專利名稱：工程化組織的示蹤方法及工程化組織的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及工程化組織技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前臨床治療組織器官嚴(yán)重的缺損或功能障礙的有效措施是組織器官移植，但是這種治療方法具有諸多缺陷，如供體組織器官來源有限、對移植組織器官產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)和增加病毒感染幾率等。
20世紀(jì)80年代隨著細(xì)胞生物學(xué)與工程材料學(xué)等基礎(chǔ)學(xué)科的深入發(fā)展，科學(xué)家開始大膽探索合理解決這一世界醫(yī)學(xué)難題的新方法?！敖M織工程”的概念由此產(chǎn)生，它是應(yīng)用工程學(xué)與生命科學(xué)的原理和方法，制備具有生物活性的替代物，以恢復(fù)、維持或提高受損組織的功能。采用組織工程學(xué)技術(shù)修復(fù)缺損的組織器官，具有移植材料來源廣泛、移植物可以在體外成形、避免或降低了免疫排斥反應(yīng)和感染性疾病的播散等優(yōu)點(diǎn)。
目前采用組織工程技術(shù)已成功構(gòu)建皮膚、骨、軟骨、肌腱、肝、心肌、膀胱等多種工程化組織。組織工程的基本原理和方法是將體外培養(yǎng)擴(kuò)增的正常組織細(xì)胞作為種子細(xì)胞，吸附于一種生物相容性良好并可被機(jī)體吸收的生物支架材料上形成復(fù)合物，將細(xì)胞-支架材料復(fù)合物植入機(jī)體組織、器官的病損部位，種子細(xì)胞在生物材料逐漸被機(jī)體降解吸收的過程中形成新的在形態(tài)和功能方面與相應(yīng)器官、組織相一致的組織，而達(dá)到修復(fù)創(chuàng)傷和重建功能的目的。
在工程化組織構(gòu)建以及植入后，需要觀測細(xì)胞在支架上生長、融合情況以及在體內(nèi)的生長、融合情況。目前，在這些組織進(jìn)行體外構(gòu)建和植入分析時(shí)，目前常用的觀測技術(shù)均存在一定的局限性，如體外構(gòu)建觀察細(xì)胞在支架材料內(nèi)的黏附生長時(shí)，往往使用倒置相差顯微鏡直接觀察，但由于支架材料有一定的厚度，細(xì)胞與材料反差不大，因此難于清楚的觀察細(xì)胞在材料內(nèi)的情況；掃描電鏡觀察是另一種常用的方法，但是不能實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞觀察，且樣本處理費(fèi)時(shí)。在細(xì)胞植入體內(nèi)的研究中，目前常用的細(xì)胞同位素標(biāo)記、熒光染料標(biāo)記和遺傳物質(zhì)標(biāo)記等也存在明顯缺陷，如細(xì)胞同位素標(biāo)記時(shí)存在放射性輻射、熒光染料標(biāo)記存在標(biāo)記時(shí)間短于2周、而遺傳物質(zhì)標(biāo)記往往存在檢測繁瑣等。
另外，在工程化組織構(gòu)建時(shí)，根據(jù)構(gòu)建的組織需要，有時(shí)在同一個(gè)組織中要接種不同的細(xì)胞或細(xì)胞要分次接種，例如復(fù)雜工程化組織中要用能夠生產(chǎn)不同組織的細(xì)胞，而在構(gòu)建較大的組織時(shí)，需要反復(fù)接種。如何區(qū)分不同的細(xì)胞或分次接種的細(xì)胞以便了解其生長及融合情況，是更加棘手的一個(gè)問題，目前的觀察手段還不易做到。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)在工程化組織構(gòu)建及植入后觀測方法存在的上述缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種工程化組織的示蹤方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的還在于提供工程化組織的體外構(gòu)建方法。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第一個(gè)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案利用基因載體將熒光蛋白基因?qū)塍w外工程化組織構(gòu)建所需的種子細(xì)胞中，獲得表達(dá)熒光蛋白的種子細(xì)胞，將該種子細(xì)胞接種于工程化組織支架上，并利用熒光顯微鏡對細(xì)胞進(jìn)行觀察。
