化生成的可溶性血纖蛋白的Aα鏈C末端區(qū)域新產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)變化部位。
2.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于，前述識別部位存在于血纖蛋白原經(jīng)纖溶酶消化而轉(zhuǎn)化為血纖蛋白原X時被切離的血纖蛋白原Aα鏈的C末端片段。
3.如權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體，其特征在于，前述識別部位存在于以血纖蛋白原Aα鏈的第425位氨基酸為N末端的分子量約16KDa的肽中。
4.如權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體，其特征在于，前述識別部位存在于具有血纖蛋白原Aα鏈的第502-521位的氨基酸序列的多肽中。
5.如權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體，其特征在于，可溶性血纖蛋白為血纖蛋白單體或血纖蛋白單體復(fù)合物。
6.如權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體，其特征在于，血纖蛋白單體復(fù)合物為血纖蛋白聚合物、血纖蛋白單體·血纖蛋白原復(fù)合物或血纖蛋白單體·FDP復(fù)合物。
7.如權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體，其特征在于，不與血纖蛋白原、血纖蛋白單體的纖溶酶分解產(chǎn)物和穩(wěn)定化血纖蛋白的纖溶酶分解產(chǎn)物作用。
8.雜交瘤，其特征在于，產(chǎn)生權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體。
9.試樣中的可溶性血纖蛋白的免疫學(xué)測定方法，其特征在于，使權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體與被測試樣反應(yīng)。
10.如權(quán)利要求9所述的測定方法，其特征在于，使用固定于不溶性載體的權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體。
11.可溶性血纖蛋白測定試劑，其特征在于，含有權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體。
12.評價(jià)被測試樣的凝血亢進(jìn)狀態(tài)的方法，其特征在于，通過權(quán)利要求9或10所述的免疫學(xué)測定方法測定被測試樣中的可溶性血纖蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及特異性識別于通過血纖蛋白原的凝血酶消化生成的可溶性血纖蛋白的Aα鏈C末端區(qū)域新產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)變化部位的針對可溶性血纖蛋白的單克隆抗體、產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤、使用該單克隆抗體的免疫學(xué)測定方法以及通過該免疫學(xué)測定方法測定被測試樣中的可溶性血纖蛋白來評價(jià)被測試樣的凝血亢進(jìn)狀態(tài)的方法。如果采用本發(fā)明的單克隆抗體，則可以特異性地測定僅反映初期的凝血亢進(jìn)、纖溶酶未作用的可溶性血纖蛋白。
文檔編號C12P21/08GK101087877SQ20058004461
公開日2007年12月12日 申請日期2005年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月28日
發(fā)明者松尾正直, 海老沼宏幸, 宮崎修, 田中恭子, 鈴木明子 申請人:第一化學(xué)藥品株式會社