專利名稱：用含3－氨基苯酚硼酸的紙片檢測細菌AmpC酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物細菌的檢測技術(shù)范圍，特別涉及一種用含3-氨基苯酚硼酸(APB)的紙片檢測細菌AmpC酶的方法。
背景技術(shù)：
AmpCβ內(nèi)酰胺酶，屬于Ambler分類的C類酶(以下簡稱AmpC酶)是部分細菌如肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌等在生長過程中產(chǎn)生的一種能水解三代頭孢類抗生素(如頭孢他啶CAZ、頭孢噻肟CTX、頭孢曲松CRO)、頭霉素(如頭孢西丁FOX)、單胺類抗生素(如氨曲南AZT)的酶。產(chǎn)生AmpC酶的細菌對以上抗生素表現(xiàn)耐藥性，當這些細菌引起感染(如敗血癥、肺炎、腎盂腎炎或傷口感染)時，采用以上抗生素將會使治療失敗。因此，正確檢測產(chǎn)生AmpC酶的細菌，對于了解細菌耐藥機制、指導(dǎo)臨床合理選用抗生素具有重要意義。但目前為止，尚缺乏簡單、有效的方法供臨床實驗室用于對產(chǎn)生AmpC酶的細菌進行常規(guī)檢測。三維試驗檢測AmpC酶(Coudron PE，Moland ES，Thomson KS.Occurrence and detectionof AmpC beta-lactamases among Escherichia coli，Klebsiella pneumoniae，and proteus mirabilis isolates at a veterans medical center.J ClinMicrobiol，2000，381791-1796)，需要制備酶的粗提物，并在瓊脂平板上挖槽，操作煩瑣，費時，且需要特殊設(shè)備如超聲破碎儀或反復(fù)凍融條件。最新國外介紹的Tris-EDTA檢測AmpC酶的方法(Black JA，Moland ES，and Thomson KS.AmpCdisk test for detection of plasmid-mediated AmpC β-lactamases inEnterobacteriaceae lacking chromosomal AmpC β-lactamases.J ClinMicrobiol，2005，433110-3113)雖然具有操作簡單，成本低廉的特點，但需要制備含有Tris-EDTA及待檢菌的紙片，增加操作步驟，且部分細菌的結(jié)果判讀需要一定的經(jīng)驗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用含3-氨基苯酚硼酸的紙片檢測細菌AmpC酶的方法，其特征在于，該方法的具體檢測步驟如下1)先配制APB溶液用二甲基亞砜作為溶劑，配成濃度為40mg/ml的溶液；所述APB分子式為C6H8BNO2.H2O，分子量為15496；2)取10μl上述APB溶液分別加入英國OXOID公司生產(chǎn)的每片含30μg CAZ、30μg CTX和30μg FOX的紙片上，使每片測試紙片上含APB 400μg，以制成CAZ/APB、CTX/APB和FOX/APB紙片；待紙片干后，置于2-8℃的溫度下保存?zhèn)溆谩?br> 3)具體實驗操作(1)將新鮮培養(yǎng)的待檢菌制成0.5麥氏單位菌懸液并均勻涂抹至M-H平板；(2)將不含有APB的CAZ、CTX和FOX紙片及含有APB的CAZ/APB，CTX/APB和FOX/APB紙片分別貼于涂布有待檢菌的M-H平板表面，35℃培養(yǎng)過夜，觀察并分別記錄含有APB的CAZ/APB，CTX/APB和FOX/APB紙片與不含APB的CAZ、CTX和FOX紙片抑菌環(huán)直徑；(3)結(jié)果判讀含有APB比不含APB的CAZ或/和CTX或/和FOX紙片抑菌環(huán)直徑增加5mm或以上者判為AmpC酶陽性。
本發(fā)明的有益效果是該項檢測是利用紙片擴散法藥敏實驗的特點，將AmpC酶抑制劑APB加至含有三種AmpC酶底物(CAZ，CTX，F(xiàn)OX)的藥敏紙片上，通過測定加APB與不加APB的藥敏紙片抑菌環(huán)直徑改變來判斷AmpC酶的存在，避免了使用單一底物可能帶來的漏檢，提高檢測的陽性率。該實驗還具有操作簡單，成本低廉，結(jié)果判讀清晰，重復(fù)性好，不需要特殊實驗條件的優(yōu)點，易于在臨床實驗室推廣應(yīng)用。
具體實施例方式
本發(fā)明提供一種用含3-氨基苯酚硼酸的紙片檢測細菌AmpC酶的方法。該方法的檢測原理是由于硼酸是AmpC酶的抑制劑，本項發(fā)明在不加3-氨基苯酚硼酸APB的CAZ，CTX和FOX紙片基礎(chǔ)上，添加APB至CAZ，CTX和FOX紙片，進行紙片法藥敏實驗，即APB紙片增強法，檢測細菌產(chǎn)生的AmpC酶。APB可使CAZ或/和CTX或/和FOX紙片對產(chǎn)生AmpC酶細菌的抑菌環(huán)擴大，當含有APB的CAZ或/和CTX或/和FOX紙片比不含APB的CAZ或/和CTX或/和FOX紙片抑菌環(huán)直徑增加5mm或以上時，判為AmpC酶檢測陽性。