為解決接種不同種類的細(xì)胞和對不同批次接種的細(xì)胞的識別問題，作為本發(fā)明進(jìn)一步的改進(jìn)，對于體外工程化組織構(gòu)建中不同種類和批次的細(xì)胞，分別導(dǎo)入不同顏色的熒光蛋白基因進(jìn)行示蹤。
所述的基因載體可以采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或普通真核表達(dá)載體。
所述的熒光蛋白可以為綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、藍(lán)色熒光蛋白和黃色熒光蛋白。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的第二個(gè)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種工程化組織的體外構(gòu)建方法，該方法包括如下過程(1)將待接種的種子細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)；(2)根據(jù)細(xì)胞種類和接種批次，準(zhǔn)備相應(yīng)的熒光蛋白和基因載體；(3)對基因載體進(jìn)行擴(kuò)增；(4)利用基因載體將熒光蛋白介導(dǎo)入擴(kuò)增后的種子細(xì)胞中；(5)將標(biāo)記有熒光蛋白的種子細(xì)胞接種到工程化組織骨架上，形成細(xì)胞-材料工程化組織復(fù)合體組織；(6)將工程化組織復(fù)合體組織在體外連續(xù)培養(yǎng)，在倒置熒光顯微鏡下直接觀察不同區(qū)域的種子細(xì)胞形態(tài)與數(shù)量變化，以及不同區(qū)域的細(xì)胞遷移或脫落等情況。
本發(fā)明將分子生物學(xué)研究中的熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于工程化組織構(gòu)建中，通過利用熒光蛋白對工程化組織中的種子細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記和示蹤，相對于現(xiàn)有的觀察方法來說，具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)利用基因表達(dá)載體，對細(xì)胞標(biāo)記熒光蛋白，利用倒置熒光顯微鏡，可以實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞觀察；(2)利用倒置熒光顯微鏡直接觀察，不需要添加反應(yīng)底物和其他材料等，具有實(shí)時(shí)觀察的特點(diǎn)；(3)利用不同顏色的熒光蛋白對不同種類和/或批次細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，可以區(qū)分不同處理措施后，能夠清楚地觀察到不同表型細(xì)胞在組織中的分布等；(4)在利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞在體外表達(dá)熒光蛋白可以超過6月，具有長期表達(dá)的特點(diǎn)；(5)細(xì)胞在經(jīng)不同熒光蛋白標(biāo)記后，仍然具有較好的增殖與功能作用。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的工程化組織的示蹤方法及工程化組織的構(gòu)建方法作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1體外構(gòu)建組織工程軟骨，需要在支架材料內(nèi)有較大的軟骨細(xì)胞或干細(xì)胞濃度[(1～5)×107/ml]，才能產(chǎn)生接近正常的軟骨基質(zhì)。目前在體外構(gòu)建組織工程軟骨時(shí)，接種到支架材料內(nèi)的細(xì)胞往往很容易脫落，使得種子細(xì)胞在局部濃度并不高，因此，有時(shí)出現(xiàn)了在一個(gè)支架材料內(nèi)反復(fù)進(jìn)行多次的細(xì)胞接種，試圖較大幅度的增加種子細(xì)胞濃度。應(yīng)用本技術(shù)即可對不同種植批次的種子細(xì)胞標(biāo)記不同的熒光蛋白，從而顯示在同一個(gè)支架材料內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量與分布變化等。步驟
