專利名稱：用腸桿菌科的細(xì)菌產(chǎn)生l－氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過發(fā)酵產(chǎn)生L-氨基酸的方法，更具體地涉及有助于此發(fā)酵的基因。這些基因可用于改進L-氨基酸的生產(chǎn)，例如，L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸和L-谷氨酸的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)上，利用由天然來源獲得的微生物菌株或其突變體通過發(fā)酵方法工業(yè)化生產(chǎn)L-氨基酸。通常，修飾所述微生物以提高L-氨基酸的產(chǎn)品收率(production yield)。
已經(jīng)報導(dǎo)了許多提高L-氨基酸產(chǎn)品收率的技術(shù)，包括用重組DNA轉(zhuǎn)化微生物(參見，例如，美國專利4,278,765)。其它提高產(chǎn)品收率的技術(shù)包括增加涉及氨基酸生物合成的酶的活性和/或使目標(biāo)酶對所得L-氨基酸的反饋抑制脫敏(desensitize)(參見，例如，WO 95/16042或美國專利4,346,170、5,661,012和6,040,160)。
用于通過發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株是已知的，包括涉及L-蘇氨酸生物合成的酶的活性增加的菌株(美國專利5,175,107、5,661,012、5,705,371和5,939,307；EP 0219027)、對化學(xué)品如L-蘇氨酸及其類似物有抗性的菌株(WO01/14525A1、EP 301572 A2、美國專利5,376,538)、具有對生產(chǎn)的L-氨基酸或其副產(chǎn)物的反饋抑制脫敏的目標(biāo)酶的菌株(美國專利5,175,107和5,661,012)、以及具有失活的蘇氨酸降解酶的菌株(美國專利5,939,307和6,297,031)。
目前，已知的生產(chǎn)蘇氨酸的菌株VKPM B-3996(美國專利5,175,107和5,705,371)是最好的已知的蘇氨酸生產(chǎn)菌之一。為構(gòu)建菌株VKPM B-3996，如下所述，將幾個突變和質(zhì)粒導(dǎo)入到親本菌株大腸桿菌K-12(VKPM B-7)中。突變的thrA基因(突變thrA442)編碼天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I，其對蘇氨酸的反饋抑制有抗性。突變的ilvA基因(突變ilvA442)編碼活性降低的蘇氨酸脫氨酶，其導(dǎo)致異亮氨酸生物合成速率降低和異亮氨酸饑餓的滲漏表型。在包含ilvA442突變的細(xì)菌中，thrABC操縱子的轉(zhuǎn)錄不被異亮氨酸所抑制，因此對于蘇氨酸生產(chǎn)是非常有效的。編碼蘇氨酸脫氫酶的tdh基因的失活阻止蘇氨酸降解。將蔗糖同化的遺傳定子(genetic determinant)(scrKYABR基因)轉(zhuǎn)移到所述菌株。為增加控制蘇氨酸生物合成的基因的表達，將包含突變的蘇氨酸操縱子thrA442BC的質(zhì)粒pVIC40導(dǎo)入中間菌株TDH6中。在菌株發(fā)酵期間累積的L-蘇氨酸的量能夠多達85g/l。
通過優(yōu)化所需化合物的主要生物合成途徑，借助于為細(xì)菌補充更大量的糖例如葡萄糖作為碳源，可以完成對L-氨基酸生產(chǎn)菌株的進一步改善。不考慮PTS的葡萄糖轉(zhuǎn)運效率，在高產(chǎn)菌株中獲取碳源仍然可能是不充足的。
已知糖和其它代謝物向細(xì)菌細(xì)胞中的主動運輸由幾種轉(zhuǎn)運系統(tǒng)完成。其中，來自大腸桿菌的XylE蛋白是D-木糖通透酶，大腸桿菌中兩種系統(tǒng)的其中一個負(fù)責(zé)吸收D-木糖；另一個是ATP-依賴性ABC轉(zhuǎn)運蛋白XylFGH。已顯示克隆的xylE基因在體內(nèi)補充xylE突變體(Davis，E.O.and Henderson，P.J.，J.Biol.Chem.，262(29)；13928-32(1987))。在整個細(xì)胞中XylE-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運由質(zhì)子載體(protonophore)所抑制，并引發(fā)堿性pH改變(Lam，V.M.等，J.Bacteriol.143(1)；396-402(1980))。利用xylE和xylF突變體的試驗已證實對于D-木糖，XylE蛋白具有63-169μM的KM(Sumiya.M.等，Receptors Channels，3(2)；117-28(1995))。XylE蛋白是轉(zhuǎn)運蛋白主要促進劑超家族(major facilitatorsuperfamily)(MFS)的成員(Griffith，J.K.等，Curr.Opin.Cell Biol. 4(4)；684-95(1992))，看起來作為D-木糖/質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運蛋白(symporter)起作用。xylE基因可能構(gòu)成單順反子操縱子，其表達由D-木糖所誘導(dǎo)。輸入的木糖在XylA(木糖異構(gòu)酶)和XylB(木酮糖激酶)酶的作用下異化為5-磷酸木酮糖。在合適的條件下，由xylA基因編碼的木糖異構(gòu)酶還有效地催化D-葡萄糖向D-果糖的轉(zhuǎn)化(Wovcha，M.G.等，Appl Environ Microbiol.45(4)1402-4(1983))。
然而，迄今還沒有利用腸桿菌科(Enterobacteriaceae family)的細(xì)菌增加L-氨基酸的生產(chǎn)的報導(dǎo)，所述腸桿菌科的細(xì)菌具有增強的D-木糖通透酶活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是增加產(chǎn)生L-氨基酸的菌株的生產(chǎn)力，以及提供用這些菌株生產(chǎn)非芳族或芳族L-氨基酸的方法。
通過發(fā)現(xiàn)增加編碼D-木糖通透酶的xylE基因的表達能增強L-氨基酸如L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸和L-谷氨酸的生產(chǎn)而實現(xiàn)了該目標(biāo)。由此完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的目的是提供腸桿菌科的產(chǎn)生L-氨基酸的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌經(jīng)改造以增強D-木糖通透酶的活性。
本發(fā)明的又一目的是提供上述的細(xì)菌，其中所述D-木糖通透酶的所述活性通過增加編碼D-木糖通透酶的基因的表達而增強。
本發(fā)明的又一目的是提供上述細(xì)菌，其中通過修飾編碼D-木糖通透酶的基因的表達控制序列以增強基因表達，或者通過增加編碼D-木糖通透酶基因的拷貝數(shù)，而增強D-木糖通透酶的所述活性。
本發(fā)明的又一目的是提供上述細(xì)菌，其中所述細(xì)菌還經(jīng)額外修飾而增強葡糖激酶的活性。
本發(fā)明的又一目的是提供上述細(xì)菌，其中所述細(xì)菌還經(jīng)額外修飾而增強木糖異構(gòu)酶的活性。
本發(fā)明的又一目的是提供上述細(xì)菌，其中所述細(xì)菌經(jīng)修飾而增加了xylABFGHR位點的表達。
本發(fā)明的又一目的是提供上述細(xì)菌，其中所述細(xì)菌選自下組菌屬埃希氏菌屬(Escherichia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、泛菌屬(Pantoea)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、志賀氏菌屬(Shigella)、和摩根氏菌屬(Morganella)。
本發(fā)明的又一目的是提供上述細(xì)菌，其中所述基因編碼選自下組的D-木糖通透酶(A)包含氨基酸序列SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)；和(B)SEQ ID NO2所示氨基酸序列的變體蛋白質(zhì)，其具有D-木糖通透酶的活性。
本發(fā)明的又一目的是提供上述細(xì)菌，其中所述編碼D-木糖通透酶的基因包含選自下組的DNA(a)包含SEQ ID NO1中核苷酸1至1476的核苷酸序列的DNA；和(b)在嚴(yán)緊條件下可與SEQ ID NO1中核苷酸1-1476的核苷酸序列或由所述核苷酸序列制備的探針雜交，并且編碼具有D-木糖通透酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。
本發(fā)明的又一目的是提供上述細(xì)菌，其中所述嚴(yán)緊條件包括其中在60℃在1×SSC和0.1％SDS的鹽濃度下洗滌15分鐘的條件。
本發(fā)明的又一目的是提供上述細(xì)菌，其中所述細(xì)菌為產(chǎn)生L-蘇氨酸的細(xì)菌。
本發(fā)明的又一目的是提供上述細(xì)菌，其中所述細(xì)菌還經(jīng)額外修飾而增強了選自下組的基因的表達-編碼天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I并對蘇氨酸的反饋抑制有抗性的突變thrA基因，-編碼高絲氨酸激酶的thrB基因，-編碼蘇氨酸合酶的thrC基因，-編碼推定的跨膜蛋白的rhtA基因，和-其任意組合。
本發(fā)明的又一目的是提供上述細(xì)菌，其中所述細(xì)菌經(jīng)修飾增加了所述突變thrA基因、所述thrB基因、所述thrC基因、和所述rhtA基因的表達。
本發(fā)明的又一目的是提供上述細(xì)菌，其中所述細(xì)菌為產(chǎn)生L-賴氨酸的細(xì)菌。
本發(fā)明的又一目的是提供上述細(xì)菌，其中所述細(xì)菌為產(chǎn)生L-組氨酸的細(xì)菌。
本發(fā)明的又一目的是提供上述細(xì)菌，其中所述細(xì)菌為產(chǎn)生L-苯丙氨酸的細(xì)菌。
本發(fā)明的又一目的是提供上述細(xì)菌，其中所述細(xì)菌為產(chǎn)生L-精氨酸的細(xì)菌。
本發(fā)明的又一目的是提供上述細(xì)菌，其中所述細(xì)菌為產(chǎn)生L-谷氨酸的細(xì)菌。
本發(fā)明的又一目的是提供產(chǎn)生L-氨基酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述細(xì)菌，使L-氨基酸在培養(yǎng)基中積累，并從培養(yǎng)基分離L-氨基酸。
本發(fā)明的又一目的是提供上述方法，其中所述培養(yǎng)基包含木糖。
本發(fā)明的又一目的是提供上述方法，其中所述L-氨基酸是L-蘇氨酸。
本發(fā)明的又一目的是提供上述方法，其中所述L-氨基酸是L-賴氨酸。
本發(fā)明的又一目的是提供上述方法，其中所述L-氨基酸是L-組氨酸。
本發(fā)明的又一目的是提供上述方法，其中所述L-氨基酸是L-苯丙氨酸。
本發(fā)明的又一目的是提供上述方法，其中所述L-氨基酸是L-精氨酸。
本發(fā)明的又一目的是提供上述方法，其中所述L-氨基酸是L-谷氨酸。


圖1顯示大腸桿菌染色體中xylE基因上游區(qū)域的結(jié)構(gòu)，和包含cat基因和雜合PL-tac啟動子的整合DNA片段的結(jié)構(gòu)。
圖2顯示在含葡萄糖的培養(yǎng)基上生長的大腸桿菌菌株MG1655、MG1655ΔptsHI-crr和MG1655PL-tacxylE的生長曲線。圖例MG＝大腸桿菌MG1655；MG Δpts＝大腸桿菌MG1655 ΔptsHI-crr；MG Δpts P xylE＝大腸桿菌MG1655ΔptsHI-crr PL-tacxylE。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案本發(fā)明中，“產(chǎn)生L-氨基酸的細(xì)菌”指當(dāng)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)菌時，具有在培養(yǎng)基中生產(chǎn)和分泌L-氨基酸的能力的細(xì)菌?？梢酝ㄟ^培育而賦予或增強L-氨基酸生產(chǎn)能力。如本文所用的術(shù)語“產(chǎn)生L-氨基酸的細(xì)菌”還指能夠以大于大腸桿菌如大腸桿菌K-12的野生型或親本菌株的量生產(chǎn)并導(dǎo)致L-氨基酸在培養(yǎng)基中積累的細(xì)菌，優(yōu)選指所述細(xì)菌能夠?qū)е略谂囵B(yǎng)基中積累不少于0.5g/L量的，更優(yōu)選不小于1.0g/L的目標(biāo)L-氨基酸。術(shù)語“L-氨基酸”包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、和L-纈氨酸。L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、和L-谷氨酸是特別優(yōu)選的。