該方法的具體檢測步驟如下1)先配制APB溶液用二甲基亞砜作為溶劑，配成濃度為40mg/ml的溶液；所述APB分子式為C6H8BNO2.H2O，分子量為15496；2)取10μl上述APB溶液分別加入英國OXOID公司生產(chǎn)的每片含30μg CAZ、30μg CTX和30μg FOX的紙片上，使每片測試紙片上含APB 400μg，以制成CAZ/APB、CTX/APB和FOX/APB紙片；待紙片干后，置于2-8℃的溫度下保存?zhèn)溆谩?br> 3)具體實驗操作(1)將新鮮培養(yǎng)的待檢菌制成0.5麥氏單位菌懸液并均勻涂抹至M-H平板；(2)將不含有APB的CAZ、CTX和FOX紙片及含有APB的CAZ/APB，CTX/APB和FOX/APB紙片分別貼于涂布有待檢菌的M-H平板表面，35℃培養(yǎng)過夜，觀察并分別記錄含有APB的CAZ/APB，CTX/APB和FOX/APB紙片與不含APB的CAZ、CTX和FOX紙片抑菌環(huán)直徑；(3)結(jié)果判讀含有APB比不含APB的CAZ或/和CTX或/和FOX紙片抑菌環(huán)直徑增加5mm或以上者判為AmpC酶陽性。
舉例說明例1，男性，51歲，臨床診斷為呼吸道感染，從其送檢痰液標本中分離到肺炎克雷伯菌，用不含有APB的CAZ、CTX和FOX紙片及含有本發(fā)明制備的APB的CAZ/APB，CTX/APB和FOX/APB紙片分別貼于涂布有分離到肺炎克雷伯菌的M-H平板表面，35℃培養(yǎng)過夜，即采用紙片增強法檢測結(jié)果如下含有APB的CAZ/APB，CTX/APB和FOX/APB紙片的抑菌環(huán)直徑分別是22mm，25mm和13mm；不含APB的CAZ、CTX和FOX紙片抑菌環(huán)直徑分別是15mm，20mm和6mm。從而計算出含有APB比不含APB的CAZ，CTX和FOX紙片抑菌環(huán)直徑分別增加了7mm，5mm和7mm，均在5mm以上。判定為A.mpC酶陽性。故該病人是由產(chǎn)AmpC酶的肺炎克雷伯菌引起的呼吸道感染。
例2，女性，50歲，臨床診斷為泌尿道感染，從其送檢尿液標本中分離到大腸艾希菌，用與例1相同的兩種紙片分別貼于涂布有分離到大腸艾希菌的M-H平板表面，35℃培養(yǎng)過夜，增強法檢測，其結(jié)果如下含有APB的CAZ/APB，CTX/APB和FOX/APB紙片的抑菌環(huán)直徑分別是21mm，24mm和12mm；不含APB的CAZ、CTX和FOX紙片抑菌環(huán)直徑分別是16mm，20mm和10mm。從而計算出含有APB比不含APB的CAZ，CTX和FOX紙片抑菌環(huán)直徑分別增加了5mm，4mm和2mm，雖然僅CAZ/APB紙片比CAZ紙片抑菌環(huán)直徑增加了5mm，仍然判定為AmpC酶陽性。故該病人是由產(chǎn)AmpC酶的大腸艾希菌引起的泌尿道感染。
權(quán)利要求
1.一種用含3-氨基苯酚硼酸的紙片檢測細菌AmpC酶的方法，其特征在于，該方法的具體檢測步驟如下1)先配制APB溶液用二甲基亞砜作為溶劑，配成濃度為40mg/ml的溶液；所述APB分子式為C6H8BNO2.H2O，分子量為15496；2)取10μl上述APB溶液分別加入英國OXOID公司生產(chǎn)的每片含30μg CAZ、30μg CTX和30μg FOX的紙片上，使每片測試紙片上含APB 400μg，以制成CAZ/APB、CTX/APB和FOX/APB紙片；待紙片干后，置于2-8℃的溫度下保存?zhèn)溆谩?)具體實驗操作(1)將新鮮培養(yǎng)的待檢菌制成0.5麥氏單位菌懸液并均勻涂抹至M-H平板；(2)將不含有APB的CAZ、CTX和FOX紙片及含有APB的CAZ/APB，CTX/APB和FOX/APB紙片分別貼于涂布有待檢菌的M-H平板表面，在35℃下培養(yǎng)過夜，觀察并分別記錄含有APB的CAZ/APB，CTX/APB和FOX/APB紙片與不含APB的CAZ、CTX和FOX紙片抑菌環(huán)直徑；(3)結(jié)果判讀含有APB比不含APB的CAZ或/和CTX或/和FOX紙片抑菌環(huán)直徑增加5mm或以上者判為AmpC酶陽性。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于生物細菌的檢測技術(shù)范圍的一種用含3－氨基苯酚硼酸的紙片檢測細菌AmpC酶的方法。主要是利用硼酸能抑制AmpC酶的原理，先配制APB溶液，并在不加3－氨基苯酚硼酸(APB)的CAZ，CTX和FOX紙片上添加APB，采用APB紙片增強法進行紙片法藥敏實驗，檢測細菌產(chǎn)生的AmpC酶。APB可使CAZ或/和CTX或/和FOX紙片對產(chǎn)生AmpC酶細菌的抑菌環(huán)擴大，因此通過測定對產(chǎn)生AmpC酶細菌抑菌環(huán)直徑改變來判斷AmpC酶的存在，避免使用單一底物可能帶來的漏檢，提高檢測的陽性率。該方法具有操作簡單，成本低廉，結(jié)果判讀清晰，重復(fù)性好，不需要特殊實驗條件的優(yōu)點，易于在臨床實驗室推廣應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/04GK1743458SQ20051011256
公開日2006年3月8日 申請日期2005年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月11日
發(fā)明者沈定霞, 羅燕萍, 張有江, 徐雅萍, 周光 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院