1.根據(jù)待構(gòu)建的工程化組織軟骨的需要，準(zhǔn)備所需的種子細(xì)胞，用軟骨細(xì)胞或干細(xì)胞，并大量擴(kuò)增。
2.自己構(gòu)建或從生物公司購買所需要的逆轉(zhuǎn)錄病毒作為基因載體，然后進(jìn)行大量擴(kuò)增。
3.細(xì)胞的熒光蛋白標(biāo)記處理(1)對準(zhǔn)備第1次接種的種子細(xì)胞采用基因轉(zhuǎn)染方式，標(biāo)記增強(qiáng)型綠色熒光蛋白，其過程為①pLEGFP-N1質(zhì)粒DNA經(jīng)酚-氯仿抽提、乙醇沉淀。培養(yǎng)PT67包裝細(xì)胞至75％融合面積，配制A液(基因DNA2μg+HEPES緩沖液25μl)、B液(DOTAP20μl+HEPES緩沖液30μl)混合后室溫下靜置15min，加入925μl不含血清DMEM培養(yǎng)液靜置30min。PT67細(xì)胞用無血清培養(yǎng)液漂洗后，加入轉(zhuǎn)染混合液，置孵箱內(nèi)培養(yǎng)10h，然后換完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，再換含G418(800μg/ml)培養(yǎng)液，4d后維持G418(400μg/ml)，待抗性克隆形成后傳代培養(yǎng)。細(xì)胞長滿瓶底后，收集24h培養(yǎng)液，孔徑0.45μm濾膜過濾，2周內(nèi)使用該病毒液時(shí)可置于4℃冰箱，否則應(yīng)濃縮后加入10％甘油于-70℃保存。
②感染逆轉(zhuǎn)錄病毒待干細(xì)胞長至35cm2培養(yǎng)瓶瓶底50％面積時(shí)，換感染液6ml(含pLEGFP-N1病毒液2ml、polybrene終濃度8μg/ml)，37℃培養(yǎng)48h。
③篩選標(biāo)記細(xì)胞采用G418遞減方法篩選3周。首先消化待篩選細(xì)胞，調(diào)整接種密度為3×104/cm2，24h后換含G418(800μg/ml)培養(yǎng)液培養(yǎng)4d，然后G418(500μg/ml)培養(yǎng)4d，最后以G418(300μg/ml)維持形成抗性克隆及常規(guī)方法傳代。
(2)對準(zhǔn)備第2次接種的種子細(xì)胞采用基因轉(zhuǎn)染方式，標(biāo)記紅色熒光蛋白，其過程為pDsRed2-C1質(zhì)粒DNA經(jīng)酚-氯仿抽提、乙醇沉淀。培養(yǎng)干細(xì)胞至50％融合面積，配制A液(基因DNA2μg+HEPES緩沖液25μl)、B液(DOTAP20μl+HEPES緩沖液30μl)混合后室溫下靜置15min，加入925μl不含血清DMEM培養(yǎng)液靜置30min。細(xì)胞用無血清培養(yǎng)液漂洗后，加入轉(zhuǎn)染混合液，置孵箱內(nèi)培養(yǎng)10h，然后換完全培養(yǎng)液培養(yǎng)48h，再換含G418(800μg/ml)培養(yǎng)液，4d后維持G418(300μg/ml)，待抗性克隆形成后傳代培養(yǎng)。
4.按工程化組織的構(gòu)建技術(shù)，將標(biāo)記增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的種子細(xì)胞以2×107個(gè)/ml濃度接種到支架材料內(nèi)，形成細(xì)胞-材料復(fù)合體，經(jīng)過4～48小時(shí)的培育后，再進(jìn)行相應(yīng)濃度的第2次接種。第2次接種使用的是標(biāo)記了紅色熒光蛋白的種子細(xì)胞。
5.體外分析反復(fù)接種后形成的細(xì)胞-材料復(fù)合體，可以在倒置熒光顯微鏡下直接觀察第2次接種細(xì)胞在支架材料內(nèi)的分布，進(jìn)而可以通過酶消化法將全部細(xì)胞消化后進(jìn)行計(jì)數(shù)，從而得出第2次接種細(xì)胞的實(shí)際粘附數(shù)量。
實(shí)施例2 對工程化骨與軟骨復(fù)合組織的構(gòu)建與再生進(jìn)行示蹤工程化骨與軟骨復(fù)合組織是采用工程化組織學(xué)技術(shù)在體外構(gòu)建工程化軟骨組織與工程化骨組織的復(fù)合組織，用于修復(fù)關(guān)節(jié)端的骨與軟骨復(fù)合組織缺損。應(yīng)用本技術(shù)可對不同區(qū)域的種子細(xì)胞標(biāo)記不同的熒光蛋白，從而研究不同細(xì)胞的遷移行為和復(fù)合組織在體內(nèi)的功能作用等特性。