腸桿菌科包括屬于埃希氏菌屬、腸桿菌屬、歐文氏菌屬、克雷伯氏菌屬、泛菌屬、Photorhabdus、普羅威登斯菌屬、沙門氏菌屬、沙雷氏菌屬、志賀氏菌屬、摩根氏菌屬、耶爾森氏菌屬(Yersinia)等的細(xì)菌。具體地，可以使用依據(jù)NCBI(National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorg？mode＝Tree&id＝1236&lvl＝3&keep＝1&srchmode＝1&unlock)中所用分類法歸類于腸桿菌科的那些。屬于埃希氏菌屬或泛菌屬的細(xì)菌是優(yōu)選的。
短語“屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌”指依據(jù)微生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的分類法歸類于埃希氏菌屬的細(xì)菌。如用于本發(fā)明的屬于埃希氏菌屬的微生物的例子包括但不限于大腸桿菌(E.coli)。
可用于本發(fā)明的屬于埃希氏菌屬細(xì)菌沒有特別限制；然而，例如Neidhardt，F(xiàn).C.等描述的細(xì)菌(Escherichia coli and Salmonella typhimurium，American Society forMicrobiology，Washington D.C.，1208，表1)包括在本發(fā)明中。
術(shù)語“屬于泛菌屬的細(xì)菌”指依據(jù)微生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的分類法歸類于泛菌屬的細(xì)菌?；?6S rRNA的核苷酸序列分析等，成團腸桿菌(Enterobacteragglomerans)的一些菌種最近已被重新歸類于成團泛菌(Pantoea agglomerans)、Pantoea ananatis、斯氏泛菌(Pantoea stewartii)等等。(Int.J.Syst.Bacteriol.，43，162-173(1993))。
本發(fā)明的細(xì)菌包括具有生產(chǎn)L-氨基酸的能力的腸桿菌科菌株，其經(jīng)修飾增強了D-木糖通透酶的活性。此外，本發(fā)明的細(xì)菌包括具有生產(chǎn)L-氨基酸的能力而不具有D-木糖通透酶天然活性，并且已經(jīng)用編碼D-木糖通透酶的DNA片段轉(zhuǎn)化的腸桿菌科的菌株。
短語“D-木糖通透酶的活性”指將糖如木糖和葡萄糖轉(zhuǎn)運到細(xì)胞中的活性?？梢酝ㄟ^補償具有破壞的糖轉(zhuǎn)運PTS-系統(tǒng)的細(xì)菌的生長延遲(參見，例如，實施例中描述的ΔptsHI-crr突變體)或者通過體內(nèi)補償xylE突變(Davis，E.O. and Henderson，P.J.，J.Biol.Chem.，262(29)；13928-32(1987))來檢測D-木糖通透酶的活性。
短語“細(xì)菌經(jīng)修飾增強了D-木糖通透酶的活性”指每個細(xì)胞的活性高于非修飾菌株例如野生型菌株的活性。這種修飾的例子包括增加每個細(xì)胞的D-木糖通透酶分子的數(shù)目，增強每個D-木糖通透酶分子的比活等。另外，可用于對比目的的野生型菌株包括例如大腸桿菌K-12。本發(fā)明中，作為增強D-木糖通透酶的胞內(nèi)活性的結(jié)果，可以增加培養(yǎng)基中積累的L-氨基酸例如L-蘇氨酸或L-精氨酸的量。
可以通過增加編碼D-木糖通透酶的xylE基因的表達獲得細(xì)菌細(xì)胞中D-木糖通透酶活性的增強。源自屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌的任何xylE基因以及源自其它細(xì)菌如棒狀桿菌型細(xì)菌(coryneform bacteria)的任意xylE基因可以用作本發(fā)明中的D-木糖通透酶基因。源自屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌的xylE基因是優(yōu)選的。
短語“增加基因的表達”指基因的表達量高于非修飾的菌株例如野生型菌株的表達量。這種修飾的例子包括增加每個細(xì)胞中基因的拷貝數(shù)，提高(一個或幾個)基因的表達水平等等。例如，通過限制性處理染色體DNA，然后利用基于基因序列的探針進行Southern印跡，熒光原位雜交(FISH)等測定基因的拷貝數(shù)?；虮磉_水平可以用多種方法包括Northern印跡、定量RT-PCR等測定。另外，可以當(dāng)作對照的野生型菌株包括例如大腸桿菌K-12或Pantoea ananatis FERM BP-6614(US2004180404A1)。Pantoea ananatis FERM BP-6614于1998年2月19日保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(National Institute of Bioscience andHuman-Technology，Agency of Industrial Science and Technology，Ministry of InternationalTrade and Industry)(現(xiàn)在為獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(International Patent Organism Depositary，National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology))，給予保藏號FERM P-16644。然后依據(jù)布達佩斯條約的規(guī)定于1999年1月11日將其轉(zhuǎn)為國際保藏，給予保藏號FERM BP-6614。雖然該菌株在其被分離時被鑒定為成團腸桿菌，但如上所述，基于16S rRNA的核苷酸序列分析，已經(jīng)將其重新歸類于Pantoea ananatis。
作為增強D-木糖通透酶胞內(nèi)活性的結(jié)果，提高了L-氨基酸例如L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸或L-谷氨酸在培養(yǎng)基中的積累。
已經(jīng)闡明了來自大腸桿菌的編碼D-木糖通透酶，即D-木糖/質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運蛋白的xylE基因(GenBank登錄號NC_000913.2，gi49175990的序列中的核苷酸編號4240277至4238802)。xylE基因位于大腸桿菌K-12染色體上yjbA ORF和malG基因之間。也闡明了另一個編碼D-木糖通透酶的xylE基因(AAN45595.xylose-proton sym...[gi24054686]，AAM41050.MFS transporter...[gi21112853]野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)XCC1759)。本發(fā)明中，來自大腸桿菌的xylE基因由SEQ IDNO.1表示。
一旦被轉(zhuǎn)運到細(xì)胞中，葡萄糖就由葡糖激酶磷酸化，所述葡糖激酶由glk基因所編碼。因此也希望改造所述細(xì)菌以使之具有增強的葡糖激酶活性。已經(jīng)闡明了編碼大腸桿菌葡糖激酶的glk基因(GenBank登錄號NC_000913.1，gi16127994的序列中核苷酸編號2506481至2507446)。glk基因位于大腸桿菌K-12染色體上b2387和b2389ORFs之間。
在合適的條件下，由xylA基因編碼的木糖異構(gòu)酶也有效地催化D-葡萄糖向D-果糖的轉(zhuǎn)化(Wovcha，M.G.等，Appl Environ Microbiol.45(4)1402-4(1983))。因此也希望修飾所述細(xì)菌以使之具有增強的木糖異構(gòu)酶活性。已經(jīng)闡明了編碼大腸桿菌木糖異構(gòu)酶的xylA基因(GenBank登錄號NC_000913.2，gi49175990的序列中核苷酸編號3728788至3727466)。xylA基因位于大腸桿菌K-12染色體上xylB和xylF基因之間。
當(dāng)培養(yǎng)基包含作為附加碳源的木糖時，增加木糖利用酶的活性是必需的?！澳咎抢媒汀卑咎寝D(zhuǎn)運、木糖異構(gòu)化和木糖磷酸化的酶、以及調(diào)節(jié)蛋白。這種酶包括木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶、木糖轉(zhuǎn)運蛋白、和木糖轉(zhuǎn)錄激活因子(xylose transcriptionalactivator)。木糖異構(gòu)酶催化D-木糖到D-木酮糖的異構(gòu)化的反應(yīng)。木酮糖激酶催化利用ATP磷酸化D-木酮糖產(chǎn)生D-木酮糖-5-磷酸(D-xylulose-5-phosphate)和ADP的反應(yīng)。木糖利用酶如木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶活性的存在分別通過相應(yīng)木糖異構(gòu)酶陰性或木酮糖激酶陰性大腸桿菌突變體的補償來測定。
編碼上述木糖利用酶的基因位于大腸桿菌染色體上xylABFGHR基因座中。編碼木酮糖激酶(EC編號2.7.1.17)的基因是已知的，已被命名為xylB(GenBank登錄號NC_000913.1，gi16131435的序列中核苷酸編號3725546至3727000)。編碼木糖結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的基因是已知的，已被命名為xylF(GenBank登錄號NC_000913.1，gi16131437的序列中核苷酸編號3728760至3729752)。編碼木糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)推定的ATP結(jié)合蛋白的基因是已知的，已被命名為xylG(GenBank登錄號NC_000913.1，gi16131438的序列中核苷酸編號3729830至3731371)。編碼ABC型木糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的通透酶成分的基因是已知的，已被命名為xylH(GenBank登錄號NC_000913.1，gi16131439的序列中核苷酸編號3731349至3732530)。編碼xyl操縱子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的基因是已知的，已被命名為xylR(GenBank登錄號NC_000913.1，gi16131440的序列中核苷酸編號3732608至3733786)。
因此，可以利用基于所述基因的已知核苷酸序列制備的引物通過PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；參考White，TJ.等.，Trends Genet.，5，185(1989))獲得xylE、glk和xylABFGHR基因座的基因。編碼其他微生物的D-木糖通透酶的基因可以按照類似的方式獲得。
用編碼下述蛋白(A)或(B)的DNA例示源自大腸桿菌的xylE基因(A)具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或(B)SEQ ID NO2所示氨基酸序列的變體蛋白質(zhì)，其具有D-木糖通透酶活性。
如本發(fā)明中所用的短語“變體蛋白”指其序列有改變的蛋白質(zhì)，無論是氨基酸的缺失、插入、添加、還是取代，但其仍然保留了可用水平的所需活性，例如可用于增強L-氨基酸的生產(chǎn)。變體蛋白中改變的數(shù)目依賴于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的位點或類型。對于蛋白質(zhì)(A)來說可以是2至30個，優(yōu)選2至15個，更優(yōu)選2至5個。所述變體中的這些改變可能發(fā)生在對于蛋白質(zhì)的功能來說不重要的蛋白質(zhì)區(qū)域中。這是因為一些氨基酸彼此具有高度的同源性，這樣三維結(jié)構(gòu)或活性不受這種改變的影響。所述變體蛋白中的這些改變可能發(fā)生在對于蛋白質(zhì)的功能來說不重要的蛋白質(zhì)區(qū)域中。因此，所述蛋白質(zhì)變體(B)可以是相對于SEQ ID NO.2所示的D-木糖通透酶的完整氨基酸序列來說具有不小于70％，優(yōu)選80％，更優(yōu)選90％，最優(yōu)選95％的同源性的變體，只要保留了D-木糖通透酶的活性。可以用熟知的方法例如計算機程序BLAST 2.0測定兩個氨基酸序列之間的同源性，BLAST 2.0計算三個參數(shù)分?jǐn)?shù)、同一性和相似性。
編碼與上述D-木糖通透酶基本相同的蛋白質(zhì)的DNA可以例如通過修飾編碼D-木糖通透酶的DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO1)來獲得，例如以定點誘變方法，使特定位點包含一個或多個氨基酸殘基的缺失、取代、插入、或添加。如上所述修飾的DNA可以由常規(guī)已知的突變處理獲得。這種處理包括羥胺處理編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA，或者用紫外線照射或試劑如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍或亞硝酸處理包含所述DNA的細(xì)菌。