步驟1.根據(jù)待構(gòu)建的工程化組織的需要，準(zhǔn)備所需的種子細(xì)胞，用軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞或干細(xì)胞，并大量擴(kuò)增。
2.自己構(gòu)建或從生物公司購買所需要的逆轉(zhuǎn)錄病毒作為基因載體，然后進(jìn)行大量擴(kuò)增。
3.細(xì)胞的熒光蛋白標(biāo)記處理(1)對準(zhǔn)備接種到軟骨區(qū)域的種子細(xì)胞采用基因轉(zhuǎn)染方式，標(biāo)記增強(qiáng)型綠色熒光蛋白。其過程為①pLEGFP-N1質(zhì)粒DNA經(jīng)酚-氯仿抽提、乙醇沉淀。培養(yǎng)PT67包裝細(xì)胞至75％融合面積，配制A液(基因DNA2μg+HEPES緩沖液25μl)、B液(DOTAP20μl+HEPES緩沖液30μl)混合后室溫下靜置15min，加入925μl不含血清DMEM培養(yǎng)液靜置30min。PT67細(xì)胞用無血清培養(yǎng)液漂洗后，加入轉(zhuǎn)染混合液，置孵箱內(nèi)培養(yǎng)10h，然后換完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，再換含G418(800μg/ml)培養(yǎng)液，4d后維持G418(400μg/ml)，待抗性克隆形成后傳代培養(yǎng)。細(xì)胞長滿瓶底后，收集24h培養(yǎng)液，孔徑0.45μm濾膜過濾，2周內(nèi)使用該病毒液時(shí)可置于4℃冰箱，否則應(yīng)濃縮后加入10％甘油于-70℃保存。
②感染逆轉(zhuǎn)錄病毒待干細(xì)胞長至35cm2培養(yǎng)瓶瓶底50％面積時(shí)，換感染液6ml(含pLEGFP-N1病毒液2ml、polybrene終濃度8μg/ml)，37℃培養(yǎng)48h。
③篩選標(biāo)記細(xì)胞采用G418遞減方法篩選3周。首先消化待篩選細(xì)胞，調(diào)整接種密度為3×104/cm2，24h后換含G418(800μg/ml)培養(yǎng)液培養(yǎng)4d，然后G418(500μg/ml)培養(yǎng)4d，最后以G418(300μg/ml)維持形成抗性克隆及常規(guī)方法傳代。
(2)對準(zhǔn)備接種到骨區(qū)域的種子細(xì)胞采用基因轉(zhuǎn)染方式，標(biāo)記紅色熒光蛋白。其過程為pDsRed2-N1質(zhì)粒DNA經(jīng)酚-氯仿抽提、乙醇沉淀。培養(yǎng)成骨細(xì)胞至50％融合面積，配制A液(基因DNA2μg+HEPES緩沖液25μl)、B液(DOTAP20μl+HEPES緩沖液30μl)混合后室溫下靜置15min，加入925μl不含血清DMEM培養(yǎng)液靜置30min。細(xì)胞用無血清培養(yǎng)液漂洗后，加入轉(zhuǎn)染混合液，置孵箱內(nèi)培養(yǎng)10h，然后換完全培養(yǎng)液培養(yǎng)48h，再換含G418(800μg/ml)培養(yǎng)液，4d后維持G418(300μg/ml)，待抗性克隆形成后傳代培養(yǎng)。
4.按工程化組織的構(gòu)建技術(shù)，在軟骨支架材料內(nèi)進(jìn)行標(biāo)記增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的種子細(xì)胞接種，細(xì)胞濃度2×107個(gè)/ml，形成細(xì)胞-材料復(fù)合體，在骨支架材料內(nèi)進(jìn)行標(biāo)記紅色熒光蛋白的種子細(xì)胞接種，細(xì)胞濃度5×106個(gè)/ml，形成細(xì)胞-材料復(fù)合體，在將兩種組織進(jìn)行裝配形成完整的工程化骨與軟骨復(fù)合組織。
5.體外分析將工程化骨與軟骨復(fù)合組織在體外連續(xù)培養(yǎng)，可以在倒置熒光顯微鏡下直接觀察不同區(qū)域的種子細(xì)胞形態(tài)與數(shù)量變化，以及不同區(qū)域的細(xì)胞遷移或脫落等情況。
6.組織移植后的分析工程化骨與軟骨復(fù)合組織植入體內(nèi)后，經(jīng)過一段時(shí)間后可以取材進(jìn)行樣本分析。樣本經(jīng)冰凍切片后直接置于熒光顯微鏡下可以觀察到不同標(biāo)記處理的細(xì)胞呈不同的熒光表現(xiàn)，而該區(qū)域未進(jìn)行標(biāo)記的細(xì)胞無熒光表現(xiàn)；結(jié)合其它相應(yīng)檢測，即可對植入組織進(jìn)行詳細(xì)的細(xì)胞功能分析。