一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入或添加應(yīng)當(dāng)是保守性突變，以保留所述活性。代表性保守性突變是保守性取代。保守性取代的例子包括Ser或Thr取代Ala，Gln、His或Lys取代Arg，Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn，Asn、Glu或Gln取代Asp，Ser或Ala取代Cys，Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln，Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu，Pro取代Gly，Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His，Leu、Met、Val或Phe取代Ile，Ile、Met、Val或Phe取代Leu，Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys，Ile、Leu、Val或Phe取代Met，Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe，Thr或Ala取代Ser，Ser或Ala取代Thr，Phe或Tyr取代Trp，His、Phe或Trp取代Tyr，以及Met、Ile或Leu取代Val。
編碼與D-木糖通透酶基本相同的蛋白質(zhì)的DNA可以通過在合適的細(xì)胞中表達具有上述突變的DNA，并研究任何表達產(chǎn)物的活性而獲得。編碼與D-木糖通透酶基本相同的蛋白質(zhì)的DNA也可以通過分離DNA獲得，所述DNA可在嚴(yán)緊條件下與具有核苷酸序列的探針雜交并編碼具有D-木糖通透酶活性的蛋白質(zhì)，所述核苷酸序列包含例如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。此處所指“嚴(yán)緊條件”是在此條件下形成所謂的特異性雜合體而不形成非特異性雜合體的條件?？梢耘e例說明所述嚴(yán)緊條件，例如，在所述嚴(yán)緊條件下，具有高度同源性的DNAs，例如具有不小于50％同源性，優(yōu)選80％，更優(yōu)選90％，最優(yōu)選95％的DNAs能夠互相雜交，而具有低于上述同源性的DNAs不能互相雜交?；蛘撸梢耘e例說明嚴(yán)緊條件，在所述嚴(yán)緊條件下，DNA能夠于Southern雜交中，在相當(dāng)于常規(guī)洗滌條件的鹽濃度下雜交，即1×SSC、0.1％SDS，優(yōu)選0.1×SSC、0.1％SDS、60℃。洗滌的持續(xù)時間依賴于用于印跡的膜的類型，通常是制造商所推薦的。例如，在嚴(yán)緊條件下，洗滌HybondTMN+尼龍膜(Amersham)的推薦的持續(xù)時間是15分鐘。優(yōu)選地，洗滌可以進行2至3次。
核苷酸序列SEQ ID NO1的部分序列也可以用作探針?？梢岳没诤塑账嵝蛄蠸EQ ID NO1的引物，和包含核苷酸序列SEQ ID NO1的DNA片段作為模板，通過PCR制備探針。長約300bp的DNA片段用作探針時，洗滌的雜交條件包括，例如50℃、2×SSC和0.1％SDS。
上述核苷酸的取代、缺失、插入、或添加還包括例如由于細(xì)菌的種或?qū)僦械亩鄻有远烊话l(fā)生(突變體或變體)并且包含D-木糖通透酶的突變。
“用編碼蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌”指例如用常規(guī)方法將DNA導(dǎo)入細(xì)菌中。該DNA的轉(zhuǎn)化將導(dǎo)致編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的基因表達的增加，并將增強細(xì)菌細(xì)胞中所述蛋白質(zhì)的活性。轉(zhuǎn)化方法包括迄今報導(dǎo)的任何已知方法。例如，對于大腸桿菌K-12，已經(jīng)報導(dǎo)了用氯化鈣處理受體細(xì)胞以增強細(xì)胞對DNA的通透性的方法(Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))，并可以使用該方法。
基因表達增強的方法包括增加基因拷貝數(shù)。將基因?qū)氲侥軌蛟谀c桿菌科細(xì)菌中發(fā)揮作用的載體中來增加基因的拷貝數(shù)。優(yōu)選使用低拷貝載體。低拷貝載體的例子包括但不限于pSC101、pMW118、pMW119等。術(shù)語“低拷貝載體”用于其拷貝數(shù)多達每個細(xì)胞5個拷貝的載體。
也可以通過將多拷貝基因?qū)氲郊?xì)菌染色體中來實現(xiàn)基因表達的增強，例如通過同源重組、Mu整合等方法導(dǎo)入。例如一次Mu整合作用允許向細(xì)菌染色體中導(dǎo)入多達3個拷貝的基因。
增加D-木糖通透酶基因的拷貝數(shù)也可以通過向細(xì)菌的染色體DNA導(dǎo)入多拷貝的D-木糖通透酶基因而實現(xiàn)。為了將多拷貝基因?qū)氲郊?xì)菌染色體中，利用其多拷貝在染色體DNA中作為靶物(target)存在的序列實施同源重組。在染色體DNA中具有多拷貝的序列包括但不限于重復(fù)DNA，或存在于轉(zhuǎn)座元件(transposable element)末端的反向重復(fù)序列(inverted repeat)。還有，如美國專利5,595,889中公開的，可以將D-木糖通透酶基因摻入到轉(zhuǎn)座子中，并使其轉(zhuǎn)移以將多拷貝基因?qū)肴旧wDNA中。
基因表達的增強也可以通過將本發(fā)明的DNA置于強啟動子的控制之下而實現(xiàn)。例如，將lac啟動子、trp啟動子、trc啟動子、和lambda噬菌體的PR或PL啟動子稱為強啟動子?；虮磉_的增強還可以通過將強終止子置于本發(fā)明的DNA下游而實現(xiàn)。強啟動子和/或終止子可以與基因拷貝的增加組合使用?；蛘?，例如可以通過向啟動子導(dǎo)入突變以提高位于啟動子下游的結(jié)構(gòu)基因(基因的編碼區(qū))的轉(zhuǎn)錄水平，從而增強啟動子的效果。類似地，例如可通過向終止子導(dǎo)入突變以提高位于終止子上游基因轉(zhuǎn)錄的周轉(zhuǎn)(turnover)，從而增強終止子的效果。
另外，已知核糖體結(jié)合位點(RBS)與起始密碼子之間的間隔區(qū)，尤其是恰位于起始密碼子上游的序列中幾個核苷酸的取代深刻地影響mRNA可譯性。例如，發(fā)現(xiàn)了20倍范圍的表達水平，這依賴于起始密碼子之前的三個核苷酸的性質(zhì)(Gold等，Annu.Rev.Microbiol.，35，365-403，1981；Hui等.，EMBO J.，3，623-629，1984)。先前，已表明rhtA23突變是相對于ATG起始密碼子來說在-1位置的A取代G的取代(ABSTRACTSof 17thInternational Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology，San Francisco，California August 24-29，1997，abstract No.457)。因此，可表明rhtA23突變增強了rhtA基因表達，結(jié)果增加了對蘇氨酸、高絲氨酸和轉(zhuǎn)運出細(xì)胞的一些其它物質(zhì)的抗性。
另外，也可能向細(xì)菌染色體上的D-木糖通透酶基因的啟動子或終止子區(qū)導(dǎo)入核苷酸取代，這導(dǎo)致更強的啟動子或終止子功能。例如，可以利用溫度敏感性質(zhì)粒以與基因取代相同的方式進行表達控制序列的改變，如國際專利公開WO 00/18935和日本專利申請公開No.1-215280中公開的。
制備質(zhì)粒DNA的方法包括但不限于DNA的消化和連接、轉(zhuǎn)化、選擇寡核苷酸作為引物等、或者本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他方法。例如在Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，和Maniatis，T.，“Molecular Cloning A Laboratory Manual，SecondEdition”，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中描述了這些方法。
可以通過將前述DNA導(dǎo)入到本身具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力的細(xì)菌中而獲得本發(fā)明的細(xì)菌?；蛘撸梢酝ㄟ^將產(chǎn)生L-氨基酸的能力賦予已包含所述DNA的細(xì)菌而獲得本發(fā)明的細(xì)菌。
生產(chǎn)L-蘇氨酸的細(xì)菌用于衍生本發(fā)明的產(chǎn)生L-蘇氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子包括，但不限于屬于埃希氏菌屬的產(chǎn)生L-蘇氨酸的細(xì)菌，如大腸桿菌TDH-6/pVIC40(VKPM B-3996)(美國專利Nos.5,175,107和5,705,371)、大腸桿菌NRRL-21593(美國專利No.5,939,307)、大腸桿菌FERM BP-3756(美國專利No.5,474,918)、大腸桿菌FERM BP-3519和FERM BP-3520(美國專利No.5,376,538)、大腸桿菌MG442(Gusyatiner等.，Genetika(俄語)、1978，14947-956)、大腸桿菌VL643和VL2055(EP 1149911 A)等。
菌株TDH-6是thrC基因缺陷的，并且是蔗糖同化的，且ilvA基因具有滲漏(leaky)突變。該菌株在rhtA基因中也有突變，其賦予對高濃度蘇氨酸或高絲氨酸的抗性。菌株B-3996包含質(zhì)粒pVIC40，其通過將包括突變thrA基因的thrA*BC操縱子插入到RSF1010衍生載體中而獲得。該突變thrA基因編碼天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I，其對于蘇氨酸反饋抑制基本上脫敏。菌株B-3996于1987年11月19日以保藏號RIA 1867保藏在All-Union ScientificCenter of Antibiotics(Nagatinskaya Street 3-A，117105莫斯科，俄羅斯聯(lián)邦)。所述菌株還于1987年4月7日以保藏號B-3996保藏在俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms)(VKPM；Dorozhny proezd.1，莫斯科117545，俄羅斯聯(lián)邦)。
優(yōu)選本發(fā)明的細(xì)菌經(jīng)額外修飾增強下述基因中一個或多個的表達-突變thrA基因，其編碼對蘇氨酸反饋抑制有抗性的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I；-thrB基因，其編碼高絲氨酸激酶；-thrC基因，其編碼蘇氨酸合酶；-rhtA基因，其編碼推定的跨膜蛋白；-asd基因，其編碼天冬氨酸-β-半醛脫氫酶；和-aspC基因，其編碼天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶)；已經(jīng)闡明了編碼大腸桿菌天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的thrA基因(核苷酸位置337至2799，GenBank登錄號NC_000913.2，gi49175990)。thrA基因位于大腸桿菌K-12染色體上的thrL和thrB基因之間。已經(jīng)闡明了編碼大腸桿菌高絲氨酸激酶的thrB基因(核苷酸位置2801至3733，GenBank登錄號NC_000913.2，gi49175990)。thrB基因位于大腸桿菌K-12染色體上thrA和thrC基因之間。已經(jīng)闡明了編碼大腸桿菌蘇氨酸合酶的thrC基因(核苷酸位置3734至5020，GenBank登錄號NC_000913.2，gi49175990)。thrC基因位于大腸桿菌K-12染色體上thrB基因和yaaX開放閱讀框之間。這三個基因都作為單一蘇氨酸操縱子起作用。
編碼對蘇氨酸反饋抑制有抗性的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的突變thrA基因，以及thrB和thrC基因，可以從熟知的質(zhì)粒pVIC40作為一個操縱子獲得，質(zhì)粒pVIC40存在于生產(chǎn)蘇氨酸的大腸桿菌VKPM B-3996中。質(zhì)粒pVIC40詳細(xì)描述于美國專利No.5,705,371。
rhtA基因存在于大腸桿菌染色體上靠近glnHPQ操縱子的18min處，其編碼谷氨酰胺轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的組件。rhtA基因與ORF1(ybiF基因，位置764至1651，GenBank登錄號AAA218541，gi440181)相同，并且位于pexB和ompX基因之間。表達由ORF1編碼的蛋白質(zhì)的單元已被命名為rhtA基因(rht抗高絲氨酸和蘇氨酸)。另外，揭示了rhtA23突變是相對于ATG起始密碼子來說-1位置的A取代G的取代(ABSTRACTS of17thInternational Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with theAnnual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology，SanFrancisco，California，August 24-29，1997，abstract No.457，EP 1013765 A)。