實(shí)施例3 對工程化組織皮膚的構(gòu)建與再生進(jìn)行示蹤為了良好的覆蓋皮膚組織缺損創(chuàng)面，體外構(gòu)建工程化皮膚時(shí)，可以仿生性的進(jìn)行2層組織構(gòu)建，其中一層接種角質(zhì)形成細(xì)胞，模擬表皮組織功能，另一層接種成纖維細(xì)胞，模擬部分真皮組織功能。應(yīng)用本技術(shù)可對不同區(qū)域的種子細(xì)胞標(biāo)記不同的熒光蛋白，從而研究不同細(xì)胞的遷移行為和組織中不同種子細(xì)胞在體內(nèi)的功能作用等特性。
步驟1.待標(biāo)記的種子細(xì)胞的大量擴(kuò)增培養(yǎng)，如角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或干細(xì)胞。
2.自己構(gòu)建或從生物公司購買所需要的逆轉(zhuǎn)錄病毒作為基因載體，然后進(jìn)行大量擴(kuò)增。
3.細(xì)胞的熒光蛋白標(biāo)記處理(1)對準(zhǔn)備接種到表皮區(qū)域的種子細(xì)胞采用基因轉(zhuǎn)染方式，標(biāo)記增強(qiáng)型綠色熒光蛋白。其過程為pEGFP-N1質(zhì)粒DNA經(jīng)酚-氯仿抽提、乙醇沉淀。培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞至50％融合面積，配制A液(基因DNA2μg+HEPES緩沖液25μl)、B液(DOTAP20μl+HEPES緩沖液30μl)混合后室溫下靜置15min，加入925μl不含血清DMEM培養(yǎng)液靜置30min。細(xì)胞用無血清培養(yǎng)液漂洗后，加入轉(zhuǎn)染混合液，置孵箱內(nèi)培養(yǎng)10h，然后換完全培養(yǎng)液培養(yǎng)48h，再換含G418(800μg/ml)培養(yǎng)液，4d后維持G418(300μg/ml)，待抗性克隆形成后傳代培養(yǎng)。
(2)對準(zhǔn)備接種到真皮區(qū)域的種子細(xì)胞采用基因轉(zhuǎn)染方式，標(biāo)記紅色熒光蛋白。其過程為①pLRFP-N1質(zhì)粒DNA經(jīng)酚-氯仿抽提、乙醇沉淀。培養(yǎng)PT67包裝細(xì)胞至75％融合面積，配制A液(基因DNA2μg+HEPES緩沖液25μl)、B液(DOTAP20μl+HEPES緩沖液30μl)混合后室溫下靜置15min，加入925μl不含血清DMEM培養(yǎng)液靜置30min。PT67細(xì)胞用無血清培養(yǎng)液漂洗后，加入轉(zhuǎn)染混合液，置孵箱內(nèi)培養(yǎng)10h，然后換完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，再換含G418(800μg/ml)培養(yǎng)液，4d后維持G418(400μg/ml)，待抗性克隆形成后傳代培養(yǎng)。細(xì)胞長滿瓶底后，收集24h培養(yǎng)液，孔徑0.45μm濾膜過濾，2周內(nèi)使用該病毒液時(shí)可置于4℃冰箱，否則應(yīng)濃縮后加入10％甘油于-70℃保存。
②感染逆轉(zhuǎn)錄病毒待干細(xì)胞長至35cm2培養(yǎng)瓶瓶底50％面積時(shí)，換感染液6ml(含pLRFP-N1病毒液2ml、polybrene終濃度8μg/ml)，37℃培養(yǎng)48h。
③篩選標(biāo)記細(xì)胞采用G418遞減方法篩選3周。首先消化待篩選細(xì)胞，調(diào)整接種密度為3×104/cm2，24h后換含G418(800μg/ml)培養(yǎng)液培養(yǎng)4d，然后G418(500μg/ml)培養(yǎng)4d，最后以G418(300μg/ml)維持形成抗性克隆及常規(guī)方法傳代。
4.按工程化組織的構(gòu)建技術(shù)，在皮膚支架材料內(nèi)進(jìn)行標(biāo)記紅色熒光蛋白的干細(xì)胞接種，細(xì)胞濃度1×107個(gè)/ml，形成細(xì)胞-材料復(fù)合體，培養(yǎng)2天后，在細(xì)胞-材料復(fù)合體的表面一側(cè)進(jìn)行標(biāo)記增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的角質(zhì)形成細(xì)胞接種，細(xì)胞濃度5×106個(gè)/ml，形成具有兩層細(xì)胞的復(fù)合體組織。
5.體外分析將具有2層結(jié)構(gòu)的工程化皮膚組織在體外連續(xù)培養(yǎng)，可以在倒置熒光顯微鏡下直接觀察不同區(qū)域的種子細(xì)胞形態(tài)與數(shù)量變化。
6.組織移植后的分析工程化皮膚組織植入皮膚缺損處后，經(jīng)過一段時(shí)間后可以取材進(jìn)行樣本分析。樣本經(jīng)冰凍切片后直接置于熒光顯微鏡下可以觀察到不同標(biāo)記處理的細(xì)胞呈不同的熒光表現(xiàn)，而該區(qū)域未進(jìn)行標(biāo)記的細(xì)胞無熒光表現(xiàn)；結(jié)合其它相應(yīng)檢測，即可對植入組織進(jìn)行詳細(xì)的細(xì)胞功能分析。
權(quán)利要求
1.一種工程化組織的細(xì)胞示蹤方法，其特征在于利用基因載體將熒光蛋白基因在體外分別導(dǎo)入將構(gòu)建工程化組織所需的種子細(xì)胞中，獲得表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞，將該細(xì)胞接種于工程化組織支架上，并利用熒光顯微鏡對細(xì)胞進(jìn)行觀察。
2.如權(quán)利要求1所述的工程化組織的細(xì)胞示蹤方法，其特征在于對于體外工程化組織構(gòu)建中不同種類和批次的細(xì)胞，分別導(dǎo)入不同顏色的熒光蛋白基因進(jìn)行示蹤。
3.如權(quán)利要求1或2所述的工程化組織的示蹤方法，其特征在于所述的基因載體采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或普通真核表達(dá)載體。
4.如權(quán)利要求1或2所述的工程化組織的示蹤方法，其特征在于所述的熒光蛋白可以為綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、藍(lán)色熒光蛋白和黃色熒光蛋白。
5.一種工程化組織的體外構(gòu)建方法，該方法包括如下過程(1)將待接種的種子細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)；(2)根據(jù)細(xì)胞種類和接種批次，準(zhǔn)備相應(yīng)的熒光蛋白和基因載體；(3)對基因載體進(jìn)行擴(kuò)增；(4)利用基因載體將熒光蛋白導(dǎo)入擴(kuò)增后的種子細(xì)胞中；(5)將標(biāo)記有熒光蛋白的種子細(xì)胞接種到工程化組織支架上，形成細(xì)胞-材料工程化組織復(fù)合體組織；(6)將工程化組織復(fù)合體在體外連續(xù)培養(yǎng)，在倒置熒光顯微鏡下直接觀察不同區(qū)域的種子細(xì)胞形態(tài)與數(shù)量變化，以及不同區(qū)域的細(xì)胞遷移或脫落等情況。
6.如權(quán)利要求5所述的工程化組織的體外構(gòu)建方法，其特征在于所述的基因載體采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或普通真核表達(dá)載體。
7.如權(quán)利要求5或6所述的工程化組織的體外構(gòu)建方法，其特征在于所述的熒光蛋白可以為綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、藍(lán)色熒光蛋白和黃色熒光蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種工程化組織的細(xì)胞示蹤方法，利用基因載體將熒光蛋白基因在體外分別導(dǎo)入將構(gòu)建工程化組織所需的種子細(xì)胞中，獲得表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞，將該細(xì)胞接種于工程化組織支架上，并利用熒光顯微鏡對細(xì)胞進(jìn)行觀察。這種工程化組織的示蹤方法，可以清楚地顯示細(xì)胞特別是不同種類及各批次細(xì)胞的分布與增殖情況、在體內(nèi)植入后細(xì)胞的分布與功能情況。
文檔編號C12Q1/04GK1766117SQ20051010332
公開日2006年5月3日 申請日期2005年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月16日
發(fā)明者楊柳, 段小軍 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院