已闡明大腸桿菌的asd基因(核苷酸位置3572511至3571408，GenBank登錄號NC_000913.1，gi16131307)，并可以利用基于所述基因的核苷酸序列的引物通過PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；參考White，T.J.等，Trends Genet.，1989，5185)獲得。其它微生物的asd基因可以以類似的方式獲得。
還闡明了大腸桿菌的aspC基因(核苷酸位置983742至984932，GenBank登錄號NC_000913.1，gi16128895)，并可以通過PCR獲得該基因。其它微生物的aspC基因可以以類似的方式獲得。
產(chǎn)生L-賴氨酸的細(xì)菌屬于埃希氏菌屬的產(chǎn)生L-賴氨酸的細(xì)菌的例子包括對L-賴氨酸類似物具有抗性的突變體。所述L-賴氨酸類似物抑制屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌的生長，但當(dāng)L-賴氨酸共存于培養(yǎng)基中時，該抑制是完全或部分脫敏的。L-賴氨酸類似物的例子包括但不限于氧代賴氨酸、賴氨酸氧肟酸(lysine hydroxamate)、S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、γ-甲基賴氨酸、α-氯代己內(nèi)酰胺(α-chlorocaprolactam)等等。對這些賴氨酸類似物有抗性的突變體可以通過對屬于埃希氏菌屬細(xì)菌進行常規(guī)人工誘變處理而獲得。可用于產(chǎn)生L-賴氨酸的菌株的具體例子包括大腸桿菌AJ11442 (FERM BP-1543，NRRL B-12185；參見美國專利4,346,170)和大腸桿菌VL611。在這些微生物中，天冬氨酸激酶受L-賴氨酸的反饋抑制是脫敏的。
菌株WC196可以用作大腸桿菌的產(chǎn)生L-賴氨酸的細(xì)菌。通過將AEC抗性賦予菌株W3110來培育該細(xì)菌菌株，菌株W3110來源于大腸桿菌K-12。所得菌株稱為大腸桿菌AJ13069菌株，并于1994年12月6日保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(National Institute of Bioscienceand Human-Technology，Agency of Industrial Science and Technology)(現(xiàn)在為獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology，International Patent OrganismDepositary)，Tsukuba Central 6，1-1，Higashi l-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，日本)，得到登錄號FERM P-14690。之后，依據(jù)布達佩斯條約的規(guī)定，于1995年9月29日轉(zhuǎn)為國際保藏，得到登錄號FERM BP-5252(美國專利5,827,698)。
產(chǎn)生L-組氨酸的細(xì)菌用于衍生本發(fā)明的產(chǎn)生L-組氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子包括但不限于屬于埃希氏菌屬的產(chǎn)生L-組氨酸的細(xì)菌，如大腸桿菌菌株24(VKPM B-5945，RU2003677)；大腸桿菌菌株80(VKPM B-7270，RU2119536)；大腸桿菌NRRLB12116-B12121(美國專利4,388,405)；大腸桿菌H-9342(FERM BP-6675)和H-9343(FERM BP-6676)(美國專利6,344,347)；大腸桿菌H-9341(FERMBP-6674)(EP 1085087)；大腸桿菌AI80/pFM201(美國專利6,258,554)等。
產(chǎn)生L-苯丙氨酸的細(xì)菌用于衍生本發(fā)明的產(chǎn)生L-苯丙氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子包括但不限于屬于埃希氏菌屬的產(chǎn)生L-苯丙氨酸的細(xì)菌，如大腸桿菌AJ12739(tyrA::Tn10，tyrR)(VKPM B-8197)；含有pheA34基因的大腸桿菌HW1089(ATCC 55371)(美國專利5,354,672)；大腸桿菌MWEC101-b(KR8903681)；大腸桿菌NRRL B-12141、NRRL B-12145、NRRL B-12146、和NRRL B-12147(美國專利4,407,952)。另外，大腸桿菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAB(FERMBP-3566)、大腸桿菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAD](FERM BP-12659)、大腸桿菌K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm](FERM BP-12662)、和命名為AJ 12604(FERM BP-3579)的大腸桿菌K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4，pACMAB]可以用作親本菌株(EP 488424 B1)。另外，也可以使用屬于埃希氏菌屬的產(chǎn)生L-苯丙氨酸的細(xì)菌，其中由yedA基因或yddG基因編碼的蛋白質(zhì)具有增強的活性(美國專利申請2003/0148473 A1和2003/0157667 A1)。
產(chǎn)生L-精氨酸的細(xì)菌用于衍生本發(fā)明的產(chǎn)生L-精氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子包括但不限于產(chǎn)生L-精氨酸的細(xì)菌如大腸桿菌菌株237(VKPM B-7925)(美國專利申請2002/0058315 A1)及其含有突變的N-乙酰谷氨酸合酶的衍生菌株(俄羅斯專利申請No.2001112869)、大腸桿菌菌株382(VKPM B-7926)(EP 1170358 A1)、具有在其中導(dǎo)入的編碼N-乙酰谷氨酸合成酶的argA基因的產(chǎn)生精氨酸的菌株(JP 57-5693A)等等。
產(chǎn)生L-谷氨酸的細(xì)菌用于衍生本發(fā)明的產(chǎn)生L-谷氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子包括但不限于屬于埃希氏菌屬的產(chǎn)生L-谷氨酸的細(xì)菌如大腸桿菌VL334thrC+(EP1172433)。大腸桿菌VL334(VKPM B-1641)是L-異亮氨酸和L-蘇氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株，其在thrC和ilvA基因中具有突變(美國專利No.4,278,765)。利用培養(yǎng)在野生型大腸桿菌K12(VKPM B-7)細(xì)胞上的噬菌體P1，通過普通的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法轉(zhuǎn)移thrC基因的野生型等位基因。結(jié)果，獲得了L-異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株VL334thrC+(VKPM B-8961)。該菌株能夠產(chǎn)生L-谷氨酸。
用于衍生本發(fā)明的產(chǎn)生L-谷氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子包括但不限于α-酮戊二酸脫氫酶活性缺陷的突變體或者具有減小的α-酮戊二酸脫氫酶活性的突變體。α-酮戊二酸脫氫酶活性缺陷的或者具有減小的α-酮戊二酸脫氫酶活性的屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌以及獲得它們的方法在美國專利5,378,616和5,573,945中描述。具體地，這些菌株包括下述大腸桿菌W3110sucA::Kmr大腸桿菌AJ12624(FERM BP-3853)大腸桿菌AJ12628(FERM BP-3854)大腸桿菌AJ12949(FERM BP-4881)大腸桿菌W3110sucA::Kmr通過破壞大腸桿菌W3110的α-酮戊二酸脫氫酶基因(以下稱為“sucA基因”)而獲得。該菌株是α-酮戊二酸脫氫酶完全缺陷的。
產(chǎn)生L-谷氨酸的細(xì)菌的其它例子包括屬于泛菌屬的突變菌株，其為α-酮戊二酸脫氫酶活性缺陷的或者具有減小的α-酮戊二酸脫氫酶活性，并可以如上所述獲得。這樣的菌株包括Pantoea ananatis AJ13356。(美國專利6,331,419)。Pantoea ananatis AJ13356于1998年2月19日以登錄號FERMP-16645保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(NationalInstitute of Bioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Science andTechnology，Ministry of International Trade and Industry)(現(xiàn)在為獨立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology，International Patent Organism Depositary)，Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，日本)。之后依據(jù)布達佩斯條約的規(guī)定于1999年1月11日轉(zhuǎn)為國際保藏，得到登錄號FERM BP-6615。Pantoea ananatis AJ13356是α-酮戊二酸脫氫酶活性缺陷的，這是破壞αKGDH-E1亞基基因(sucA)的結(jié)果。上述菌株在分離時被鑒定為成團腸桿菌，并保藏為成團腸桿菌AJ13356。然而，最近根據(jù)16S rRNA的核苷酸測序等將其重新分類為Pantoea ananatis。盡管AJ13356在前述保藏機構(gòu)保藏為成團腸桿菌，但在本說明書中，將它們描述為Pantoea ananatis。
L-氨基酸的生產(chǎn)草酰乙酸(OAA)作為導(dǎo)致合成Thr和Lys的反應(yīng)的底物。OAA由于PEP與磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的反應(yīng)而得到，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶作為催化劑起作用。因此，細(xì)胞中PEPC濃度的升高對于這些氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)可能是非常重要的。當(dāng)葡萄糖用作發(fā)酵中的碳源時，葡萄糖被葡萄糖-磷酸轉(zhuǎn)移酶(Glc-PTS)系統(tǒng)內(nèi)在化(internalize)。此系統(tǒng)消耗PEP，而且PTS中的蛋白質(zhì)由ptsG和ptsHIcrr編碼。內(nèi)在化期間，從一個分子葡萄糖產(chǎn)生一個分子PEP和一個分子丙酮酸(Pyr)。
在蔗糖而非葡萄糖中培養(yǎng)時，已被修飾而具有利用蔗糖的能力(Scr-PTS)的產(chǎn)生L-蘇氨酸的菌株和產(chǎn)生L-賴氨酸的菌株具有更高的生產(chǎn)這些氨基酸的能力(EP 1149911 A2)。相信由一個分子蔗糖通過Scr-PTS產(chǎn)生三個分子PEP和一個分子Pyr，提高PEP/Pyr的比例，由此促進由蔗糖合成Thr和Lys。此外，已報導(dǎo)Glc-PTS受到幾種表達控制(Postma P.W.等.，Microbiol Rev.，57(3)，543-94(1993)；Clark B.等.J.Gen.Microbiol.，96(2)，191-201(1976)；PlumbridgeJ.，Curr.Opin.Microbiol.，5(2)，187-93(2002)；Ryu S.等.，J.Biol.Chem.，270(6)2489-96(1995))，因此有可能葡萄糖自身的摻入在氨基酸發(fā)酵中可能是限速步驟。
通過在產(chǎn)生蘇氨酸的菌株、產(chǎn)生賴氨酸的菌株、產(chǎn)生組氨酸的菌株、產(chǎn)生苯丙氨酸的菌株和/或產(chǎn)生谷氨酸的菌株中增加xylE基因的表達而進一步提高PEP/Pyr的比例將進一步增加氨基酸生產(chǎn)。因為從兩個分子葡萄糖產(chǎn)生四個分子PEP，預(yù)期PEP/Pyr的比例將大大提高。由于xylE基因表達增加，預(yù)期將去除glc-PTS的表達控制。
本發(fā)明產(chǎn)生L-氨基酸的方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)菌，使L-氨基酸在培養(yǎng)基中積累，并從培養(yǎng)基收集L-氨基酸的步驟。此外，本發(fā)明的方法包括產(chǎn)生L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸或L-谷氨酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)菌，使L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸或L-谷氨酸積累在培養(yǎng)基中，并從培養(yǎng)基收集L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸或L-谷氨酸。
在本發(fā)明中，從培養(yǎng)基培養(yǎng)、收集、和純化L-氨基酸等可通過常規(guī)發(fā)酵方法進行，其中用微生物生產(chǎn)L-氨基酸。
所述培養(yǎng)基可以是合成的或天然的，只要所述培養(yǎng)基包括碳源和氮源以及礦物質(zhì)，并且必要時還包括微生物生長所需的適量營養(yǎng)物。碳源可以包括多種碳水化合物如葡萄糖、蔗糖和木糖，以及多種有機酸。取決于所選微生物的同化方式，可以使用醇包括乙醇和甘油。作為氮源，可以使用多種銨鹽如氨和硫酸銨，其它氮化合物如胺，天然氮源如蛋白胨，大豆水解物和經(jīng)消化的發(fā)酵微生物。作為礦物質(zhì)，可以使用鉀單磷酸鹽(potassiummonophosphate)、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、氯化鈣等。硫胺、酵母提取物等可以用作維生素。必要時可以向培養(yǎng)基添加附加營養(yǎng)物。例如，如果微生物生長需要L-氨基酸(L-氨基酸營養(yǎng)缺陷型)，則可以向培養(yǎng)基添加足量的L-氨基酸。
培養(yǎng)優(yōu)選在需氧條件下進行，例如在20至40℃，優(yōu)選30至38℃的溫度振蕩培養(yǎng)，以及通氣攪拌培養(yǎng)。培養(yǎng)的pH通常在5到9之間，優(yōu)選6.5到7.2之間?？梢杂冒薄⑻妓徕}、多種酸、多種堿、和緩沖液調(diào)整培養(yǎng)的pH。通常，培養(yǎng)1至5天導(dǎo)致目標(biāo)L-氨基酸在液體培養(yǎng)基中積累。
培養(yǎng)后，可以通過離心或膜過濾從液體培養(yǎng)基中去除固體如細(xì)胞，然后可以通過離子交換、濃縮和/或結(jié)晶方法收集并純化目標(biāo)L-氨基酸。
實施例以下將參考下述非限制性實施例更具體地解釋本發(fā)明。
實施例1用雜合PL-tac啟動子取代大腸桿菌中xylE基因的天然啟動子區(qū)為了取代xylE基因的天然啟動子區(qū)，利用Datsenko K.A.and Wanner B.L.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97，6640-6645)描述的方法，將攜帶雜合PL-tac啟動子和由cat基因編碼的氯霉素抗性標(biāo)記(CmR)的DNA片段整合到大腸桿菌MG1655(ATCC 700926)的染色體中，代替天然啟動子區(qū)，所述方法也稱為“Red-介導(dǎo)的整合”和/或“Red-驅(qū)動的整合”。具有熱敏復(fù)制子的重組質(zhì)粒pKD46(Datsenko，K.A.，Wanner，B.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97，6640-6645)用作由噬菌體λ衍生的基因的供體，所述基因負(fù)責(zé)Red-介導(dǎo)的重組系統(tǒng)。包含重組質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌菌株BW25113可由大腸桿菌GeneticStock Center，Yale University，New Haven，USA獲得，其登錄號為CGSC7630。
化學(xué)合成雜合PL-tac啟動子。取代的啟動子的核苷酸序列顯示于序列表中(SEQ ID NO3)。包含雜合PL-tac啟動子的合成DNA片段在其5’端包含BglII識別位點，其對于進一步連接到被導(dǎo)入以進一步整合到細(xì)菌染色體中的cat基因和與xylE基因5’末端同源的36個核苷酸來說是必需的。
使用商業(yè)上可獲得的質(zhì)粒pACYC184(GenBank/EMBL登錄號X06403，“Fermentas”，Lithuania)為模板，和引物P1(SEQ ID NO4)和P2(SEQID NO5)通過PCR獲得包含由cat基因編碼的CmR標(biāo)記的DNA片段。引物P1在其5’端包含BglII識別位點，其對于進一步連接到雜合PL-tac啟動子是必需的，引物P2包含與位于xylE基因起始密碼子上游217bp的區(qū)域同源的36個核苷酸，其被導(dǎo)入到引物中用于進一步整合到細(xì)菌染色體中。
利用“TermoHybaid PCR Express”擴增儀實施PCR。反應(yīng)混合物(總體積-50μl)由含15mM MgCl2的5μl 10×PCR緩沖液(“Fermentas”，Lithuania)、200μM的每種dNTP、25pmol的每種所用引物和1U的Taq-聚合酶(“Fermentas”，Lithuania)組成。將大約5ng的質(zhì)粒DNA添加到反應(yīng)混合物中作為模板DNA用于PCR擴增。溫度曲線(temperature profile)如下在95℃初始DNA變性5min，接下來是95℃變性30sec、55℃退火30sec、72℃延伸30sec的25個循環(huán)；和在+72℃最終延伸7min。然后，通過瓊脂糖凝膠電泳純化擴增的DNA片段，用“GenElute Spin Columns”(“Sigma”，USA)提取，并用乙醇沉淀。
用BglII限制酶處理上述兩種DNA片段并連接。用引物P2(SEQ ID NO5)和P3(SEQ ID NO6)通過PCR擴增連接產(chǎn)物。引物P3在其5’端包含36個核苷酸，這36個核苷酸與被導(dǎo)入用于進一步整合到細(xì)菌染色體中的xylE基因的5’末端同源。
通過瓊脂糖凝膠電泳純化擴增的DNA片段，用“GenElute Spin Columns”(“Sigma”，USA)提取，并用乙醇沉淀。獲得的DNA片段用于電穿孔和Red-介導(dǎo)整合到大腸桿菌MG1655/pKD46的細(xì)菌染色體中。
將MG1655/pKD46細(xì)胞于30℃在添加了氨芐青霉素(100μg/ml)的液體LB-培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，然后用添加了氨芐青霉素(100μg/ml)和L-阿拉伯糖(10mM)(阿拉伯糖用于誘導(dǎo)Red系統(tǒng)的質(zhì)粒編碼基因)的SOB-培養(yǎng)基(酵母提取物，5g/l；NaCl，0.5g/l；胰蛋白胨，20g/l；KCl，2.5mM；MgCl2，10mM)1∶100稀釋，在30℃培養(yǎng)以使細(xì)菌培養(yǎng)物的光密度達到OD600＝0.4-0.7。來自10ml細(xì)菌培養(yǎng)物的培養(yǎng)細(xì)胞用以冰預(yù)冷的去離子水洗滌3次，然后懸浮在100μl水中。將溶解在去離子水中的10μl DNA片段(100ng)添加到細(xì)胞懸浮液中。依照廠商的說明，用“Bio-Rad”電穿孔儀(USA)(No.165-2098，2-89版本)進行電穿孔。將電擊過的(shocked)細(xì)胞添加到1-ml SOC培養(yǎng)基(Sambrook等，“Molecular Cloning A Laboratory Manual，Second Edition”，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989))，在37℃溫育2小時，然后將其涂布到含25μg/ml氯霉素的L-瓊脂上。用引物P4(SEQ ID NO7)和P5(SEQ ID NO8)通過PCR測試24小時內(nèi)生長的菌落的CmR標(biāo)記而非xylE基因的天然啟動子區(qū)的存在。為此目的，將新分離的菌落懸浮在20μl水中，然后將1μl獲得的懸浮液用于PCR。使用下述溫度曲線在95℃初始DNA變性10min；然后是95℃變性30sec、55℃退火30sec、72℃延伸1min的30個循環(huán)；在72℃最終延伸7min。所測試的少量CmR菌落包含所需的～2000bp DNA片段，這證實了CmR標(biāo)記DNA而不是xylE基因的192bp天然啟動子區(qū)的存在(參見圖1)。這些菌株中的一個通過在37℃培養(yǎng)來消除熱敏質(zhì)粒pKD46，并將所得菌株命名為大腸桿菌MG1655PL-tacxylE。
實施例2增加的xylE基因表達對具有破壞的PTS轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的大腸桿菌菌株生長的影響為了表明xylE基因表達增強對大腸桿菌菌株生長的影響，構(gòu)建了具有破壞的PTS轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的大腸桿菌菌株。
為實現(xiàn)該目的，用Datsenko K.A.和Wanner B.L.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97，6640-6645)描述的方法將攜帶卡那霉素抗性標(biāo)記(KmR)的DNA片段整合到大腸桿菌MG1655/pKD46的染色體中，代替ptsHI-crr操縱子，該方法也稱為“Red-介導(dǎo)的整合”和/或“Red-驅(qū)動的整合”，實施例1也描述了該方法。
已經(jīng)闡明了ptsHI-crr操縱子(GenBank登錄號NC_000913.2，gi49175990的序列中，對于ptsH、ptsI和crr基因分別為核苷酸編號2531786至2532043、2532088至2533815和2533856至2534365)。ptsHI-crr操縱子位于大腸桿菌K-12染色體上cysK和pdxK基因之間。
利用商業(yè)上可獲得的質(zhì)粒pUC4KAN(GenBank/EMBL登錄號X06404，“Fermentas”，Lithuania)作為模板，和引物P6(SEQ ID NO9)和P7(SEQ IDNO10)通過PCR獲得攜帶KmR基因的DNA片段。引物P6包含與ptsH基因5`末端同源的36個核苷酸，引物P7包含與crr基因3’-末端同源的36個核苷酸。將這些序列導(dǎo)入到引物P6和P7中，用于進一步整合到細(xì)菌染色體中。
如實施例1所述進行PCR。
然后，用瓊脂糖凝膠電泳濃縮擴增的DNA片段，通過以“GenElute SpinColumns”(“Sigma”，USA)離心從凝膠中提取，并用乙醇沉淀。所獲得的DNA片段如實施例1所述用于電穿孔和Red-介導(dǎo)整合到大腸桿菌MG1655/pKD46的細(xì)菌染色體中，只是在電穿孔后將細(xì)胞涂布到含50μg/ml卡那霉素的L-瓊脂上。
利用引物P8(SEQ ID NO11)和P9(SEQ ID NO12)通過PCR測試24小時內(nèi)生長的菌落的KmR標(biāo)記而非ptsHI-crr操縱子的存在。為此目的，將新分離的菌落懸浮在20μl水中，然后將1μl獲得的懸浮液用于PCR。PCR條件如實施例1所述。所測試的少量KmR菌落包含所需的～1300bp DNA片段，這證實了KmR基因而非ptsHI-crr操縱子的存在。所獲得的菌株中的一個通過在37℃培養(yǎng)而消除熱敏質(zhì)粒pKD46，并將所得菌株命名為大腸桿菌MG1655ΔptsHI-crr。
然后，將來自上述大腸桿菌MG1655PL-tacxylE的染色體的DNA片段通過P1轉(zhuǎn)導(dǎo)(Miller，J.H.(1972)Experiments in Molecular Genetics，Cold SpringHarbor Lab.Press，Plainview，NY)轉(zhuǎn)移到大腸桿菌MG1655ΔptsHI-crr，得到菌株MG1655ΔptsHI-crrPL-tacxylE。
檢測三個大腸桿菌菌株MG1655、MG1655ΔptsHI-crr和MG1655ΔptsHI-crrPL-tacxylE在含有葡萄糖(4％)作為碳源的基本Adams上生長的能力。如圖2所示，大腸桿菌MG1655ΔptsHI-crr不能在含葡萄糖的基本Adams培養(yǎng)基上良好地生長(μ～0.06)。增加xylE基因表達明顯增強了受體菌株在含葡萄糖的基本Adams培養(yǎng)基上的生長特性。
實施例3增加的xylE基因表達對蘇氨酸產(chǎn)生的影響為了測試在PL-tac啟動子控制下的xylE基因增強的表達對蘇氨酸生產(chǎn)的影響，將來自上述大腸桿菌MG1655PL-tacxylE的染色體的DNA片段通過P1轉(zhuǎn)導(dǎo)(Miller，J.H.(1972)Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring HarborLab.Press，Plainview，NY)轉(zhuǎn)移到產(chǎn)生蘇氨酸的大腸桿菌菌株VKPM B-3996。菌株VKPM B-3996于1987年4月7日以登錄號B-3996保藏在俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM)(俄羅斯，117545莫斯科，1stDorozhny proezd，1)。
將大腸桿菌菌株B-3996和B-3996PL-tacxylE都在37℃在L-瓊脂平板上培養(yǎng)18-24小時。為獲得種子培養(yǎng)物，在旋轉(zhuǎn)震蕩器(250rpm)上，在32℃將所述菌株在含2ml具有4％蔗糖的L-培養(yǎng)液(L-broth)的20×200mm試管中培養(yǎng)18小時。然后，用0.21ml(10％)種子材料接種發(fā)酵培養(yǎng)基。在20×200mm試管中，在2ml用于發(fā)酵的基本培養(yǎng)基中進行發(fā)酵。細(xì)胞在32℃250rpm振動生長48小時。
培養(yǎng)后，用以下流動相丁醇∶醋酸∶水＝4∶1∶1(v/v)通過紙層析測定培養(yǎng)基中積累的L-蘇氨酸的量。將茚三酮的丙酮溶液(2％)用作顯示試劑。切下含L-蘇氨酸的斑點，在CdCl2的0.5％水溶液中洗脫L-蘇氨酸，用分光光度法在540nm處評估L-蘇氨酸的量。結(jié)果顯示在表1中。由于導(dǎo)入PL-tacxylE，改進了蘇氨酸生產(chǎn)。
發(fā)酵培養(yǎng)基的成分(g/l)如下葡萄糖80.0(NH4)2SO422.0NaCl 0.8KH2PO42.0MgSO47H2O 0.8FeSO47H2O 0.02MnSO45H2O 0.02硫胺素鹽酸鹽(thiamine HCl)0.0002酵母提取物1.0CaCO330.0葡萄糖和硫酸鎂分別滅菌。CaCO3在180℃干熱滅菌2小時。pH調(diào)整到7.0。滅菌后將抗生素加到培養(yǎng)基中。
表1

實施例4增加的xylE基因表達對L-賴氨酸產(chǎn)生的影響大腸桿菌W3110染色體DNA的完整核苷酸序列是已知的(Science，277，1453-1474(1997))?；谒鶊髮?dǎo)的核苷酸序列合成引物，并用如下PCR方法擴增xylE基因。
通過常規(guī)方法(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch E. F.and Maniatis T.(1989)MolecularCloningA laboratory manual，2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.)制備染色體DNA。將引物10(SEQ ID NO13)設(shè)計為其中將EcoRI識別位點添加到登錄號AE000476的序列7479-7508的5’末端的序列，并將引物11(SEQ ID NO14)設(shè)計為與其中將SalI識別位點添加到登錄號AE000476的序列8963-8992的5’-末端的序列互補的序列。利用這些引物，如“PCR protocols.Current methods and applications”(White，B.A.，ed.，HumanaPress，Totowa，New Jersey，1993)中所述標(biāo)準(zhǔn)條件擴增xylE基因。
通過常規(guī)方法純化PCR產(chǎn)物。用限制酶SalI和EcoRI消化所述產(chǎn)物，并用連接試劑盒連接到已經(jīng)用相同限制酶處理過的載體pSTV29。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109的感受態(tài)細(xì)胞(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch E.F.and Maniatis T.(1989)Molecular CloningA laboratory manual，2nd ed.Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)，將細(xì)胞涂布在含10μg/ml IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷)、40μg/ml X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和50μg/ml氯霉素的L-平板(細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨(Bacto-trypton)10g/l、酵母提取物5g/l、NaCl5g/l、瓊脂15g/l，pH7.0)上，培養(yǎng)過夜。挑取并分離出現(xiàn)的白色菌落，如此獲得轉(zhuǎn)化體。通過堿提取法由所述轉(zhuǎn)化體制備質(zhì)粒，獲得質(zhì)粒pSTV29-xylE，其中xylE基因以正向連接到lac啟動子。
將大腸桿菌WC196用作屬于埃希氏菌屬的產(chǎn)生L-賴氨酸的菌株。
用質(zhì)粒pSTV29-xylE或載體pSTV29轉(zhuǎn)化WC196，獲得WC196/pSTV29-xylE和WC196/pSTV29。將這些菌株中的每個都在37℃在含50mg/l氯霉素的L-培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直到600nm處的最終OD達到約0.6。然后向培養(yǎng)物添加相同體積的40％甘油溶液，將所述混合物以合適的體積分裝，儲存在-80℃。以下將其稱為“甘油儲液(glycerol stock)”。
為了檢驗L-賴氨酸生產(chǎn)條件下增強木糖通透酶活性的影響，按照上述步驟用質(zhì)粒pSTV29-xylE和pCABD2轉(zhuǎn)化WC196。pCABD2為包含dapA基因、lysC基因、dapB基因、和ddh基因的質(zhì)粒，所述dapA基因編碼具有對L-賴氨酸反饋抑制脫敏的突變的二氫吡啶二羧酸合酶，lysC基因編碼具有對L-賴氨酸反饋抑制脫敏的突變的天冬氨酸激酶III，dapB基因編碼二氫吡啶二羧酸還原酶，ddh基因編碼二氨基庚二酸脫氫酶(美國專利6,040,160)。作為對照，將WC196用質(zhì)粒pSTV29和pCABD2轉(zhuǎn)化。獲得的每種轉(zhuǎn)化體都在37℃在含50mg/l氯霉素和20mg/l鏈霉素的L-培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直到600nm處的最終OD達到約0.6。然后向培養(yǎng)物添加相同體積的40％甘油溶液，將所述混合物以合適的體積分裝，并儲存在-80℃。
熔化WC196/pSTV29-xylE和WC196/pSTV29的甘油儲液，將每種100μl在含50mg/l氯霉素的L-平板上均勻地涂布，并在37℃培養(yǎng)24小時。此外，將WC196/(pCABD2，pSTV29-xylE)和WC196/(pCABD2，pSTV29)在含50mg/l氯霉素和20mg/l鏈霉素的L-平板上均勻地涂布，并在37℃培養(yǎng)24小時。在500ml-燒瓶中，將平板上約八分之一量的細(xì)胞接種到含所需藥物的20ml發(fā)酵培養(yǎng)基中。通過使用往復(fù)振蕩器以115rpm的振蕩速度在37℃培養(yǎng)16小時。培養(yǎng)后，用已知方法(Biotech-analyzer AS210，由Sakura Seiki Co.制造)測定培養(yǎng)基中L-賴氨酸和殘留葡萄糖的量。然后，對于每種菌株，計算L-賴氨酸相對于消耗的葡萄糖的得率。
發(fā)酵培養(yǎng)基的成分(g/l)如下葡萄糖40(NH4)2SO424K2HPO41.0MgSO4x7H2O1.0FeSO4x7H2O0.01MnSO4x5H2O0.01酵母提取物2.0用KOH將pH調(diào)到7.0，并將培養(yǎng)基在115℃高壓滅菌10min。葡萄糖和MgSO4x7H2O分別滅菌。添加30g/l的CaCO3，CaCO3已于180℃干熱滅菌2小時。
結(jié)果如表2所示。與其中木糖通透酶的表達量不增加的WC196/pSTV29相比，WC196/pSTV29-xylE積累更大量的L-賴氨酸。此外，在WC196/pCABD2中也觀測到增強木糖通透酶活性改進了L-賴氨酸的積累和得率，WC196/pCABD2生產(chǎn)更大量的L-賴氨酸。
表2


實施例5增加xylE基因表達對產(chǎn)生L-精氨酸的影響為了測試在PL-tac啟動子控制下的xylE基因增強的表達對產(chǎn)生精氨酸的影響，將來自上述大腸桿菌MG1655PL-tacxylE的染色體的DNA片段通過P1轉(zhuǎn)導(dǎo)(Miller，J.H.(1972)Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring HarborLab.Press，Plainview，NY)轉(zhuǎn)移到產(chǎn)生精氨酸的大腸桿菌菌株382。菌株382已于2000年4月10日以登錄號VKPM B-7926保藏在俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM)(俄羅斯，117545莫斯科，1stDorozhny proezd，1)。
將所得菌株382PL-tacxylE和親本菌株382分別在32℃在2ml LB營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)18小時，將0.3ml所得的培養(yǎng)物接種到20×200mm試管中的2ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在旋轉(zhuǎn)震蕩器上在32℃培養(yǎng)48小時。
培養(yǎng)后，用以下流動相丁醇∶醋酸∶水＝4∶1∶1(v/v)通過紙層析測定培養(yǎng)基中積累的L-精氨酸的量。將茚三酮的丙酮溶液(2％)用作顯示試劑。切下含L-精氨酸的斑點，在CdCl2的0.5％水溶液中洗脫L-精氨酸，在540nm用分光光度法評估L-精氨酸的量。
發(fā)酵培養(yǎng)基的成分(g/l)如下葡萄糖 48.0(NH4)2SO435.0KH2PO42.0MgSO4x7H2O1.0硫胺素鹽酸鹽0.0002酵母提取物 1.0L-異亮氨酸 0.1CaCO35.0葡萄糖和硫酸鎂分別滅菌。CaCO3于180℃干熱滅菌2小時。pH調(diào)到7.0。
10個獨立試驗的結(jié)果顯示于表3。由表3可以看到，與其中D-木糖通透酶的表達量不增加的菌株382相比，菌株382PL-tacxylE積累更大量的L-精氨酸。
表3

實施例6用產(chǎn)生L-組氨酸的細(xì)菌通過葡萄糖和木糖的混合物的發(fā)酵產(chǎn)生L-組氨酸產(chǎn)生L-組氨酸的大腸桿菌菌株80用于通過葡萄糖和木糖的混合物的發(fā)酵產(chǎn)生L-組氨酸。大腸桿菌菌株80(VKPM B-7270)詳細(xì)描述于俄羅斯專利RU2119536。菌株80于1999年10月15日以登錄號B-7270保藏在俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM；Dorozhny proezd.1，莫斯科117545，俄羅斯聯(lián)邦)。之后，依據(jù)布達佩斯條約的規(guī)定于2004年6月12日將其轉(zhuǎn)為國際保藏。
為了測試在PL-tac啟動子控制下的xylE基因表達的增強對產(chǎn)生組氨酸的影響，將來自上述大腸桿菌MG1655PL-tacxylE的染色體的DNA片段通過P1轉(zhuǎn)導(dǎo)(Miller，J.H.(1972)Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring HarborLab.Press，Plainview，NY)轉(zhuǎn)移到產(chǎn)生組氨酸的大腸桿菌菌株80。通過常規(guī)方法用pMW119mod-xylA-R質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株80和所得菌株80PL-tacxylE，產(chǎn)生菌株80/pMW119mod-xylA-R和80PL-tacxylE/pMW119mod-xylA-R。從大腸桿菌菌株MG1655的染色體克隆xylABFGHR基因座在俄羅斯專利申請RU2005106720中描述。
為獲得種子培養(yǎng)物，將菌株80/pMW119mod-xylA-R和80PL-tacxylE/pMW119mod-xylA-R均在40ml試管(18mm)中在27℃在旋轉(zhuǎn)震蕩器(250rpm)上培養(yǎng)6小時，所述試管中包含含有1g/l鏈霉素和100mg/l氨芐青霉素的2mlL-培養(yǎng)液。然后，將2ml(5％)的種子材料接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中。發(fā)酵在含有2ml發(fā)酵培養(yǎng)基的40ml試管中在27℃在旋轉(zhuǎn)震蕩器(250rpm)上進行50小時。
培養(yǎng)后，通過紙層析測定累積在培養(yǎng)基中的L-組氨酸的量。流動相的成分如下丁醇∶醋酸∶水＝4∶1∶1(v/v)。將茚三酮的丙酮溶液(0.5％)用作顯示試劑。結(jié)果顯示于表4中。
發(fā)酵培養(yǎng)基的成分(g/l)如下碳水化合物(合計) 100.0豆?jié)?Mameno)(大豆水解產(chǎn)物)0.2的總氮L-脯氨酸 0.8(NH4)2SO425.0K2HPO42.0MgSO4x7H2O 1.0FeSO4x7H2O 0.01MnSO4x5H2O 0.01硫胺素鹽酸鹽 0.001甜菜堿(Betaine) 2.0CaCO36.0鏈霉素1.0碳水化合物(葡萄糖，木糖)、L-脯氨酸、甜菜堿和硫酸鎂分別滅菌。CaCO3于110℃干熱滅菌30min。滅菌前用KOH將pH調(diào)到6.0。
表4

由表4可見，與其中D-木糖通透酶的表達不增加的菌株80/pMW119mod-xylA-R相比，在含有葡萄糖和木糖混合物的培養(yǎng)基中，菌株80PL-tacxylE/pMW119mod-xylA-R導(dǎo)致累積更大量的L-組氨酸。
雖然已經(jīng)參考本發(fā)明的優(yōu)選實施方案詳細(xì)描述了本發(fā)明，然而對于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來說顯而易見的是，能夠進行各種改變，和所使用的等同物，而不脫離本發(fā)明的范圍。
工業(yè)實用性本發(fā)明提供通過發(fā)酵生產(chǎn)非芳族或芳族L-氨基酸如L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸和L-谷氨酸的方法。根據(jù)本發(fā)明，可以增強腸桿菌科的產(chǎn)生L-氨基酸的細(xì)菌的生產(chǎn)力。
序列表<110>味之素株式會社(Ajinomoto Co.，Inc.)<120>使用腸桿菌科的細(xì)菌產(chǎn)生L-氨基酸的方法<130>C3490PC5252<150>RU2004130954<151>2004-10-22<150>US60/673807<151>2005-04-22<160>14<170>Patent In version 3.1<210>1<211>1476<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(1476)<400>1atg aat acc cag tat aat tcc agt tat ata ttt tcg att acc tta gtc 48Met Asn Thr Gln Tyr Asn Ser Ser Tyr Ile Phe Ser Ile Thr Leu Val1 5 10 15gct aca tta ggt ggt tta tta ttt ggc tac gac acc gcc gtt att tcc 96Ala Thr Leu Gly Gly Leu Leu Phe Gly Tyr Asp Thr Ala Val Ile Ser20 25 30ggt act gtt gag tca ctc aat acc gtc ttt gtt gct cca caa aac tta144Gly Thr Val Glu Ser Leu Asn Thr Val Phe Val Ala Pro Gln Asn Leu35 40 45agt gaa tcc get gcc aac tcc ctg tta ggg ttt tgc gtg gcc agc gct192Ser Glu Ser Ala Ala Asn Ser Leu Leu Gly Phe Cys Val Ala Ser Ala50 55 60ctg att ggt tgc atc atc ggc ggt gcc ctc ggt ggt tat tgc agt aac240Leu Ile Gly Cys Ile Ile Gly Gly Ala Leu Gly Gly Tyr Cys Ser Asn65 70 75 80cgc ttc ggt cgt cgt gat tca ctt aag att gct gct gtc ctg ttt ttt288Arg Phe Gly Arg Arg Asp Ser Leu Lys Ile Ala Ala Val Leu Phe Phe85 90 95att tct ggt gta ggt tct gcc tgg cca gaa ctt ggt ttt acc tct ata336Ile Ser Gly Val Gly Ser Ala Trp Pro Glu Leu Gly Phe Thr Ser Ile100 105 110aac ccg gac aac act gtg cct gtt tat ctg gca ggt tat gtc ccg gaa384
Asn Pro Asp Asn Thr Val Pro Val Tyr Leu Ala Gly Tyr Val Pro Glu115 120 125ttt gtt att tat cgc att att ggc ggt att ggc gtt ggt tta gcc tca 432Phe Val Ile Tyr Arg Ile Ile Gly Gly Ile Gly Val Gly Leu Ala Ser130 135 140atg ctc tcg cca atg tat att gcg gaa ctg gct cca gct cat att cgc 480Met Leu Ser Pro Met Tyr Ile Ala Glu Leu Ala Pro Ala His Ile Arg145 150 155 160ggg aaa ctg gtc tct ttt aac cag ttt gcg att att ttc ggg caa ctt 528Gly Lys Leu Val Ser Phe Asn Gln Phe Ala Ile Ile Phe Gly Gln Leu165 170 175tta gtt tac tgc gta aac tat ttt att gcc cgt tcc ggt gat gcc agc 576Leu Val Tyr Cys Val Asn Tyr Phe Ile Ala Arg Ser Gly Asp Ala Ser180 185 190tgg ctg aat act gac ggc tgg cgt tat atg ttt gcc tcg gaa tgt atc 624Trp Leu Asn Thr Asp Gly Trp Arg Tyr Met Phe Ala Ser Glu Cys Ile195 200 205cct gca ctg ctg ttc tta atg ctg ctg tat acc gtg cca gaa agt cct 672Pro Ala Leu Leu Phe Leu Met Leu Leu Tyr Thr Val Pro Glu Ser Pro210 215 220cgc tgg ctg atg tcg cgc ggc aag caa gaa cag gcg gaa ggt atc ctg 720Arg Trp Leu Met Ser Arg Gly Lys Gln Glu Gln Ala Glu Gly Ile Leu225 230 235 240cgc aaa att atg ggc aac acg ctt gca act cag gca gta cag gaa att 768Arg Lys Ile Met Gly Asn Thr Leu Ala Thr Gln Ala Val Gln Glu Ile245 250 255aaa cac tcc ctg gat cat ggc cgc aaa acc ggt ggt cgt ctg ctg atg 816Lys His Ser Leu Asp His Gly Arg Lys Thr Gly Gly Arg Leu Leu Met260 265 270ttt ggc gtg ggc gtg att gta atc ggc gta atg ctc tcc atc ttc cag 864Phe Gly Val Gly Val Ile Val Ile Gly Val Met Leu Ser Ile Phe Gln275 280 285caa ttt gtc ggc atc aat gtg gtg ctg tac tac gcg ccg gaa gtg ttc 912Gln Phe Val Gly Ile Asn Val Val Leu Tyr Tyr Ala Pro Glu Val Phe290 295 300aaa acg ctg ggg gcc agc acg gat atc gcg ctg ttg cag acc att att 960Lys Thr Leu Gly Ala Ser Thr Asp Ile Ala Leu Leu Gln Thr Ile Ile305 310 315 320gtc gga gtt atc aac ctc acc ttc acc gtt ctg gca att atg acg gtg1008Val Gly Val Ile Asn Leu Thr Phe Thr Val Leu Ala Ile Met Thr Val325 330 335gat aaa ttt ggt cgt aag cca ctg caa att atc ggc gca ctc gga atg1056Asp Lys Phe Gly Arg Lys Pro Leu Gln Ile Ile Gly Ala Leu Gly Met340 345 350
gca atc ggt atg ttt agc ctc ggt acc gcg ttt tac act cag gca ccg1104Ala Ile Gly Met Phe Ser Leu Gly Thr Ala Phe Tyr Thr Gln Ala Pro355 360 365ggt att gtg gcg cta ctg tcg atg ctg ttc tat gtt gcc gcc ttt gcc1152Gly Ile Val Ala Leu Leu Ser Met Leu Phe Tyr Val Ala Ala Phe Ala370 375 380atg tcc tgg ggt ccg gta tgc tgg gta ctg ctg tcg gaa atc ttc ccg1200Met Ser Trp Gly Pro Val Cys Trp Val Leu Leu Ser Glu Ile Phe Pro385 390 395 400aat gct att cgt ggt aaa gcg ctg gca atc gcg gtg gcg gcc cag tgg1248Asn Ala Ile Arg Gly Lys Ala Leu Ala Ile Ala Val Ala Ala Gln Trp405 410 415ctg gcg aac tac ttc gtc tcc tgg acc ttc ccg atg atg gac aaa aac1296Leu Ala Asn Tyr Phe Val Ser Trp Thr Phe Pro Met Met Asp Lys Asn420 425 430tcc tgg ctg gtg gcc cat ttc cac aac ggt ttc tcc tac tgg att tac1344Ser Trp Leu Val Ala His Phe His Asn Gly Phe Ser Tyr Trp Ile Tyr435 440 445ggt tgt atg ggc gtt ctg gca gca ctg ttt atg tgg aaa ttt gtc ccg1392Gly Cys Met Gly Val Leu Ala Ala Leu Phe Met Trp Lys Phe Val Pro450 455 460gaa acc aaa ggt aaa acc ctt gag gag ctg gaa gcg ctc tgg gaa ccg1440Glu Thr Lys Gly Lys Thr Leu Glu Glu Leu Glu Ala Leu Trp Glu Pro465 470 475 480gaa acg aag aaa aca caa caa act gct acg ctg taa1476Glu Thr Lys Lys Thr Gln Gln Thr Ala Thr Leu485 490<210>2<211>491<212>PRT<213>大腸桿菌<400>2Met Asn Thr Gln Tyr Asn Ser Ser Tyr Ile Phe Ser Ile Thr Leu Val1 5 10 15Ala Thr Leu Gly Gly Leu Leu Phe Gly Tyr Asp Thr Ala Val Ile Ser20 25 30Gly Thr Val Glu Ser Leu Asn Thr Val Phe Val Ala Pro Gln Asn Leu35 40 45Ser Glu Ser Ala Ala Asn Ser Leu Leu Gly Phe Cys Val Ala Ser Ala50 55 60Leu Ile Gly Cys Ile Ile Gly Gly Ala Leu Gly Gly Tyr Cys Ser Asn65 70 75 80
Arg Phe Gly Arg Arg Asp Ser Leu Lys Ile Ala Ala Val Leu Phe Phe85 90 95Ile Ser Gly Val Gly Ser Ala Trp Pro Glu Leu Gly Phe Thr Ser Ile100 105 110Asn Pro Asp Asn Thr Val Pro Val Tyr Leu Ala Gly Tyr Val Pro Glu115 120 125Phe Val Ile Tyr Arg Ile Ile Gly Gly Ile Gly Val Gly Leu Ala Ser130 135 140Met Leu Ser Pro Met Tyr Ile Ala Glu Leu Ala Pro Ala His Ile Arg145 150 155 160Gly Lys Leu Val Ser Phe Asn Gln Phe Ala Ile Ile Phe Gly Gln Leu165 170 175Leu Val Tyr Cys Val Asn Tyr Phe Ile Ala Arg Ser Gly Asp Ala Ser180 185 190Trp Leu Asn Thr Asp Gly Trp Arg Tyr Met Phe Ala Ser Glu Cys Ile195 200 205Pro Ala Leu Leu Phe Leu Met Leu Leu Tyr Thr Val Pro Glu Ser Pro210 215 220Arg Trp Leu Met Ser Arg Gly Lys Gln Glu Gln Ala Glu Gly Ile Leu225 230 235 240Arg Lys Ile Met Gly Asn Thr Leu Ala Thr Gln Ala Val Gln Glu Ile245 250 255Lys His Ser Leu Asp His Gly Arg Lys Thr Gly Gly Arg Leu Leu Met260 265 270Phe Gly Val Gly Val Ile Val Ile Gly Val Met Leu Ser Ile Phe Gln275 280 285Gln Phe Val Gly Ile Asn Val Val Leu Tyr Tyr Ala Pro Glu Val Phe290 295 300Lys Thr Leu Gly Ala Ser Thr Asp Ile Ala Leu Leu Gln Thr Ile Ile305 310 315 320Val Gly Val Ile Asn Leu Thr Phe Thr Val Leu Ala Ile Met Thr Val325 330 335Asp Lys Phe Gly Arg Lys Pro Leu Gln Ile Ile Gly Ala Leu Gly Met340 345 350Ala Ile Gly Met Phe Ser Leu Gly Thr Ala Phe Tyr Thr Gln Ala Pro355 360 365Gly Ile Val Ala Leu Leu Ser Met Leu Phe Tyr Val Ala Ala Phe Ala370 375 380
Met Ser Trp Gly Pro Val Cys Trp Val Leu Leu Ser Glu Ile Phe Pro385 390 395 400Asn Ala Ile Arg Gly Lys Ala Leu Ala Ile Ala Val Ala Ala Gln Trp405 410 415Leu Ala Asn Tyr Phe Val Ser Trp Thr Phe Pro Met Met Asp Lys Asn420 425 430Ser Trp Leu Val Ala His Phe His Asn Gly Phe Ser Tyr Trp Ile Tyr435 440 445Gly Cys Met Gly Val Leu Ala Ala Leu Phe Met Trp Lys Phe Val Pro450 455 460Glu Thr Lys Gly Lys Thr Leu Glu Glu Leu Glu Ala Leu Trp Glu Pro465 470 475 480Glu Thr Lys Lys Thr Gln Gln Thr Ala Thr Leu485 490<210>3<211>180<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>雜合啟動子<400>3ctagatctct cacctaccaa acaatgcccc cctgcaaaaa ataaattcat aaaaaacata 60cagataacca tctgcggtga taaattatct ctggcggtgt tgacaattaa tcatcggctc120gtataatgtg tggaattgtg agcgtcagaa tggtctaagg caggtctgaa tgaataccca180<210>4<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4gtaagatctc tcatgtttga cagcttatca tc 32<210>5<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5
ggcgctccac ggagcgcctt tttttctttc gtctgcctaa gctttctaga cg 52<210>6<211>55<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6tgggtattca ttcagacctg ccttagacca ttctgacgct cacaattcca cacat 55<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>7gatcaccatc gtcttcttg 19<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>8gtagcgacta aggtaatcg 19<210>9<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>9cacaacacta aacctataag ttggggaaat acaatgtgaa gcctgctttt ttatactaag 60<210>10<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>10gccgatgggc gccatttttc actgcggcaa gaattacgct caagttagta taaaaaagct 60<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>11tcctggcatt gattcagcct gt 22<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>12ccagcagcat gagagcgatg a21<210>13<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>13cccgaattcg gacaggaaga ttacagcgta gcagtttgt 39<210>14<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>14cccgtcgacg atcagaatgg tctaaggcag gtctgaatg 39
權(quán)利要求
1.腸桿菌科的產(chǎn)生L-氨基酸的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌已經(jīng)過修飾增強了D-木糖通透酶的活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中所述D-木糖通透酶的活性通過增加編碼D-木糖通透酶的基因的表達而增強。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中通過修飾編碼D-木糖通透酶的基因的表達控制序列，或者通過增加編碼D-木糖通透酶基因的拷貝數(shù)而增強所述D-木糖通透酶的活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌還經(jīng)額外修飾而增強了葡糖激酶的活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌還經(jīng)額外修飾而增強了木糖異構(gòu)酶的活性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌還經(jīng)額外修飾而增加了xylABFGHR位點的表達。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌選自下組菌屬埃希氏菌屬、腸桿菌屬、歐文氏菌屬、克雷伯氏菌屬、泛菌屬、普羅威登斯菌屬、沙門氏菌屬、沙雷氏菌屬、志賀氏菌屬、和摩根氏菌屬。
8.根據(jù)權(quán)利要求2的細(xì)菌，其中所述基因編碼選自下組的D-木糖通透酶(A)包含氨基酸序列SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)；和(B)SEQ ID NO2所示氨基酸序列的變體蛋白質(zhì)，其具有D-木糖通透酶活性。
9.根據(jù)權(quán)利要求2的細(xì)菌，其中所述編碼D-木糖通透酶的基因包含選自下組的DNA(a)包含SEQ ID NO1中核苷酸1至1476的核苷酸序列的DNA；和(b)在嚴(yán)緊條件下可與SEQ ID NO1中核苷酸1-1476的核苷酸序列或者由所述核苷酸序列制備的探針雜交，并且編碼具有D-木糖通透酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的細(xì)菌，其中所述嚴(yán)緊條件包括其中在60℃在1xSSC和0.1％SDS的鹽濃度下洗滌15分鐘的條件。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是產(chǎn)生L-蘇氨酸的細(xì)菌。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌還經(jīng)額外修飾而增強了選自下組的基因的表達-編碼天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I并對蘇氨酸的反饋抑制有抗性的突變thrA基因，-編碼高絲氨酸激酶的thrB基因，-編碼蘇氨酸合酶的thrC基因，-編碼推定的跨膜蛋白的rhtA基因，和-其任意組合。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌經(jīng)修飾增強了所述突變的thrA基因、所述thrB基因、所述thrC基因、和所述rhtA基因的表達。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是產(chǎn)生L-賴氨酸的細(xì)菌。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是產(chǎn)生L-組氨酸的細(xì)菌。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是產(chǎn)生L-苯丙氨酸的細(xì)菌。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是產(chǎn)生L-精氨酸的細(xì)菌。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是產(chǎn)生L-谷氨酸的細(xì)菌。
19.生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)菌，使所述L-氨基酸在培養(yǎng)基中積累，并從培養(yǎng)基分離L-氨基酸。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述培養(yǎng)基含有木糖。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述L-氨基酸是L-蘇氨酸。
22.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述L-氨基酸是L-賴氨酸。
23.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述L-氨基酸是L-組氨酸。
24.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述L-氨基酸是L-苯丙氨酸。
25.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述L-氨基酸是L-精氨酸。
26.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述L-氨基酸是L-谷氨酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了利用腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)生L－氨基酸，例如L－蘇氨酸、L－賴氨酸、L－組氨酸、L－苯丙氨酸、L－精氨酸或L－谷氨酸的方法，其中所述細(xì)菌經(jīng)修飾增強了D－木糖通透酶的活性。
文檔編號C12P13/04GK101044159SQ20058003622
公開日2007年9月26日 申請日期2005年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月22日
發(fā)明者康斯坦丁·V·賴貝克, ?？ㄌ乩锬恰·斯利文斯卡亞, ?？ㄌ乩锬恰·賽維拉索瓦, 瓦萊里·Z·阿克維迪安, 埃琳娜·V·克里亞奇科, 瑟奇·V·馬什科, 薇拉·G·多羅申科, 拉里薩·G·埃里克, 塔特亞娜·V·里奧諾娃, 米克海爾·M·古斯亞蒂納, 埃爾韋拉·B·沃羅什洛娃, 尤里·I·科茲洛夫, 原吉彥, 植田拓嗣 申請人:味之素株式會社